Summary
Este protocolo describe la extracción de compuestos orgánicos volátiles de una muestra biológica con el método de extracción de sorbente asistido por vacío, cromatografía de gases junto con espectrometría de masas utilizando el riel de preparación de muestras Entech y análisis de datos. También describe el cultivo de muestras biológicas y el sondeo de isótopos estables.
Abstract
Los compuestos orgánicos volátiles (COV) de muestras biológicas tienen orígenes desconocidos. Los COV pueden originarse en el huésped o en diferentes organismos dentro de la comunidad microbiana del huésped. Para desentrañar el origen de los COV microbianos, se realizó un análisis volátil del espacio de cabeza de mono y cocultivos bacterianos de Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa y Acinetobacter baumannii, y sondeo de isótopos estables en muestras biológicas de heces, saliva, aguas residuales y esputo. Se utilizaron monocultivos y cocultivos para identificar la producción volátil de especies bacterianas individuales o en combinación con sondeos de isótopos estables para identificar el metabolismo activo de los microbios a partir de las muestras biológicas.
Se empleó la extracción de sorbente asistida por vacío (VASE) para extraer los COV. VASE es un método de extracción de espacio de cabeza fácil de usar, comercializado y sin disolventes para compuestos semivolátiles y volátiles. La falta de disolventes y las condiciones cercanas al vacío utilizadas durante la extracción hacen que el desarrollo de un método sea relativamente fácil y rápido en comparación con otras opciones de extracción, como la terc-butilación y la microextracción en fase sólida. El flujo de trabajo descrito aquí se utilizó para identificar firmas volátiles específicas de monocultivos y cocultivos. Además, el análisis del sondeo de isótopos estables de muestras biológicas humanas asociadas identificó COV que se produjeron de forma común o única. Este artículo presenta el flujo de trabajo general y las consideraciones experimentales de VASE junto con el sondeo de isótopos estables de cultivos microbianos vivos.
Introduction
Los compuestos orgánicos volátiles (COV) son muy prometedores para la detección e identificación de bacterias porque son emitidos por todos los organismos, y los diferentes microbios tienen firmas únicas de COV. Las moléculas volátiles se han utilizado como una medida no invasiva para detectar diversas infecciones respiratorias, incluida la enfermedad pulmonar obstructiva crónica1, la tuberculosis2 en la orina3 y la neumonía asociada al ventilador4, además de distinguir a los sujetos con fibrosis quística (FQ) de los sujetos de control sanos 5,6. Las firmas volátiles incluso se han utilizado para distinguir infecciones patógenas específicas en la FQ (Staphylococcus aureus7, Pseudomonas aeruginosa 8,9 y S. aureus vs. P. aeruginosa10). Sin embargo, con la complejidad de tales muestras biológicas, a menudo es difícil identificar la fuente de COV específicos.
Una estrategia para desenredar los perfiles volátiles de múltiples microbios infecciosos es realizar análisis del espacio de cabeza de los microorganismos tanto en monocultivo como en cocultivo11. El análisis del espacio de cabeza examina los analitos emitidos en el "espacio de cabeza" sobre una muestra en lugar de los incrustados en la muestra misma. Los metabolitos microbianos a menudo se han caracterizado en monocultivos debido a la dificultad para determinar el origen de los metabolitos microbianos en muestras clínicas complejas. Al perfilar volátiles a partir de monocultivos bacterianos, los tipos de volátiles que un microbio produce in vitro pueden representar una línea de base de su repertorio volátil. La combinación de cultivos bacterianos, por ejemplo, la creación de cocultivos y el perfil de las moléculas volátiles producidas pueden revelar las interacciones o la alimentación cruzada entre las bacterias12.
Otra estrategia para identificar el origen microbiano de las moléculas volátiles es proporcionar una fuente de nutrientes que esté etiquetada con un isótopo estable. Los isótopos estables son formas naturales y no radiactivas de átomos con un número diferente de neutrones. En una estrategia que se ha utilizado desde principios de la década de 1930 para rastrear el metabolismo activo en animales13, el microorganismo se alimenta de la fuente de nutrientes etiquetada e incorpora el isótopo estable en sus vías metabólicas. Más recientemente, se ha utilizado un isótopo estable en forma de agua pesada (D2O) para identificar S. aureus metabólicamente activo en una muestra clínica de esputo de FQ14. En otro ejemplo, se ha utilizado 13glucosa marcada con C para demostrar la alimentación cruzada de metabolitos entre aislados clínicos de FQ de P. aeruginosa y Rothia mucilaginosa12 .
Con el avance de las técnicas de espectrometría de masas, los métodos de detección de señales volátiles han pasado de observaciones cualitativas a mediciones más cuantitativas. Mediante el uso de la espectrometría de masas por cromatografía de gases (GC-MS), el procesamiento de muestras biológicas se ha vuelto al alcance de la mayoría de los entornos clínicos o de laboratorio. Se han utilizado muchos métodos para estudiar moléculas volátiles para perfilar muestras como alimentos, cultivos bacterianos y otras muestras biológicas, y aire y agua para detectar la contaminación. Sin embargo, varios métodos comunes de muestreo volátil con alto rendimiento requieren disolvente y no se realizan con las ventajas proporcionadas por la extracción al vacío. Además, a menudo se requieren volúmenes o cantidades mayores (superiores a 0,5 ml) de materiales muestreados parael análisis 15,16,17,18,19, aunque esto es específico del sustrato y requiere optimización para cada tipo de muestra y método.
