Summary
Detta protokoll beskriver extraktionen av flyktiga organiska föreningar från ett biologiskt prov med vakuumassisterad sorbentextraktionsmetod, gaskromatografi i kombination med masspektrometri med hjälp av Entech Sample Preparation Rail och dataanalys. Den beskriver också odling av biologiska prover och stabil isotopprobning.
Abstract
Flyktiga organiska föreningar (VOC) från biologiska prover har okänt ursprung. VOC kan härröra från värden eller olika organismer inifrån värdens mikrobiella samhälle. För att avlägsna ursprunget till mikrobiella VOC utfördes flyktig headspace-analys av bakteriella mono- och samkulturer av Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa och Acinetobacter baumannii och stabil isotopprobning i biologiska prover av avföring, saliv, avloppsvatten och sputum. Mono- och samkulturer användes för att identifiera flyktig produktion från enskilda bakteriearter eller i kombination med stabil isotopprobning för att identifiera den aktiva metabolismen av mikrober från de biologiska proverna.
Vakuumassisterad sorbentextraktion (VASE) användes för att extrahera VOC. VASE är en lättanvänd, kommersialiserad, lösningsmedelsfri extraktionsmetod för huvudutrymme för halvflyktiga och flyktiga föreningar. Bristen på lösningsmedel och de nära vakuumförhållanden som används vid extraktion gör det relativt enkelt och snabbt att utveckla en metod jämfört med andra extraktionsalternativ som tert-butylering och mikroextraktion i fast fas. Arbetsflödet som beskrivs här användes för att identifiera specifika flyktiga signaturer från mono- och samkulturer. Vidare identifierade analys av den stabila isotopprobningen av humanassocierade biologiska prover VOC som antingen producerades vanligt eller unikt. Detta dokument presenterar det allmänna arbetsflödet och experimentella överväganden för VASE i samband med stabil isotopprobning av levande mikrobiella kulturer.
Introduction
Flyktiga organiska föreningar (VOC) har stort löfte för bakteriell detektion och identifiering eftersom de emitteras från alla organismer, och olika mikrober har unika VOC-signaturer. Flyktiga molekyler har använts som en icke-invasiv mätning för att detektera olika luftvägsinfektioner inklusive kronisk obstruktiv lungsjukdom1, tuberkulos2 i urin3 och ventilatorassocierad lunginflammation4, förutom att skilja personer med cystisk fibros (CF) från friska kontrollpersoner 5,6. Flyktiga signaturer har till och med använts för att särskilja specifika patogeninfektioner vid CF (Staphylococcus aureus7, Pseudomonas aeruginosa 8,9 och S. aureus vs. P. aeruginosa10). Men med komplexiteten hos sådana biologiska prover är det ofta svårt att fastställa källan till specifika VOC.
En strategi för att lösgöra de flyktiga profilerna från flera infekterande mikrober är att utföra headspace-analys av mikroorganismer i både mono- och samkultur11. Headspace-analys undersöker analyterna som emitteras i "huvudutrymmet" ovanför ett prov snarare än de som är inbäddade i själva provet. Mikrobiella metaboliter har ofta karakteriserats i monokulturer på grund av svårigheten att bestämma ursprunget till mikrobiella metaboliter i komplexa kliniska prover. Genom att profilera flyktiga ämnen från bakteriella monokulturer kan de typer av flyktiga ämnen som en mikrob producerar in vitro representera en baslinje för dess flyktiga repertoar. Att kombinera bakteriekulturer, t.ex. skapa samkulturer, och profilera de flyktiga molekylerna som produceras kan avslöja interaktionerna eller korsmatningen mellan bakterierna12.
En annan strategi för att identifiera det mikrobiella ursprunget för flyktiga molekyler är att tillhandahålla en näringskälla som är märkt med en stabil isotop. Stabila isotoper är naturligt förekommande, icke-radioaktiva former av atomer med ett annat antal neutroner. I en strategi som har använts sedan början av 1930-talet för att spåra aktiv metabolism hos djur13, matar mikroorganismen av den märkta näringskällan och införlivar den stabila isotopen i sina metaboliska vägar. På senare tid har en stabil isotop i form av tungt vatten (D2O) använts för att identifiera metaboliskt aktiv S. aureus i ett kliniskt CF-sputumprov14. I ett annat exempel har 13C-märkt glukos använts för att demonstrera korsmatning av metaboliter mellan CF-kliniska isolat av P. aeruginosa och Rothia mucilaginosa12 .
Med utvecklingen av masspektrometritekniker har metoder för att detektera flyktiga signaler flyttat från kvalitativa observationer till mer kvantitativa mätningar. Genom att använda gaskromatografi masspektrometri (GC-MS) har bearbetning av biologiska prover blivit inom räckhåll för de flesta laboratorie- eller kliniska inställningar. Många metoder för att kartlägga flyktiga molekyler har använts för att profilera prover som mat, bakteriekulturer och andra biologiska prover och luft och vatten för att upptäcka föroreningar. Flera vanliga metoder för flyktig provtagning med hög genomströmning kräver emellertid lösningsmedel och utförs inte med de fördelar som vakuumextraktion ger. Dessutom krävs ofta större volymer eller kvantiteter (större än 0,5 ml) provterade material för analys 15,16,17,18,19, även om detta är substratspecifikt och kräver optimering för varje provtyp och metod.
