Summary
このプロトコルは、真空支援吸着剤抽出法、Entechサンプル調製レールを使用した質量分析と組み合わせたガスクロマトグラフィー、およびデータ分析による生体サンプルからの揮発性有機化合物の抽出を記述しています。また、生物学的サンプルの培養および安定同位体プロービングについても記載する。
Abstract
生体試料由来の揮発性有機化合物(VOC)は起源不明です。VOCは、宿主または宿主の微生物群集内からの異なる生物に由来する可能性がある。微生物VOCの起源を解きほぐすために、 黄色ブドウ球菌、緑膿菌 、および アシネトバクター・バウマンニの細菌単培養および共培養物の揮発性ヘッドスペース分析、ならびに糞便、唾液、下水、および痰の生物学的サンプルにおける安定同位体プロービングが行われた。単一培養および共培養物を使用して、個々の細菌種からの揮発性産生を同定するか、または安定同位体プロービングと組み合わせて、生物学的サンプルからの微生物の活性代謝を同定した。
VOCsを抽出するために真空支援吸着剤抽出(VASE)が用いられた。VASEは、半揮発性および揮発性化合物用の使いやすく、商業化された無溶媒ヘッドスペース抽出法です。抽出時に使用される溶媒の不足および真空に近い条件により、 tert-ブチル化および固相マイクロ抽出などの他の抽出オプションと比較して、方法の開発が比較的容易かつ迅速に行われる。ここで説明するワークフローは、単一および共同カルチャからの特定の揮発性シグネチャを識別するために使用されました。さらに、ヒト関連生物試料の安定同位体プロービングの分析により、一般的または一意に産生されたVOCが同定された。本稿では、VASEの一般的なワークフローと実験的考察を、生きた微生物培養物の安定同位体プロービングと併せて提示する。
Introduction
揮発性有機化合物(VOC)は、すべての生物から放出され、異なる微生物が固有のVOCシグネチャを有するため、細菌の検出と同定に大きな期待を寄せています。揮発性分子は、嚢胞性線維症(CF)を有する被験者と健常対照者5,6を区別することに加えて、慢性閉塞性肺疾患1、尿中結核2、人工呼吸器関連肺炎4を含む様々な呼吸器感染症を検出するための非侵襲的測定として利用されている。揮発性シグネチャは、CFにおける特定の病原体感染(黄色ブドウ球菌7、緑膿菌8、9、および黄色ブドウ球菌対緑膿菌10)を区別するためにも使用されている。 しかし、このような生物学的サンプルの複雑さにより、特定のVOCの発生源を特定することはしばしば困難である。
複数の感染微生物から揮発性プロファイルを解きほぐすための1つの戦略は、単一培養および共培養11の両方において微生物のヘッドスペース分析を行うことである。ヘッドスペース分析は、サンプル自体に埋め込まれた分析物ではなく、サンプルの上の「ヘッドスペース」に放出される分析種を調べます。微生物代謝産物は、複雑な臨床サンプル中の微生物代謝産物の起源を決定することが困難であるため、単一培養においてしばしば特徴付けられてきた。細菌単一培養物から揮発性物質をプロファイリングすることにより、微生物が インビトロで 産生する揮発性物質の種類は、その揮発性レパトアのベースラインを表し得る。細菌培養物を組み合わせること、 例えば、共培養物を作成し、産生される揮発性分子をプロファイリングすることは、細菌12間の相互作用または交配を明らかにし得る。
揮発性分子の微生物起源を同定するための別の戦略は、安定同位体で標識された栄養源を提供することである。安定同位体は、中性子の数が異なる天然に存在する非放射性の原子です。動物13の活性代謝を追跡するために1930年代初頭から利用されてきた戦略では、微生物は標識された栄養源から摂食し、安定同位体を代謝経路に組み込んでいる。より最近では、重水(D2O)の形態の安定同位体が、臨床CF喀痰試料14において代謝的に活性な黄色ブドウ球菌を同定するために使用されている。別の例では、13C標識グルコースが、緑膿菌のCF臨床分離株とRothia mucilaginosaとの間の代謝産物の交差摂食を実証するために用いられている12。
質量分析技術の進歩に伴い、揮発性の手がかりを検出する方法は、定性的な観察からより定量的な測定に移行しました。ガスクロマトグラフィー質量分析(GC-MS)を使用することにより、生物学的サンプルの処理は、ほとんどの実験室または臨床現場で手の届くところにあります。揮発性分子を調査する多くの方法は、汚染を検出するために、食品、細菌培養物、およびその他の生物学的サンプル、および空気および水などのサンプルをプロファイルするために使用されてきた。しかし、ハイスループットで揮発性サンプリングを行ういくつかの一般的な方法は、溶媒を必要とし、真空抽出によって提供される利点では実行されません。さらに、分析には、より大きな量または量(0.5mLを超える)のサンプリングされた材料がしばしば必要とされますが、これは基質固有であり、サンプルタイプおよび方法ごとに最適化する必要があります。
ここでは、真空支援吸着剤抽出(VASE)とそれに続くGC-MSでの熱脱着を用いて、細菌の単一培養物および共培養物の揮発性プロファイルを調査し、ヒト糞便、唾液、下水、および喀痰サンプルから安定同位体プロービングで積極的に産生された揮発性物質を同定した(図1)。限られたサンプル量で、VOCはわずか15μLの喀痰から抽出されました。ヒト試料を用いた同位体プロービング実験では、微生物群集の増殖を培養するために、13Cグルコースなどの安定同位体源と培地を添加する必要があった。揮発分の活性産生は、GC−MSによってより重い分子として同定された。静的真空下での揮発性分子の抽出により、揮発性分子の検出が感度が向上しました20,21,22。