Aquí, se empleó la extracción de sorbente asistida por vacío (VASE) seguida de la desorción térmica en un GC-MS para estudiar los perfiles volátiles de monocultivos y cocultivos bacterianos e identificar volátiles producidos activamente con sondeo de isótopos estables a partir de heces humanas, saliva, aguas residuales y muestras de esputo (Figura 1). Con cantidades de muestra limitadas, los COV se extrajeron de tan solo 15 μL de esputo. Los experimentos de sondeo de isótopos con muestras humanas requirieron agregar una fuente de isótopos estable, como glucosa de 13C, y medios para cultivar el crecimiento de la comunidad microbiana. La producción activa de volátiles fue identificada como una molécula más pesada por GC-MS. La extracción de moléculas volátiles bajo vacío estático permitió la detección de moléculas volátiles con mayor sensibilidad 20,21,22.
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Protocol
1. Pluma sorbente de espacio para la cabeza (HSP) y consideraciones de análisis de muestras
NOTA: El HSP que contiene el sorbente Tenax TA fue seleccionado para capturar una amplia gama de volátiles. Tenax tiene una menor afinidad por el agua en comparación con otros sorbentes, lo que le permite atrapar más COV de muestras de mayor humedad. Tenax también tiene un bajo nivel de impurezas y puede ser acondicionado para su reutilización. La selección del sorbente también se hizo en consideración con la columna instalada en el GC-MS (ver la Tabla de Materiales).
- Generar controles negativos mediante la extracción de medios y/o muestras en blanco con las mismas condiciones utilizadas para la extracción de muestras.
- Analice un HSP en blanco (previamente confirmado como limpio y libre de antecedentes significativos) en el GC-MS antes de analizar las muestras extraídas. Ejecute espacios en blanco entre tipos de muestra (por ejemplo, tres réplicas de monocultivo de bacterias, en blanco, tres réplicas de cocultivo de bacterias, en blanco, etc.).
- Limite el uso de artículos fragantes de cuidado personal o el consumo de alimentos malolientes antes de la extracción y el análisis de la muestra. Idealmente, prepare muestras en una campana de bioseguridad que no haya sido limpiada con alcohol u otros limpiadores volátiles durante al menos 30 minutos. Encienda el flujo de aire en la campana de bioseguridad durante 30-60 minutos antes de la preparación de la muestra.
- Mantenga las muestras en hielo para limitar la liberación de volátiles durante la preparación de la muestra.
2. Preparación monocultivo y cocultivo
- En la fase de bioseguridad, inocular cultivos de A. baumannii, S. aureus y P. aeruginosa en medios de crecimiento Todd Hewitt. Incubar durante la noche a 37 °C con agitación a 200 rpm.
- Después de la incubación durante la noche, realice el manejo del cultivo en la campana de bioseguridad. Diluir cada cultivo a una densidad óptica de 0,05 a 500 nm.
- Mezcle los cocultivos en partes iguales y pipetee 200 μL de medios de control, monocultivo o cocultivo en cada pozo de una placa de 96 pocillos, y colóquelos en una incubadora de 37 °C durante 24 h. Prepare un segundo plato para una incubación de 48 horas.
- Al final del período de incubación, prepare las muestras para la extracción en la sección 4. Pipetear cultivos líquidos en tubos de microcentrífuga y conservar a -80 °C.
NOTA: En este punto, las muestras se pueden almacenar a -80 ° C para extraerlas más tarde si es necesario.
3. Sondeo de isótopos estables en la preparación de muestras biológicas
NOTA: Las muestras de heces y saliva fueron donadas por donantes anónimos con la aprobación de la Junta de Revisión Institucional de la Universidad de California Irvine (HS # 2017-3867). Las aguas residuales provenían de San Diego, CA. Las muestras de esputo se recolectaron de sujetos con fibrosis quística como parte de un estudio más amplio aprobado por la Junta de Revisión Institucional de la Facultad de Medicina de la Universidad de Michigan (HUM00037056).
- Realizar todas las preparaciones de muestras biológicas en la campana de bioseguridad.
- Para preparar muestras fecales, agregue 1 ml de agua desionizada a 100 mg de heces en un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml y vórtice durante 3 min. Colocar sobre hielo cuando no esté en uso.
- A 15 μL de mezcla fecal y agua, agregue 485 μL de medio de infusión cerebral del corazón (BHI) con 20 mM 13C de glucosa, o BHI con 30% de deuterio (D2O). Asegúrese de que el volumen final de la muestra es de 500 μL. Preparar las muestras por triplicado técnico.
- Para preparar muestras de aguas residuales, agregue 500 μL de aguas residuales a 500 μL de BHI con 20 mM 13C de glucosa o BHI con 30% D2O para un volumen total de 1 mL. Preparar muestras por triplicado. Colocar sobre hielo cuando no esté en uso.
- Para preparar muestras de saliva, agregue 50 μL de saliva a 500 μL de BHI con 20 mM 13C de glucosa o BHI con 30% D2O para un volumen total de 550 μL. Prepare muestras por triplicado. Colocar sobre hielo cuando no esté en uso.
- Para preparar muestras de esputo para comparar los volátiles presentes en la muestra antes y después del cultivo, realice una primera extracción con 15 μL de esputo. Preparar muestras por triplicado. Colocar sobre hielo cuando no esté en uso. Continúe con la sección 4 para la extracción de la muestra y extraiga durante 18 h a 37 °C con agitación a 200 rpm.
