Summary
Dit protocol beschrijft de extractie van vluchtige organische stoffen uit een biologisch monster met de vacuümondersteunde sorptiemiddelextractiemethode, gaschromatografie in combinatie met massaspectrometrie met behulp van de Entech Sample Preparation Rail en data-analyse. Het beschrijft ook de kweek van biologische monsters en stabiele isotooponderzoek.
Abstract
Vluchtige organische stoffen (VOS) uit biologische monsters hebben een onbekende oorsprong. VOC's kunnen afkomstig zijn van de gastheer of verschillende organismen uit de microbiële gemeenschap van de gastheer. Om de oorsprong van microbiële VOC's te ontrafelen, werden vluchtige headspace-analyse van bacteriële mono- en coculturen van Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa en Acinetobacter baumannii en stabiele isotooponderzoek in biologische monsters van uitwerpselen, speeksel, rioolwater en sputum uitgevoerd. Mono- en coculturen werden gebruikt om vluchtige productie van individuele bacteriesoorten te identificeren of in combinatie met stabiele isotooponderzoek om het actieve metabolisme van microben uit de biologische monsters te identificeren.
Vacuüm-geassisteerde sorptiemiddelextractie (VASE) werd gebruikt om de VOC's te extraheren. VASE is een eenvoudig te gebruiken, gecommercialiseerde, oplosmiddelvrije headspace-extractiemethode voor semi-vluchtige en vluchtige stoffen. Het gebrek aan oplosmiddelen en de bijna-vacuümomstandigheden die tijdens de extractie worden gebruikt, maken het ontwikkelen van een methode relatief eenvoudig en snel in vergelijking met andere extractieopties zoals tert-butylatie en micro-extractie in vaste fase. De hier beschreven workflow werd gebruikt om specifieke vluchtige handtekeningen van mono- en coculturen te identificeren. Bovendien identificeerde analyse van de stabiele isotooponderzoek van menselijke geassocieerde biologische monsters VOS die algemeen of uniek werden geproduceerd. Dit artikel presenteert de algemene workflow en experimentele overwegingen van VASE in combinatie met stabiele isotooponderzoek van levende microbiële culturen.
Introduction
Vluchtige organische stoffen (VOS) zijn veelbelovend voor bacteriële detectie en identificatie omdat ze worden uitgestoten door alle organismen en verschillende microben unieke VOC-handtekeningen hebben. Vluchtige moleculen zijn gebruikt als een niet-invasieve meting voor het detecteren van verschillende luchtweginfecties, waaronder chronische obstructieve longziekte1, tuberculose2 in urine3 en beademingsgerelateerde pneumonie4, naast het onderscheiden van proefpersonen met cystische fibrose (CF) van gezonde controlepersonen 5,6. Vluchtige handtekeningen zijn zelfs gebruikt om specifieke pathogene infecties bij CF te onderscheiden (Staphylococcus aureus7, Pseudomonas aeruginosa 8,9 en S. aureus vs. P. aeruginosa10). Met de complexiteit van dergelijke biologische monsters is het echter vaak moeilijk om de bron van specifieke VOS te lokaliseren.
Een strategie voor het ontwarren van de vluchtige profielen van meerdere infecterende microben is het uitvoeren van headspace-analyse van micro-organismen in zowel mono- als co-cultuur11. Headspace-analyse onderzoekt de analyten die worden uitgezonden in de "headspace" boven een monster in plaats van die ingebed in het monster zelf. Microbiële metabolieten zijn vaak gekarakteriseerd in monoculturen vanwege de moeilijkheid om de oorsprong van microbiële metabolieten in complexe klinische monsters te bepalen. Door vluchtige stoffen uit bacteriële monoculturen te profileren, kunnen de soorten vluchtige stoffen die een microbe in vitro produceert een basislijn van zijn vluchtige repertoire vertegenwoordigen. Het combineren van bacterieculturen, bijvoorbeeld het creëren van coculturen, en het profileren van de geproduceerde vluchtige moleculen kan de interacties of kruisvoeding tussen de bacteriënonthullen 12.
Een andere strategie voor het identificeren van de microbiële oorsprong van vluchtige moleculen is om een voedingsbron te bieden die is gelabeld met een stabiele isotoop. Stabiele isotopen zijn van nature voorkomende, niet-radioactieve vormen van atomen met een verschillend aantal neutronen. In een strategie die sinds de vroege jaren 1930 wordt gebruikt om het actieve metabolisme bij dieren te traceren13, voedt het micro-organisme zich met de gelabelde voedingsbron en neemt het de stabiele isotoop op in zijn metabole routes. Meer recent is een stabiele isotoop in de vorm van zwaar water (D2O) gebruikt om metabolisch actieve S. aureus te identificeren in een klinisch CF-sputummonster14. In een ander voorbeeld is 13C-gelabelde glucose gebruikt om de kruising van metabolieten tussen CF klinische isolaten van P. aeruginosa en Rothia mucilaginosa aan te tonen 12 .
Met de vooruitgang van massaspectrometrietechnieken zijn methoden voor het detecteren van vluchtige signalen overgegaan van kwalitatieve waarnemingen naar meer kwantitatieve metingen. Door gebruik te maken van gaschromatografie massaspectrometrie (GC-MS) is de verwerking van biologische monsters binnen handbereik gekomen voor de meeste laboratorium- of klinische omgevingen. Veel methoden om vluchtige moleculen te onderzoeken zijn gebruikt om monsters zoals voedsel, bacterieculturen en andere biologische monsters te profileren, en lucht en water om besmetting te detecteren. Verschillende gangbare methoden voor vluchtige bemonstering met een hoge doorvoer vereisen echter oplosmiddel en worden niet uitgevoerd met de voordelen van vacuümextractie. Bovendien zijn grotere volumes of hoeveelheden (groter dan 0,5 ml) bemonsterde materialen vaak vereist voor analyse 15,16,17,18,19, hoewel dit substraatspecifiek is en optimalisatie vereist voor elk monstertype en elke methode.