Här användes vakuumassisterad sorbentextraktion (VASE) följt av termisk desorption på en GC-MS för att kartlägga de flyktiga profilerna för bakteriella mono- och samkulturer och identifiera aktivt producerade flyktiga ämnen med stabil isotopprobning från mänsklig avföring, saliv, avloppsvatten och sputumprover (Figur 1). Med begränsade provmängder extraherades VOC från så lite som 15 μL sputum. Isotopprobningsexperiment med mänskliga prover krävde tillsats av en stabil isotopkälla, såsom 13C glukos, och media för att odla tillväxten av det mikrobiella samhället. Den aktiva produktionen av flyktiga ämnen identifierades som en tyngre molekyl av GC-MS. Extraktion av flyktiga molekyler under ett statiskt vakuum möjliggjorde detektion av flyktiga molekyler med ökad känslighet 20,21,22.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Överväganden för Headspace Sorbent Pen (HSP) och provanalys
OBS: HSP som innehåller sorbent tenax TA valdes för att fånga ett brett spektrum av flyktiga ämnen. Tenax har en lägre affinitet för vatten jämfört med andra sorbenter, vilket gör det möjligt att fånga fler VOC från prover med högre fuktighet. Tenax har också en låg nivå av föroreningar och kan konditioneras för återanvändning. Sorbentval gjordes också med hänsyn till kolonnen installerad i GC-MS (se materialförteckningen).
- Generera negativa kontroller genom att extrahera medie- och/eller provämnen med samma villkor som används för provextraktion.
- Analysera en tom HSP (tidigare bekräftad att vara ren och fri från betydande bakgrund) på GC-MS innan du analyserar extraherade prover. Kör ämnen mellan provtyper (t.ex. tre replikat av bakterier monokultur, blank, tre replikat av bakterier samodling, blank, etc.).
- Begränsa användningen av doftande personliga hygienartiklar eller konsumtion av illaluktande livsmedel före provutvinning och analys. Förbered helst prover i en biosäkerhetskåpa som inte har rengjorts med alkohol eller andra flyktiga rengöringsmedel på minst 30 minuter. Slå på luftflödet i biosäkerhetshuven i 30-60 minuter före provberedning.
- Förvara prover på is för att begränsa flyktig frisättning under provberedningen.
2. Mono- och samkulturberedning
- I biosäkerhetshuven inokulerar kulturer av A. baumannii, S. aureus och P. aeruginosa i Todd Hewitt tillväxtmedia. Inkubera över natten vid 37 °C med omrörning på 200 rpm.
- Efter inkubationen över natten, utför kulturhantering i biosäkerhetshuven. Späd varje kultur till optisk densitet 0,05 vid 500 nm.
- Blanda samkulturer i lika delar och pipetter 200 μL styrmedier, monokultur eller samkultur i varje brunn på en 96-brunnsplatta och placera i 37 ° C inkubator i 24 timmar. Förbered en andra platta för en 48-timmars inkubation.
- Vid slutet av inkubationsperioden, förbered prover för extraktion i avsnitt 4. Pipettera flytande kulturer i mikrocentrifugrör och förvara vid -80 °C.
OBS: Vid denna tidpunkt kan prover lagras vid -80 ° C för att extrahera senare om det behövs.
3. Stabil isotopprobning vid beredning av biologiska prover
OBS: Avförings- och salivproverna donerades från anonyma givare med godkännande från University of California Irvine Institutional Review Board (HS # 2017-3867). Avloppet kom från San Diego, CA. Sputumproverna samlades in från personer med cystisk fibros som en del av en större studie godkänd av University of Michigan Medical School Institutional Review Board (HUM00037056).
- Utför alla biologiska provpreparat i biosäkerhetshuven.
- För att förbereda fekala prover, tillsätt 1 ml avjoniserat vatten till 100 mg avföring i ett 1,5 ml mikrocentrifugrör och virvel i 3 min. Lägg på is när den inte används.
- Till 15 μL fekal och vattenblandning, tillsätt 485 μL BHI-medium (Brain Heart Infusion) med 20 mM 13C glukos eller BHI med 30% deuterium (D2O). Se till att provets slutliga volym är 500 μL. Förbered prover i tekniska tre exemplar.
- För att förbereda avloppsprover, tillsätt 500 μL avloppsvatten till 500 μL BHI med 20 mM 13C glukos eller BHI med 30%D2Oför en total volym av 1 ml. Förbered prover i tre exemplar. Lägg på is när den inte används.
- För att förbereda salivprover, tillsätt 50 μL saliv till 500 μL BHI med 20 mM 13C glukos eller BHI med 30%D2Oför en total volym av 550 μL. Förbered prover i tre exemplar. Lägg på is när den inte används.
- För att förbereda sputumprover för att jämföra de flyktiga ämnen som finns i provet före och efter odling, utför en första extraktion med 15 μL sputum. Förbered prover i tre exemplar. Lägg på is när den inte används. Fortsätt till avsnitt 4 för provextraktion och extrahera i 18 timmar vid 37 °C med 200 rpm omrörning.
- Efter slutförandet av den första extraktionen av de odlade sputumproverna, spara flaskorna med sputum. Tillsätt 500 μL BHI med 20 mM 13C glukos till injektionsflaskorna med sputum från 3.5.1. Lägg på is när den inte används.
- För att förbereda fekala prover, tillsätt 1 ml avjoniserat vatten till 100 mg avföring i ett 1,5 ml mikrocentrifugrör och virvel i 3 min. Lägg på is när den inte används.
- Fortsätt till avsnitt 4 för provutvinning.
4. Extraktion av prov
- Placera tomma flyktiga organiska analysflaskor (VOA) (20 ml) på den kalla plattan och placera den kalla plattan på is i biosäkerhetshuven.
- Slå på 5600 sorbent pen extraction unit (SPEU) och justera till önskad temperatur efter behov för varje metod.
OBS: För stabila isotopprobningsexperiment vid 37 ° C kan det ta upp till 15 minuter att nå börvärdet. För mono- och samodlingsexperiment vid 70 °C kan det ta upp till 60 minuter att nå börvärdet. - Samla in rena HSP:er som är lika med antalet prover som framställts, inklusive HSP:er för medie- eller provkontroller.