- Después de completar la primera extracción de las muestras de esputo no cultivadas, guarde los viales con esputo. Añadir 500 μL de BHI con 20 mM 13C de glucosa a los viales con esputo a partir de 3.5.1. Colocar sobre hielo cuando no esté en uso.
- Para preparar muestras fecales, agregue 1 ml de agua desionizada a 100 mg de heces en un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml y vórtice durante 3 min. Colocar sobre hielo cuando no esté en uso.
- Continúe con la sección 4 para la extracción de muestras.
4. Extracción de muestras
- Coloque viales vacíos de análisis orgánico volátil (VOA) (20 ml) en la placa fría y coloque la placa fría sobre hielo en la campana de bioseguridad.
- Encienda la unidad de extracción de pluma sorbente 5600 (SPEU) y ajuste a la temperatura deseada según sea necesario para cada método.
NOTA: Para experimentos de sondeo de isótopos estables a 37 ° C, alcanzar el punto de consigna puede tomar hasta 15 minutos. Para experimentos de monocultivo y cocultivo a 70 °C, alcanzar el punto de consigna puede tardar hasta 60 min. - Recolecte HSP limpios que sean iguales al número de muestras preparadas, incluidos los HSP para medios o controles de muestras.
- Etiquete los viales de VOA de 20 ml de acuerdo con las muestras, réplicas e id. HSP según sea necesario. Use un marcador que resista el agua en caso de que se forme condensación en el exterior del vial mientras está en hielo.
- Dentro de la campana de bioseguridad, desenrosque la tapa blanca del vial, canalice rápidamente la muestra en el vial y ensamble la tapa negra, el revestimiento de la tapa y el HSP.
NOTA: Las muestras no deben entrar en contacto con el HSP, y el volumen de la muestra dependerá del tipo de muestra. - Coloque el vial que contiene la muestra y la HSP de nuevo en la placa fría.
- Repita los pasos 4.5 y 4.6 para cada muestra. Realice estos pasos por muestra en lugar de todos a la vez para evitar el calentamiento de la muestra y, por lo tanto, la liberación prematura de volátiles.
- Una vez que todas las muestras se hayan preparado en los viales de vidrio, realice los siguientes pasos fuera de la campana de bioseguridad en el banco. Encienda la bomba de vacío, coloque los viales bajo vacío a 30 mmHg y retire la fuente de vacío.
NOTA: No es necesario que los viales estén en la bandeja fría después de que se haya completado la aplicación al vacío. - Verifique la presión después de colocar todas las muestras al vacío utilizando el manómetro. Si un vial tiene una fuga, asegúrese de que la tapa esté bien atornillada y que las juntas tóricas blancas del HSP y los revestimientos de la tapa estén correctamente colocados.
NOTA: Un sello comprometido puede resultar en una disminución de la detección de volátiles en comparación con un vial al vacío. - Coloque los viales en el SPEU para el tiempo y la temperatura optimizados con agitación a 200 rpm. Extraer cultivos durante 1 h a 70 °C. Extraiga experimentos de sondeo de isótopos estables con muestras fecales, residuales, saliva y esputo durante 18 h a 37 ° C.
- Coloque la placa fría a -80 °C para su uso después de que se complete el período de extracción.
- Cuando se complete la extracción, coloque las muestras en la placa fría durante 15 minutos para extraer el vapor de agua del HSP y el espacio de cabeza del vial.
- Transfiera los HSP a sus mangas.
NOTA: El experimento se puede pausar aquí hasta ~ 1 semana a temperatura ambiente antes de perder los compuestos más altamente volátiles de los HSP.
5. Analizar muestras en la cromatografía de gases - espectrómetro de masas (GC-MS)
- Utilice los siguientes ajustes de GC-MS (consulte la Tabla de materiales): 35 °C con una retención de 5 minutos, rampa de 10 °C/min a 170 °C y una rampa de 15 °C/min a 230 °C con una relación dividida de 20:1 y un tiempo de ejecución total de 38 min.
- Establezca el método de desorción de la siguiente manera: 2 min, 70 °C de precalentamiento; 2 min 260 °C de desorción; 34 min, 260 °C bakeout; y 2 min, 70 °C post horneado.
- Configure la secuencia de muestras e inicie la ejecución de acuerdo con la instrumentación.
- Para configurar una secuencia en el software Entech, abra el programa. En las opciones a la derecha del menú desplegable del instrumento, seleccione 5800 | Secuencia.
- Observe la tabla de secuencias en el software Entech similar a la del software GC-MS. Asigne a la columna ID de ejemplo el nombre del número de date_vial actual. Tenga en cuenta que Name es análogo a Name en la tabla de secuencia GC-MS, y el método 5800 determina la velocidad de la rampa de temperatura, los tiempos de retención, etc. (abre un menú para seleccionar el método generado en el paso 5.2).
- Tenga en cuenta que las columnas Bandeja y Posición determinan dónde irá el riel de preparación de muestras (SPR) para recoger los HSP.
- Observe las dos bandejas con 30 puntos cada una a la izquierda inmediata, dispuestas como seis columnas con cinco puntos cada una. La posición de la bandeja que queda más a la izquierda y más cerca del usuario (delante) es la posición 1, mientras que la más a la derecha, más alejada, es la posición 30.