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Protocol
1. ヘッドスペース吸着ペン(HSP)とサンプル分析の考慮事項
注:吸着剤テナックスTAを含むHSPは、広範囲の揮発性物質を捕捉するために選択された。テナックスは、他の吸着剤と比較して水に対する親和性が低いため、水分の高いサンプルからより多くのVOCを捕捉することができます。テナックスはまた、不純物のレベルが低く、再利用のために調整することができます。吸着剤の選択もGC-MSに設置したカラムを考慮して行われました( 材料表参照)。
- サンプル抽出に使用したのと同じ条件でメディアおよび/またはサンプルブランクを抽出することによって、ネガティブコントロールを生成します。
- 抽出されたサンプルを分析する前に、GC-MS上のブランクHSP(以前にクリーンで有意なバックグラウンドがないことが以前に確認された)を分析します。サンプルタイプ間でブランクを実行します(例えば、細菌の単一培養の3回の反復、ブランク、細菌の共培養の3回の反復、ブランクなど)。
- サンプルの抽出と分析の前に、香りのよいパーソナルケアアイテムの使用や臭いのする食品の消費を制限してください。理想的には、アルコールまたは他の揮発性クリーナーによって少なくとも30分間洗浄されていないバイオセーフティフードにサンプルを調製する。サンプル調製の前に、バイオセーフティフード内の空気の流れを30〜60分間オンにします。
- サンプル調製中の揮発性放出を制限するために、サンプルを氷上に保管してください。
2. 単一および共培養の調製
- バイオセーフティフード内で、 A. baumannii、黄色ブドウ球菌、 および 緑膿菌 の培養物をトッド・ヒューイット増殖培地に接種する。200rpmの攪拌で37°Cで一晩インキュベートする。
- 一晩のインキュベーションの後、バイオセーフティフード内で培養ハンドリングを行う。各培養物を500nmで光学密度0.05に希釈する。
- 共培養物を等分に混合し、200 μLのコントロール培地、モノ、または共培養を96ウェルプレートの各ウェルにピペットで混合し、37°Cのインキュベーターに24時間置いた。48時間インキュベーション用の第2プレートを準備する。
- インキュベーション期間の終わりに、セクション4で抽出用のサンプルを準備します。ピペット液体培養物を微量遠心チューブに入れ、-80°Cで保存した。
注: この時点で、サンプルは -80 °C で保存して、必要に応じて後で抽出できます。
3. 生体試料調製における安定同位体プロービング
注:糞便および唾液サンプルは、カリフォルニア大学アーバイン治験審査委員会(HS#2017-3867)の承認を得て、匿名のドナーから寄付されました。下水はカリフォルニア州サンディエゴから来ました。喀痰サンプルは、ミシガン大学医学部治験審査委員会(HUM00037056)によって承認されたより大きな研究の一環として、嚢胞性線維症の被験者から収集された。
- バイオセーフティフード内のすべての生物学的サンプル調製を行う。
- 糞便サンプルを調製するには、1.5mL微量遠心管内の100mgの糞便に1mLの脱イオン水を加え、3分間渦巻き込む。使用していないときは氷の上に置きます。
- 15 μL の糞便と水の混合物に、20 mM 13C グルコースを含む 485 μL のブレインハート注入 (BHI) 培地、または BHI と 30% 重水素 (D2O) を加えます。サンプルの最終容量が 500 μL であることを確認します。サンプルを技術的な 3 連で準備します。
- 下水サンプルを調製するには、500 μL の下水を 20 mM 13 C グルコースを含む BHI 500 μL に、または BHIを 30% D2O と共に 1 mL の総量で加えます。サンプルを3連で準備する。使用していないときは氷の上に置きます。
- 唾液サンプルを調製するには、20 mM 13Cグルコースを含む500 μLのBHIに50 μLの唾液を加え、30%D2 Oを含むBHIを350 μLの総容量で加えます。使用していないときは氷の上に置きます。
- 培養前後の試料中に存在する揮発分を比較するために喀痰試料を調製するには、15μLの喀痰で最初の抽出を行う。サンプルを3連で準備する。使用していないときは氷の上に置きます。試料抽出用のセクション4に進み、200rpmの攪拌で37°Cで18時間抽出する。
- 未培養の喀痰サンプルの最初の抽出の終了後、バイアルを喀痰と共に保存する。3.5.1からの痰でバイアルに20mM 13Cグルコースを含む500μLの BHIを加える。使用していないときは氷の上に置きます。
- 糞便サンプルを調製するには、1.5mL微量遠心管内の100mgの糞便に1mLの脱イオン水を加え、3分間渦巻き込む。使用していないときは氷の上に置きます。
- サンプル抽出のセクション 4 に進みます。
4. サンプル抽出
- 空の揮発性有機分析(VOA)バイアル(20mL)をコールドプレートの上に置き、コールドプレートをバイオセーフティフードの氷の上に置きます。
