Summary
Questo protocollo descrive l'estrazione di composti organici volatili da un campione biologico con il metodo di estrazione assorbente assistita da vuoto, la gascromatografia accoppiata con la spettrometria di massa utilizzando il binario di preparazione del campione Entech e l'analisi dei dati. Descrive anche la coltura di campioni biologici e il sondaggio isotopico stabile.
Abstract
I composti organici volatili (COV) provenienti da campioni biologici hanno origini sconosciute. I COV possono provenire dall'ospite o da organismi diversi all'interno della comunità microbica dell'ospite. Per districare l'origine dei COV microbici, sono state eseguite analisi dello spazio di testa volatile di mono- e co-colture batteriche di Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa e Acinetobacter baumannii e sondaggi isotopici stabili in campioni biologici di feci, saliva, acque reflue ed espettorato. Mono- e co-colture sono state utilizzate per identificare la produzione volatile da singole specie batteriche o in combinazione con il sondaggio isotopico stabile per identificare il metabolismo attivo dei microbi dai campioni biologici.
L'estrazione assorbente assistita da vuoto (VASE) è stata impiegata per estrarre i COV. VASE è un metodo di estrazione dello spazio di testa facile da usare, commercializzato e privo di solventi per composti semi-volatili e volatili. La mancanza di solventi e le condizioni di quasi vuoto utilizzate durante l'estrazione rendono lo sviluppo di un metodo relativamente facile e veloce rispetto ad altre opzioni di estrazione come la terz-butilazione e la microestrazione in fase solida. Il flusso di lavoro qui descritto è stato utilizzato per identificare specifiche firme volatili da mono- e co-culture. Inoltre, l'analisi del sondaggio isotopico stabile di campioni biologici associati all'uomo ha identificato COV che sono stati prodotti comunemente o in modo univoco. Questo documento presenta il flusso di lavoro generale e le considerazioni sperimentali di VASE in combinazione con il sondaggio isotopico stabile di colture microbiche vive.
Introduction
I composti organici volatili (COV) sono molto promettenti per il rilevamento e l'identificazione batterica perché sono emessi da tutti gli organismi e diversi microbi hanno firme VOC uniche. Le molecole volatili sono state utilizzate come misura non invasiva per rilevare varie infezioni respiratorie tra cui la broncopneumopatia cronica ostruttiva1, la tubercolosi2 nelle urine3 e la polmonite associata al ventilatore4, oltre a distinguere i soggetti con fibrosi cistica (FC) dai soggetti di controllo sani 5,6. Le firme volatili sono state persino utilizzate per distinguere specifiche infezioni patogene nella FC (Staphylococcus aureus7, Pseudomonas aeruginosa 8,9 e S. aureus vs. P. aeruginosa10). Tuttavia, con la complessità di tali campioni biologici, è spesso difficile individuare la fonte di SPECIFICI COV.
Una strategia per districare i profili volatili da più microbi infettanti è quella di eseguire l'analisi dello spazio di testa dei microrganismi sia in mono- che in co-coltura11. L'analisi dello spazio di testa esamina gli analiti emessi nello "spazio di testa" sopra un campione piuttosto che quelli incorporati nel campione stesso. I metaboliti microbici sono stati spesso caratterizzati in monocolture a causa della difficoltà nel determinare l'origine dei metaboliti microbici in campioni clinici complessi. Profilando i volatili da monocolture batteriche, i tipi di sostanze volatili che un microbo produce in vitro possono rappresentare una linea di base del suo repertorio volatile. La combinazione di colture batteriche, ad esempio la creazione di co-colture e la profilazione delle molecole volatili prodotte possono rivelare le interazioni o l'alimentazione incrociata tra i batteri12.
Un'altra strategia per identificare l'origine microbica delle molecole volatili è quella di fornire una fonte di nutrienti etichettata con un isotopo stabile. Gli isotopi stabili sono forme naturali, non radioattive, di atomi con un diverso numero di neutroni. In una strategia che è stata utilizzata fin dai primi anni 1930 per tracciare il metabolismo attivo negli animali13, il microrganismo si nutre della fonte di nutrienti etichettata e incorpora l'isotopo stabile nelle sue vie metaboliche. Più recentemente, un isotopo stabile sotto forma di acqua pesante (D2O) è stato utilizzato per identificare S. aureus metabolicamente attivo in un campione clinico di espettorato CF14. In un altro esempio, 13glucosio marcato con C sono stati utilizzati per dimostrare l'alimentazione incrociata di metaboliti tra isolati clinici CF di P. aeruginosa e Rothia mucilaginosa12 .