- Märk 20 ml VOA-injektionsflaskor enligt prover, replikat och HSP-ID efter behov. Använd en markör som motstår vatten om kondens bildas på utsidan av injektionsflaskan medan du är på is.
- Inuti biosäkerhetshuven skruvar du loss det vita locket på flaskan, pipetterar snabbt provet i flaskan och monterar det svarta locket, lockfodret och HSP.
OBS: Prover bör inte komma i kontakt med HSP, och provvolymen beror på provtyp. - Placera injektionsflaskan som innehåller provet och HSP tillbaka på den kalla plattan.
- Upprepa steg 4.5 och 4.6 för varje prov. Utför dessa steg per prov istället för allt på en gång för att förhindra provuppvärmning och därmed för tidig flyktig frisättning.
- När alla prover har förberetts i glasflaskorna, utför följande steg utanför biosäkerhetshuven på bänken. Slå på vakuumpumpen, placera flaskorna under vakuum till 30 mmHg och ta bort vakuumkällan.
OBS: Injektionsflaskorna behöver inte ligga på den kalla brickan efter att vakuumapplicering har slutförts. - Dubbelkolla trycket efter att ha placerat alla prover under vakuum med hjälp av manometern. Om en injektionsflaska har läckage, se till att locket skruvas fast ordentligt och att de vita O-ringarna på HSP och lockfodren är ordentligt på plats.
OBS: En komprometterad tätning kan resultera i minskad flyktig detektion jämfört med en injektionsflaska under vakuum. - Placera injektionsflaskor i SPEU för optimerad tid och temperatur med omrörning vid 200 rpm. Extrahera kulturer i 1 timme vid 70 °C. Extrahera stabila isotopprobningsexperiment med fekal-, avlopps-, saliv- och sputumprover i 18 timmar vid 37 ° C.
- Placera den kalla plattan vid -80 °C för användning efter att extraktionsperioden är klar.
- När extraktionen är klar, placera prover på den kalla plattan i 15 minuter för att dra ut vattenånga från HSP- och injektionsflaskans huvudutrymme.
- Överför HSP: erna till ärmarna.
OBS: Experimentet kan pausas här i upp till ~ 1 vecka vid rumstemperatur innan de mer mycket flyktiga föreningarna från HSP: erna förloras.
5. Analysera prover på gaskromatografi - masspektrometer (GC-MS)
- Använd följande GC-MS-inställningar (se materialförteckningen): 35 °C med 5 minuters håll, 10 °C/min ramp till 170 °C och en ramp på 15 °C/min till 230 °C med ett delat förhållande på 20:1 och en total körtid på 38 minuter.
- Ställ in desorptionsmetoden enligt följande: 2 min, 70 °C förvärmning; 2 min 260 ° C desorption; 34 min, 260 ° C bakeout; och 2 min, 70 °C efterbakning.
- Ställ in sekvensen av prover och starta körningen enligt instrumentation.
- För att ställa in en sekvens på Entech Software, öppna programmet. I alternativen till höger om instrumentmenyn väljer du 5800 | Sekvens.
- Observera sekvenstabellen i Entech-programvaran som liknar den i GC-MS-programvaran. Namnge kolumnen Exempel-ID enligt Aktuellt date_vial-nummer. Tänk på att Namn är analogt med Namn i GC-MS-sekvenstabellen och 5800-metoden bestämmer hastigheten för temperaturramp, hålltider etc. (öppnar en meny för att välja den metod som genereras i steg 5.2).
- Tänk på att kolumnerna Fack och Position avgör vart Sample Preparation Rail (SPR) ska gå för att hämta HSP:erna.
- Observera de två brickorna med 30 fläckar vardera till omedelbar vänster, utlagda som sex kolumner med fem fläckar vardera. Fackpositionen som är längst och närmast användaren (fram) är position 1, medan den längst till höger, längst bort är position 30.
- Observera att dessa fack är HSP A eller B, där HSP B är facket närmare SPR (innersta facket), och direkt bakom HSP B är HSP Blank. Placera de extraherade proverna i brickorna och välj platsen på sekvensen i enlighet därefter.
- Spara sekvenstabellen, välj Kör till vänster och sedan Börja med tomt i desorber om den tomma HSP:en finns i desorbern (betecknad med en HSP markerad med gul etikett).
- Observera att HSP:er hanteras av SPR för varje prov i sekvensen. Låt SPR värmas upp, då visas ett meddelande högst upp på skärmen för att bekräfta om ämnet finns i desorbern. Klicka på Hoppa över för att bekräfta att pennan är där. Tillåt att SPR kör alla exempel automatiskt, och sekvensen på GC-MS-sidan registrerar automatiskt data i separata filer.
6. Dataanalys
- Kvalitetsfilterdata på GC-MS-programvara (Materialtabell).
- Granska varje topp på kromatogrammet och kommentera toppar som matchar National Institute of Standards & Technology (NIST) bibliotek (eller med ett annat tillgängligt bibliotek).
- Lägg till kommenterade kromatogramtoppar till bearbetningsmetoden. Ställ in kriterierna för att välja toppar för att inkludera föreningar med större än 75% sannolikhet och se till att inriktningen av varje identifierande jon av föreningen ligger inom mitten av toppen.
- Om du vill lägga till en topp i bearbetningsmetoden väljer du Kalibrera | Redigera sammansatt | Namn | sätt in förening under extern standardförening. Lägg till namnet på föreningen, retentionstid, Quant Signal Target Ion. Lägg till de tre största topparna. Spara genom att välja ok | | Spara.
- När processmetoden har ställts in fortsätter du till Kvantitera | Beräkna och visa | QEdit Quant-resultat.
- Inspektera varje förening för att säkerställa att topparna överensstämmer med deras förväntade retentionstider och ligger över bakgrundsbruset.
- När QEdit har slutförts väljer du Avsluta | Ja för att spara QEdits och återgå till huvudkromatogrammet. Exportera områdesintegrationerna genom att öppna filen till vänster. Välj Kvantitet | Generera rapport.
