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Biochemistry

वैक्यूम-असिस्टेड सॉर्बेंट निष्कर्षण के साथ मानव-संबद्ध नमूनों से सक्रिय रूप से उत्पादित माइक्रोबियल वाष्पशील कार्बनिक यौगिकों पर कब्जा करना

Published: June 1, 2022 doi: 10.3791/62547
Automatic Translation
1, 1, 2, 3, 3, 3, 1
1Department of Molecular Biology and Biochemistry, University of California Irvine, 2Department of Ecology and Evolutionary Biology, University of California Irvine, 3Entech Instruments Inc.

Summary

यह प्रोटोकॉल वैक्यूम-असिस्टेड सॉर्बेंट निष्कर्षण विधि के साथ एक जैविक नमूने से वाष्पशील कार्बनिक यौगिकों के निष्कर्षण का वर्णन करता है, गैस क्रोमैटोग्राफी एनटेक नमूना तैयारी रेल का उपयोग करके मास स्पेक्ट्रोमेट्री के साथ युग्मित होता है, और डेटा विश्लेषण। यह जैविक नमूनों और स्थिर आइसोटोप जांच की संस्कृति का भी वर्णन करता है।

Abstract

जैविक नमूनों से वाष्पशील कार्बनिक यौगिकों (वीओसी) की उत्पत्ति अज्ञात होती है। VOCs मेजबान के माइक्रोबियल समुदाय के भीतर से मेजबान या विभिन्न जीवों से उत्पन्न हो सकते हैं। माइक्रोबियल VOCs की उत्पत्ति को अलग करने के लिए, बैक्टीरियल मोनो के वाष्पशील हेडस्पेस विश्लेषण- और स्टैफिलोकोकस ऑरियस, स्यूडोमोनास एरुगिनोसा और एसिनेटोबैक्टर बाउमैनी की सह-संस्कृतियों, और मल, लार, सीवेज और थूक के जैविक नमूनों में स्थिर आइसोटोप जांच की गई थी। मोनो- और सह-संस्कृतियों का उपयोग व्यक्तिगत जीवाणु प्रजातियों से वाष्पशील उत्पादन की पहचान करने के लिए या जैविक नमूनों से रोगाणुओं के सक्रिय चयापचय की पहचान करने के लिए स्थिर आइसोटोप जांच के साथ संयोजन में किया गया था।

वैक्यूम-असिस्टेड सॉर्बेंट एक्सट्रैक्शन (वीएएसई) को वीओसी निकालने के लिए नियोजित किया गया था। VASE अर्ध-वाष्पशील और वाष्पशील यौगिकों के लिए एक आसान-से-उपयोग, व्यावसायीकृत, विलायक-मुक्त हेडस्पेस निष्कर्षण विधि है। सॉल्वैंट्स की कमी और निष्कर्षण के दौरान उपयोग की जाने वाली निकट-वैक्यूम स्थितियां एक विधि को अपेक्षाकृत आसान और तेज़ बनाती हैं जब अन्य निष्कर्षण विकल्पों जैसे कि टर्ट-ब्यूटिलेशन और ठोस चरण माइक्रोएक्सट्रैक्शन की तुलना में। यहां वर्णित वर्कफ़्लो का उपयोग मोनो- और सह-संस्कृतियों से विशिष्ट वाष्पशील हस्ताक्षरों की पहचान करने के लिए किया गया था। इसके अलावा, मानव संबंधित जैविक नमूनों की स्थिर आइसोटोप जांच के विश्लेषण ने वीओसी की पहचान की जो या तो आमतौर पर या विशिष्ट रूप से उत्पादित किए गए थे। यह पेपर सामान्य वर्कफ़्लो और VASE के प्रयोगात्मक विचारों को लाइव माइक्रोबियल संस्कृतियों की स्थिर आइसोटोप जांच के साथ संयोजन के रूप में प्रस्तुत करता है।

Introduction

वाष्पशील कार्बनिक यौगिकों (वीओसी) में बैक्टीरिया का पता लगाने और पहचान के लिए महान वादा है क्योंकि वे सभी जीवों से उत्सर्जित होते हैं, और विभिन्न रोगाणुओं में अद्वितीय वीओसी हस्ताक्षर होते हैं। वाष्पशील अणुओं का उपयोग विभिन्न श्वसन संक्रमणों का पता लगाने के लिए एक गैर-आक्रामक माप के रूप में किया गया है, जिसमें क्रोनिक ऑब्सट्रक्टिव पल्मोनरी डिजीज1, मूत्र3 में तपेदिक2, और वेंटिलेटर से जुड़े निमोनिया4 शामिल हैं, इसके अलावा स्वस्थ नियंत्रण विषयों से सिस्टिक फाइब्रोसिस (सीएफ) के साथ विषयों को अलग करने के लिए 5,6। वाष्पशील हस्ताक्षर का उपयोग सीएफ (स्टेफिलोकोकस ऑरियस7, स्यूडोमोनास एरुगिनोसा 8,9, और एस ऑरियस बनाम पी एरुगिनोसा10) में विशिष्ट रोगज़नक़ संक्रमणों को अलग करने के लिए भी किया गया है। हालांकि, इस तरह के जैविक नमूनों की जटिलता के साथ, अक्सर विशिष्ट वीओसी के स्रोत को इंगित करना मुश्किल होता है।

कई संक्रमित रोगाणुओं से वाष्पशील प्रोफाइल को अलग करने के लिए एक रणनीति मोनो- और सह-संस्कृतिदोनों में सूक्ष्मजीवों के हेडस्पेस विश्लेषण करना है। हेडस्पेस विश्लेषण नमूने में एम्बेडेड लोगों के बजाय एक नमूने के ऊपर "हेडस्पेस" में उत्सर्जित एनालिस्ट की जांच करता है। माइक्रोबियल मेटाबोलाइट्स को अक्सर मोनो-संस्कृतियों में विशेषता दी गई है क्योंकि जटिल नैदानिक नमूनों में माइक्रोबियल मेटाबोलाइट्स की उत्पत्ति को निर्धारित करने में कठिनाई होती है। बैक्टीरियल मोनो-संस्कृतियों से वाष्पशील ों को प्रोफाइल करके, विट्रो में एक माइक्रोब द्वारा उत्पादित वाष्पशील के प्रकार इसके वाष्पशील प्रदर्शनों की सूची की एक आधार रेखा का प्रतिनिधित्व कर सकते हैं। बैक्टीरियल संस्कृतियों का संयोजन, उदाहरण के लिए, सह-संस्कृतियों का निर्माण, और उत्पादित वाष्पशील अणुओं को प्रोफाइल करना बैक्टीरिया12 के बीच बातचीत या क्रॉस-फीडिंग को प्रकट कर सकता है।

वाष्पशील अणुओं की माइक्रोबियल उत्पत्ति की पहचान करने के लिए एक और रणनीति एक पोषक तत्व स्रोत प्रदान करना है जिसे एक स्थिर आइसोटोप के साथ लेबल किया गया है। स्थिर आइसोटोप स्वाभाविक रूप से होते हैं, न्यूट्रॉन की एक अलग संख्या के साथ परमाणुओं के गैर-रेडियोधर्मी रूप। एक रणनीति में जिसका उपयोग 1930 के दशक की शुरुआत से जानवरों में सक्रिय चयापचय का पता लगाने के लिए किया गया है,सूक्ष्मजीव लेबल किए गए पोषक तत्व स्रोत को बंद कर देता है और स्थिर आइसोटोप को अपने चयापचय मार्गों में शामिल करता है। हाल ही में, भारी पानी (डी2ओ) के रूप में एक स्थिर आइसोटोप का उपयोग नैदानिक सीएफ थूक नमूना14 में चयापचय रूप से सक्रिय एस ऑरियस की पहचान करने के लिए किया गया है। एक अन्य उदाहरण में, 13सी-लेबल वाले ग्लूकोज का उपयोग पी. एरुगिनोसा और रोथिया म्यूसिलागिनोसा12 के सीएफ नैदानिक आइसोलेट्स के बीच चयापचयों के क्रॉस-फीडिंग को प्रदर्शित करने के लिए किया गया है।