Hier werd vacuümondersteunde sorptiemiddelextractie (VASE) gevolgd door thermische desorptie op een GC-MS gebruikt om de vluchtige profielen van bacteriële mono- en coculturen te onderzoeken en actief geproduceerde vluchtige stoffen te identificeren met stabiele isotoopsondering uit menselijke uitwerpselen, speeksel, rioolwater en sputummonsters (figuur 1). Met beperkte monsterhoeveelheden werden VOC's geëxtraheerd uit slechts 15 μL sputum. Isotopenonderzoeksexperimenten met menselijke monsters vereisten het toevoegen van een stabiele isotoopbron, zoals 13C glucose, en media om de groei van de microbiële gemeenschap te cultiveren. De actieve productie van vluchtige stoffen werd door GC-MS geïdentificeerd als een zwaarder molecuul. Extractie van vluchtige moleculen onder een statisch vacuüm maakte de detectie van vluchtige moleculen met verhoogde gevoeligheidmogelijk 20,21,22.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Headspace Sorbent Pen (HSP) en overwegingen voor monsteranalyse
OPMERKING: De HSP die het sorptiemiddel Tenax TA bevat, is geselecteerd om een breed scala aan vluchtige stoffen vast te leggen. Tenax heeft een lagere affiniteit voor water in vergelijking met andere sorptiemiddelen, waardoor het meer VOC's uit monsters met een hoger vochtgehalte kan vangen. Tenax heeft ook een laag gehalte aan onzuiverheden en kan worden geconditioneerd voor hergebruik. Sorptiemiddelselectie werd ook gemaakt in overweging met de kolom geïnstalleerd in de GC-MS (zie de tabel met materialen).
- Genereer negatieve controles door media en/of blancomonsters te extraheren met dezelfde omstandigheden als voor monsterextractie.
- Analyseer een lege HSP (waarvan eerder is bevestigd dat deze schoon en vrij van significante achtergrond is) op de GC-MS voordat u geëxtraheerde monsters analyseert. Voer blanco's uit tussen monstertypen (bijv. Drie replicaties van bacteriën monocultuur, blanco, drie replicaties van bacteriën co-cultuur, blanco, enz.).
- Beperk het gebruik van geurige persoonlijke verzorgingsproducten of de consumptie van stinkende voedingsmiddelen voorafgaand aan monsterextractie en analyse. Bereid idealiter monsters voor in een bioveiligheidskap die gedurende ten minste 30 minuten niet is gereinigd door alcohol of andere vluchtige reinigingsmiddelen. Schakel de luchtstroom in de bioveiligheidskap in gedurende 30-60 minuten voorafgaand aan de monstervoorbereiding.
- Bewaar monsters op ijs om het vrijkomen van vluchtige stoffen tijdens de monstervoorbereiding te beperken.
2. Mono- en co-cultuurbereiding
- In de bioveiligheidskap, ent culturen van A. baumannii, S. aureus en P. aeruginosa in Todd Hewitt groeimedia. Incubeer 's nachts bij 37 °C met 200 tpm roeren.
- Voer na de nachtelijke incubatie cultuurbehandeling uit in de bioveiligheidskap. Verdun elke cultuur tot optische dichtheid 0,05 bij 500 nm.
- Meng coculturen in gelijke delen en pipetteer 200 μL controlemedia, mono- of cocultuur in elke put van een 96-well plaat en plaats deze gedurende 24 uur in een incubator van 37 °C. Bereid een tweede plaat voor op een incubatietijd van 48 uur.
- Bereid aan het einde van de incubatietijd monsters voor op extractie in sectie 4. Pipetteer vloeistofculturen in microcentrifugebuizen en bewaar bij -80 °C.
OPMERKING: Op dit punt kunnen monsters worden opgeslagen bij -80 °C om later te extraheren indien nodig.
3. Stabiele isotooponderzoek bij de bereiding van biologische monsters
OPMERKING: De uitwerpselen en speekselmonsters werden gedoneerd van anonieme donoren met goedkeuring van de University of California Irvine Institutional Review Board (HS # 2017-3867). Het rioolwater kwam uit San Diego, CA. De sputummonsters werden verzameld van proefpersonen met cystische fibrose als onderdeel van een grotere studie goedgekeurd door de University of Michigan Medical School Institutional Review Board (HUM00037056).
- Voer alle biologische monsterpreparaten uit in de bioveiligheidskap.
- Om fecale monsters te bereiden, voegt u 1 ml gedeïoniseerd water toe aan 100 mg uitwerpselen in een microcentrifugebuis van 1,5 ml en vortex gedurende 3 minuten. Plaats op ijs wanneer het niet in gebruik is.
- Voeg aan 15 μL fecaal en watermengsel 485 μL Brain Heart Infusion (BHI) medium toe met 20 mM 13C glucose, of BHI met 30% deuterium (D2O). Zorg ervoor dat het uiteindelijke volume van het monster 500 μL is. Bereid monsters in technische drielicaten.
- Voeg voor het bereiden van rioolwatermonsters 500 μL rioolwater toe aan 500 μL BHI met 20 mM 13C glucose of BHI met 30% D2O voor een totaal volume van 1 ml. Bereid monsters in drievoud. Plaats op ijs wanneer het niet in gebruik is.
- Om speekselmonsters te bereiden, voegt u 50 μL speeksel toe aan 500 μL BHI met 20 mM 13C glucose of BHI met 30% D2O voor een totaal volume van 550 μL. Bereid monsters in drievoud. Plaats op ijs wanneer het niet in gebruik is.
- Om sputummonsters voor te bereiden om de vluchtige stoffen in het monster vóór en na het kweken te vergelijken, voert u een eerste extractie uit met 15 μL sputum. Bereid monsters in drievoud. Plaats op ijs wanneer het niet in gebruik is. Ga naar sectie 4 voor monsterextractie en extraheer gedurende 18 uur bij 37 °C met 200 tpm roeren.
- Na de voltooiing van de eerste extractie van de ongekweekte sputummonsters, bewaar de injectieflacons met sputum. Voeg 500 μL BHI met 20 mM 13C glucose toe aan de injectieflacons met sputum vanaf 3.5.1. Plaats op ijs wanneer het niet in gebruik is.
- Om fecale monsters te bereiden, voegt u 1 ml gedeïoniseerd water toe aan 100 mg uitwerpselen in een microcentrifugebuis van 1,5 ml en vortex gedurende 3 minuten. Plaats op ijs wanneer het niet in gebruik is.
- Ga verder naar rubriek 4 voor monsterextractie.
4. Extractie van monsters
- Plaats lege injectieflacons met vluchtige organische analyse (VOA) (20 ml) op de koude plaat en plaats de koude plaat op ijs in de bioveiligheidskap.
- Schakel de 5600 sorptiepenextractie-eenheid (SPEU) in en pas deze aan de gewenste temperatuur aan zoals vereist voor elke methode.
OPMERKING: Voor stabiele isotoop tastende experimenten bij 37 °C kan het bereiken van het instelpunt tot 15 minuten duren. Voor mono- en co-cultuurexperimenten bij 70 °C kan het bereiken van het instelpunt tot 60 minuten duren. - Verzamel schone HSP's die gelijk zijn aan het aantal voorbereide monsters, inclusief HSP's voor media of monstercontroles.