- 5600吸着ペン抽出ユニット(SPEU)の電源を入れ、各方法の必要に応じて所望の温度に調整します。
注:37°Cでの安定同位体プロービング実験の場合、設定値に達するには最大15分かかることがあります。70 °C での単一および共培養実験の場合、設定値に達するまでに最大 60 分かかることがあります。 - メディアまたはサンプル コントロールの HSP を含め、準備されたサンプルの数に等しいクリーンな HSP を収集します。
- 20 mL VOA バイアルを、必要に応じてサンプル、複製、および HSP ID に従ってラベル付けします。氷の上にいる間にバイアルの外側に結露が形成された場合に備えて、水に抵抗するマーカーを使用してください。
- バイオセーフティフードの内側で、バイアルの白いキャップのネジを外し、サンプルをバイアルに素早くピペッティングし、黒いキャップ、蓋ライナー、HSPを組み立てます。
注:サンプルはHSPと接触してはならず、サンプル量はサンプルの種類によって異なります。 - サンプルとHSPを含むバイアルをコールドプレートに戻します。
- サンプルごとに手順 4.5 と 4.6 を繰り返します。これらの手順を一度にすべて実行するのではなく、サンプルごとに実行して、サンプルの温暖化を防ぎ、したがって、揮発性の早期放出を防ぎます。
- すべてのサンプルをガラスバイアルに調製したら、ベンチのバイオセーフティフードの外で次の手順を実行します。真空ポンプの電源を入れ、バイアルを30mmHgの真空下に置き、真空源を取り外します。
注:バイアルは、真空の適用が完了した後、コールドトレイ上にある必要はありません。 - 圧力計を使用してすべてのサンプルを真空下に置いた後、圧力を再確認してください。バイアルに漏れがある場合は、キャップがしっかりとねじ込まれていること、およびHSPライナーと蓋ライナーの白いOリングが正しく所定の位置にあることを確認してください。
注:シールが損なわれると、真空下のバイアルと比較して揮発性検出が低下する可能性があります。 - バイアルをSPEUに入れ、200rpmでの攪拌で時間と温度を最適化します。培養物を70°Cで1時間抽出する。 糞便、下水、唾液、および喀痰サンプルで安定同位体プロービング実験を37°Cで18時間抽出する。
- 抽出期間が完了した後に使用するために-80°Cにコールドプレートを置く。
- 抽出が完了したら、サンプルをコールドプレート上に15分間置き、HSPとバイアルヘッドスペースから水蒸気を引き出します。
- HSPをスリーブに移します。
注:実験は、HSPからより揮発性の高い化合物を失う前に、室温で最大1週間ここで一時停止することができます。
5. ガスクロマトグラフィーでサンプルを分析する - 質量分析計(GC-MS)
- 次のGC-MS( 材料表を参照)設定を使用します:5分保持で35°C、170°Cまで10°C/分のランプ、20:1の分割比で38分の合計実行時間で230°Cまで15°C/分のランプ。
- 脱着方法を次のように設定します:2分間、70°C予熱;2分間260°C脱着;34分、260°Cベークアウト;2分間、70°Cポストベークした。
- サンプルのシーケンスを設定し、インストルメンテーションに従って実行を開始します。
- Entechソフトウェアでシーケンスを設定するには、プログラムを開きます。計測器ドロップダウンメニューの右側にあるオプションで、[ 5800 |シーケンス。
- Entechソフトウェアのシーケンステーブルは、GC-MSソフトウェアの場合と同様に観察します。[サンプル ID] 列に、現在のdate_vial番号に従って名前を付けます。Name は GC-MS シーケンステーブルの Name に類似しており、5800 Method は温度ランプの速度、保持時間などを決定します (メニューが開き、ステップ 5.2 で生成されたメソッドが選択されます)。
- [トレイ] 列と [位置] 列は、サンプル調製レール (SPR) が HSP を拾う場所を決定することに注意してください。
- すぐ左にそれぞれ30個のスポットがある2つのトレイを観察し、それぞれ5つのスポットを持つ6つの列としてレイアウトします。最も左側でユーザー(手前)に最も近いトレイ位置は位置1であり、右端、最も遠いトレイ位置は位置30です。
- これらのトレイは HSP A または B であり、HSP B は SPR に近いトレイ(最も内側のトレイ)であり、HSP B のすぐ後ろは HSP ブランクであることに注意してください。抽出したサンプルをトレイに置き、それに応じてシーケンス上のスポットを選択します。
- シーケンステーブルを保存し、左側の「 実行 」を選択してから、ブランクの HSP がデ ソーバーにある場合は、デソーバー でブランクから開始します (黄色のラベルでマークされた HSP で示されます)。
- HSPは、シーケンス内の各サンプルについてSPRによって処理されることに注意してください。SPRをウォームアップさせると、空白がデソーバにあるかどうかを確認するメッセージが画面の上部に表示されます。[ スキップ ]をクリックして、ペンがあることを確認します。SPR がすべてのサンプルを自動的に実行できるようにすると、GC-MS 側のシーケンスによってデータが自動的に別々のファイルに記録されます。
6. データ解析
- GC-MSソフトウェアの品質フィルタデータ(材料表)。