- Tenga en cuenta que estas bandejas son HSP A o B, donde HSP B es la bandeja más cercana al SPR (bandeja más interna), y directamente detrás de HSP B está HSP Blank. Coloque las muestras extraídas en las bandejas y seleccione el punto en la secuencia en consecuencia.
- Guarde la tabla de secuencia, seleccione Ejecutar en el lado izquierdo y, a continuación, Comience con espacio en blanco en el desorbente si el HSP en blanco está en el desorber (denotado por un HSP marcado con una etiqueta amarilla).
- Tenga en cuenta que los HSP serán manejados por el SPR para cada muestra en la secuencia. Deje que el SPR se caliente, luego aparecerá un mensaje en la parte superior de la pantalla para confirmar si el espacio en blanco está en el desorber. Haga clic en Omitir para confirmar que el lápiz está allí. Permita que el SPR ejecute todas las muestras automáticamente, y la secuencia en el lado GC-MS registrará automáticamente los datos en archivos separados.
6. Análisis de datos
- Datos de filtro de calidad en el software GC-MS (Tabla de Materiales).
- Revise cada pico en el cromatograma y anote los picos que coincidan con la biblioteca del Instituto Nacional de Estándares y Tecnología (NIST) (o con otra biblioteca disponible).
- Agregue picos de cromatograma anotados al método de procesamiento. Establezca los criterios para seleccionar picos para incluir compuestos con una probabilidad superior al 75%, y asegúrese de que la alineación de cada ion identificativo del compuesto se encuentre dentro del centro del pico.
- Para agregar un pico al método de procesamiento, seleccione Calibrar | Editar | compuesto Nombre | inserte el compuesto en Compuesto estándar externo. Agregue el nombre del compuesto, tiempo de retención, Quant Signal Target Ion. Agregue los tres picos más grandes. Para guardar, seleccione aceptar | Método | Guardar.
- Una vez configurado el método de proceso, proceda a Cuantificar | Calcular y ver | QEdit Resultado cuantitativo.
- Inspeccione cada compuesto para asegurarse de que los picos se alineen con sus tiempos de retención esperados y estén por encima del ruido de fondo.
- Una vez que se haya completado QEdit, seleccione Salir | Sí para guardar el QEdits y volver al cromatograma principal. Exporte las integraciones de área abriendo el archivo en el lado izquierdo. Seleccione Cantidadar | Generar informe.
- Para exportar archivos para su uso en DExSI, seleccione | Exportar datos a formato AIA | Cree un nuevo directorio y seleccione una ubicación para el archivo o Usar directorio existente.
- Observe cómo se abre una nueva ventana para seleccionar los archivos que desea exportar. Mueva los archivos al lado derecho de la ventana y haga clic en Procesar. Espere de unos segundos a unos minutos dependiendo de la cantidad de archivos que se conviertan.
- Corrija la abundancia de isótopos en DExSI de acuerdo con las instrucciones para el software DExSI (https://github.com/DExSI/DExSI) y realice análisis con un software o programa favorito (por ejemplo, R). Los scripts utilizados para generar las figuras se encuentran en https://github.com/joannlp/
VOC_SIP .
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Representative Results
Monocultivos y cocultivos de S. aureus, P. aeruginosa y A. baumannii
Los monocultivos y cocultivos consistieron en las especies bacterianas S. aureus, P. aeruginosa y A. baumannii. Estos son patógenos oportunistas comunes que se encuentran en heridas humanas e infecciones crónicas. Para identificar las moléculas volátiles presentes en los monocultivos y cocultivos, se realizó una extracción corta de 1 h a 70 °C con agitación a 200 rpm. A partir de los monocultivos y cocultivos en puntos de tiempo de 24 y 48 h, se detectaron 43 moléculas volátiles anotadas (Figura 2) entre las que se encontraban aldehídos, cetonas, alcoholes, compuestos sulfúricos, hidrocarburos, ácidos o ésteres carboxílicos y aromáticos. Hubo un pequeño número de moléculas volátiles que solo se detectaron en ciertos monocultivos o cocultivos en ciertos puntos de tiempo. Por ejemplo, la acetoína y el acetato de 3-hidroxi-2-butanona solo se detectaron en los cultivos de S. aureus en el punto de tiempo de 48 h (Figura 2).
El volátil 1-propanol 2-metilo se detectó sólo en el cocultivo de P. aeruginosa y A. baumannii a las 48 h (Figura 2). El acetato de etilo estuvo presente en los cocultivos de A. baumannii con S. aureus o P. aeruginosa a las 48 h (Figura 2). Los metabolitos heptano, 2,3-dimetil y pentano, 2-metilo sólo se detectaron en el cultivo de A. baumannii a las 24 h (Figura 2). El acetaldehído y el etanol tuvieron mayores abundancias relativas en el cocultivo de A. baumannii y S. aureus en el punto de tiempo de 24 h en comparación con 48 h y cualquiera de las cepas en cultivo solo (Figura 2). Algunos de los volátiles eran más abundantes en cultivos en el punto de tiempo de 24 o 48 horas. Los ácidos grasos de cadena corta, incluyendo el ácido acético, el ácido butanoico y el ácido propanoico, tuvieron altas abundancias relativas en cultivos a las 48 h, pero no se detectaron en los cultivos de 24 h (Figura 2). El hexano fue más abundante en el control de TH a las 24 h en comparación con las 48 h (Figura 2).