मास स्पेक्ट्रोमेट्री तकनीकों की प्रगति के साथ, वाष्पशील संकेतों का पता लगाने के तरीके गुणात्मक टिप्पणियों से अधिक मात्रात्मक माप में चले गए हैं। गैस क्रोमैटोग्राफी मास स्पेक्ट्रोमेट्री (जीसी-एमएस) का उपयोग करके, जैविक नमूनों का प्रसंस्करण अधिकांश प्रयोगशाला या नैदानिक सेटिंग्स के लिए पहुंच के भीतर हो गया है। वाष्पशील अणुओं का सर्वेक्षण करने के लिए कई तरीकों का उपयोग नमूनों जैसे कि भोजन, जीवाणु संस्कृतियों और अन्य जैविक नमूनों, और संदूषण का पता लगाने के लिए हवा और पानी जैसे नमूनों को प्रोफाइल करने के लिए किया गया है। हालांकि, उच्च-थ्रूपुट के साथ वाष्पशील नमूने के कई सामान्य तरीकों को विलायक की आवश्यकता होती है और वैक्यूम निष्कर्षण द्वारा प्रदान किए गए लाभों के साथ प्रदर्शन नहीं किया जाता है। इसके अलावा, नमूना सामग्री की बड़ी मात्रा या मात्रा (0.5 मिलीलीटर से अधिक) अक्सर विश्लेषण15,16,17,18,19 के लिए आवश्यक होती है, हालांकि यह सब्सट्रेट-विशिष्ट है और प्रत्येक नमूना प्रकार और विधि के लिए अनुकूलन की आवश्यकता होती है।

यहां, वैक्यूम-असिस्टेड सोर्बेंट एक्सट्रैक्शन (वीएएसई) के बाद जीसी-एमएस पर थर्मल डिसोर्प्शन को बैक्टीरियल मोनो- और सह-संस्कृतियों के वाष्पशील प्रोफाइल का सर्वेक्षण करने और मानव मल, लार, सीवेज और थूक के नमूनों से स्थिर आइसोटोप जांच के साथ सक्रिय रूप से उत्पादित वाष्पशील की पहचान करने के लिए नियोजित किया गया था (चित्रा 1)। सीमित नमूना मात्रा के साथ, VOCs थूक के 15 μL के रूप में कम से निकाले गए थे। मानव नमूनों के साथ आइसोटोप जांच प्रयोगों के लिए एक स्थिर आइसोटोप स्रोत को जोड़ने की आवश्यकता होती है, जैसे कि 13सी ग्लूकोज, और माइक्रोबियल समुदाय के विकास की खेती करने के लिए मीडिया। वाष्पशील के सक्रिय उत्पादन को जीसी-एमएस द्वारा एक भारी अणु के रूप में पहचाना गया था। एक स्थैतिक निर्वात के तहत वाष्पशील अणुओं के निष्कर्षण ने20,21,22 बढ़ी हुई संवेदनशीलता के साथ वाष्पशील अणुओं का पता लगाने में सक्षम बनाया।

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Protocol

1. Headspace Sorbent पेन (HSP) और नमूना विश्लेषण विचार

नोट:: Sorbent Tenax TA युक्त HSP volatiles की एक विस्तृत श्रृंखला को कैप्चर करने के लिए चुना गया था। टेनैक्स में अन्य सॉर्बेंट्स की तुलना में पानी के लिए कम आत्मीयता है, जो इसे उच्च नमी वाले नमूनों से अधिक वीओसी को फंसाने में सक्षम बनाता है। टेनैक्स में अशुद्धियों का निम्न स्तर भी होता है और इसे फिर से उपयोग के लिए वातानुकूलित किया जा सकता है। सॉर्बेंट चयन भी जीसी-एमएस में स्थापित कॉलम के साथ विचार में किया गया था ( सामग्री की तालिका देखें)।

  1. नमूना निष्कर्षण के लिए उपयोग की जाने वाली समान शर्तों के साथ मीडिया और / या नमूना रिक्तस्थान निकालकर नकारात्मक नियंत्रण उत्पन्न करें।
  2. निकाले गए नमूनों का विश्लेषण करने से पहले जीसी-एमएस पर एक रिक्त एचएसपी (पहले साफ और महत्वपूर्ण पृष्ठभूमि से मुक्त होने की पुष्टि की गई थी) का विश्लेषण करें। नमूना प्रकारों के बीच रिक्त स्थान चलाएं (उदाहरण के लिए, बैक्टीरिया मोनो-संस्कृति की तीन प्रतिकृतियां, रिक्त, बैक्टीरिया सह-संस्कृति, रिक्त, आदि की तीन प्रतिकृतियां)।
  3. नमूना निष्कर्षण और विश्लेषण से पहले सुगंधित व्यक्तिगत देखभाल वस्तुओं या बदबूदार खाद्य पदार्थों की खपत के उपयोग को सीमित करें। आदर्श रूप से, एक जैव सुरक्षा हुड में नमूने तैयार करें जो कम से कम 30 मिनट के लिए शराब या अन्य वाष्पशील क्लीनर द्वारा साफ नहीं किए गए हैं। नमूना तैयारी से पहले 30-60 मिनट के लिए जैव सुरक्षा हुड में एयरफ्लो चालू करें।
  4. नमूना तैयारी के दौरान वाष्पशील रिलीज को सीमित करने के लिए बर्फ पर नमूने रखें।

2. मोनो और सह संस्कृति तैयारी

  1. Biosafety हुड में, टॉड हेविट विकास मीडिया में A. baumannii, S. aureus, और P. aeruginosa की संस्कृतियों को टीका लगाएं। 200 आरपीएम आंदोलन के साथ 37 डिग्री सेल्सियस पर रात भर इनक्यूबेट करें।
  2. रात भर के इनक्यूबेशन के बाद, जैव सुरक्षा हुड में संस्कृति से निपटने का प्रदर्शन करें। 500 एनएम पर ऑप्टिकल घनत्व 0.05 के लिए प्रत्येक संस्कृति को पतला करें।
  3. समान भागों में सह-संस्कृतियों को मिलाएं, और 96-अच्छी तरह से प्लेट के प्रत्येक कुएं में नियंत्रण मीडिया, मोनो-, या सह-संस्कृति के पिपेट 200 μL, और 24 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में रखें। 48-h इनक्यूबेशन के लिए एक दूसरी प्लेट तैयार करें।
  4. इनक्यूबेशन अवधि के अंत में, अनुभाग 4 में निष्कर्षण के लिए नमूने तैयार करें। पिपेट तरल संस्कृतियों को माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूबों में और -80 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करते हैं।
    नोट:: इस बिंदु पर, यदि आवश्यक हो तो बाद में निकालने के लिए नमूने -80 °C पर संग्रहीत किए जा सकते हैं।

3. जैविक नमूनों की तैयारी में स्थिर आइसोटोप जांच

नोट: मल और लार के नमूने कैलिफोर्निया इरविन इंस्टीट्यूशनल रिव्यू बोर्ड (HS # 2017-3867) विश्वविद्यालय से अनुमोदन के साथ अनाम दाताओं से दान किए गए थे। सीवेज सैन डिएगो, सीए से आया था। थूक के नमूने मिशिगन मेडिकल स्कूल संस्थागत समीक्षा बोर्ड (HUM00037056) के विश्वविद्यालय द्वारा अनुमोदित एक बड़े अध्ययन के हिस्से के रूप में सिस्टिक फाइब्रोसिस वाले विषयों से एकत्र किए गए थे।