- Om du vill exportera filer för användning i DExSI väljer du Arkiv | Exportera data till AIA-format | Skapa ny katalog och välj en plats för filen eller Använd befintlig katalog.
- Observera ett nytt fönster som öppnas för att välja filer för export. Flytta filerna till höger om fönstret och klicka på Bearbeta. Vänta några sekunder till några minuter beroende på antalet filer som konverteras.
- Korrekt för isotopöverflöd i DExSI enligt instruktionerna för DExSI-programvaran (https://github.com/DExSI/DExSI) och utför analys med en favoritprogramvara eller ett favoritprogram (t.ex. R). Skript som används för att generera siffrorna finns på https://github.com/joannlp/
VOC_SIP .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Mono- och samkulturer av S. aureus, P. aeruginosa och A. baumannii
Mono- och samkulturerna bestod av bakteriearterna S. aureus, P. aeruginosa och A. baumannii. Dessa är vanliga opportunistiska patogener som finns i mänskliga sår och kroniska infektioner. För att identifiera de flyktiga molekyler som finns i mono- och samkulturerna utfördes en kort 1-timmars extraktion vid 70 °C med 200 rpm omrörning. Från mono- och samkulturerna vid 24- och 48-timmars tidpunkter detekterades 43 kommenterade flyktiga molekyler (figur 2) bland annat aldehyder, ketoner, alkoholer, svavelföreningar, kolväten, karboxylsyror eller estrar och aromater. Det fanns ett litet antal flyktiga molekyler som endast detekterades i vissa mono- eller samkulturer vid vissa tidpunkter. Till exempel detekterades acetoin och 3-hydroxi-2-butanonacetat endast i S. aureus-kulturerna vid 48-timmarspunkten (figur 2).
Flyktig 1-propanol 2-metyl detekterades endast i P. aeruginosa och A. baumannii samodling vid 48 timmar (figur 2). Etylacetat var närvarande i A. baumannii samkulturer med antingen S. aureus eller P. aeruginosa vid 48 timmar (figur 2). Metaboliterna heptan, 2,3-dimetyl och pentan, 2-metyl detekterades endast i A. baumannii-kulturen vid 24 timmar (figur 2). Acetaldehyd och etanol hade högre relativa överflöd i A. baumannii och S. aureus samkultur vid 24-timmarspunkten jämfört med 48 timmar och någon av stammarna i kulturen ensam (Figur 2). Några av flyktiga ämnen var rikligare i kulturer vid antingen 24- eller 48-timmarspunkten. Kortkedjiga fettsyror, inklusive ättiksyra, butansyra och propansyra, hade höga relativa överflöd i kulturer vid 48 timmar, men detekterades inte i 24-timmarskulturerna (figur 2). Hexan var rikligare i TH-kontrollen vid 24 timmar jämfört med 48 timmar (figur 2).
Stabil isotopmärkning av fekal-, avlopps- och salivprover
För att identifiera aktiv produktion av flyktiga molekyler från ett biologiskt prov tillsattes en märkt näringskälla, 13C glukos ellerD2O, och media för att stödja tillväxten av det mikrobiella samhället. Ett unikt prov analyserades från var och en av de olika provtyperna av fekal-, avlopps- och salivprover i tre exemplar. Det fanns mer införlivande av 13C i fullständigt märkta flyktiga molekyler (figur 3A-D) jämfört med införlivande med deuterium (figur 3E). 13C införlivades i 2-butanon, 3-hydroxi; 2,3-butanedion; ättiksyra; och fenol för alla fekal-, avlopps- och salivprover (figur 3A).
De andra märkta flyktiga ämnena detekterades i antingen två eller en provtyp. Till exempel detekterades aceton, butansyra och propansyra som märkta i saliv och avloppsvatten (figur 3B). De märkta flyktiga ämnena, dimetyltrisulfid och disulfiddimetyl, berikades i både fekala och salivprover (figur 3C). Flyktiga ämnen, 1-propanol, 2-butanon, bensofenon, etanol och metyltiolacetat, berikades endast i avloppsvatten (figur 3D). Den märkta flyktiga, 2,3-pentanedoin, berikades med saliv (figur 3D). Deuterium införlivades i flyktiga ämnen, ättiksyra; bensaldehyd, 4-metyl; dimetyltrisulfid; och fenol, från antingen saliv- eller avloppsprover (figur 3E). Förutom de isotopberikade flyktiga ämnena detekterades flyktiga ämnen som inte innehöll inkorporerade stabila isotoper. Till exempel detekterades pyrazinföreningar, med undantag för pyrazin, 2,5-dimetyl, i fekal-, avlopps- och salivprover, men berikades inte helt med 13C (kompletterande figur S1).
Stabil isotopmärkning av sputumprover
Den stabila isotopmärkningsstrategin implementerades för att identifiera aktivt producerade flyktiga ämnen med sputumprover från sju försökspersoner med cystisk fibros. De flyktiga ämnena i provet jämfördes med de som framkom från prover odlade med en stabil isotopetikett. Varje flyktig komponent i varje prov analyserades två gånger: före och efter stabil isotopprobning med 13C glukos och media. Proverna som samlades in från försökspersonerna sträckte sig över tre olika tidpunkter eller kliniska tillstånd: baslinje, exacerbation och behandling23. De flyktiga ämnen som detekterades som märkta i de odlade sputumproverna hade olika relativa överflöd jämfört med de omärkta flyktiga ämnena från de okultiverade sputumproverna. Odlingsförhållanden i de stabila isotopprobningsexperimenten med sputum kan gynna tillväxten av vissa mikrober, vilket leder till skillnader i relativa överflöd av flyktiga ämnen jämfört med de odlade sputumproverna.