Con l'avanzamento delle tecniche di spettrometria di massa, i metodi per rilevare segnali volatili si sono spostati da osservazioni qualitative a misurazioni più quantitative. Utilizzando la spettrometria di massa per gascromatografia (GC-MS), l'elaborazione di campioni biologici è diventata a portata di mano per la maggior parte dei laboratori o delle impostazioni cliniche. Molti metodi per esaminare le molecole volatili sono stati utilizzati per profilare campioni come cibo, colture batteriche e altri campioni biologici e aria e acqua per rilevare la contaminazione. Tuttavia, diversi metodi comuni di campionamento volatile ad alta produttività richiedono solvente e non vengono eseguiti con i vantaggi forniti dall'estrazione sotto vuoto. Inoltre, per l'analisi 15,16,17,18,19 sono spesso necessari volumi o quantità maggiori (superiori a 0,5 ml) di materiali campionati, sebbene ciò sia specifico del substrato e richieda un'ottimizzazione per ciascun tipo di campione e metodo.
Qui, l'estrazione assorbente assistita da vuoto (VASE) seguita dal desorbimento termico su un GC-MS è stata impiegata per esaminare i profili volatili delle mono- e co-colture batteriche e identificare i volatili prodotti attivamente con sonda isotopica stabile da feci umane, saliva, liquami e campioni di espettorato (Figura 1). Con quantità di campione limitate, i COV sono stati estratti da un minimo di 15 μL di espettorato. Gli esperimenti di indagine isotopica con campioni umani hanno richiesto l'aggiunta di una fonte isotopica stabile, come il glucosio 13C, e mezzi per coltivare la crescita della comunità microbica. La produzione attiva di sostanze volatili è stata identificata come una molecola più pesante da GC-MS. L'estrazione di molecole volatili sotto vuoto statico ha permesso la rilevazione di molecole volatili con maggiore sensibilità 20,21,22.
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Protocol
1. Headspace Sorbent Pen (HSP) e considerazioni sull'analisi del campione
NOTA: L'HSP contenente l'assorbente Tenax TA è stato selezionato per catturare un'ampia gamma di sostanze volatili. Tenax ha un'affinità inferiore per l'acqua rispetto ad altri assorbenti, che gli consente di intrappolare più COV da campioni di umidità più elevata. Tenax ha anche un basso livello di impurità e può essere condizionato per il riutilizzo. La selezione del sorbente è stata effettuata anche in considerazione con la colonna installata nel GC-MS (vedi la Tabella dei materiali).
- Generare controlli negativi estraendo supporti e/o campioni grezzi con le stesse condizioni utilizzate per l'estrazione del campione.
- Analizzare un HSP vuoto (precedentemente confermato pulito e privo di sfondi significativi) sul GC-MS prima di analizzare i campioni estratti. Eseguire spazi vuoti tra i tipi di campione (ad esempio, tre repliche di batteri monocoltura, vuoti, tre repliche di co-coltura batterica, vuoti, ecc.).
- Limitare l'uso di articoli profumati per la cura personale o il consumo di cibi maleodoranti prima dell'estrazione e dell'analisi del campione. Idealmente, preparare i campioni in una cappa di biosicurezza che non sia stata pulita da alcol o altri detergenti volatili per almeno 30 minuti. Attivare il flusso d'aria nella cappa di biosicurezza per 30-60 minuti prima della preparazione del campione.
- Conservare i campioni sul ghiaccio per limitare il rilascio volatile durante la preparazione del campione.
2. Preparazione mono- e co-coltura
- Nella cappa di biosicurezza, inoculare colture di A. baumannii, S. aureus e P. aeruginosa nei mezzi di crescita di Todd Hewitt. Incubare durante la notte a 37 °C con agitazione a 200 giri/min.
- Dopo l'incubazione notturna, eseguire la gestione della coltura nella cappa di biosicurezza. Diluire ogni coltura a densità ottica 0,05 a 500 nm.