  1. जैव सुरक्षा हुड में सभी जैविक नमूना तैयारी प्रदर्शन.
    1. फेकल नमूने तैयार करने के लिए, 1.5 मिलीलीटर माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूब में 100 मिलीग्राम मल में 1 मिलीलीटर विआयनीकृत पानी जोड़ें और 3 मिनट के लिए भंवर। उपयोग में न होने पर बर्फ पर रखें।
      1. फेकल और पानी के मिश्रण के 15 μL के लिए, 20 mM 13C ग्लूकोज के साथ ब्रेन हार्ट इन्फ्यूश़न (BHI) माध्यम का 485 μL जोड़ें, या 30% ड्यूटेरियम (D2O) के साथ BHI जोड़ें। सुनिश्चित करें कि नमूने की अंतिम मात्रा 500 μL है। तकनीकी प्रतिलिपियों में नमूने तैयार करें।
    2. सीवेज के नमूने तैयार करने के लिए, 20 mM 13C ग्लूकोज के साथ BHI के 500 μL में 500 μL सीवेज जोड़ें या 1 mL की कुल मात्रा के लिए 30% D2O के साथ BHI जोड़ें। तीन प्रतियों में नमूने तैयार करें। उपयोग में न होने पर बर्फ पर रखें।
    3. लार के नमूने तैयार करने के लिए, 550 μL की कुल मात्रा के लिए 20 mM 13C ग्लूकोज के साथ BHI के 500 μL में लार का 50 μL जोड़ें या 30% D2O के साथ BHI जोड़ें। नमूने को तीन प्रतियों में तैयार करें। उपयोग में न होने पर बर्फ पर रखें।
    4. कल्चर से पहले और बाद में नमूने में मौजूद वाष्पशीलों की तुलना करने के लिए थूक के नमूने तैयार करने के लिए, थूक के 15 μL के साथ पहला निष्कर्षण करें। तीन प्रतियों में नमूने तैयार करें। उपयोग में न होने पर बर्फ पर रखें। नमूना निष्कर्षण के लिए धारा 4 पर आगे बढ़ें, और 200 आरपीएम आंदोलन के साथ 37 डिग्री सेल्सियस पर 18 घंटे के लिए निकालें।
    5. असंस्कृत थूक के नमूनों के पहले निष्कर्षण के पूरा होने के बाद, थूक के साथ शीशियों को सहेजें। 3.5.1 से थूक के साथ शीशियों में 20 mM 13C ग्लूकोज के साथ BHI के 500 μL जोड़ें। उपयोग में न होने पर बर्फ पर रखें।
  2. नमूना निष्कर्षण के लिए अनुभाग 4 पर आगे बढ़ें।

4. नमूना निष्कर्षण

  1. ठंडी प्लेट पर खाली वाष्पशील कार्बनिक विश्लेषण (वीओए) शीशियों (20 मिलीलीटर) रखें, और बर्फ पर ठंडी प्लेट को जैव सुरक्षा हुड में रखें।
  2. 5600 sorbent पेन निष्कर्षण इकाई (SPEU) को चालू करें, और प्रत्येक विधि के लिए आवश्यक के रूप में वांछित तापमान को समायोजित करें।
    नोट: 37 डिग्री सेल्सियस पर स्थिर आइसोटोप जांच प्रयोगों के लिए, सेटपॉइंट तक पहुंचने में 15 मिनट तक का समय लग सकता है। 70 डिग्री सेल्सियस पर मोनो- और सह-संस्कृति प्रयोगों के लिए, सेटपॉइंट तक पहुंचने में 60 मिनट तक का समय लग सकता है।
  3. मीडिया या नमूना नियंत्रण के लिए HSPs सहित तैयार किए गए नमूनों की संख्या के बराबर हैं जो स्वच्छ HSPs एकत्र करें।
  4. लेबल 20 एमएल वीओए शीशियों के अनुसार नमूनों, प्रतिकृतियों, और HSP आईडी के अनुसार आवश्यकतानुसार. एक मार्कर का उपयोग करें जो बर्फ पर रहते हुए शीशी के बाहर संक्षेपण रूपों के मामले में पानी का विरोध करता है।
  5. Biosafety हुड के अंदर, शीशी पर सफेद टोपी unscrew, जल्दी से शीशी में pipet नमूना, और काले टोपी, ढक्कन लाइनर, और एचएसपी इकट्ठा.
    नोट:: नमूने HSP के साथ संपर्क में नहीं आना चाहिए, और नमूना वॉल्यूम नमूना प्रकार पर निर्भर करेगा।
  6. नमूना और HSP युक्त शीशी को ठंडे प्लेट पर वापस रखें।
  7. प्रत्येक नमूने के लिए चरण 4.5 और 4.6 दोहराएँ। नमूना वार्मिंग को रोकने के लिए एक बार में सभी के बजाय प्रति नमूना इन चरणों का पालन करें और इस प्रकार, समय से पहले वाष्पशील रिलीज।
  8. एक बार जब सभी नमूने कांच की शीशियों में तैयार हो जाते हैं, तो बेंच पर जैव सुरक्षा हुड के बाहर निम्नलिखित चरणों का प्रदर्शन करें। वैक्यूम पंप को चालू करें, 30 mmHg के लिए वैक्यूम के नीचे शीशियों को रखें, और वैक्यूम स्रोत को हटा दें।
    नोट: वैक्यूम आवेदन पूरा होने के बाद शीशियों को ठंडे ट्रे पर होने की आवश्यकता नहीं है।
  9. दबाव गेज का उपयोग करके वैक्यूम के तहत सभी नमूनों को रखने के बाद दबाव को डबल-चेक करें। यदि एक शीशी में रिसाव होता है, तो सुनिश्चित करें कि टोपी कसकर खराब हो गई है, और एचएसपी और ढक्कन लाइनर के सफेद ओ-रिंग ठीक से जगह में हैं।
    नोट: एक समझौता सील वैक्यूम के तहत एक शीशी की तुलना में वाष्पशील पता लगाने में कमी के परिणामस्वरूप कर सकते हैं।
  10. 200 आरपीएम पर आंदोलन के साथ अनुकूलित समय और तापमान के लिए एसपीईयू में शीशियों रखें। 70 डिग्री सेल्सियस पर 1 ज के लिए संस्कृतियों को निकालें। 37 डिग्री सेल्सियस पर 18 ज के लिए फेकल, सीवेज, लार और थूक के नमूनों के साथ स्थिर आइसोटोप जांच प्रयोगों को निकालें।
  11. निष्कर्षण अवधि पूरी होने के बाद उपयोग के लिए ठंडी प्लेट को -80 डिग्री सेल्सियस पर रखें।
  12. जब निष्कर्षण पूरा हो जाता है, तो एचएसपी और शीशी हेडस्पेस से जल वाष्प को बाहर निकालने के लिए 15 मिनट के लिए ठंडी प्लेट पर नमूने रखें।
  13. HSPs को उनकी आस्तीन में स्थानांतरित करें।
    नोट: प्रयोग को एचएसपी से अधिक अत्यधिक वाष्पशील यौगिकों को खोने से पहले कमरे के तापमान पर ~ 1 सप्ताह तक यहां रोका जा सकता है।

5. गैस क्रोमैटोग्राफी पर नमूनों का विश्लेषण - द्रव्यमान स्पेक्ट्रोमीटर (जीसी-एमएस)