Etiquetado de isótopos estables de muestras fecales, residuales y de saliva
Para identificar la producción activa de moléculas volátiles a partir de una muestra biológica, se agregó una fuente de nutrientes etiquetada, glucosa 13C o D2O, y medios para apoyar el crecimiento de la comunidad microbiana. Se analizó una muestra única de cada uno de los diferentes tipos de muestras de muestras fecales, residuales y de saliva por triplicado. Hubo más incorporación del 13C en moléculas volátiles totalmente marcadas (Figura 3A-D) en comparación con la incorporación con deuterio (Figura 3E). El 13C se incorporó a 2-butanona, 3-hidroxi; 2,3-butanediona; ácido acético; y fenol para todas las muestras fecales, residuales y saliva (Figura 3A).
Los otros volátiles etiquetados se detectaron en dos o un tipo de muestra. Por ejemplo, la acetona, el ácido butanoico y el ácido propanoico se detectaron como etiquetados en la saliva y las aguas residuales (Figura 3B). Los volátiles marcados, trisulfuro de dimetilo y dimetilo disulfuro, se enriquecieron en muestras fecales y de saliva (Figura 3C). Los volátiles, 1-propanol, 2-butanona, benzofenona, etanol y tiolacetato de metilo, se enriquecieron solo en aguas residuales (Figura 3D). El volátil marcado, 2,3-pentanedoína, fue enriquecido en saliva (Figura 3D). El deuterio se incorporó a los volátiles, ácido acético; benzaldehído, 4-metilo; trisulfuro de dimetilo; y fenol, ya sea de muestras de saliva o aguas residuales (Figura 3E). Además de los volátiles enriquecidos con isótopos, se detectaron volátiles que no contenían isótopos estables incorporados. Por ejemplo, los compuestos de pirazina, a excepción de la pirazina, 2,5-dimetilo, se detectaron en muestras fecales, de aguas residuales y de saliva, pero no se enriquecieron completamente con 13C (Figura suplementaria S1).
Etiquetado de isótopos estables de muestras de esputo
Se implementó la estrategia de etiquetado de isótopos estables para identificar volátiles producidos activamente con muestras de esputo de siete sujetos humanos con fibrosis quística. Los volátiles en la muestra se compararon con los que surgieron de muestras cultivadas con una etiqueta de isótopos estable. Cada componente volátil de cada muestra se analizó dos veces: antes y después del sondeo de isótopos estables con glucosa y medios de 13C. Las muestras recogidas de los sujetos abarcaron tres puntos de tiempo o estados clínicos diferentes: línea de base, exacerbación y tratamiento23. Los volátiles detectados como etiquetados en las muestras de esputo cultivado tenían diferentes abundancias relativas en comparación con los volátiles no etiquetados de las muestras de esputo no cultivadas. Las condiciones de cultivo en los experimentos de sondeo de isótopos estables con esputo pueden favorecer el crecimiento de ciertos microbios, lo que lleva a diferencias en las abundancias relativas de volátiles en comparación con las muestras de esputo no cultivadas.
Por ejemplo, el ácido acético, el trisulfuro de dimetilo, la acetona y el propanal, 2-metilo fueron más abundantes en las muestras de esputo cultivadas en comparación con las muestras de esputo no cultivadas (Figura 4). La detección de etanol marcado con 13C, que puede estar presente en cantidades variables en el aire de la habitación de fondo, proporciona evidencia de que el etanol fue producido activamente por el metabolismo microbiano a partir de glucosa de 13C. La cantidad de variación se explicó por sujeto según lo evaluado por el Análisis Multivariante Permutacional de Varianza (PERMANOVA) y también fue diferente para los dos conjuntos de datos volátiles diferentes (Tabla 1 y Figura Suplementaria S2). Para el esputo cultivado marcado con 13C, el 51% de la variación fue explicada por el sujeto, mientras que el 33% de la variación fue explicada por el sujeto a partir de los volátiles en las muestras de esputo no cultivado (Tabla 1). La composición de la comunidad del microbioma determinada por la secuenciación del amplicón 16S rRNA de los siete sujetos fue única para cada sujeto (Figura suplementaria S3), y las firmas individuales también se reflejaron en las moléculas volátiles de esputo cultivadas y no cultivadas detectadas.
En el esputo cultivado, se detectaron 23 volátiles que estaban completamente etiquetados con 13carbonos. Los volátiles enriquecidos con isótopos (activos) detectados a partir de las muestras de esputo fueron diferentes para cada sujeto. Los volátiles con enriquecimiento de isótopos detectados en las muestras de esputo de los siete sujetos fueron 2,3-butanediona; ácido acético; acetona; trisulfuro de dimetilo; disulfuro, dimetilo; y pirazina, 2,5-dimetilo (Figura 5). Aunque esos volátiles se detectaron en todos los sujetos, el enriquecimiento de isótopos para cada sujeto varió. Las muestras del sujeto 7 tenían un mayor enriquecimiento isotópico de disulfuro dimetilo en comparación con los otros seis sujetos (Figura 5B). La acetona fue mayor en los sujetos 4 y 6 (Figura 5). Algunos volátiles se enriquecieron con 13C solo en ciertos sujetos. Por ejemplo, el 1-butanol, el 3-metilo y el ácido propanoico, el 2-metilo solo se enriquecieron en un subconjunto de muestras del sujeto 2 (Figura 5). Además de los volátiles enriquecidos con isótopos, también se detectaron volátiles como no etiquetados a partir del mismo esputo cultivado (Figura suplementaria S4). Volátiles 2-piperidinona; benzaldehído, 4-metilo; benzotiazol; ácido butanoico, 3-metilo; hexanal; hexano; alcohol isopropílico; fenol; ácido propanoico, 2-metilo; y pirrolo 1,2-apirazina-1,4-diona, hexahidro, se detectaron en las muestras de esputo, pero no fueron enriquecidos con isótopos (Figura suplementaria S4).