Till exempel var ättiksyra, dimetyltrisulfid, aceton och propanal, 2-metyl rikligare i de odlade sputumproverna jämfört med de okultiverade sputumproverna (figur 4). Detektering av 13C-märkt etanol, som kan vara närvarande i varierande mängder i bakgrundsrumsluften, ger bevis för att etanolen aktivt producerades genom mikrobiell metabolism från 13C glukos. Mängden variation förklarades av försökspersonen enligt bedömningen av Permutational Multivariate Analysis of Variance (PERMANOVA) och var också annorlunda för de två olika flyktiga dataseten (tabell 1 och kompletterande figur S2). För de 13C-märkta odlade sputumen förklarades 51% av variationen av ämnet, medan 33% av variationen förklarades av försöksperson från flyktiga ämnen i de okultiverade sputumproverna (tabell 1). Mikrobiomsamhällets sammansättning bestämd av 16S rRNA-amplikonsekvensering från de sju ämnena var unik för varje ämne (kompletterande figur S3), och de enskilda signaturerna återspeglades också i både de odlade och okultiverade sputumflyktiga molekylerna som detekterades.
I odlat sputum upptäcktes 23 flyktiga ämnen som var helt märkta med 13kol. De isotopberikade (aktiva) flyktiga ämnen som detekterades från sputumproverna var olika för varje försöksperson. De flyktiga ämnen med isotopanrikning som detekterades i sputumproverna från alla sju försökspersonerna var 2,3-butanedion; ättiksyra; aceton; dimetyltrisulfid; disulfid, dimetyl; och pyrazin, 2,5-dimetyl (figur 5). Även om dessa flyktiga ämnen detekterades hos alla försökspersoner varierade isotopberikningen för varje försöksperson. Prover från försöksperson 7 hade högre isotopanrikning av disulfiddimetyl jämfört med de andra sex försökspersonerna (figur 5B). Aceton var högre hos försökspersonerna 4 och 6 (figur 5). Vissa flyktiga ämnen berikades med 13C endast i vissa ämnen. Till exempel berikades 1-butanol, 3-metyl och propansyra, 2-metyl endast i en delmängd av prover från ämne 2 (figur 5). Förutom de isotopberikade flyktiga ämnena fanns det också flyktiga ämnen som detekterades som omärkta från samma odlade sputum (kompletterande figur S4). Flyktiga ämnen 2-piperidinon; bensaldehyd, 4-metyl; bensotiazol; butansyra, 3-metyl; hexanal; hexan; isopropylalkohol; fenol; propansyra, 2-metyl; och pyrrolo 1,2-apyrazin-1,4-dion, hexahydro detekterades i sputumproverna, men var inte isotopberikade (kompletterande figur S4).
Bild 1: Protokollschema. Ett biologiskt prov placeras i en glasflaska och monteras med lockfodret och Headspace Sorbent Pen. Ett vakuum appliceras på injektionsflaskan tills ett tryck på cirka 30 mmHg uppnås. Vakuumkällan avlägsnas och injektionsflaskorna placeras i sorbentpennextraktionsenheten där en statisk extraktion utförs med hjälp av värme, omrörning och tid. Efter extraktion placeras injektionsflaskor på ett kallt metallblock för att avlägsna vatten från huvudutrymmet och HSP. HSP: erna samlas in och körs via termisk desorption på GC-MS. Data analyseras med ChemStation, DExSI och R. Förkortningar: HSP = Headspace Sorbent Pen; GC-MS = gaskromatografi-masspektrometri. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 2: Värmekarta över mono- och samkulturer. VOC detekterade från mono- och samkulturer vid 24- och 48-timmars tidpunkter. Samkulturerna är kombinationerna av bokstäverna som representerar varje stam. Alla prover extraherades i 1 timme vid 70 °C med 200 rpm omrörning. Värmekartensitetsvärden är kolumn Z-poäng, normaliserade av metabolit. Z-poängen beräknades av värdeskillnaden från medelvärdet av värdena, dividerat med standardavvikelsen för värdena. Dendrogrammet genererades med alternativet cluster_cols i pheatmap-funktionen för R. Dendrogrammet representerar hierarkisk klustring där metaboliter som kluster tillsammans har mer liknande Z-poäng över prover. Förkortningar: A = A. baumanii; P = P. aeruginosa; S = S. aureus; TH = Todd Hewitt media (kontroll). Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 3: Procentuell omvandling av 13C till flyktig molekylmassa i fekal-, saliv- och avloppsprover under 18 timmar samtidig inkubation och extraktion. Omvandlingsprocenten beräknades för fullständigt märkta föreningar genom att ta massan av den fullständigt märkta föreningen (M + N) och dividera den med (M + N) + massan av den omärkta flyktiga massan (M), där N är det maximala antalet möjliga kolatogener (i A-D) eller väten (i E) som kan märkas i varje flyktig molekyl. Föreningar anses vara fullständigt märkta när alla kolato ämnen i det flyktiga ämnet ersätts med 13C. Om data saknas upptäcktes inte den flyktiga flyktiga. Till exempel, i (D) detekterades inte 1-propanol i fekala eller salivprover. Antal repliker per prov = 3. (A) De 13C-märkta flyktiga ämnen som detekterats i alla provtyper (avföring, saliv och avloppsvatten). (B) De 13C-märkta flyktiga ämnen som endast detekterats i saliv- och avloppsprover. (C) De 13C-märkta flyktiga ämnen som detekterats i avföring och salivprover. (D) De 13C-märkta flyktiga ämnen som detekterats i en av de tre olika provtyperna. (E) De deuteriummärkta flyktiga molekylerna. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 4: Värmekarta över 13C-märkta flyktiga ämnen från odlat sputum och flyktiga molekyler detekterade från okultiverad sputum. De märkta flyktiga ämnena kommer från de stabila isotopprobningsexperimenten där 13C glukos och brain Heart Infusion medium tillsattes till sputum under extraktionssteget för att odla mikrobiell tillväxt och fånga aktiv flyktig produktion. De omärkta flyktiga molekylerna detekterades direkt från sputumprover. Värmekartans intensitet är Z-poäng enligt beskrivningen i bildtexten till figur 2. Z-poängen beräknades dock inom varje experiment för de odlade och okultiverade sputumexperimenten. Dendrogrammet genererades enligt beskrivningen i figur 2. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 5: Procentuell omvandling av 13C till flyktig molekylmassa i sputumprover från sju personer med cystisk fibros under 18 timmars samtidig inkubation och extraktion. Omvandlingen i % beräknades enligt beskrivningen i bildtexten till figur 3. Flyktiga ämnen som inte detekteras i prover indikeras av frånvaron av data. N = 1-3. (A) De 13C-märkta flyktiga ämnen som detekteras vid en högre procentuell omvandling i de flesta sputumprover. (B) De 13C-märkta flyktiga ämnen som detekteras vid en lägre procentuell omvandling i de flesta sputumprover. (C) De 13C-märkta flyktiga ämnen som detekterats vid en lägre procentuell omvandling i en minoritet av sputumproverna. Förkortningar: B = baslinje; E = förvärring; T = behandling. Klicka här för att se en större version av denna figur.