  1. निम्नलिखित जीसी-एमएस ( सामग्री की तालिका देखें) सेटिंग्स का उपयोग करें: 5 मिनट की पकड़ के साथ 35 डिग्री सेल्सियस, 170 डिग्री सेल्सियस तक 10 डिग्री सेल्सियस / मिनट रैंप, और 20: 1 विभाजन अनुपात और 38 मिनट के कुल रनटाइम के साथ 230 डिग्री सेल्सियस के लिए 15 डिग्री सेल्सियस / मिनट रैंप।
  2. desorption विधि निम्नानुसार सेट करें: 2 मिनट, 70 °C preheat; 2 मिनट 260 डिग्री सेल्सियस desorption; 34 मिनट, 260 डिग्री सेल्सियस बेकआउट; और 2 मिनट, 70 डिग्री सेल्सियस पोस्ट सेंकना.
  3. नमूनों का अनुक्रम सेट करें, और इंस्ट्रूमेंटेशन के अनुसार रन शुरू करें।
    1. Entech सॉफ़्टवेयर पर एक अनुक्रम सेट करने के लिए, प्रोग्राम खोलें. इंस्ट्रूमेंट ड्रॉपडाउन मेनू के दाईं ओर के विकल्पों में, 5800 | का चयन करें अनुक्रम ।
    2. GC-MS सॉफ़्टवेयर के समान Entech सॉफ़्टवेयर में अनुक्रम तालिका का निरीक्षण करें. वर्तमान date_vial संख्या के अनुसार नमूना ID स्तंभ का नाम दें. ध्यान रखें कि नाम GC-MS अनुक्रम तालिका में नाम के अनुरूप है, और 5800 विधि तापमान रैंप, होल्डिंग समय, आदि की दर निर्धारित करता है (चरण 5.2 में उत्पन्न विधि का चयन करने के लिए एक मेनू खोलता है)।
    3. ध्यान रखें कि ट्रे और स्थिति स्तंभ यह निर्धारित करते हैं कि नमूना तैयारी रेल (SPR) HSP लेने के लिए कहाँ जाएगी।
      1. तत्काल बाईं ओर 30 धब्बों के साथ दो ट्रे का निरीक्षण करें, प्रत्येक को पांच धब्बों के साथ छह कॉलम के रूप में रखा गया है। ट्रे की स्थिति जो उपयोगकर्ता (सामने) के सबसे अधिक छोड़ दी जाती है और निकटतम होती है, वह स्थिति 1 है, जबकि सबसे दाईं ओर, सबसे दूर की स्थिति 30 है।
      2. ध्यान दें कि ये ट्रे एचएसपी ए या बी हैं, जहां एचएसपी बी एसपीआर (सबसे भीतरी ट्रे) के करीब ट्रे है, और सीधे एचएसपी बी के पीछे एचएसपी ब्लैंक है। निकाले गए नमूनों को ट्रे में रखें, और तदनुसार अनुक्रम पर स्थान का चयन करें।
    4. अनुक्रम तालिका को सहेजें, बाईं ओर चलाएँ का चयन करें, फिर desorber में रिक्त स्थान के साथ प्रारंभ करें यदि रिक्त HSP desorber में है (पीले लेबल द्वारा चिह्नित HSP द्वारा दर्शाया गया).
  4. ध्यान दें कि HSPs अनुक्रम में प्रत्येक नमूने के लिए SPR द्वारा नियंत्रित किया जाएगा। एसपीआर को गर्म होने दें, फिर स्क्रीन के शीर्ष पर एक संदेश दिखाई देगा ताकि यह पुष्टि की जा सके कि रिक्त डेसोर्बर में है या नहीं। यह पुष्टि करने के लिए स्किप पर क्लिक करें कि पेन वहां है। SPR को सभी नमूनों को स्वचालित रूप से चलाने की अनुमति दें, और GC-MS साइड पर अनुक्रम स्वचालित रूप से अलग-अलग फ़ाइलों में डेटा रिकॉर्ड करेगा।

6. डेटा विश्लेषण

  1. जीसी-एमएस सॉफ़्टवेयर (सामग्री की तालिका) पर गुणवत्ता-फ़िल्टर डेटा।
    1. क्रोमैटोग्राम पर प्रत्येक चोटी की समीक्षा करें, और उन चोटियों को एनोटेट करें जो राष्ट्रीय मानक और प्रौद्योगिकी संस्थान (NIST) लाइब्रेरी (या किसी अन्य उपलब्ध पुस्तकालय के साथ) से मेल खाती हैं।
    2. एनोटेट क्रोमैटोग्राम चोटियों को प्रसंस्करण विधि में जोड़ें। 75% से अधिक संभावना वाले यौगिकों को शामिल करने के लिए चोटियों का चयन करने के लिए मानदंड निर्धारित करें, और सुनिश्चित करें कि यौगिक के प्रत्येक पहचान आयन का संरेखण चोटी के केंद्र के भीतर स्थित है।
      1. संसाधन विधि में कोई चोटी जोड़ने के लिए, कैलिब्रेट करें | यौगिक | संपादित करें नाम | बाह्य मानक यौगिक के अंतर्गत यौगिक सम्मिलित करें. यौगिक, अवधारण समय, क्वांट सिग्नल लक्ष्य आयन का नाम जोड़ें। तीन सबसे बड़ी चोटियों जोड़ें। सहेजने के लिए, ठीक | का चयन करें विधि | सहेजें।
    3. एक बार प्रक्रिया विधि सेट अप हो जाने के बाद, Quantitate | पर आगे बढ़ें परिकलित करें, और | देखें QEdit क्वांट परिणाम.
    4. यह सुनिश्चित करने के लिए प्रत्येक यौगिक का निरीक्षण करें कि चोटियां अपने अपेक्षित प्रतिधारण समय के साथ संरेखित होती हैं और पृष्ठभूमि शोर से ऊपर होती हैं।
    5. एक बार QEdit पूरा हो जाने के बाद, बाहर निकलें | का चयन करें हाँ QEdits को बचाने के लिए और मुख्य क्रोमैटोग्राम पर लौटने के लिए। बाईं ओर फ़ाइल खोलकर क्षेत्र एकीकरण निर्यात करें। क्वांटिटेट | का चयन करें रिपोर्ट जनरेट करें.
    6. DExSI में उपयोग के लिए फ़ाइलों को निर्यात करने के लिए, फ़ाइल | का चयन करें AIA स्वरूप | में डेटा निर्यात करें नई निर्देशिका बनाएँ, और फ़ाइल के लिए किसी स्थान का चयन करें या मौजूदा निर्देशिका का उपयोग करें।
    7. निर्यात के लिए फ़ाइलों का चयन करने के लिए खोलने वाली एक नई विंडो का निरीक्षण करें। फ़ाइलों को विंडो के दाईं ओर ले जाएं और प्रक्रिया पर क्लिक करें। कनवर्ट की जा रही फ़ाइलों की संख्या के आधार पर कुछ सेकंड से कुछ मिनट तक प्रतीक्षा करें.
  2. DExSI सॉफ़्टवेयर (https://github.com/DExSI/DExSI) के निर्देशों के अनुसार DExSI में आइसोटोप बहुतायत के लिए सही है, और एक पसंदीदा सॉफ़्टवेयर या प्रोग्राम (जैसे, आर) के साथ विश्लेषण करें। आंकड़े उत्पन्न करने के लिए उपयोग की जाने वाली स्क्रिप्ट https://github.com/joannlp/ VOC_SIP पर स्थित हैं।

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Representative Results

एस ऑरियस, पी. एरुगिनोसा, और ए. बाउमनी की मोनो- और सह-संस्कृतियां
मोनो- और सह-संस्कृतियों में जीवाणु प्रजातियां एस. ऑरियस, पी. एरुगिनोसा और ए. बाउमनी शामिल थीं। ये मानव घावों और पुराने संक्रमणों में पाए जाने वाले सामान्य अवसरवादी रोगजनक हैं। मोनो- और सह-संस्कृतियों में मौजूद वाष्पशील अणुओं की पहचान करने के लिए, 200 आरपीएम आंदोलन के साथ 70 डिग्री सेल्सियस पर एक छोटा 1-एच निष्कर्षण किया गया था। 24- और 48-h टाइमपॉइंट्स पर मोनो- और सह-संस्कृतियों से, 43 एनोटेटेड वाष्पशील अणुओं का पता लगाया गया था (चित्रा 2) जिनमें से एल्डिहाइड, कीटोन्स, अल्कोहल, सल्फ्यूरिक यौगिक, हाइड्रोकार्बन, कार्बोक्जिलिक एसिड या एस्टर, और एरोमैटिक्स थे। वाष्पशील अणुओं की एक छोटी संख्या थी जो केवल कुछ निश्चित समय बिंदुओं पर कुछ मोनो- या सह-संस्कृतियों में पाई गई थी। उदाहरण के लिए, एसिटोइन और 3-हाइड्रॉक्सी-2-ब्यूटेनोन एसीटेट को केवल 48-एच टाइमपॉइंट (चित्रा 2) पर एस ऑरियस संस्कृतियों में पाया गया था।