- クロマトグラム上の各ピークを確認し、米国国立標準技術研究所(NIST)ライブラリ(または利用可能な別のライブラリ)と一致するピークに注釈を付けます。
- アノテーション付きクロマトグラムピークを処理方法に追加します。75% を超える確率を持つ化合物を含むようにピークを選択するための基準を設定し、化合物の各識別イオンのアライメントがピークの中心内にあることを確認します。
- 処理方法にピークを追加するには、[ |のキャリブレーション] を選択します。複合|の編集名前の| 外部標準コンパウン ドの下にコンパウンドを挿入します。化合物の名前、保持時間、量子シグナル ターゲットイオンを追加します。3 つの最大のピークを追加します。保存するには、[OK] | を選択します。 メソッド|保存します。
- プロセス方法を設定したら、 定量化に進み||の計算と 表示QEdit Quant Result.
- 各コンパウンドを調べて、ピークが予想される保持時間と一致し、バックグラウンドノイズを超えていることを確認します。
- QEdit が完了したら、[ |の終了] を選択します。はい、 QEditsを保存してメインのクロマトグラムに戻ります。左側のファイルを開いて、領域統合をエクスポートします。 定量|の選択レポートの生成。
- DExSI で使用するためにファイルをエクスポートするには、[ファイル|] を選択します。 データを AIA 形式にエクスポートする |[新しいディレクトリを作成] を選択し、ファイルの場所を選択するか、[既存のディレクトリを使用] を選択します。
- エクスポートするファイルを選択するための新しいウィンドウが開きます。ファイルをウィンドウの右側に移動し、[ プロセス]をクリックします。変換されるファイルの数に応じて数秒から数分待ちます。
- DExSIソフトウェア(https://github.com/DExSI/DExSI)の指示に従ってDExSIの同位体存在量を補正し、好きなソフトウェアやプログラム(Rなど)で解析を行います。図の生成に使用されるスクリプトは、https://github.com/joannlp/ VOC_SIP
にあります。
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Representative Results
黄色ブドウ球菌、緑膿菌、A.バウマンニの単一および共培養
単一および共培養は、細菌種 S. aureus、P. aeruginosa、 および A. baumanniiで構成されていた。これらは、ヒトの創傷および慢性感染症に見られる一般的な日和見病原体である。モノカルチャーおよび共培養物中に存在する揮発性分子を同定するために、200rpmの攪拌で70°Cで短い1時間の抽出を行った。24時間および48時間の時点における単一および共培養から、43個の注釈付き揮発性分子が検出され(図2)、その中にはアルデヒド、ケトン、アルコール、硫酸化合物、炭化水素、カルボン酸またはエステル、および芳香族化合物が含まれていた。特定の時点で特定の単一または共培養でのみ検出された少数の揮発性分子があった。例えば、アセトインおよび3-ヒドロキシ-2-ブタノンアセテートは、48時間時点の 黄色ブドウ球菌 培養物においてのみ検出された(図2)。
揮発性1−プロパノール2−メチルは、緑膿菌とA.バウマンニの共培養においてのみ48時間で検出された(図2)。酢酸エチルは、黄色ブドウ球菌または緑膿菌のいずれかとのA. baumannii共培養物中に48時間で存在した(図2)。代謝産物ヘプタン、2,3−ジメチルおよびペンタン、2−メチルは、24時間でA.バウマンニ培養においてのみ検出された(図2)。アセトアルデヒドおよびエタノールは、24時間時点におけるA. baumanniiおよび黄色ブドウ球菌の共培養において、培養単独における48時間およびいずれかの菌株と比較して、より高い相対存在量を有した(図2)。揮発性物質の一部は、24時間または48時間の時点で培養物においてより豊富であった。酢酸、ブタン酸、プロパン酸を含む短鎖脂肪酸は、48時間の培養では相対的存在量が高かったが、24時間の培養では検出されなかった(図2)。ヘキサンは、48時間と比較して24時間でTH対照においてより豊富であった(図2)。
糞便、下水、唾液サンプルの安定同位体標識
生物学的試料からの揮発性分子の活性産生を同定するために、標識栄養源、13CグルコースまたはD2O、および培地を添加して、微生物群集の増殖を支持した。1つのユニークなサンプルを、糞便、下水、および唾液サンプルの異なるサンプルタイプのそれぞれから3連で分析した。重水素(図3E)との取り込みと比較して、完全に標識された揮発性分子への13Cの取り込み(図3A-D)が多かった。13Cを2-ブタノン、3-ヒドロキシに組み込んだ;2,3-ブタンジオン;酢酸;すべての糞便、下水、および唾液サンプルのフェノール(図3A)。