- Label 20 ml VOA-injectieflacons volgens monsters, replicaties en HSP-ID's indien nodig. Gebruik een marker die bestand is tegen water in het geval dat condensatie ontstaat aan de buitenkant van de injectieflacon terwijl u op ijs bent.
- Schroef in de bioveiligheidskap de witte dop op de injectieflacon los, pipetteer snel het monster in de injectieflacon en monteer de zwarte dop, dekselvoering en HSP.
OPMERKING: Monsters mogen niet in contact komen met de HSP en het monstervolume is afhankelijk van het type monster. - Plaats de injectieflacon met het monster en HSP terug op de koude plaat.
- Herhaal stap 4.5 en 4.6 voor elk monster. Voer deze stappen per monster uit in plaats van allemaal tegelijk om opwarming van het monster en dus voortijdige vluchtige afgifte te voorkomen.
- Zodra alle monsters in de glazen injectieflacons zijn voorbereid, voert u de volgende stappen uit buiten de bioveiligheidskap op de bank. Zet de vacuümpomp aan, plaats de injectieflacons onder vacuüm tot 30 mmHg en verwijder de vacuümbron.
OPMERKING: De injectieflacons hoeven niet op de koude lade te staan nadat het vacuüm aanbrengen is voltooid. - Controleer de druk nogmaals nadat alle monsters onder vacuüm zijn geplaatst met behulp van de manometer. Als een injectieflacon een lek heeft, zorg er dan voor dat de dop goed is vastgeschroefd en dat de witte O-ringen van de HSP- en dekselvoeringen goed op hun plaats zitten.
OPMERKING: Een gecompromitteerde afdichting kan resulteren in een verminderde vluchtige detectie in vergelijking met een injectieflacon onder vacuüm. - Plaats injectieflacons in de SPEU voor de geoptimaliseerde tijd en temperatuur met roeren bij 200 tpm. Extractculturen gedurende 1 uur bij 70 °C. Extract stabiele isotoop tastende experimenten met fecale, rioolwater-, speeksel- en sputummonsters gedurende 18 uur bij 37 °C.
- Plaats de koude plaat op -80 °C voor gebruik nadat de extractieperiode is voltooid.
- Wanneer de extractie is voltooid, plaatst u monsters gedurende 15 minuten op de koude plaat om waterdamp uit de HSP- en flaconkopruimte te halen.
- Breng de HSP's over naar hun mouwen.
OPMERKING: Het experiment kan hier tot ~ 1 week bij kamertemperatuur worden gepauzeerd voordat de meer zeer vluchtige stoffen van de HSP's worden verloren.
5. Analyseer monsters op de gaschromatografie - massaspectrometer (GC-MS)
- Gebruik de volgende GC-MS (zie de tabel met materialen): 35 °C met een 5 min hold, 10 °C/min ramp tot 170 °C en een 15 °C/min ramp tot 230 °C met een 20:1 split ratio en een totale looptijd van 38 min.
- Stel de desorptiemethode als volgt in: 2 min, 70 °C voorverwarmen; 2 min 260 °C desorptie; 34 min, 260 °C bakenen; en 2 min, 70 °C na het bakken.
- Stel de volgorde van monsters in en start de run volgens instrumentatie.
- Als u een reeks wilt instellen op de Entech-software, opent u het programma. Selecteer in de opties rechts van het vervolgkeuzemenu van het instrument 5800 | Volgorde.
- Bekijk de volgordetabel in de Entech-software vergelijkbaar met die in de GC-MS-software. Geef de kolom Voorbeeld-id een naam op basis van het huidige date_vial-nummer. Houd er rekening mee dat Naam analoog is aan Naam in de GC-MS-reekstabel en dat de 5800-methode de snelheid van temperatuurstijging, wachttijden, enz. bepaalt (hiermee opent u een menu om de methode te selecteren die in stap 5.2 is gegenereerd).
- Houd er rekening mee dat de kolommen Lade en Positie bepalen waar de SAMPLE PREPARATION RAIL (SPR) naartoe gaat om de HSP's op te halen.
- Observeer de twee trays met elk 30 vlekken aan de directe linkerkant, ingedeeld als zes kolommen met elk vijf vlekken. De ladepositie die het meest links en het dichtst bij de gebruiker (vooraan) is, is positie 1, terwijl de meest rechtse, verste afstand positie 30 is.
- Merk op dat deze trays HSP A of B zijn, waarbij HSP B de lade is die dichter bij de SPR (binnenste lade) ligt en direct achter HSP B HSP Blank. Plaats de geëxtraheerde monsters in de trays en selecteer de plek op de volgorde dienovereenkomstig.
- Sla de volgordetabel op, selecteer Uitvoeren aan de linkerkant en vervolgens Begin met leeg in desorber als de lege HSP zich in de desorber bevindt (aangegeven door een HSP gemarkeerd met geel label).
- Houd er rekening mee dat HSP's worden afgehandeld door de SPR voor elk monster in de reeks. Laat de SPR opwarmen en er verschijnt een bericht boven aan het scherm om te bevestigen of de lege ruimte zich in de desorber bevindt. Klik op Overslaan om te bevestigen dat de pen aanwezig is. Laat de SPR alle voorbeelden automatisch uitvoeren en de reeks aan de GC-MS-kant zal de gegevens automatisch in afzonderlijke bestanden opnemen.
6. Data-analyse
- Kwaliteitsfiltergegevens op GC-MS-software (materiaaltabel).
- Bekijk elke piek op het chromatogram en annoteer pieken die overeenkomen met de bibliotheek van het National Institute of Standards & Technology (NIST) (of met een andere beschikbare bibliotheek).
- Voeg geannoteerde chromatogrampieken toe aan de verwerkingsmethode. Stel de criteria voor het selecteren van pieken in om verbindingen met een waarschijnlijkheid van meer dan 75% op te nemen en zorg ervoor dat de uitlijning van elk identificerend ion van de verbinding in het midden van de piek ligt.
- Als u een piek aan de verwerkingsmethode wilt toevoegen, selecteert u Kalibreren | Samengestelde | bewerken Naam | voeg verbinding in onder Externe standaardsamenstelling. Voeg de naam van de verbinding, retentietijd, Quant Signal Target Ion toe. Tel daar de drie grootste pieken bij op. Als u wilt opslaan, selecteert u ok | Methode | Opslaan.