| Frihetsgrader | R2 | P-värde | ||
| Okultiverad sputum | Subjekt | 6 | 0.33 | 0.001 |
| Kliniskt tillstånd | 2 | 0.01 | 0.46 | |
| Angående: kliniskt tillstånd | 12 | 0.12 | 0.092 | |
| Odlat sputum med 13C glukos och media | Subjekt | 6 | 0.51 | 0.001 |
| Kliniskt tillstånd | 2 | 0.02 | 0.095 | |
| Angående: kliniskt tillstånd | 12 | 0.11 | 0.194 |
Tabell 1: Permuterad multivariat analys av varians (PERMANOVA) av sputumprover. PERMANOVA genererades med hjälp av adonisfunktionen från veganförpackningen i R.
Kompletterande figur S1: De relativa överflöden av märkta (M + N (max)) och omärkta (M + 0) flyktiga ämnen över fekala, saliv- och avloppsprover. Klicka här för att ladda ner den här filen.
Kompletterande figur S2: Icke-metrisk flerdimensionell skalning av odlat sputum med stabil isotopprobning och okultiverad sputum. (A) NMDS för odlat sputum med 13C glukos och media genererades med k = 3 dimensioner. Stressvärdet var 0,07. (B) NMDS för okultiverad sputum genererades med k = 3 dimensioner. Stressvärdet var 0,13. Förkortningar: NMDS = icke-metrisk flerdimensionell skalning; B = utgångsläge, E = förvärring; T = behandling. Klicka här för att ladda ner den här filen.
Kompletterande figur S3: Mikrobiell samhällssammansättning av sputumprover från personer med cystisk fibros. Bedömd av 16S rRNA-amplikonsekvensering som en del av en större studie, ytterligare information om tillvägagångssätt som finns i Carmody etal. från ämnen med cystisk fibros. Varje staplad stapel är en annan tidpunkt. Förkortningar: B = baslinje, E = exacerbation, T = behandling. Klicka här för att ladda ner den här filen.
Kompletterande figur S4: De relativa överflöden av märkta (M + N (max)) och omärkta (M + 0) flyktiga ämnen över sputumprover från sju personer med cystisk fibros. Klicka här för att ladda ner den här filen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
För att identifiera flyktig produktion i in vitro-kulturer och humanassocierade prover utfördes flyktig analys av mono- och samkulturer av P. aeruginosa, S. aureus och A. baumanii och stabil isotopprobning av olika biologiska prover. I analysen för mono- och samkulturerna detekterades flyktiga ämnen genom att utföra en kort extraktion i 1 timme vid 70 °C. Den flyktiga analysen av mono- och samkulturer möjliggjorde undersökning av de föreningar som produceras både av enskilda arter och under deras interaktioner med andra arter. Det fanns skillnader i relativa överflöd mellan de olika kulturtyperna och tidpunkterna. I de stabila isotopprobningsexperimenten inkluderade de biologiska proverna avföring och saliv från friska försökspersoner, avloppsvatten och sputum från personer med cystisk fibros. Stabil isotopprofilering möjliggjorde identifiering av aktivt producerade flyktiga molekyler genom extraktion i 18 timmar vid 37 °C. Den långa extraktionstiden med en lägre temperatur möjliggjorde tillväxt och metabolism av mikrober som finns i de biologiska proverna. Jämförelse av 13C glukos och D2O anrikningar visade att det fanns mer omfattande isotop anrikning med märkt 13C.
När du extraherade olika exempeltyper gjordes de första optimeringsstegen innan en fullständig körning startades. Testa först olika volymer av ett prov som en provkörning. För vissa provtyper var sputum, till exempel, endast små provvolymer tillgängliga. Vi rekommenderar att du börjar med en lägre volym eller mindre mängd prov först, beroende på provtyp och tillgängliga provmängder. Extrahera inte en stor volym eller för mycket av provet eftersom det kan överväldiga kolonnen och förorena HSP. Kolonnöverbelastning kan vara uppenbar när toppar i kromatogrammet är mättade eller visas i efterföljande körningar. HSP-kontaminering har inträffat om överföring är närvarande när HSP körs igen på GC-MS. I mono- och samodlingsexperimenten var 200 μL kultur tillräckligt för att detektera en mängd olika flyktiga ämnen. I de stabila isotopprobningsexperimenten, beroende på provtyp, varierade volymen för varje experiment från 500 μL till 1 ml. För det andra, beroende på provtyp och föreningar av intresse, måste extraktionstiden och temperaturen samt GC-MS och termiska desorptionsmetoder justeras för att optimera flyktig detektion. Dessa metoder bestämdes vara lämpliga för analyterna av intresse och kolonntyp.