他の標識揮発性物質は、2つまたは1つのサンプルタイプのいずれかで検出された。例えば、アセトン、ブタン酸、およびプロパン酸は、唾液および下水中で標識されたものとして検出された(図3B)。標識された揮発性物質、ジメチルトリスルフィドおよびジメチルジスルフィドは、糞便および唾液サンプルの両方で富化されました(図3C)。揮発分、1-プロパノール、2-ブタノン、ベンゾフェノン、エタノール、およびメチルチオールアセテートは、下水でのみ濃縮された(図3D)。標識された揮発性の2,3-ペンタンドインは、唾液中で富化されていた(図3D)。重水素は揮発性物質、酢酸に取り込まれた。ベンズアルデヒド、4-メチル;ジメチルトリスルフィド;フェノールは、唾液または下水サンプルのいずれかに由来する(図3E)。同位体富化揮発分に加えて、組み込まれた安定同位体を含まない揮発分が検出された。例えば、ピラジン、2,5-ジメチルを除くピラジン化合物は、糞便、下水、および唾液サンプルで検出されたが、 13°Cで完全に濃縮されなかった(補足図S1)。
喀痰サンプルの安定同位体標識
安定同位体標識戦略は、嚢胞性線維症を有する7人のヒト被験者からの喀痰サンプルで積極的に産生された揮発性物質を同定するために実施された。試料中の揮発分を、安定同位体標識で培養した試料から出現したものと比較した。各試料の各揮発性成分を2回分析した: 13Cグルコースおよび培地による安定同位体プロービングの前後。被験者から収集されたサンプルは、3つの異なる時点または臨床状態にまたがっていた:ベースライン、悪化、および治療23。培養喀痰サンプル中で標識として検出された揮発性物質は、未培養喀痰サンプルからの非標識揮発性物質と比較して、異なる相対存在量を有していた。喀痰を用いた安定同位体プロービング実験における培養条件は、特定の微生物の増殖に有利に働き、未培養の喀痰サンプルと比較して揮発性物質の相対的存在量に差をもたらす可能性がある。
例えば、酢酸、ジメチルトリスルフィド、アセトン、およびプロパナール、2-メチルは、未培養の喀痰サンプルと比較して、培養喀痰サンプルにおいてより豊富であった(図4)。バックグラウンドルーム空気中に可変量で存在し得る13C標識エタノールを検出することは、エタノールが13Cグルコースからの微生物代謝によって積極的に産生されたという証拠を提供する。変動量は、順列多変量分散分析(PERMANOVA)によって評価された被験者によって説明され、2つの異なる揮発性データセットについても異なっていた(表1および補足図S2)。13C標識培養喀痰について、変動の51%が被験者によって説明され、変動の33%が非培養喀痰サンプル中の揮発分から被験者によって説明された(表1)。7人の被験者からの16S rRNAアンプリコンシーケンシングによって決定されたマイクロバイオームコミュニティ組成は、各被験者に固有であり(補足図S3)、個々のシグネチャは、検出された培養および未培養の喀痰揮発性分子の両方にも反映された。
培養された喀痰において、13個の炭素で完全に標識された 23個の揮発分が検出された。喀痰サンプルから検出された同位体富化(活性)揮発分は、被験者ごとに異なっていた。7人の被験者全員からの喀痰サンプルで検出された同位体濃縮を伴う揮発性物質は、2,3-ブタンジオンであった。酢酸;アセトン;ジメチルトリスルフィド;ジスルフィド、ジメチル;ピラジンと、2,5-ジメチルとを含む(図5)。これらの揮発性物質は全ての被験者において検出されたが、各被験者について同位体濃縮度は変化した。被験者7からのサンプルは、他の6人の被験者と比較してジスルフィドジメチルの同位体富化が高かった(図5B)。アセトンは被験者4および6において高かった(図5)。いくつかの揮発性物質は、特定の被験者においてのみ 13°Cで濃縮された。例えば、1−ブタノール、3−メチルおよびプロパン酸、2−メチルは、対象2からの試料のサブセットにおいてのみ富化されていた(図5)。同位体富化揮発分に加えて、同じ培養喀痰から標識されていない揮発性物質も検出した(補足図S4)。揮発性物質2-ピペリジノン;ベンズアルデヒド、4-メチル;ベンゾチアゾール;ブタン酸、3-メチル;ヘキサナール;ヘキサン;イソプロピルアルコール;フェノール;プロパン酸、2-メチル;ピロロ-1,2-アピラジン-1,4-ジオンと、ヘキサヒドロは喀痰試料中に検出されたが、同位体富化されなかった(補足図S4)。
図1:プロトコル回路図 生物学的サンプルをガラスバイアルに入れ、蓋ライナーとヘッドスペース吸着ペンで組み立てます。約30mmHgの圧力に達するまでバイアルに真空を適用する。真空源が除去され、バイアルが吸着ペン抽出ユニットに入れられ、そこで熱、攪拌、および時間の助けを借りて静的抽出が行われる。抽出後、バイアルを冷たい金属ブロックの上に置き、ヘッドスペースおよびHSPから水を除去する。HSPは収集され、GC-MS上の熱脱着を介して実行されます。データは、ChemStation、DExSI、およびR.略語で分析されます:HSP = ヘッドスペース吸着ペン。GC-MS = ガスクロマトグラフィー質量分析。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図2:単一および共培養のヒートマップ。VOCは、24時間および48時間の時点で単一および共培養から検出されました。共培養とは、各菌株を表す文字の組み合わせです。全ての試料を200rpmの攪拌で70°Cで1時間抽出した。ヒートマップ強度値は列Zスコアで、代謝産物で正規化されています。Zスコアは、値の平均との値の差を値の標準偏差で割って計算しました。樹状図は、R のフィートマップ関数の cluster_cols オプションを使用して生成されました。樹状図は階層的なクラスタリングを表し、一緒にクラスター化する代謝産物はサンプル間でより類似したZスコアを持ちます。