- Zodra de procesmethode is ingesteld, gaat u verder met Quantitate | Bereken en bekijk | QEdit Quant Resultaat.
- Inspecteer elke verbinding om ervoor te zorgen dat de pieken overeenkomen met hun verwachte retentietijden en boven achtergrondgeluid liggen.
- Zodra QEdit is voltooid, selecteert u | afsluiten Ja om de QEdits op te slaan en terug te keren naar het hoofdchromatogram. Exporteer de gebiedsintegraties door het bestand aan de linkerkant te openen. Selecteer Quantitate | Rapport genereren.
- Als u bestanden wilt exporteren voor gebruik in DExSI, selecteert u Bestand | Gegevens exporteren naar AIA-indeling | Maak een nieuwe map en selecteer een locatie voor het bestand of Gebruik bestaande map.
- Zie een nieuw venster openen om bestanden te selecteren voor export. Verplaats de bestanden naar de rechterkant van het venster en klik op Verwerken. Wacht een paar seconden tot een paar minuten, afhankelijk van het aantal bestanden dat wordt geconverteerd.
- Corrigeer voor isotopenrijkdom in DExSI volgens instructies voor de DExSI-software (https://github.com/DExSI/DExSI) en voer analyse uit met een favoriete software of programma (bijv. R). Scripts die worden gebruikt om de cijfers te genereren, bevinden zich op https://github.com/joannlp/
VOC_SIP .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Mono- en coculturen van S. aureus, P. aeruginosa en A. baumannii
De mono- en coculturen bestonden uit de bacteriesoorten S. aureus, P. aeruginosa en A. baumannii. Dit zijn veel voorkomende opportunistische pathogenen die worden aangetroffen in menselijke wonden en chronische infecties. Om de vluchtige moleculen in de mono- en coculturen te identificeren, werd een korte extractie van 1 uur uitgevoerd bij 70 °C met 200 rpm agitatie. Uit de mono- en coculturen op 24- en 48-uurs tijdpunten werden 43 geannoteerde vluchtige moleculen gedetecteerd (figuur 2), waaronder aldehyden, ketonen, alcoholen, zwavelverbindingen, koolwaterstoffen, carbonzuren of esters en aromaten. Er was een klein aantal vluchtige moleculen die alleen in bepaalde mono- of coculturen op bepaalde tijdstippen werden gedetecteerd. Acetoïne en 3-hydroxy-2-butonacetaat werden bijvoorbeeld alleen gedetecteerd in de S. aureusculturen op het 48-h-tijdspunt (figuur 2).
Vluchtig 1-propanol 2-methyl werd alleen gedetecteerd in de cocultuur van P. aeruginosa en A. baumannii na 48 uur (figuur 2). Ethylacetaat was aanwezig in A. baumannii co-culturen met S. aureus of P. aeruginosa bij 48 h (figuur 2). De metabolieten heptaan, 2,3-dimethyl en pentaan, 2-methyl werden pas na 24 uur in de A. baumannii-cultuur gedetecteerd (figuur 2). Aceetaldehyde en ethanol hadden hogere relatieve abundanties in de A. baumannii - en S. aureus-cocultuur op het 24-uurstijdpunt in vergelijking met 48 h en een van de stammen alleen in cultuur (figuur 2). Sommige van de vluchtige stoffen waren overvloediger in culturen op het 24- of 48-uurs tijdspunt. Vetzuren met een korte keten, waaronder azijnzuur, butaanzuur en propaanzuur, waren in culturen na 48 uur in hoge relatieve abundanties, maar werden niet gedetecteerd in de 24-uursculturen (figuur 2). Hexaan was overvloediger in de TH-controle na 24 uur in vergelijking met 48 uur (figuur 2).
Stabiele isotoopetikettering van fecale, rioolwater- en speekselmonsters
Om de actieve productie van vluchtige moleculen uit een biologisch monster te identificeren, werden een gelabelde voedingsbron, 13C glucose of D2O en media toegevoegd om de groei van de microbiële gemeenschap te ondersteunen. Eén uniek monster werd geanalyseerd van elk van de verschillende monstertypen fecale, rioolwater- en speekselmonsters in drievoud. Er was meer integratie van de 13C in volledig gelabelde vluchtige moleculen (figuur 3A-D) in vergelijking met incorporatie met deuterium (figuur 3E). De 13C werd opgenomen in 2-butanone, 3-hydroxy; 2,3-butanedione; azijnzuur; en fenol voor alle fecale, riool- en speekselmonsters (figuur 3A).
De andere gelabelde vluchtige stoffen werden gedetecteerd in twee of één monstertypen. Aceton, butaanzuur en propaanzuur werden bijvoorbeeld gedetecteerd als gelabeld in speeksel en rioolwater (figuur 3B). De gelabelde vluchtige stoffen, dimethyltrisulfide en disulfidedimethyl, werden verrijkt in zowel fecale als speekselmonsters (figuur 3C). Vluchtige stoffen, 1-propanol, 2-butanon, benzofenon, ethanol en methylthiolacetaat, werden alleen verrijkt in rioolwater (figuur 3D). Het gelabelde vluchtige, 2,3-pentanedoïne, was verrijkt met speeksel (figuur 3D). Deuterium werd opgenomen in de vluchtige stoffen, azijnzuur; benzaldehyde, 4-methyl; dimethyltrisulfide; en fenol, uit speeksel- of rioolwatermonsters (figuur 3E). Naast de met isotopen verrijkte vluchtige stoffen werden er vluchtige stoffen gedetecteerd die geen opgenomen stabiele isotopen bevatten. Pyrazineverbindingen, met uitzondering van pyrazine, 2,5-dimethyl, werden bijvoorbeeld gedetecteerd in fecale, riool- en speekselmonsters, maar waren niet volledig verrijkt met 13C (aanvullende figuur S1).
Stabiele isotoopetikettering van sputummonsters
De stabiele isotoopetiketteringsstrategie werd geïmplementeerd voor het identificeren van actief geproduceerde vluchtige stoffen met sputummonsters van zeven menselijke proefpersonen met cystische fibrose. De vluchtige stoffen in het monster werden vergeleken met die welke voortkwamen uit monsters gekweekt met een stabiel isotooplabel. Elke vluchtige component van elk monster werd tweemaal geanalyseerd: voor en na stabiele isotooponderzoek met 13C glucose en media. De monsters verzameld van de proefpersonen besloegen drie verschillende tijdspunten of klinische toestanden: baseline, exacerbatie en behandeling23. De vluchtige stoffen die werden gedetecteerd zoals gelabeld in de gekweekte sputummonsters hadden verschillende relatieve abundanties in vergelijking met de niet-gelabelde vluchtige stoffen uit de niet-gekweekte sputummonsters. Kweekomstandigheden in de stabiele isotoop tastende experimenten met sputum kunnen de groei van bepaalde microben bevorderen, wat leidt tot verschillen in relatieve overvloed aan vluchtige stoffen in vergelijking met de niet-gekweekte sputummonsters.