वाष्पशील 1-प्रोपेनॉल 2-मिथाइल केवल पी. एरुगिनोसा और ए. बाउमनी सह-संस्कृति में 48 ज (चित्रा 2) पर पाया गया था। एथिल एसीटेट ए. बाउमनी सह-संस्कृतियों में मौजूद था, जिसमें या तो एस. ऑरियस या पी. एरुगिनोसा के साथ 48 ज (चित्रा 2) पर मौजूद था। मेटाबोलाइट्स हेप्टेन, 2,3-डाइमिथाइल और पेंटेन, 2-मिथाइल को केवल 24 घंटे (चित्रा 2) पर ए. बौमनी संस्कृति में पाया गया था। एसिटाल्डिहाइड और इथेनॉल में 48 घंटे की तुलना में 24-एच टाइमपॉइंट पर ए. बाउमनी और एस. ऑरियस सह-संस्कृति में उच्च सापेक्ष बहुतायत थी और अकेले संस्कृति में उपभेदों में से कोई भी (चित्रा 2)। वाष्पशील में से कुछ या तो 24- या 48-h टाइमपॉइंट पर संस्कृतियों में अधिक प्रचुर मात्रा में थे। एसिटिक एसिड, ब्यूटेनोइक एसिड और प्रोपेनोइक एसिड सहित शॉर्ट-चेन फैटी एसिड, 48 घंटे में संस्कृतियों में उच्च सापेक्ष बहुतायत में थे, लेकिन 24-एच संस्कृतियों (चित्रा 2) में पाए गए थे। हेक्सेन 48 घंटे (चित्रा 2) की तुलना में 24 घंटे में टीएच नियंत्रण में अधिक प्रचुर मात्रा में था।

फेकल, सीवेज और लार के नमूनों की स्थिर आइसोटोप लेबलिंग
एक जैविक नमूने से वाष्पशील अणुओं के सक्रिय उत्पादन की पहचान करने के लिए, एक लेबल पोषक तत्व स्रोत, 13सी ग्लूकोज या डी2ओ, और मीडिया को माइक्रोबियल समुदाय के विकास का समर्थन करने के लिए जोड़ा गया था। एक अद्वितीय नमूने का विश्लेषण फेकल, सीवेज और लार के नमूनों के विभिन्न नमूना प्रकारों में से प्रत्येक से किया गया था। ड्यूटेरियम (चित्रा 3 ई) के साथ निगमन की तुलना में पूरी तरह से लेबल किए गए वाष्पशील अणुओं (चित्रा 3 ए-डी) में 13सी का अधिक समावेश था। 13सी को 2-ब्यूटेनोन, 3-हाइड्रॉक्सी में शामिल किया गया था; 2,3-butanedione; एसिटिक एसिड; और सभी फेकल, सीवेज, और लार के नमूनों के लिए फिनोल (चित्रा 3 ए)।

अन्य लेबल किए गए वाष्पशील या तो दो या एक नमूना प्रकारों में पाए गए थे। उदाहरण के लिए, एसीटोन, ब्यूटेनोइक एसिड और प्रोपेनोइक एसिड को लार और सीवेज (चित्रा 3 बी) में लेबल के रूप में पाया गया था। लेबल वाष्पशील, डाइमिथाइल ट्राइसल्फ़ाइड और डाइसल्फ़ाइड डाइमिथाइल, फेकल और लार के नमूनों दोनों में समृद्ध थे (चित्रा 3 सी)। Volatiles, 1-propanol, 2-butanone, benzophenone, इथेनॉल, और मिथाइल thiolacetate, केवल सीवेज (चित्रा 3 डी) में समृद्ध थे। लेबल वाष्पशील, 2,3-pentanedoine, लार (चित्रा 3 डी) में समृद्ध किया गया था। ड्यूटेरियम को वाष्पशील, एसिटिक एसिड में शामिल किया गया था; बेंजाल्डिहाइड, 4-मिथाइल; डाइमिथाइल ट्राइसल्फ़ाइड; और फिनोल, या तो लार या सीवेज के नमूनों से (चित्रा 3ई)। आइसोटोप-समृद्ध वाष्पशीलों के अलावा, वाष्पशील का पता लगाया गया था जिसमें शामिल स्थिर आइसोटोप नहीं थे। उदाहरण के लिए, pyrazine यौगिकों, pyrazine, 2,5-dimethyl को छोड़कर, फेकल, सीवेज और लार के नमूनों में पाया गया था, लेकिन 13सी (पूरक चित्रा S1) के साथ पूरी तरह से समृद्ध नहीं थे।

थूक के नमूनों का स्थिर आइसोटोप लेबलिंग
सिस्टिक फाइब्रोसिस के साथ सात मानव विषयों से थूक के नमूनों के साथ सक्रिय रूप से उत्पादित वाष्पशील की पहचान करने के लिए स्थिर आइसोटोप लेबलिंग रणनीति को लागू किया गया था। नमूने में वाष्पशील की तुलना उन लोगों के साथ की गई थी जो एक स्थिर आइसोटोप लेबल के साथ सुसंस्कृत नमूनों से उभरे थे। प्रत्येक नमूने के प्रत्येक वाष्पशील घटक का दो बार विश्लेषण किया गया था: 13सी ग्लूकोज और मीडिया के साथ स्थिर आइसोटोप जांच से पहले और बाद में। विषयों से एकत्र किए गए नमूनों ने तीन अलग-अलग टाइमपॉइंट्स या नैदानिक राज्यों को फैलाया: बेसलाइन, एक्ससेर्बेशन और उपचार23। सुसंस्कृत थूक के नमूनों में लेबल के रूप में पाए गए वाष्पशीलों में असंस्कृत थूक के नमूनों से अनलेबल किए गए वाष्पशीलों की तुलना में अलग-अलग सापेक्ष बहुतायत थी। थूक के साथ स्थिर आइसोटोप जांच प्रयोगों में खेती की स्थिति कुछ रोगाणुओं के विकास का पक्ष ले सकती है, जिससे असंस्कृत थूक के नमूनों की तुलना में वाष्पशील की सापेक्ष बहुतायत में अंतर हो सकता है।

उदाहरण के लिए, एसिटिक एसिड, डाइमिथाइल ट्राइसल्फ़ाइड, एसीटोन, और प्रोपेनल, 2-मिथाइल असंस्कृत थूक के नमूनों की तुलना में सुसंस्कृत थूक के नमूनों में अधिक प्रचुर मात्रा में थे (चित्रा 4)। 13सी-लेबल इथेनॉल का पता लगाना, जो पृष्ठभूमि कक्ष की हवा में परिवर्तनीय मात्रा में मौजूद हो सकता है, इस बात का सबूत प्रदान करता है कि इथेनॉल सक्रिय रूप से 13सी ग्लूकोज से माइक्रोबियल चयापचय द्वारा उत्पादित किया गया था। भिन्नता की मात्रा को विषय द्वारा समझाया गया था जैसा कि विचरण के क्रमपरिवर्तनीय बहुचर विश्लेषण (PERMANOVA) द्वारा मूल्यांकन किया गया था और दो अलग-अलग वाष्पशील डेटासेट (तालिका 1 और पूरक चित्रा S2) के लिए भी अलग था। 13सी-लेबल वाले सुसंस्कृत थूक के लिए, भिन्नता का 51% विषय द्वारा समझाया गया था, जबकि 33% भिन्नता को असंस्कृत थूक के नमूनों (तालिका 1) में वाष्पशील से विषय द्वारा समझाया गया था। सात विषयों से 16S rRNA amplicon अनुक्रमण द्वारा निर्धारित माइक्रोबायोम सामुदायिक संरचना प्रत्येक विषय (पूरक चित्रा S3) के लिए अद्वितीय थी, और व्यक्तिगत हस्ताक्षर भी सुसंस्कृत और असंस्कृत थूक वाष्पशील अणुओं का पता लगाया दोनों में परिलक्षित हुए थे।