略語: A = A. バウマニイ;P = P. 緑膿;S = 黄色ブドウ球菌; TH = トッド・ヒューイット・メディア (コントロール)。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図3:18時間の同時インキュベーションおよび抽出中の糞便、唾液、および下水サンプル中の 13°Cの揮発性分子塊への変換率。 完全標識化合物の%転化率は、完全標識化合物の質量(M + N)を(M + N)+標識されていない揮発性質量(M)の質量で割ることによって完全に標識された化合物について計算された(ここで、Nは各揮発性分子において標識され得る炭素( A-D中)または水素( E中)の最大数である。化合物は、揮発性の全ての炭素が 13Cで置き換えられると完全に標識されていると考えられる。データが欠落している場合、揮発性は検出されませんでした。例えば、(D)では、1-プロパノールは糞便または唾液試料中に検出されなかった。サンプルあたりの反復数 = 3。(A)すべてのサンプルタイプ(糞便、唾液、および下水)で検出された 13個のC標識揮発性物質。(B)唾液および下水サンプルでのみ検出された 13個のC標識揮発性物質。(c)糞便および唾液サンプル中に検出された 13個のC標識揮発分。(D)3つの異なるサンプルタイプのうちの1つで検出された 13個のC標識揮発分。(e)重水素標識揮発性分子。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図4:培養喀痰から検出された 13個のC標識揮発性物質と未培養喀痰から検出された揮発性分子のヒートマップ。 標識された揮発性物質は、微生物の増殖を培養し、活発な揮発性生産を捕捉するために、抽出ステップ中に 13Cグルコースおよびブレインハート注入培地を喀痰に添加した安定同位体プロービング実験に由来する。標識されていない揮発性分子を喀痰サンプルから直接検出した。ヒートマップの強度は、 図 2 のキャプションで説明されているように Z スコアです。しかしながら、Zスコアは、培養および非培養喀痰実験について各実験内で計算された。樹状図は、 図 2 に示すように生成されました。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図5:18時間の同時インキュベーションおよび抽出中の嚢胞性線維症を有する7人の被験者からの喀痰サンプル中の 13Cの揮発性分子塊へのパーセント変換。 % 変換は、 図 3 のキャプションに示されているように計算されました。サンプル中に検出されない揮発性物質は、データの欠如によって示される。N = 1〜3。(A) 13個のC標識揮発性物質が、大多数の喀痰サンプルにおいてより高い転化率で検出された。(B) 13個のC標識揮発分が、大部分の喀痰サンプルにおいて低い転化率で検出された。(C)少数の喀痰サンプルにおいてより低いパーセント変換で検出された 13個のC標識揮発性物質。略語: B = ベースライン;E = 悪化;T = 治療。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
| 自由度 | R2 · | P値 | ||
| 未培養の痰 | 件名 | 6 | 0.33 | 0.001 |
| 臨床状態 | 2 | 0.01 | 0.46 | |
| 件名: 臨床状態 | 12 | 0.12 | 0.092 | |
| 13Cグルコースおよび培地による培養痰 | 件名 | 6 | 0.51 | 0.001 |
| 臨床状態 | 2 | 0.02 | 0.095 | |
| 件名: 臨床状態 | 12 | 0.11 | 0.194 |
表1:喀痰サンプルの順列多変量分散分析(PERMANOVA) PERMANOVAは、Rのビーガンパッケージのアドニス関数を使用して生成されました。
補足図S1:糞便、唾液、および下水サンプルにわたる標識(M + N(max))および標識されていない(M + 0)揮発性物質の相対的存在量。このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。
補足図S2:安定同位体プロービングおよび未培養喀痰を用いた培養喀痰の非メートル多次元スケーリング。 (a) 13Cグルコース及び培地で培養した喀痰のNMDSをk=3次元で生成した。応力値は0.07であった。(b)未培養の喀痰のNMDSをk=3次元で生成した。応力値は0.13であった。略語: NMDS = 非メトリック多次元スケーリング;B = ベースライン;E = 悪化;T = 治療。 このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。
補足図S3:嚢胞性線維症を有する被験者からの喀痰サンプルの微生物群集組成。 より大きな研究の一環として16S rRNAアンプリコンシーケンシングによって評価された、アプローチに関するさらなる情報はCarmody et al. 202019に見出された。嚢胞性線維症を有する被験者から。各積み上げ棒グラフは異なるタイムポイントです。略語:B = ベースライン、E = 悪化、T = 治療。 このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。