Efter optimering av metoden gällde de kritiska stegen i protokollet stegen före och efter extrahering. Under provberedningen placerades prover på is så att de flyktiga ämnen som fanns i provet inte kom ut. Det var också viktigt att se till att vakuumtätningen var tät och att locket var ordentligt stängt. Annars skulle det finnas en ineffektiv extraktion och minskad detektion av flyktiga ämnen från provet. Läckor kan uppstå från O-ringarna runt lockfodret eller HSP. För att säkerställa att injektionsflaskan var under vakuum användes en mätare före extraktion för att säkerställa att O-ringarna fortfarande var funktionella. Dessutom, efter extraktionen, placerades prover på isblocket så att vatten drogs ut ur huvudutrymmet under en bestämd period. Vatten i kolonnen kan leda till förändringar i retentionstiderna och undertryckande av medlemsstaternas insatser, vilket skulle leda till icke-kvantitativa resultat. Möjligheten att dra ut överflödigt vatten ur HSP: erna före avlägsnande från vakuumhylsan / injektionsflaskan är möjlig på grund av VASE-processens slutna systemkaraktär och förmågan att extrahera vatten tillbaka till den kallaste platsen i det extraktionssystemet med hjälp av -80 ° C kallplatta.
Det finns både begränsningar och fördelar med dessa metoder med avseende på alternativa metoder. Utvärdering av mono- och samodlingsexperimenten upptäcktes flyktiga signaturer som var specifika för en viss mikrob eller samkultur. Det fanns också förändringar i flyktiga överflöd över tiden. När det gäller de stabila isotopprobningsexperimenten i de olika typerna av biologiska prover resulterade deuteriummärkning inte i så många isotopberikade flyktiga ämnen som 13C glukos. Den metabolism som krävs för att producera isotopberikade flyktiga ämnen med deuterium kan vara mer begränsad. Dessutom tillsattes media till de biologiska proverna för att förbättra mikrobiell tillväxt, vilket kan leda till förändringar i den mikrobiella samhällssammansättningen. Odlingsförhållanden för stabila isotopprobningsexperiment kan välja för den gynnade tillväxten av vissa mikrober i ett biologiskt prov. Detta motsatte sig den korta extraktionen i en timme vid 70 ° C utformad för att upptäcka flyktiga ämnen i samhällsprovet innan en eller några av mikroberna börjar ta över samhället. Komplexiteten i de mikrobiella och kemiska sammansättningarna av provtyperna fekal, avloppsvatten, saliv och sputum gör det svårt att tilldela specifika kemiska signaturer till ett visst mikrobiellt eller mänskligt ursprung utan ytterligare analyser såsom sekvensering. Denna metod gav en hög genomströmning, lösningsmedelsfri vakuumextraktion som ledde till känsligare detektion av lågvolymprover. Volymerna som användes för dessa experiment varierade från 200 μL till 1 ml odlade biologiska prover. I andra fall (data visas inte) extraherades biologiska prover (t.ex. sputum- och fekalprover) så låga som 15 μL eller 10 μg.
För framtida tillämpningar av metoden kan ett brett spektrum av provtyper analyseras med små eller begränsade volymer. Dussintals prover kan extraheras samtidigt, och körtiden beror på parametrarna för det specifika GC-MS-instrumentet. Vid stabil isotopprobning, i kombination med metagenomisk sekvensering, finns det möjlighet att identifiera mikroberna som är ansvariga för produktionen av de flyktiga molekylerna. Metagenomet för det biologiska provet kan sekvenseras före och efter extraktion med stabil isotopprobning för att identifiera förändringar i mikrobiell samhällssammansättning. Metagenomisk sekvensering skulle möjliggöra identifiering av gener som är ansvariga för produktionen av de isotopberikade flyktiga molekylerna. Här framhävs några exempel på de provtyper och tillvägagångssätt som kan användas som underlag för det presenterade protokollet, som redan har etablerats i olika branscher. Eftersom flyktiga molekyler är viktiga diagnostiska indikatorer kan användningen av detta protokoll utvidgas till biologiska laboratorier och kliniska vårdinställningar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
V. L. V och S. J.B. D. var tidigare anställda i Entech Instruments Inc., och K. W. är medlem i Entechs universitetsprogram. J. P., J. K. och C. I. R. har inga intressekonflikter att deklarera.
Acknowledgments
Vi tackar Heather Maughan och Linda M. Kalikin för noggrann redigering av detta manuskript. Detta arbete stöddes av NIH NHLBI (anslag 5R01HL136647-04).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 13C glucose | Sigma-Aldrich | 389374-1G | |
| 2-Stg Diaph Pump | Entech Instruments | 01-10-20030 | |
| 20 mL VOA vials | Fisher Scientific | 5719110 | |
| 24 mm Black Caps with hole, no septum | Entech Instruments | 01-39-76044B | holds lid liner in place on vial |
| 24 mm vial liner for sorbent pens | Entech Instruments | SP-L024S | allows pens to make a vacuum seal at top of vial |
| 5600 Sorbent pen extraction unit (SPEU) | Entech Instruments | 5600-SPES | 5600 Sorbent Pen Extraction Unit -120 VAC |
| 96-well assay plates | Genesee | 25-224 | |
| Brain Heart Infusion (BHI) media | Sigma-Aldrich | 53286-500G | |
| ChemStation Stofware | Agilent | ||
| DB-624 column | Agilent | 122-1364E | 60 m, 0.25 mm ID, 1.40 micron film thickness, in GC-MS |
| Deuterium oxide | Sigma-Aldrich | 151882-1L | |
| Dexsi sofware | Dexsi (open source) | ||
| GC-MS (7890A GC and 5975C inert XL MSD with Triple-Axis Detector) | Agilent | 7890A GC and 5975C inert XL MSD with triple-axis detector | |
| Headspace Bundle HS-B01, 120VA | Entech Instruments | SP-HS-B01 | Items for running headspace extraction included in bundle |
| Headspace sorbent pen (HSP) - blank | Entech Instruments | SP-HS-0 | |
| Headspace sorbent pen (HSP) Tenax TA (35/60 Mesh) | Entech Instruments | SP-HS-T3560 | |
| Microcentrifuge tubes (2 mL) | VWR | 53550-792 | |
| O-rings | Entech Instruments | SP-OR-L024 | |
| Sample Preparation Rail | Entech Instruments | ||
| Sorbent pen thermal conditioner | Entech Instruments | 3801-SPTC | |
| Todd Hewitt (TH) media | Sigma | T1438-500G |
References
- Van Berkel, J. J. B. N., et al. A profile of volatile organic compounds in breath discriminates COPD patients from controls. Respiratory Medicine. 104 (4), 557-563 (2010).