Azijnzuur, dimethyltrisulfide, aceton en propanaal 2-methyl waren bijvoorbeeld overvloediger in de gekweekte sputummonsters in vergelijking met de niet-gekweekte sputummonsters (figuur 4). Het detecteren van 13C-gelabelde ethanol, die in variabele hoeveelheden in de lucht van de achtergrondkamer aanwezig kan zijn, levert bewijs dat de ethanol actief werd geproduceerd door microbieel metabolisme van 13C glucose. De hoeveelheid variatie werd verklaard door het onderwerp zoals beoordeeld door Permutational Multivariate Analysis of Variance (PERMANOVA) en was ook verschillend voor de twee verschillende vluchtige datasets (tabel 1 en aanvullende figuur S2). Voor het 13C-gelabelde gekweekte sputum werd 51% van de variatie verklaard door de proefpersoon, terwijl 33% van de variatie werd verklaard door het onderwerp van de vluchtige stoffen in de niet-gekweekte sputummonsters (tabel 1). De samenstelling van de microbioomgemeenschap zoals bepaald door 16S rRNA amplicon sequencing van de zeven proefpersonen was uniek voor elk onderwerp (aanvullende figuur S3), en de individuele handtekeningen werden ook weerspiegeld in zowel de gekweekte als niet-gekweekte sputum vluchtige moleculen gedetecteerd.
In gekweekt sputum werden 23 vluchtige stoffen gedetecteerd die volledig waren gelabeld met 13koolstof. De isotoopverrijkte (actieve) vluchtige stoffen die uit de sputummonsters werden gedetecteerd, waren voor elke proefpersoon anders. De vluchtige stoffen met isotoopverrijking die in de sputummonsters van alle zeven proefpersonen werden gedetecteerd, waren 2,3-butanedione; azijnzuur; aceton; dimethyltrisulfide; disulfide, dimethyl; en pyrazine, 2,5-dimethyl (figuur 5). Hoewel die vluchtige stoffen bij alle proefpersonen werden gedetecteerd, varieerde de isotoopverrijking voor elke proefpersoon. Monsters van proefpersoon 7 hadden een hogere isotoopverrijking van disulfidedimethyl in vergelijking met de andere zes proefpersonen (figuur 5B). Aceton was hoger bij proefpersonen 4 en 6 (figuur 5). Sommige vluchtige stoffen werden alleen bij bepaalde proefpersonen verrijkt met 13C. Bijvoorbeeld, 1-butanol, 3-methyl en propaanzuur, 2-methyl werden alleen verrijkt in een subset van monsters van proefpersoon 2 (figuur 5). Naast de met isotopen verrijkte vluchtige stoffen werden er ook vluchtige stoffen gedetecteerd als niet-gelabeld uit hetzelfde gekweekte sputum (aanvullende figuur S4). Vluchtige stoffen 2-piperidinone; benzaldehyde, 4-methyl; benzothiazol; butaanzuur, 3-methyl; zesvoudig; hexaan; isopropylalcohol; fenol; propaanzuur, 2-methyl; en pyrrolo 1,2-apyrazine-1,4-dion, hexahydro werden gedetecteerd in de sputummonsters, maar waren niet isotoopverrijkt (aanvullende figuur S4).
Figuur 1: Protocolschema. Een biologisch monster wordt in een glazen injectieflacon geplaatst en geassembleerd met de dekselvoering en de Headspace Sorbent Pen. Een vacuüm wordt op de injectieflacon aangebracht totdat een druk van ongeveer 30 mmHg is bereikt. De vacuümbron wordt verwijderd en de injectieflacons worden in de sorptiepenextractie-eenheid geplaatst waar een statische extractie wordt uitgevoerd met behulp van warmte, agitatie en tijd. Na extractie worden injectieflacons op een koud metalen blok geplaatst om water uit de headspace en HSP te verwijderen. De HSP's worden verzameld en uitgevoerd via thermische desorptie op de GC-MS. De gegevens worden geanalyseerd met ChemStation, DExSI en R. Afkortingen: HSP = Headspace Sorbent Pen; GC-MS = gaschromatografie-massaspectrometrie. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Heatmap van mono- en coculturen. VOC's gedetecteerd uit mono- en coculturen op 24- en 48-uurs tijdpunten. De coculturen zijn de combinaties van de letters die elke soort vertegenwoordigen. Alle monsters werden gedurende 1 uur geëxtraheerd bij 70 °C met 200 tpm roeren. Heatmap intensiteitswaarden zijn kolom Z-scores, genormaliseerd per metaboliet. De Z-score werd berekend door het verschil in waarde ten opzichte van het gemiddelde van waarden, gedeeld door de standaardafwijking van waarden. Het dendrogram werd gegenereerd met de cluster_cols optie in de pheatmap functie van R. Het dendrogram vertegenwoordigt hiërarchische clustering waarbij metabolieten die samen clusteren meer vergelijkbare Z-scores hebben in verschillende monsters. Afkortingen: A = A. baumanii; P = P. aeruginosa; S = S. aureus; TH = Todd Hewitt media (controle). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: Procentuele omzetting van 13C in vluchtige molecuulmassa in fecale, speeksel- en rioolwatermonsters gedurende 18 uur van gelijktijdige incubatie en extractie. De % conversie werd berekend voor volledig gelabelde verbindingen door de massa van de volledig gelabelde verbinding (M+N) te nemen en deze te delen door (M+N) + de massa van de niet-gelabelde vluchtige massa (M), waarbij N het maximale aantal mogelijke koolstofatomen (in A-D) of waterstof (in E) is dat in elk vluchtig molecuul kan worden geëtiketteerd. Verbindingen worden geacht volledig te zijn geëtiketteerd wanneer alle koolstofatomen van de vluchtige worden vervangen door 13C. Waar gegevens ontbreken, werd het vluchtige niet gedetecteerd. In (D) werd bijvoorbeeld 1-propanol niet gedetecteerd in fecale of speekselmonsters. Aantal replicaties per monster = 3. (A) De 13C-gelabelde vluchtige stoffen die in alle monstertypen (uitwerpselen, speeksel en rioolwater) worden gedetecteerd. (B) De 