Figura 1: Esquema de protocolo. Se coloca una muestra biológica en un vial de vidrio y se ensambla con el revestimiento de la tapa y la pluma sorbente Headspace. Se aplica un vacío al vial hasta que se alcanza una presión de aproximadamente 30 mmHg. Se retira la fuente de vacío y los viales se colocan en la unidad de extracción de la pluma sorbente, donde se realiza una extracción estática con la ayuda del calor, la agitación y el tiempo. Después de la extracción, los viales se colocan en un bloque de metal frío para eliminar el agua del espacio de la cabeza y el HSP. Los HSP se recogen y funcionan a través de la desorción térmica en el GC-MS. Los datos se analizan con ChemStation, DExSI y R. Abreviaturas: HSP = Headspace Sorbent Pen; GC-MS = cromatografía de gases-espectrometría de masas. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Mapa de calor de monocultivos y cocultivos. COV detectados a partir de monocultivos y cocultivos en puntos de tiempo de 24 y 48 horas. Los cocultivos son las combinaciones de las letras que representan cada cepa. Todas las muestras se extrajeron durante 1 h a 70 °C con agitación a 200 rpm. Los valores de intensidad del mapa de calor son puntuaciones Z de columna, normalizadas por metabolito. La puntuación Z se calculó por la diferencia de valor de la media de valores, dividida por la desviación estándar de los valores. El dendrograma se generó con la opción cluster_cols en la función pheatmap de R. El dendrograma representa la agrupación jerárquica en la que los metabolitos que se agrupan tienen puntuaciones Z más similares en todas las muestras. Abreviaturas: A = A. baumanii; P = P. aeruginosa; S = S. aureus; TH = Todd Hewitt media (control). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Conversión porcentual de 13C en masa de molécula volátil en muestras fecales, salivales y de aguas residuales durante 18 h de incubación y extracción simultáneas. La conversión porcentual se calculó para compuestos totalmente marcados tomando la masa del compuesto totalmente marcado (M+N) y dividiéndola por (M+N) + la masa de la masa volátil no etiquetada (M), donde N es el número máximo de carbonos posibles (en A-D) o hidrógenos (en E) que se pueden etiquetar en cada molécula volátil. Los compuestos se consideran completamente etiquetados cuando todos los carbonos del volátil se reemplazan por 13C. Cuando faltan datos, no se detectó el volátil. Por ejemplo, en (D), no se detectó 1-propanol en muestras fecales o de saliva. Número de réplicas por muestra = 3. (A) Los 13volátiles marcados con C detectados en todos los tipos de muestra (heces, saliva y aguas residuales). (B) Los 13volátiles marcados con C solo se detectaron en muestras de saliva y aguas residuales. (C) Los 13volátiles marcados con C detectados en heces y muestras de saliva. (D) Los 13volátiles marcados con C detectados en uno de los tres tipos de muestra diferentes. (E) Las moléculas volátiles marcadas con deuterio. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4: Mapa de calor de 13volátiles marcados con C a partir de esputo cultivado y moléculas volátiles detectadas a partir de esputo no cultivado. Los volátiles etiquetados provienen de los experimentos de sondeo de isótopos estables donde se agregaron glucosa 13C y medio de infusión de corazón cerebral al esputo durante la etapa de extracción para cultivar el crecimiento microbiano y capturar la producción volátil activa. Las moléculas volátiles no etiquetadas se detectaron directamente a partir de muestras de esputo. Las intensidades del mapa de calor son puntuaciones Z como se describe en la leyenda de la Figura 2. Sin embargo, las puntuaciones Z se calcularon dentro de cada experimento para los experimentos de esputo cultivado y no cultivado. El dendrograma se generó como se describe en la Figura 2. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 5: Conversión porcentual de 13C en masa de molécula volátil en muestras de esputo de siete sujetos con fibrosis quística durante 18 h de incubación y extracción simultáneas. La conversión porcentual se calculó como se describe en la leyenda de la Figura 3. Los volátiles no detectados en las muestras están indicados por la ausencia de datos. N = 1-3. (A) Los 13volátiles marcados con C detectados con una conversión porcentual más alta en la mayoría de las muestras de esputo. (B) Los 13volátiles marcados con C detectados con una conversión porcentual más baja en la mayoría de las muestras de esputo. (C) Los 13volátiles marcados con C detectados en un porcentaje de conversión más bajo en una minoría de las muestras de esputo. Abreviaturas: B = línea de base; E = exacerbación; T = tratamiento. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
| Grados de libertad | R2 | Valor de P | ||
| Esputo inculto | Asunto | 6 | 0.33 | 0.001 |
| Estado clínico | 2 | 0.01 | 0.46 | |
| Asunto: Estado clínico | 12 | 0.12 | 0.092 | |
| Esputo cultivado con glucosa y medios de 13C | Asunto | 6 | 0.51 | 0.001 |
| Estado clínico | 2 | 0.02 | 0.095 | |
| Asunto: estado clínico | 12 | 0.11 | 0.194 |
Tabla 1: Análisis multivariante permutado de varianza (PERMANOVA) de muestras de esputo. El PERMANOVA se generó utilizando la función adonis del paquete vegano en R.