- Nakhleh, M. K., et al. Detecting active pulmonary tuberculosis with a breath test using nanomaterial-based sensors. European Respiratory Journal. 43 (5), 1522-1525 (2014).
- Lim, S. H., et al. Rapid diagnosis of tuberculosis from analysis of urine volatile organic compounds. ACS Sensors. 1 (7), 852-856 (2016).
- Schnabel, R., et al. Analysis of volatile organic compounds in exhaled breath to diagnose ventilator-associated pneumonia. Scientific Reports. 5, 17179 (2015).
- Paff, T., et al. Exhaled molecular profiles in the assessment of cystic fibrosis and primary ciliary dyskinesia. Journal of Cystic Fibrosis. 12 (5), 454-460 (2013).
- Robroeks, C. M. H. H. T., et al. Metabolomics of volatile organic compounds in cystic fibrosis patients and controls. Pediatric Research. 68 (1), 75-80 (2010).
- Neerincx, A. H., et al. Hydrogen cyanide emission in the lung by Staphylococcus aureus. European Respiratory Journal. 48 (2), 577-579 (2016).
- Goeminne, P. C., et al. Detection of Pseudomonas aeruginosa in sputum headspace through volatile organic compound analysis. Respiratory Research. 13, 87 (2012).
- Joensen, O., et al. Exhaled breath analysis using Electronic Nose in cystic fibrosis and primary ciliary dyskinesia patients with chronic pulmonary infections. PLOS ONE. 9 (12), 115584 (2014).
- Nasir, M., et al. Volatile molecules from bronchoalveolar lavage fluid can 'rule-in' Pseudomonas aeruginosa and 'rule-out' Staphylococcus aureus infections in cystic fibrosis patients. Scientific Reports. 8 (1), 826 (2018).
- Tyc, O., Zweers, H., de Boer, W., Garbeva, P.
- Gao, B., et al. Tracking polymicrobial metabolism in cystic fibrosis airways: Pseudomonas aeruginosa metabolism and physiology are influenced by Rothia mucilaginosa-derived metabolites. mSphere. 3 (2), 00151 (2018).
- Schoenheimer, R., Rittenberg, D. Deuterium as an indicator in the study of intermediary metabolism. Science. 82 (2120), 156-157 (1935).
- Neubauer, C., et al. Refining the application of microbial lipids as tracers of Staphylococcus aureus growth rates in cystic fibrosis sputum. Journal of Bacteriology. 200 (24), 00365 (2018).
- Cordell, R. L., Pandya, H., Hubbard, M., Turner, M. A., Monks, P. S. GC-MS analysis of ethanol and other volatile compounds in micro-volume blood samples-quantifying neonatal exposure. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 405 (12), 4139-4147 (2013).
- Mayor, A. S. R. Optimisation of sample preparation for direct SPME-GC-MS analysis of murine and human faecal volatile organic compounds for metabolomic studies. Journal of Analytical & Bioanalytical Techniques. 5 (2), 184 (2014).
- Camarasu, C. C. Headspace SPME method development for the analysis of volatile polar residual solvents by GC-MS. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis. 23 (1), 197-210 (2000).
- Charry-Parra, G., DeJesus-Echevarria, M., Perez, F. J. Beer volatile analysis: optimization of HS/SPME coupled to GC/MS/FID. Journal of Food Science. 76 (2), 205-211 (2011).
- Bicchi, C., Cordero, C., Liberto, E., Rubiolo, P., Sgorbini, B. Automated headspace solid-phase dynamic extraction to analyse the volatile fraction of food matrices. Journal of Chromatography A. 1024 (1), 217-226 (2004).
- Trujillo-Rodríguez, M. J., Anderson, J. L., Dunham, S. J. B., Noad, V. L., Cardin, D. B. Vacuum-assisted sorbent extraction: An analytical methodology for the determination of ultraviolet filters in environmental samples. Talanta. 208, 120390 (2020).
- Mollamohammada, S., Hassan, A. A., Dahab, M. Immobilized algae-based treatment of herbicide-contaminated groundwater. Water Environment Research. 93 (2), 263-273 (2021).
- Psillakis, E. The effect of vacuum: an emerging experimental parameter to consider during headspace microextraction sampling. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 412 (24), 5989-5997 (2020).
- Carmody, L. A., et al. The daily dynamics of cystic fibrosis airway microbiota during clinical stability and at exacerbation. Microbiome. 3, 12 (2015).
- Carmody, L. A., et al. Fluctuations in airway bacterial communities associated with clinical states and disease stages in cystic fibrosis. PLOS ONE. 13 (3), 0194060 (2018).
- Mahboubi, M. A., et al. Culture-based and culture-independent bacteriologic analysis of cystic fibrosis respiratory specimens. Journal of Clinical Microbiology. 54 (3), 613-619 (2016).