13vluchtige stoffen met het C-label worden alleen gedetecteerd in speeksel- en rioolwatermonsters. (C) De 13vluchtige stoffen met C-label die in uitwerpselen en speekselmonsters worden aangetroffen. D) De 13vluchtige stoffen met een C-label die in een van de drie verschillende monstertypen zijn gedetecteerd. (E) De deuterium-gelabelde vluchtige moleculen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4: Heatmap van 13C-gelabelde vluchtige stoffen uit gekweekt sputum en vluchtige moleculen gedetecteerd uit ongecultiveerd sputum. De gelabelde vluchtige stoffen zijn afkomstig van de stabiele isotoop tastende experimenten waarbij 13C glucose en Brain Heart Infusion medium werden toegevoegd aan sputum tijdens de extractiestap om microbiële groei te cultiveren en actieve vluchtige productie vast te leggen. De ongelabelde vluchtige moleculen werden rechtstreeks uit sputummonsters gedetecteerd. De heatmapintensiteiten zijn Z-scores zoals beschreven in het bijschrift van figuur 2. De Z-scores werden echter binnen elk experiment berekend voor de gekweekte en niet-gekweekte sputumexperimenten. Het dendrogram werd gegenereerd zoals beschreven in figuur 2. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 5: Procentuele omzetting van 13C in vluchtige molecuulmassa in sputummonsters van zeven proefpersonen met cystische fibrose gedurende 18 uur van gelijktijdige incubatie en extractie. De % conversie werd berekend zoals beschreven in het bijschrift van figuur 3. Vluchtige stoffen die niet in monsters worden gedetecteerd, worden aangegeven door de afwezigheid van gegevens. N = 1-3. (A) De 13C-gelabelde vluchtige stoffen gedetecteerd bij een hogere procent conversie in de meerderheid van de sputummonsters. (B) De 13C-gelabelde vluchtige stoffen gedetecteerd bij een lagere procent conversie in de meerderheid van de sputummonsters. (C) De 13C-gelabelde vluchtige stoffen gedetecteerd bij een lagere procent conversie in een minderheid van de sputummonsters. Afkortingen: B = baseline; E = exacerbatie; T = behandeling. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
| Vrijheidsgraden | R2 | P-waarde | ||
| Onbeschaafd sputum | Onderwerp | 6 | 0.33 | 0.001 |
| Klinische toestand | 2 | 0.01 | 0.46 | |
| Betreft: klinische toestand | 12 | 0.12 | 0.092 | |
| Gekweekt sputum met 13C glucose en media | Onderwerp | 6 | 0.51 | 0.001 |
| Klinische toestand | 2 | 0.02 | 0.095 | |
| Onderwerp: klinische toestand | 12 | 0.11 | 0.194 |
Tabel 1: Gepermuteerde multivariate variantieanalyse (PERMANOVA) van sputummonsters. De PERMANOVA is gegenereerd met behulp van de adonis-functie uit het veganistische pakket in R.
Aanvullende figuur S1: De relatieve abundanties van gelabelde (M +N (max)) en niet-gelabelde (M + 0) vluchtige stoffen over fecale, speeksel- en rioolwatermonsters. Klik hier om dit bestand te downloaden.
Aanvullende figuur S2: Niet-metrische multidimensionale schaling van gekweekt sputum met stabiele isotoopprobing en ongecultiveerd sputum. (A) De NMDS van gekweekt sputum met 13C glucose en media werd gegenereerd met k = 3 dimensies. De stresswaarde was 0,07. (B) Het NMDS van ongecultiveerd sputum werd gegenereerd met k = 3 dimensies. De stresswaarde was 0,13. Afkortingen: NMDS = niet-metrische multidimensionale schaling; B = uitgangswaarde; E = exacerbatie; T = behandeling. Klik hier om dit bestand te downloaden.
Aanvullende figuur S3: Microbiële gemeenschapssamenstelling van sputummonsters van proefpersonen met cystische fibrose. Beoordeeld door 16S rRNA amplicon sequencing als onderdeel van een grotere studie, verdere informatie over aanpak gevonden in Carmody et al. 202019. van proefpersonen met cystische fibrose. Elke gestapelde balk is een ander tijdspunt. Afkortingen: B = baseline, E = exacerbatie, T = behandeling. Klik hier om dit bestand te downloaden.
Aanvullende figuur S4: De relatieve abundanties van gelabelde (M +N (max)) en niet-gelabelde (M + 0) vluchtige stoffen over sputummonsters van zeven proefpersonen met cystische fibrose. Klik hier om dit bestand te downloaden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Om vluchtige productie in in vitro culturen en met de mens geassocieerde monsters te identificeren, werden vluchtige analyses van mono- en coculturen van P. aeruginosa, S. aureus en A. baumanii en stabiele isotooponderzoek van verschillende biologische monsters uitgevoerd. In de analyse voor de mono- en coculturen werden vluchtige stoffen gedetecteerd door een korte extractie gedurende 1 uur bij 70 °C uit te voeren. De vluchtige analyse van mono- en coculturen maakte het mogelijk om de verbindingen te onderzoeken die zowel door individuele soorten als tijdens hun interacties met andere soorten werden geproduceerd. Er waren verschillen in relatieve abundanties tussen de verschillende cultuurtypen en tijdstippen. In de stabiele isotooponderzoeksexperimenten omvatten de biologische monsters uitwerpselen en speeksel van gezonde proefpersonen, rioolwater en sputum van proefpersonen met cystische fibrose. Stabiele isotoopprofilering maakte de identificatie van actief geproduceerde vluchtige moleculen mogelijk door gedurende 18 uur bij 37 °C te extraheren. De lange extractietijd met een lagere temperatuur maakte groei en metabolisme van microben in de biologische monsters mogelijk. Vergelijking van de 13C glucose en D2O verrijkingen toonde aan dat er een uitgebreidere isotoopverrijking was met het label 13C.