Figura suplementaria S1: Las abundancias relativas de volátiles etiquetados (M + N (máx.)) y no etiquetados (M + 0) en muestras fecales, de saliva y de aguas residuales. Haga clic aquí para descargar este archivo.
Figura suplementaria S2: Escalamiento multidimensional no métrico de esputo cultivado con sondeo de isótopos estables y esputo no cultivado. (A) El NMDS de esputo cultivado con glucosa y medios de 13C se generó con k = 3 dimensiones. El valor de estrés fue de 0,07. (B) El NMDS de esputo no cultivado se generó con k = 3 dimensiones. El valor de estrés fue de 0,13. Abreviaturas: NMDS = escalamiento multidimensional no métrico; B = línea de base; E = exacerbación; T = tratamiento. Haga clic aquí para descargar este archivo.
Figura suplementaria S3: Composición de la comunidad microbiana de muestras de esputo de sujetos con fibrosis quística. Evaluado por secuenciación de amplicon 16S rRNA como parte de un estudio más amplio, más información sobre el enfoque encontrado en Carmody et al. 202019. de sujetos con fibrosis quística. Cada barra apilada es un punto de tiempo diferente. Abreviaturas: B = basal, E = exacerbación, T = tratamiento. Haga clic aquí para descargar este archivo.
Figura suplementaria S4: Las abundancias relativas de volátiles marcados (M + N (máx.)) y no etiquetados (M + 0) en muestras de esputo de siete sujetos con fibrosis quística. Haga clic aquí para descargar este archivo.
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Discussion
Para identificar la producción volátil en cultivos in vitro y muestras asociadas al ser humano, se realizó un análisis volátil de monocultivos y cocultivos de P. aeruginosa, S. aureus y A. baumanii y sondeo de isótopos estables de diferentes muestras biológicas. En el análisis para los monocultivos y cocultivos, se detectaron volátiles realizando una extracción corta durante 1 h a 70 °C. El análisis volátil de monocultivos y cocultivos permitió el estudio de los compuestos producidos tanto por especies individuales como durante sus interacciones con otras especies. Hubo diferencias en las abundancias relativas entre los diferentes tipos de cultura y puntos de tiempo. En los experimentos de sondeo de isótopos estables, las muestras biológicas incluyeron heces y saliva de sujetos sanos, aguas residuales y esputo de sujetos con fibrosis quística. El perfil de isótopos estables permitió la identificación de moléculas volátiles producidas activamente mediante la extracción durante 18 h a 37 °C. El largo tiempo de extracción con una temperatura más baja permitió el crecimiento y el metabolismo de los microbios presentes en las muestras biológicas. La comparación de los enriquecimientos de glucosa 13C y D2O mostró que hubo un enriquecimiento de isótopos más extenso con 13C marcado.
Al extraer diferentes tipos de muestras, se tomaron pasos iniciales de optimización antes de comenzar una ejecución completa. Primero, pruebe diferentes volúmenes de una muestra como una prueba. Para algunos tipos de muestra, esputo, por ejemplo, solo se disponía de pequeños volúmenes de muestra. Se recomienda comenzar con un volumen menor o una cantidad menor de muestra primero, dependiendo del tipo de muestra y las cantidades de muestra disponibles. No extraiga un gran volumen o demasiado de la muestra porque podría abrumar la columna y contaminar el HSP. La sobrecarga de columna puede ser evidente cuando los picos en el cromatograma están saturados o aparecen en ejecuciones posteriores. Se ha producido contaminación por HSP si el arrastre está presente cuando el HSP se vuelve a ejecutar en el GC-MS. En los experimentos de monocultivo y cocultivo, 200 μL de cultivo fueron suficientes para detectar una variedad de volátiles. En los experimentos de sondeo de isótopos estables, dependiendo del tipo de muestra, el volumen para cada experimento varió de 500 μL a 1 mL. En segundo lugar, dependiendo del tipo de muestra y los compuestos de interés, el tiempo y la temperatura de extracción, así como los métodos GC-MS y de desorción térmica deberán ajustarse para optimizar la detección de volátiles. Se determinó que estos métodos eran apropiados para los analitos de interés y el tipo de columna.
Después de optimizar el método, los pasos críticos en el protocolo pertenecían a los pasos anteriores y posteriores a la extracción. Durante la preparación de la muestra, las muestras se colocaron en hielo para que los volátiles presentes en la muestra no escaparan. También era importante asegurarse de que el sello de vacío estuviera hermético y que la tapa estuviera bien cerrada. De lo contrario, habría una extracción ineficiente y una menor detección de los volátiles de la muestra. Las fugas pueden surgir de las juntas tóricas alrededor del revestimiento de la tapa o el HSP. Para asegurarse de que el vial estuviera al vacío, se utilizó un medidor antes de la extracción para asegurarse de que las juntas tóricas siguieran funcionando. Además, después de la extracción, se colocaron muestras en el bloque de hielo para que el agua se extrajera del espacio de la cabeza durante un período determinado. El agua en la columna podría conducir a cambios en los tiempos de retención y la supresión de la respuesta de la EM, lo que llevaría a resultados no cuantitativos. La capacidad de extraer cualquier exceso de agua de los HSP antes de retirarlo del manguito de vacío / conjunto del vial es posible debido a la naturaleza del sistema cerrado del proceso VASE y la capacidad de extraer agua al punto más frío dentro de ese sistema de extracción utilizando la placa fría de -80 ° C.