सुसंस्कृत थूक में, 23 वाष्पशील का पता लगाया गया था जिन्हें पूरी तरह से 13कार्बन के साथ लेबल किया गया था। थूक के नमूनों से पता लगाए गए आइसोटोप-समृद्ध (सक्रिय) वाष्पशील प्रत्येक विषय के लिए अलग-अलग थे। सभी सात विषयों से थूक के नमूनों में पाए गए आइसोटोप संवर्धन के साथ वाष्पशील 2,3-ब्यूटेनेडिओन थे; एसिटिक एसिड; एसीटोन; डाइमिथाइल ट्राइसल्फ़ाइड; डाइसल्फ़ाइड, डाइमिथाइल; और pyrazine, 2,5-dimethyl (चित्रा 5). यद्यपि उन वाष्पशीलों को सभी विषयों में पाया गया था, प्रत्येक विषय के लिए आइसोटोप संवर्धन भिन्न था। विषय 7 के नमूनों में अन्य छह विषयों की तुलना में डाइसल्फ़ाइड डाइमिथाइल का उच्च आइसोटोप संवर्धन था (चित्रा 5 बी)। एसीटोन विषयों 4 और 6 (चित्रा 5) में अधिक था। कुछ वाष्पशील केवल कुछ विषयों में 13सी के साथ समृद्ध थे। उदाहरण के लिए, 1-ब्यूटेनॉल, 3-मिथाइल और प्रोपेनोइक एसिड, 2-मिथाइल केवल विषय 2 (चित्रा 5) से नमूनों के सबसेट में समृद्ध थे। आइसोटोप-समृद्ध वाष्पशील के अलावा, एक ही सुसंस्कृत थूक (पूरक चित्रा S4) से अनलेबल के रूप में भी वाष्पशील पाए गए थे। Volatiles 2-piperidinone; बेंजाल्डिहाइड, 4-मिथाइल; बेंजोथियाज़ोल; ब्यूटेनोइक एसिड, 3-मिथाइल; हेक्सानल; हेक्सेन; आइसोप्रोपिल अल्कोहल; फिनोल; प्रोपेनोइक एसिड, 2-मिथाइल; और pyrrolo 1,2-apyrazine-1,4-dione, हेक्साहाइड्रो थूक के नमूनों में पाया गया था, लेकिन आइसोटोप-समृद्ध नहीं थे (पूरक चित्रा S4)।

Figure 1
चित्रा 1: प्रोटोकॉल योजनाबद्ध. एक जैविक नमूना एक कांच की शीशी में रखा जाता है और ढक्कन लाइनर और हेडस्पेस सोर्बेंट पेन के साथ इकट्ठा किया जाता है। एक वैक्यूम को शीशी पर तब तक लागू किया जाता है जब तक कि लगभग 30 mmHg का दबाव नहीं पहुंच जाता है। वैक्यूम स्रोत को हटा दिया जाता है, और शीशियों को सॉर्बेंट पेन निष्कर्षण इकाई में रखा जाता है जहां गर्मी, आंदोलन और समय की सहायता से एक स्थिर निष्कर्षण किया जाता है। निष्कर्षण के बाद, शीशियों को हेडस्पेस और एचएसपी से पानी को हटाने के लिए एक ठंडे धातु ब्लॉक पर रखा जाता है। HSPs एकत्र कर रहे हैं और जीसी-एमएस पर थर्मल desorption के माध्यम से चलाने के लिए। डेटा ChemStation, DExSI, और R. संक्षेप के साथ विश्लेषण कर रहे हैं: HSP = Headspace Sorbent पेन; जीसी-एमएस = गैस क्रोमैटोग्राफी-मास स्पेक्ट्रोमेट्री। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 2
चित्रा 2: मोनो- और सह-संस्कृतियों का हीटमैप। VOCs 24- और 48-h टाइमपॉइंट्स पर मोनो- और सह-संस्कृतियों से पता लगाया गया। सह-संस्कृतियां प्रत्येक तनाव का प्रतिनिधित्व करने वाले अक्षरों के संयोजन हैं। सभी नमूनों को 200 आरपीएम आंदोलन के साथ 70 डिग्री सेल्सियस पर 1 घंटे के लिए निकाला गया था। हीटमैप तीव्रता मान स्तंभ जेड-स्कोर हैं, जो मेटाबोलाइट द्वारा सामान्यीकृत हैं। Z-स्कोर की गणना मूल्यों के माध्य से मूल्य के अंतर से की गई थी, जिसे मूल्यों के मानक विचलन से विभाजित किया गया था। डेंड्रोग्राम आर के pheatmap समारोह में cluster_cols विकल्प के साथ उत्पन्न किया गया था। डेंड्रोग्राम पदानुक्रमित क्लस्टरिंग का प्रतिनिधित्व करता है जिसमें एक साथ क्लस्टर करने वाले मेटाबोलाइट्स में नमूनों में अधिक समान जेड-स्कोर होते हैं। संक्षेप: A = A. baumanii; P = P. aeruginosa; S = S. aureus; TH = टॉड हेविट मीडिया (नियंत्रण)। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 3
चित्रा 3: एक साथ इनक्यूबेशन और निष्कर्षण के 18 घंटे के दौरान फेकल, लार और सीवेज नमूनों में वाष्पशील अणु द्रव्यमान में 13सी का प्रतिशत रूपांतरण। % रूपांतरण की गणना पूरी तरह से लेबल किए गए यौगिक (एम + एन) के द्रव्यमान को लेकर और इसे (एम + एन) + अनलेबल वाष्पशील द्रव्यमान (एम) के द्रव्यमान से विभाजित करके पूरी तरह से लेबल किए गए यौगिकों के लिए की गई थी, जहां एन संभावित कार्बन ( ए-डी में) या हाइड्रोजन ( ई में) की अधिकतम संख्या है जिसे प्रत्येक वाष्पशील अणु में लेबल किया जा सकता है। यौगिकों को पूरी तरह से लेबल किया जाता है जब वाष्पशील के सभी कार्बन को 13सी द्वारा प्रतिस्थापित किया जाता है। जहां डेटा अनुपलब्ध हैं, वाष्पशील का पता नहीं चला था। उदाहरण के लिए, (डी) में, फेकल या लार के नमूनों में 1-प्रोपेनॉल का पता नहीं चला था। प्रति नमूना प्रतिकृतियों की संख्या = 3. (ए) सभी नमूना प्रकारों (मल, लार और सीवेज) में पाए गए 13सी-लेबल वाले वाष्पशील। (बी) 13सी-लेबल वाले वाष्पशील केवल लार और सीवेज के नमूनों में पाए जाते हैं। (c) मल और लार के नमूनों में पाए गए 13सी-लेबल वाले वाष्पशील। (डी) तीन अलग-अलग नमूना प्रकारों में से एक में पाए गए 13सी-लेबल वाले वाष्पशील। (ई) ड्यूटेरियम-लेबल वाष्पशील अणु। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 4
चित्रा 4: सुसंस्कृत थूक और अस्थिर अणुओं से 13सी-लेबल वाष्पशील का हीटमैप असंस्कृत थूक से पता चला। लेबल किए गए वाष्पशील स्थिर आइसोटोप जांच प्रयोगों से आते हैं जहां 13सी ग्लूकोज और ब्रेन हार्ट इन्फ्यूश़न माध्यम को माइक्रोबियल विकास की खेती करने और सक्रिय वाष्पशील उत्पादन पर कब्जा करने के लिए निष्कर्षण चरण के दौरान थूक में जोड़ा गया था। बिना लेबल वाले वाष्पशील अणुओं को सीधे थूक के नमूनों से पता लगाया गया था। हीटमैप तीव्रता Z-स्कोर हैं जैसा कि चित्र 2 के कैप्शन में वर्णित है। हालांकि, जेड-स्कोर की गणना सुसंस्कृत और असंस्कृत थूक प्रयोगों के लिए प्रत्येक प्रयोग के भीतर की गई थी। डेंड्रोग्राम को चित्र 2 में वर्णित के रूप में उत्पन्न किया गया था। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 5
चित्रा 5: एक साथ इनक्यूबेशन और निष्कर्षण के 18 घंटे के दौरान सिस्टिक फाइब्रोसिस के साथ सात विषयों से थूक के नमूनों में वाष्पशील अणु द्रव्यमान में 13सी का प्रतिशत रूपांतरण। % रूपांतरण की गणना चित्र 3 के कैप्शन में वर्णित के रूप में की गई थी. नमूनों में नहीं पाए गए वाष्पशील डेटा की अनुपस्थिति से संकेत दिए जाते हैं। N = 1-3 (ए) थूक के अधिकांश नमूनों में उच्च प्रतिशत रूपांतरण पर 13सी-लेबल वाले वाष्पशील का पता चला। (बी) थूक के अधिकांश नमूनों में कम प्रतिशत रूपांतरण पर पाए गए 13सी-लेबल वाले वाष्पशील। (ग) थूक के नमूनों के अल्पसंख्यक में कम प्रतिशत रूपांतरण पर पाए गए 13सी-लेबल वाले वाष्पशील। संक्षिप्त रूप: बी = बेसलाइन; E = exacerbation; T = उपचार। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