Bij het extraheren van verschillende monstertypen werden er initiële optimalisatiestappen genomen voordat een volledige run werd gestart. Test eerst verschillende volumes van een monster als proef. Voor sommige monstertypen, bijvoorbeeld sputum, waren slechts kleine steekproefvolumes beschikbaar. Het wordt aanbevolen om eerst met een lager volume of een kleinere hoeveelheid monster te beginnen, afhankelijk van het type monster en de beschikbare monsterhoeveelheden. Extraheer geen groot volume of te veel van het monster omdat dit de kolom kan overweldigen en de HSP kan besmetten. Kolomoverbelasting kan duidelijk zijn wanneer pieken in het chromatogram verzadigd zijn of in volgende runs verschijnen. HSP-verontreiniging is opgetreden als er sprake is van overdracht wanneer de HSP opnieuw op de GC-MS wordt uitgevoerd. In de mono- en co-kweekexperimenten was 200 μL cultuur voldoende om een verscheidenheid aan vluchtige stoffen te detecteren. In de stabiele isotoop tastende experimenten varieerde, afhankelijk van het monstertype, het volume voor elk experiment van 500 μL tot 1 ml. Ten tweede, afhankelijk van het monstertype en de verbindingen van belang, zullen de extractietijd en temperatuur, evenals de GC-MS en thermische desorptiemethoden moeten worden aangepast om de vluchtige detectie te optimaliseren. Deze methoden werden geschikt bevonden voor de analyten van belang en kolomtype.
Na het optimaliseren van de methode hadden de kritische stappen in het protocol betrekking op de stappen voorafgaand aan en na de extractie. Tijdens de monstervoorbereiding werden monsters op ijs geplaatst, zodat de in het monster aanwezige vluchtige stoffen niet ontsnapten. Het was ook belangrijk om ervoor te zorgen dat de vacuümafdichting goed zat en het deksel goed gesloten was. Anders zou er een inefficiënte extractie en verminderde detectie van de vluchtige stoffen uit het monster zijn. Lekkages kunnen ontstaan door de O-ringen rond de dekselvoering of de HSP. Om ervoor te zorgen dat de injectieflacon onder vacuüm stond, werd voorafgaand aan de extractie een meter gebruikt om ervoor te zorgen dat de O-ringen nog steeds functioneel waren. Bovendien werden na de extractie monsters op het ijsblok geplaatst, zodat er gedurende een bepaalde periode water uit de hoofdruimte werd getrokken. Water in de kolom kan leiden tot veranderingen in retentietijden en onderdrukking van de MS-respons, wat leidt tot niet-kwantitatieve resultaten. De mogelijkheid om overtollig water uit de HSP's te trekken voordat het uit de vacuümhuls/injectieflaconassemblage wordt verwijderd, is mogelijk vanwege het gesloten systeemkarakter van het VASE-proces en de mogelijkheid om water terug te extraheren naar de koudste plek in dat extractiesysteem met behulp van de -80 °C koude plaat.
Er zijn zowel beperkingen als voordelen aan deze methoden met betrekking tot alternatieve methoden. Bij het evalueren van de mono- en co-cultuurexperimenten werden vluchtige handtekeningen gedetecteerd die specifiek waren voor een bepaalde microbe of co-cultuur. Er waren ook veranderingen in volatiele overvloeden in de loop van de tijd. Wat betreft de stabiele isotooponderzoeksexperimenten in de verschillende soorten biologische monsters, resulteerde deuteriumetikettering niet in zoveel isotoopverrijkte vluchtige stoffen als 13C glucose. Het metabolisme dat nodig is om met isotopen verrijkte vluchtige stoffen met deuterium te produceren, kan beperkter zijn. Bovendien werden media toegevoegd aan de biologische monsters om de microbiële groei te verbeteren, wat kan leiden tot veranderingen in de samenstelling van de microbiële gemeenschap. Kweekomstandigheden van stabiele isotooponderzoeksexperimenten kunnen worden geselecteerd voor de gewenste groei van bepaalde microben in een biologisch monster. Dit in tegenstelling tot de korte extractie gedurende een uur bij 70 ° C, ontworpen om de vluchtige stoffen in het gemeenschapsmonster te detecteren voordat een of enkele van de microben de gemeenschap beginnen over te nemen. De complexiteit van de microbiële en chemische samenstellingen van de fecale, rioolwater-, speeksel- en sputummonstertypen maken het moeilijk om specifieke chemische handtekeningen toe te wijzen aan een bepaalde microbiële of menselijke oorsprong zonder aanvullende analyses zoals sequencing. Deze methode zorgde voor een oplosmiddelvrije vacuümextractie met hoge doorvoer die leidde tot een gevoeligere detectie van monsters met een laag volume. De volumes die voor deze experimenten werden gebruikt, varieerden van 200 μL tot 1 ml gekweekte biologische monsters. In andere gevallen (gegevens niet getoond) werden biologische monsters (bijv. sputum- en fecale monsters) zo laag als 15 μL of 10 μg geëxtraheerd.
Voor toekomstige toepassingen van de methode kan een breed scala aan monstertypen worden geanalyseerd met kleine of beperkte volumes. Tientallen monsters konden tegelijkertijd worden geëxtraheerd en de looptijd zou afhangen van de parameters van het specifieke GC-MS-instrument. In het geval van stabiele isotooponderzoek, in combinatie met metagenomische sequencing, is er de mogelijkheid om de microben te identificeren die verantwoordelijk zijn voor de productie van de vluchtige moleculen. Het metagenoom van het biologische monster kon vóór en na de extractie worden gesequenced met stabiele isotooponderzoek om veranderingen in de samenstelling van microbiële gemeenschappen te identificeren. Metagenomische sequencing zou identificatie mogelijk maken van genen die verantwoordelijk zijn voor de productie van de isotoop verrijkte vluchtige moleculen. Hier worden enkele voorbeelden van de voorbeeldtypen en -benaderingen gemarkeerd die kunnen worden gebruikt als input voor het gepresenteerde protocol, dat al in verschillende industrieën is vastgesteld. Omdat vluchtige moleculen belangrijke diagnostische indicatoren zijn, kan het gebruik van dit protocol worden uitgebreid naar biologische laboratoria en klinische zorginstellingen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
V. L. V en S. J.B. D. waren voormalige werknemers van Entech Instruments Inc., en K. W. is lid van het Universiteitsprogramma van Entech. J. P., J. K. en C. I. R. hebben geen belangenconflicten te melden.