Existen limitaciones y ventajas para estos métodos con respecto a los métodos alternativos. Al evaluar los experimentos de monocultivo y cocultivo, se detectaron firmas volátiles que eran específicas de un microbio o cocultivo en particular. También hubo cambios en las abundancias volátiles a lo largo del tiempo. En cuanto a los experimentos de sondeo de isótopos estables en los diferentes tipos de muestras biológicas, el etiquetado con deuterio no dio lugar a tantos volátiles enriquecidos con isótopos como la glucosa 13C. El metabolismo requerido para producir volátiles enriquecidos con isótopos con deuterio puede ser más limitado. Además, se agregaron medios a las muestras biológicas para mejorar el crecimiento microbiano, lo que puede conducir a cambios en la composición de la comunidad microbiana. Las condiciones de cultivo de los experimentos de sondeo de isótopos estables pueden ser seleccionadas para el crecimiento favorecido de ciertos microbios en una muestra biológica. Esto se opuso a la extracción corta durante una hora a 70 ° C diseñada para detectar los volátiles en la muestra de la comunidad antes de que uno o pocos de los microbios comiencen a apoderarse de la comunidad. La complejidad de las composiciones microbianas y químicas de los tipos de muestras fecales, residuales, saliva y esputo dificultan la asignación de firmas químicas específicas a cualquier origen microbiano o humano sin análisis adicionales como la secuenciación. Este método proporcionó una extracción al vacío de alto rendimiento y sin disolventes que condujo a una detección más sensible de muestras de bajo volumen. Los volúmenes utilizados para estos experimentos oscilaron entre 200 μL y 1 mL de muestras biológicas cultivadas. En otros casos (datos no mostrados), se extrajeron muestras biológicas (por ejemplo, muestras de esputo y fecales) tan bajas como 15 μL o 10 μg.
Para futuras aplicaciones del método, se podría analizar una amplia gama de tipos de muestras con volúmenes pequeños o limitados. Se podrían extraer docenas de muestras simultáneamente, y el tiempo de ejecución dependería de los parámetros del instrumento GC-MS específico. En el caso del sondeo de isótopos estables, cuando se combina con la secuenciación metagenómica, existe la posibilidad de identificar los microbios responsables de la producción de las moléculas volátiles. El metagenoma de la muestra biológica podría secuenciarse antes y después de la extracción con sondeo de isótopos estables para identificar cambios en la composición de la comunidad microbiana. La secuenciación metagenómica permitiría identificar los genes responsables de la producción de moléculas volátiles enriquecidas con isótopos. Aquí se destacan algunos ejemplos de los tipos de muestra y enfoques que podrían usarse como entrada para el protocolo presentado, que ya se ha establecido en diferentes industrias. Debido a que las moléculas volátiles son indicadores de diagnóstico importantes, el uso de este protocolo podría ampliarse a laboratorios biológicos y entornos de atención médica clínica.
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Disclosures
V. L. V y S. J.B. D. fueron ex empleados de Entech Instruments Inc., y K. W. es miembro del Programa Universitario de Entech. J. P., J. K. y C. I. R. no tienen conflictos de intereses que declarar.
Acknowledgments
Agradecemos a Heather Maughan y Linda M. Kalikin por la cuidadosa edición de este manuscrito. Este trabajo fue apoyado por NIH NHLBI (subvención 5R01HL136647-04).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 13C glucose | Sigma-Aldrich | 389374-1G | |
| 2-Stg Diaph Pump | Entech Instruments | 01-10-20030 | |
| 20 mL VOA vials | Fisher Scientific | 5719110 | |
| 24 mm Black Caps with hole, no septum | Entech Instruments | 01-39-76044B | holds lid liner in place on vial |
| 24 mm vial liner for sorbent pens | Entech Instruments | SP-L024S | allows pens to make a vacuum seal at top of vial |
| 5600 Sorbent pen extraction unit (SPEU) | Entech Instruments | 5600-SPES | 5600 Sorbent Pen Extraction Unit -120 VAC |
| 96-well assay plates | Genesee | 25-224 | |
| Brain Heart Infusion (BHI) media | Sigma-Aldrich | 53286-500G | |
| ChemStation Stofware | Agilent | ||
| DB-624 column | Agilent | 122-1364E | 60 m, 0.25 mm ID, 1.40 micron film thickness, in GC-MS |
| Deuterium oxide | Sigma-Aldrich | 151882-1L | |
| Dexsi sofware | Dexsi (open source) | ||
| GC-MS (7890A GC and 5975C inert XL MSD with Triple-Axis Detector) | Agilent | 7890A GC and 5975C inert XL MSD with triple-axis detector | |
| Headspace Bundle HS-B01, 120VA | Entech Instruments | SP-HS-B01 | Items for running headspace extraction included in bundle |
| Headspace sorbent pen (HSP) - blank | Entech Instruments | SP-HS-0 | |
| Headspace sorbent pen (HSP) Tenax TA (35/60 Mesh) | Entech Instruments | SP-HS-T3560 | |
| Microcentrifuge tubes (2 mL) | VWR | 53550-792 | |
| O-rings | Entech Instruments | SP-OR-L024 | |
| Sample Preparation Rail | Entech Instruments | ||
| Sorbent pen thermal conditioner | Entech Instruments | 3801-SPTC | |
| Todd Hewitt (TH) media | Sigma | T1438-500G |
References
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