補足図S4:嚢胞性線維症を有する7人の被験者からの喀痰サンプルにわたる標識(M + N(max))および非標識(M + 0)揮発性物質の相対的存在量。このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。
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Discussion
インビトロ培養物およびヒト関連サンプルにおける揮発性産生を同定するために、緑膿菌、黄色ブドウ球菌、およびA.バウマニイの単一および共培養物の揮発性分析、ならびに異なる生物学的サンプルの安定同位体プロービングが行われた。モノ培養および共培養についての分析において、揮発分は、70°Cで1時間の短い抽出を行うことにより検出された。 単一および共培養の揮発性分析により、個々の種によって、および他の種との相互作用中に産生される化合物の調査が可能になった。異なる文化タイプと時間ポイント間で相対的な豊富さに違いがありました。安定同位体プロービング実験では、生体試料には健常者由来の糞便や唾液、嚢胞性線維症の被験者由来の下水や痰が含まれていた。安定同位体プロファイリングにより、37°Cで18時間抽出することにより、活発に生成した揮発性分子の同定が可能となりました。 より低い温度での長い抽出時間は、生物学的サンプル中に存在する微生物の増殖および代謝を可能にした。13CグルコースおよびD2O富化物を比較すると、標識された13Cを有するより広範な同位体富化が存在することが示された。
異なるサンプルタイプを抽出する場合、フルランを開始する前に最初に最適化手順が取られました。まず、サンプルの異なるボリュームを試運転としてテストします。いくつかのサンプルタイプでは、例えば、喀痰は、少数のサンプル量しか利用できなかった。サンプルの種類と利用可能なサンプル量に応じて、まず少量のサンプルまたは少量のサンプルから始めることをお勧めします。大量のサンプルや大量のサンプルを抽出すると、カラムが圧倒され、HSP が汚染される可能性があるため、抽出しないでください。カラムの過負荷は、クロマトグラムのピークが飽和しているか、後続の実行で現れると明らかになります。HSPがGC-MS上で再実行されたときにキャリーオーバーが存在すると、HSP汚染が発生しています。単一培養および共培養実験では、200μLの培養物が様々な揮発性物質を検出するのに十分であった。安定同位体プロービング実験では、サンプルの種類に応じて、各実験の容量は500μLから1mLの範囲であった。第2に、サンプルの種類と目的の化合物に応じて、抽出時間と温度、GC-MSおよび熱脱着方法を調整して、揮発性検出を最適化する必要があります。これらの方法は、目的の分析種およびカラムタイプに適していると判断した。
方法を最適化した後、プロトコルの重要なステップは、抽出の前後のステップに関係していました。試料調製中、試料中に存在する揮発分が逃げないように、試料を氷上に置いた。また、真空シールがきつく、蓋がしっかりと閉じていることを確認することも重要でした。さもなければ、非効率的な抽出があり、サンプルからの揮発性物質の検出が減少するであろう。漏れは、蓋ライナーまたはHSPの周りのOリングから発生する可能性があります。バイアルが真空下にあることを確認するために、抽出前にゲージを使用して、Oリングがまだ機能していることを確認しました。さらに、抽出後、試料を氷ブロック上に置き、決定された期間、ヘッドスペースから水を引き抜いた。カラム内の水は、保持時間の変化およびMS応答の抑制をもたらし、それによって非定量的な結果をもたらす可能性がある。真空スリーブ/バイアルアセンブリから除去する前にHSPから余分な水を引き出す能力は、VASEプロセスの閉鎖系の性質と、-80°Cのコールドプレートを使用して抽出システム内の最も寒い場所に水を抽出する能力のために可能です。
代替方法に関して、これらの方法には制限と利点の両方があります。単一および共培養実験を評価すると、特定の微生物または共培養に特異的であった揮発性シグネチャが検出されました。また、時間の経過とともに揮発性の豊富さにも変化がありました。異なるタイプの生物学的試料における安定同位体プロービング実験に関しては、重水素標識は 13Cグルコースほど多くの同位体富化揮発性物質をもたらさなかった。重水素で同位体富化揮発性物質を生成するために必要な代謝は、より限定的であり得る。加えて、培地を生物学的試料に添加して微生物増殖を増強し、これは微生物群集組成の変化をもたらし得る。安定同位体プロービング実験の培養条件は、生体試料中の特定の微生物の好ましい増殖のために選択され得る。これは、1つまたは少数の微生物がコミュニティを乗っ取り始める前に、コミュニティサンプル中の揮発性物質を検出するように設計された70°Cで1時間の短い抽出に反対した。糞便、下水、唾液、および喀痰サンプルタイプの微生物および化学組成の複雑さは、シーケンシングなどの追加の分析なしに、特定の微生物またはヒト起源に特定の化学的特徴を割り当てることを困難にする。この方法は、ハイスループットで無溶媒の真空抽出を提供し、少量のサンプルをより高感度に検出することにつながった。これらの実験に使用された容量は、培養生物学的サンプルの200μLから1mLの範囲であった。他の場合(データは示さず)、15μLまたは10μgの生物学的サンプル(例えば、喀痰および糞便サンプル)が抽出された。