Acknowledgments
We bedanken Heather Maughan en Linda M. Kalikin voor het zorgvuldig bewerken van dit manuscript. Dit werk werd ondersteund door NIH NHLBI (subsidie 5R01HL136647-04).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 13C glucose | Sigma-Aldrich | 389374-1G | |
| 2-Stg Diaph Pump | Entech Instruments | 01-10-20030 | |
| 20 mL VOA vials | Fisher Scientific | 5719110 | |
| 24 mm Black Caps with hole, no septum | Entech Instruments | 01-39-76044B | holds lid liner in place on vial |
| 24 mm vial liner for sorbent pens | Entech Instruments | SP-L024S | allows pens to make a vacuum seal at top of vial |
| 5600 Sorbent pen extraction unit (SPEU) | Entech Instruments | 5600-SPES | 5600 Sorbent Pen Extraction Unit -120 VAC |
| 96-well assay plates | Genesee | 25-224 | |
| Brain Heart Infusion (BHI) media | Sigma-Aldrich | 53286-500G | |
| ChemStation Stofware | Agilent | ||
| DB-624 column | Agilent | 122-1364E | 60 m, 0.25 mm ID, 1.40 micron film thickness, in GC-MS |
| Deuterium oxide | Sigma-Aldrich | 151882-1L | |
| Dexsi sofware | Dexsi (open source) | ||
| GC-MS (7890A GC and 5975C inert XL MSD with Triple-Axis Detector) | Agilent | 7890A GC and 5975C inert XL MSD with triple-axis detector | |
| Headspace Bundle HS-B01, 120VA | Entech Instruments | SP-HS-B01 | Items for running headspace extraction included in bundle |
| Headspace sorbent pen (HSP) - blank | Entech Instruments | SP-HS-0 | |
| Headspace sorbent pen (HSP) Tenax TA (35/60 Mesh) | Entech Instruments | SP-HS-T3560 | |
| Microcentrifuge tubes (2 mL) | VWR | 53550-792 | |
| O-rings | Entech Instruments | SP-OR-L024 | |
| Sample Preparation Rail | Entech Instruments | ||
| Sorbent pen thermal conditioner | Entech Instruments | 3801-SPTC | |
| Todd Hewitt (TH) media | Sigma | T1438-500G |
References
- Van Berkel, J. J. B. N., et al. A profile of volatile organic compounds in breath discriminates COPD patients from controls. Respiratory Medicine. 104 (4), 557-563 (2010).
- Nakhleh, M. K., et al. Detecting active pulmonary tuberculosis with a breath test using nanomaterial-based sensors. European Respiratory Journal. 43 (5), 1522-1525 (2014).
- Lim, S. H., et al. Rapid diagnosis of tuberculosis from analysis of urine volatile organic compounds. ACS Sensors. 1 (7), 852-856 (2016).
- Schnabel, R., et al. Analysis of volatile organic compounds in exhaled breath to diagnose ventilator-associated pneumonia. Scientific Reports. 5, 17179 (2015).
- Paff, T., et al. Exhaled molecular profiles in the assessment of cystic fibrosis and primary ciliary dyskinesia. Journal of Cystic Fibrosis. 12 (5), 454-460 (2013).
- Robroeks, C. M. H. H. T., et al. Metabolomics of volatile organic compounds in cystic fibrosis patients and controls. Pediatric Research. 68 (1), 75-80 (2010).
- Neerincx, A. H., et al. Hydrogen cyanide emission in the lung by Staphylococcus aureus. European Respiratory Journal. 48 (2), 577-579 (2016).
- Goeminne, P. C., et al. Detection of Pseudomonas aeruginosa in sputum headspace through volatile organic compound analysis. Respiratory Research. 13, 87 (2012).
- Joensen, O., et al. Exhaled breath analysis using Electronic Nose in cystic fibrosis and primary ciliary dyskinesia patients with chronic pulmonary infections. PLOS ONE. 9 (12), 115584 (2014).
- Nasir, M., et al. Volatile molecules from bronchoalveolar lavage fluid can 'rule-in' Pseudomonas aeruginosa and 'rule-out' Staphylococcus aureus infections in cystic fibrosis patients. Scientific Reports. 8 (1), 826 (2018).
- Tyc, O., Zweers, H., de Boer, W., Garbeva, P.
- Gao, B., et al. Tracking polymicrobial metabolism in cystic fibrosis airways: Pseudomonas aeruginosa metabolism and physiology are influenced by Rothia mucilaginosa-derived metabolites. mSphere. 3 (2), 00151 (2018).
- Schoenheimer, R., Rittenberg, D. Deuterium as an indicator in the study of intermediary metabolism. Science. 82 (2120), 156-157 (1935).
- Neubauer, C., et al. Refining the application of microbial lipids as tracers of Staphylococcus aureus growth rates in cystic fibrosis sputum. Journal of Bacteriology. 200 (24), 00365 (2018).
- Cordell, R. L., Pandya, H., Hubbard, M., Turner, M. A., Monks, P. S. GC-MS analysis of ethanol and other volatile compounds in micro-volume blood samples-quantifying neonatal exposure. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 405 (12), 4139-4147 (2013).
- Mayor, A. S. R. Optimisation of sample preparation for direct SPME-GC-MS analysis of murine and human faecal volatile organic compounds for metabolomic studies. Journal of Analytical & Bioanalytical Techniques. 5 (2), 184 (2014).
- Camarasu, C. C. Headspace SPME method development for the analysis of volatile polar residual solvents by GC-MS. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis. 23 (1), 197-210 (2000).
- Charry-Parra, G., DeJesus-Echevarria, M., Perez, F. J. Beer volatile analysis: optimization of HS/SPME coupled to GC/MS/FID. Journal of Food Science. 76 (2), 205-211 (2011).
- Bicchi, C., Cordero, C., Liberto, E., Rubiolo, P., Sgorbini, B. Automated headspace solid-phase dynamic extraction to analyse the volatile fraction of food matrices. Journal of Chromatography A. 1024 (1), 217-226 (2004).
- Trujillo-Rodríguez, M. J., Anderson, J. L., Dunham, S. J. B., Noad, V. L., Cardin, D. B. Vacuum-assisted sorbent extraction: An analytical methodology for the determination of ultraviolet filters in environmental samples. Talanta. 208, 120390 (2020).
- Mollamohammada, S., Hassan, A. A., Dahab, M. Immobilized algae-based treatment of herbicide-contaminated groundwater. Water Environment Research. 93 (2), 263-273 (2021).
- Psillakis, E. The effect of vacuum: an emerging experimental parameter to consider during headspace microextraction sampling. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 412 (24), 5989-5997 (2020).
- Carmody, L. A., et al. The daily dynamics of cystic fibrosis airway microbiota during clinical stability and at exacerbation. Microbiome. 3, 12 (2015).
- Carmody, L. A., et al. Fluctuations in airway bacterial communities associated with clinical states and disease stages in cystic fibrosis. PLOS ONE. 13 (3), 0194060 (2018).
- Mahboubi, M. A., et al. Culture-based and culture-independent bacteriologic analysis of cystic fibrosis respiratory specimens. Journal of Clinical Microbiology. 54 (3), 613-619 (2016).