स्वतंत्रता की डिग्री R2 P मान
असंस्कृत थूक विषय 6 0.33 0.001
नैदानिक राज्य 2 0.01 0.46
विषय: नैदानिक राज्य 12 0.12 0.092
13सी ग्लूकोज और मीडिया के साथ सुसंस्कृत थूक विषय 6 0.51 0.001
नैदानिक राज्य 2 0.02 0.095
विषय: नैदानिक राज्य 12 0.11 0.194

तालिका 1: थूक के नमूनों के विचरण (PERMANOVA) का क्रमपरिवर्तित बहुचर विश्लेषण। PERMANOVA आर में शाकाहारी पैकेज से adonis समारोह का उपयोग कर उत्पन्न किया गया था।

पूरक चित्रा S1: लेबल (एम + एन (अधिकतम)) और बिना लेबल (एम + 0) के सापेक्ष बहुतायत फेकल, लार और सीवेज नमूनों में वाष्पशील। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें।

पूरक चित्रा S2: स्थिर आइसोटोप जांच और असंस्कृत थूक के साथ सुसंस्कृत थूक के गैर-मीट्रिक बहुआयामी स्केलिंग। (ए) 13सी ग्लूकोज और मीडिया के साथ सुसंस्कृत थूक का एनएमडीएस k = 3 आयामों के साथ उत्पन्न किया गया था। तनाव मूल्य 0.07 था। (बी) असंस्कृत थूक का एनएमडीएस k = 3 आयामों के साथ उत्पन्न किया गया था। तनाव मूल्य 0.13 था। संक्षेप: NMDS = गैर-मीट्रिक बहुआयामी स्केलिंग; बी = आधार रेखा; E = exacerbation; T = उपचार। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें।

पूरक चित्रा S3: सिस्टिक फाइब्रोसिस के साथ विषयों से थूक के नमूनों की माइक्रोबियल सामुदायिक संरचना। एक बड़े अध्ययन के हिस्से के रूप में 16S rRNA amplicon अनुक्रमण द्वारा मूल्यांकन किया गया, Carmody et al. 202019 में पाए गए दृष्टिकोण के बारे में अधिक जानकारी। सिस्टिक फाइब्रोसिस वाले विषयों से। प्रत्येक स्टैक्ड बार एक अलग टाइमपॉइंट है। संक्षेप: बी = बेसलाइन, ई = एक्ससेर्बेशन, टी = उपचार। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें।

पूरक चित्रा S4: लेबल (एम + एन (अधिकतम)) और बिना लेबल (एम + 0) की सापेक्ष बहुतायत सिस्टिक फाइब्रोसिस के साथ सात विषयों से थूक के नमूनों में वाष्पशील। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें।

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Discussion

इन विट्रो संस्कृतियों और मानव-संबद्ध नमूनों में वाष्पशील उत्पादन की पहचान करने के लिए, पी. एरुगिनोसा, एस. ऑरियस और ए. बाउमनी के मोनो- और सह-संस्कृतियों का वाष्पशील विश्लेषण किया गया और विभिन्न जैविक नमूनों की स्थिर आइसोटोप जांच की गई। मोनो- और सह-संस्कृतियों के लिए विश्लेषण में, 70 डिग्री सेल्सियस पर 1 घंटे के लिए एक छोटा निष्कर्षण करके वाष्पशील का पता लगाया गया था। मोनो- और सह-संस्कृतियों के वाष्पशील विश्लेषण ने व्यक्तिगत प्रजातियों द्वारा और अन्य प्रजातियों के साथ उनकी बातचीत के दौरान उत्पादित यौगिकों के सर्वेक्षण की अनुमति दी। विभिन्न संस्कृति प्रकारों और समय बिंदुओं में सापेक्ष बहुतायत में अंतर थे। स्थिर आइसोटोप जांच प्रयोगों में, जैविक नमूनों में स्वस्थ विषयों से मल और लार, सीवेज और सिस्टिक फाइब्रोसिस वाले विषयों से थूक शामिल थे। स्थिर आइसोटोप प्रोफाइलिंग ने 37 डिग्री सेल्सियस पर 18 घंटे के लिए निकालने से सक्रिय रूप से उत्पादित वाष्पशील अणुओं की पहचान को सक्षम किया। एक कम तापमान के साथ लंबे निष्कर्षण समय ने जैविक नमूनों में मौजूद रोगाणुओं के विकास और चयापचय को सक्षम किया। 13सी ग्लूकोज और डी 2 ओ संवर्धनकीतुलना करने से पता चला कि लेबल 13सी के साथ अधिक व्यापक आइसोटोप संवर्धन था।

विभिन्न नमूना प्रकारों को निकालते समय, पूर्ण रन शुरू करने से पहले उठाए गए प्रारंभिक अनुकूलन कदम थे। सबसे पहले, एक परीक्षण चलाने के रूप में एक नमूने के विभिन्न संस्करणों का परीक्षण करें। कुछ नमूना प्रकारों के लिए, थूक, उदाहरण के लिए, केवल छोटे नमूना वॉल्यूम उपलब्ध थे। नमूना प्रकार और उपलब्ध नमूना मात्रा के आधार पर पहले कम मात्रा या नमूने की छोटी मात्रा के साथ शुरू करने की सिफारिश की जाती है। एक बड़ी मात्रा या नमूने का बहुत अधिक न निकालें क्योंकि यह स्तंभ को अभिभूत कर सकता है और एचएसपी को दूषित कर सकता है। स्तंभ अधिभार स्पष्ट हो सकता है जब क्रोमैटोग्राम में चोटियां संतृप्त होती हैं या बाद के रन में दिखाई देती हैं। HSP संदूषण तब हुआ है जब HSP GC-MS पर पुन: चलाया जाता है, तो कैरीओवर मौजूद होता है। मोनो- और सह-संस्कृति प्रयोगों में, संस्कृति के 200 μL विभिन्न प्रकार के वाष्पशील का पता लगाने के लिए पर्याप्त था। स्थिर आइसोटोप जांच प्रयोगों में, नमूना प्रकार के आधार पर, प्रत्येक प्रयोग के लिए मात्रा 500 μL से 1 mL तक थी। दूसरा, नमूना प्रकार और ब्याज के यौगिकों के आधार पर, निष्कर्षण समय और तापमान के साथ-साथ जीसी-एमएस और थर्मल desorption विधियों को वाष्पशील पता लगाने का अनुकूलन करने के लिए समायोजित करने की आवश्यकता होगी। इन विधियों को ब्याज और स्तंभ प्रकार के analytes के लिए उपयुक्त होने के लिए निर्धारित किया गया था।

विधि को अनुकूलित करने के बाद, प्रोटोकॉल में महत्वपूर्ण चरण निष्कर्षण से पहले और बाद के चरणों से संबंधित थे। नमूना तैयार करने के दौरान, नमूनों को बर्फ पर रखा गया था ताकि नमूने में मौजूद वाष्पशील बच न सकें। यह सुनिश्चित करना भी महत्वपूर्ण था कि वैक्यूम सील तंग थी, और ढक्कन सुरक्षित रूप से बंद हो गया था। अन्यथा, एक अक्षम निष्कर्षण होगा और नमूने से वाष्पशील का पता लगाने में कमी आएगी। लीक ढक्कन लाइनर या एचएसपी के चारों ओर ओ-रिंग्स से उत्पन्न हो सकता है। यह सुनिश्चित करने के लिए कि शीशी वैक्यूम के तहत थी, निष्कर्षण से पहले एक गेज का उपयोग यह सुनिश्चित करने के लिए किया गया था कि ओ-रिंग अभी भी कार्यात्मक थे। इसके अलावा, निष्कर्षण के बाद, नमूनों को बर्फ के ब्लॉक पर रखा गया था ताकि पानी को एक निर्धारित अवधि के लिए हेडस्पेस से बाहर निकाला जा सके। कॉलम में पानी प्रतिधारण समय में परिवर्तन और एमएस प्रतिक्रिया के दमन का कारण बन सकता है, जिससे गैर-मात्रात्मक परिणाम हो सकते हैं। वैक्यूम आस्तीन / शीशी विधानसभा से हटाने से पहले एचएसपी से किसी भी अतिरिक्त पानी को खींचने की क्षमता वीएएसई प्रक्रिया की बंद प्रणाली प्रकृति के कारण संभव है, और -80 डिग्री सेल्सियस ठंडी प्लेट का उपयोग करके उस निष्कर्षण प्रणाली के भीतर सबसे ठंडे स्थान पर पानी वापस निकालने की क्षमता।