この方法の将来の用途のために、幅広いサンプルタイプを少量または限られた量で分析することができます。数十のサンプルを同時に抽出することができ、実行時間は特定のGC-MS計測器のパラメータに依存します。安定同位体プロービングの場合、メタゲノムシークエンシングと組み合わせると、揮発性分子の産生に関与する微生物を同定する可能性がある。生物試料のメタゲノムを安定同位体プロービングによる抽出の前後に配列決定し、微生物群集組成の変化を同定することができた。メタゲノムシーケンシングは、同位体富化揮発性分子の産生に関与する遺伝子の同定を可能にするであろう。ここでは、提示されたプロトコルの入力として使用できるサンプルの種類とアプローチの例をいくつか紹介します。このプロトコルは、さまざまな業界で既に確立されています。揮発性分子は重要な診断指標であるため、このプロトコルの使用は生物学的実験室や臨床医療現場に拡大することができます。
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Disclosures
V. L. V.とS.J..B.D.はEntech Instruments Inc.の元従業員であり、K. W.はEntechのUniversity Programのメンバーです。J. P.、J.K.、およびC.I.R.には、宣言すべき利益相反はありません。
Acknowledgments
ヘザー・モーガンとリンダ・M・カリキンに、この原稿を慎重に編集してくれたことに感謝します。この研究はNIH NHLBIの支援を受けた(助成金5R01HL136647-04)。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 13C glucose | Sigma-Aldrich | 389374-1G | |
| 2-Stg Diaph Pump | Entech Instruments | 01-10-20030 | |
| 20 mL VOA vials | Fisher Scientific | 5719110 | |
| 24 mm Black Caps with hole, no septum | Entech Instruments | 01-39-76044B | holds lid liner in place on vial |
| 24 mm vial liner for sorbent pens | Entech Instruments | SP-L024S | allows pens to make a vacuum seal at top of vial |
| 5600 Sorbent pen extraction unit (SPEU) | Entech Instruments | 5600-SPES | 5600 Sorbent Pen Extraction Unit -120 VAC |
| 96-well assay plates | Genesee | 25-224 | |
| Brain Heart Infusion (BHI) media | Sigma-Aldrich | 53286-500G | |
| ChemStation Stofware | Agilent | ||
| DB-624 column | Agilent | 122-1364E | 60 m, 0.25 mm ID, 1.40 micron film thickness, in GC-MS |
| Deuterium oxide | Sigma-Aldrich | 151882-1L | |
| Dexsi sofware | Dexsi (open source) | ||
| GC-MS (7890A GC and 5975C inert XL MSD with Triple-Axis Detector) | Agilent | 7890A GC and 5975C inert XL MSD with triple-axis detector | |
| Headspace Bundle HS-B01, 120VA | Entech Instruments | SP-HS-B01 | Items for running headspace extraction included in bundle |
| Headspace sorbent pen (HSP) - blank | Entech Instruments | SP-HS-0 | |
| Headspace sorbent pen (HSP) Tenax TA (35/60 Mesh) | Entech Instruments | SP-HS-T3560 | |
| Microcentrifuge tubes (2 mL) | VWR | 53550-792 | |
| O-rings | Entech Instruments | SP-OR-L024 | |
| Sample Preparation Rail | Entech Instruments | ||
| Sorbent pen thermal conditioner | Entech Instruments | 3801-SPTC | |
| Todd Hewitt (TH) media | Sigma | T1438-500G |
References
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