वैकल्पिक तरीकों के संबंध में इन विधियों की सीमाएं और लाभ दोनों हैं। मोनो- और सह-संस्कृति प्रयोगों का मूल्यांकन करते हुए, वाष्पशील हस्ताक्षरों का पता लगाया गया था जो किसी विशेष माइक्रोब या सह-संस्कृति के लिए विशिष्ट थे। समय के साथ वाष्पशील बहुतायत में भी परिवर्तन हुए। विभिन्न प्रकार के जैविक नमूनों में स्थिर आइसोटोप जांच प्रयोगों के लिए, ड्यूटेरियम लेबलिंग के परिणामस्वरूप 13सी ग्लूकोज के रूप में कई आइसोटोप-समृद्ध वाष्पशील नहीं हुए। ड्यूटेरियम के साथ आइसोटोप-समृद्ध वाष्पशील का उत्पादन करने के लिए आवश्यक चयापचय अधिक सीमित हो सकता है। इसके अलावा, माइक्रोबियल विकास को बढ़ाने के लिए जैविक नमूनों में मीडिया को जोड़ा गया था, जिससे माइक्रोबियल सामुदायिक संरचना में परिवर्तन हो सकता है। स्थिर आइसोटोप जांच प्रयोगों की संस्कृति की स्थिति एक जैविक नमूने में कुछ रोगाणुओं के पसंदीदा विकास के लिए चयन कर सकती है। यह 70 डिग्री सेल्सियस पर एक घंटे के लिए छोटे निष्कर्षण का विरोध किया गया था, जो समुदाय के नमूने में वाष्पशील का पता लगाने के लिए डिज़ाइन किया गया था, इससे पहले कि एक या कुछ रोगाणु समुदाय पर लेना शुरू कर दें। फेकल, सीवेज, लार और थूक नमूना प्रकारों की माइक्रोबियल और रासायनिक रचनाओं की जटिलता किसी भी दिए गए माइक्रोबियल या मानव मूल को अनुक्रमण जैसे अतिरिक्त विश्लेषणों के बिना विशिष्ट रासायनिक हस्ताक्षरों को असाइन करना मुश्किल बनाती है। इस विधि ने एक उच्च-थ्रूपुट, विलायक-मुक्त वैक्यूम-निष्कर्षण प्रदान किया जिससे कम मात्रा वाले नमूनों का अधिक संवेदनशील पता लगाया गया। इन प्रयोगों के लिए उपयोग किए जाने वाले वॉल्यूम 200 μL से लेकर 1 मिलीलीटर सुसंस्कृत जैविक नमूनों तक थे। अन्य मामलों में (डेटा नहीं दिखाया गया है), जैविक नमूने (जैसे, थूक और फेकल नमूने) 15 μL या 10 μg के रूप में कम निकाले गए थे।

विधि के भविष्य के अनुप्रयोगों के लिए, नमूना प्रकारों की एक विस्तृत श्रृंखला का विश्लेषण छोटे या सीमित वॉल्यूम के साथ किया जा सकता है। दर्जनों नमूने एक साथ निकाले जा सकते हैं, और रन टाइम विशिष्ट जीसी-एमएस साधन के मापदंडों पर निर्भर करेगा। स्थिर आइसोटोप जांच के मामले में, जब मेटाजीनोमिक अनुक्रमण के साथ युग्मित होता है, तो वाष्पशील अणुओं के उत्पादन के लिए जिम्मेदार रोगाणुओं की पहचान करने की संभावना होती है। जैविक नमूने के मेटाजीनोम को माइक्रोबियल समुदाय संरचना में परिवर्तन की पहचान करने के लिए स्थिर आइसोटोप जांच के साथ निष्कर्षण से पहले और बाद में अनुक्रमित किया जा सकता है। मेटाजीनोमिक अनुक्रमण आइसोटोप समृद्ध वाष्पशील अणुओं के उत्पादन के लिए जिम्मेदार जीन की पहचान की अनुमति देगा। यहां हाइलाइट किए गए नमूना प्रकारों और दृष्टिकोणों के कुछ उदाहरण हैं जिनका उपयोग प्रस्तुत प्रोटोकॉल के लिए इनपुट के रूप में किया जा सकता है, जो पहले से ही विभिन्न उद्योगों में स्थापित किया जा चुका है। क्योंकि वाष्पशील अणु महत्वपूर्ण नैदानिक संकेतक हैं, इसलिए इस प्रोटोकॉल के उपयोग को जैविक प्रयोगशालाओं और नैदानिक स्वास्थ्य देखभाल सेटिंग्स में विस्तारित किया जा सकता है।

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Disclosures

V. L. V. और S. J. .B. D. Entech Instruments Inc. के पूर्व कर्मचारी थे, और K. W. Entech के University Program के सदस्य हैं। J. P., J. K., और C. I. R. के पास घोषित करने के लिए हितों का कोई संघर्ष नहीं है।

Acknowledgments

हम इस पांडुलिपि के सावधानीपूर्वक संपादन के लिए हीथर मौघन और लिंडा एम. कालीकिन को धन्यवाद देते हैं। इस काम को NIH NHLBI (अनुदान 5R01HL136647-04) द्वारा समर्थित किया गया था।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
13C glucose Sigma-Aldrich 389374-1G
2-Stg Diaph Pump Entech Instruments 01-10-20030
20 mL VOA vials Fisher Scientific 5719110
24 mm Black Caps with hole, no septum Entech Instruments 01-39-76044B holds lid liner in place on vial
24 mm vial liner for sorbent pens Entech Instruments SP-L024S allows pens to make a vacuum seal at top of vial
5600 Sorbent pen extraction unit (SPEU) Entech Instruments 5600-SPES 5600 Sorbent Pen Extraction Unit -120 VAC
96-well assay plates Genesee 25-224
Brain Heart Infusion (BHI) media Sigma-Aldrich 53286-500G
ChemStation Stofware Agilent
DB-624 column Agilent 122-1364E 60 m, 0.25 mm ID, 1.40 micron film thickness, in GC-MS
Deuterium oxide Sigma-Aldrich 151882-1L
Dexsi sofware Dexsi (open source)
GC-MS (7890A GC and 5975C inert XL MSD with Triple-Axis Detector) Agilent 7890A GC and 5975C inert XL MSD with triple-axis detector
Headspace Bundle HS-B01, 120VA Entech Instruments SP-HS-B01 Items for running headspace extraction included in bundle
Headspace sorbent pen (HSP) - blank Entech Instruments SP-HS-0
Headspace sorbent pen (HSP) Tenax TA (35/60 Mesh) Entech Instruments SP-HS-T3560
Microcentrifuge tubes (2 mL) VWR 53550-792
O-rings Entech Instruments SP-OR-L024
Sample Preparation Rail Entech Instruments
Sorbent pen thermal conditioner Entech Instruments 3801-SPTC
Todd Hewitt (TH) media Sigma T1438-500G

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References

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जैव रसायन अंक 184 वाष्पशील कार्बनिक यौगिकों जीसी-एमएस वैक्यूम सहायता प्राप्त सॉर्बेंट निष्कर्षण हेडस्पेस निष्कर्षण नैदानिक नमूने स्थिर आइसोटोप जांच
वैक्यूम-असिस्टेड सॉर्बेंट निष्कर्षण के साथ मानव-संबद्ध नमूनों से सक्रिय रूप से उत्पादित माइक्रोबियल वाष्पशील कार्बनिक यौगिकों पर कब्जा करना
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Phan, J., Kapcia III, J., Rodriguez, C. I., Vogel, V. L., Cardin, D. B., Dunham, S. J. B., Whiteson, K. Capturing Actively Produced Microbial Volatile Organic Compounds from Human-Associated Samples with Vacuum-Assisted Sorbent Extraction. J. Vis. Exp. (184), e62547, doi:10.3791/62547 (2022).

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