- Mescolare co-colture in parti uguali e pipettare 200 μL di mezzi di controllo, mono-, o co-colture in ciascun pozzetto di una piastra a 96 pozzetti e posizionare in un incubatore a 37 °C per 24 ore. Preparare una seconda piastra per un'incubazione di 48 ore.
- Al termine del periodo di incubazione, preparare i campioni per l'estrazione nella sezione 4. Pipettare il liquido viene estratto in tubi di microcentrifuga e conservato a -80 °C.
NOTA: A questo punto, i campioni possono essere conservati a -80 °C per essere estratti in un secondo momento, se necessario.
3. Sonda isotopica stabile nella preparazione di campioni biologici
NOTA: I campioni di feci e saliva sono stati donati da donatori anonimi con l'approvazione dell'Università della California Irvine Institutional Review Board (HS # 2017-3867). Le acque reflue provenivano da San Diego, CA. I campioni di espettorato sono stati raccolti da soggetti con fibrosi cistica come parte di uno studio più ampio approvato dall'Università del Michigan Medical School Institutional Review Board (HUM00037056).
- Eseguire tutti i preparati biologici del campione nella cappa di biosicurezza.
- Per preparare campioni fecali, aggiungere 1 mL di acqua deionizzata a 100 mg di feci in un tubo microcentrifuga da 1,5 mL e vortice per 3 minuti. Mettere sul ghiaccio quando non in uso.
- A 15 μL di miscela fecale e acquosa, aggiungere 485 μL di mezzo per infusione cardiaca cerebrale (BHI) con 20 mM di glucosio a 13C o BHI con il 30% di deuterio (D2O). Assicurarsi che il volume finale del campione sia di 500 μL. Preparare i campioni in tripliceti tecnici.
- Per preparare i campioni di acque reflue, aggiungere 500 μL di liquami a 500 μL di BHI con 20 mM 13C di glucosio o BHI con il 30% D2O per un volume totale di 1 mL. Preparare i campioni in triplice copia. Mettere sul ghiaccio quando non in uso.
- Per preparare campioni di saliva, aggiungere 50 μL di saliva a 500 μL di BHI con 20 mM 13C di glucosio o BHI con il 30% di D2O per un volume totale di 550 μL. Preparare i campioni in triplice copia. Mettere sul ghiaccio quando non in uso.
- Per preparare campioni di espettorato per confrontare i volatili presenti nel campione prima e dopo la coltura, eseguire una prima estrazione con 15 μL di espettorato. Preparare i campioni in triplice copia. Mettere sul ghiaccio quando non in uso. Procedere al punto 4 per l'estrazione del campione ed estrarre per 18 ore a 37 °C con agitazione a 200 giri/min.
- Dopo il completamento della prima estrazione dei campioni di espettorato non coltivati, salvare le fiale con espettorato. Aggiungere 500 μL di BHI con 20 mM 13C di glucosio ai flaconcini con espettorato da 3.5.1. Mettere sul ghiaccio quando non in uso.
- Per preparare campioni fecali, aggiungere 1 mL di acqua deionizzata a 100 mg di feci in un tubo microcentrifuga da 1,5 mL e vortice per 3 minuti. Mettere sul ghiaccio quando non in uso.
- Passare alla sezione 4 per l'estrazione del campione.
4. Estrazione del campione
- Posizionare i flaconcini vuoti per analisi organica volatile (VOA) (20 ml) sulla piastra fredda e posizionare la piastra fredda sul ghiaccio nella cappa di biosicurezza.
- Accendere l'unità di estrazione a penna assorbente 5600 (SPEU) e regolare la temperatura desiderata come richiesto per ciascun metodo.
NOTA: per esperimenti di rilevamento di isotopi stabili a 37 °C, il raggiungimento del setpoint può richiedere fino a 15 minuti. Per esperimenti mono- e co-coltura a 70 °C, raggiungere il setpoint può richiedere fino a 60 minuti. - Raccogliere HSP puliti pari al numero di campioni preparati, inclusi gli HSP per i controlli dei supporti o dei campioni.
- Etichettare 20 ml di flaconcini di VOA in base a campioni, repliche e ID HSP secondo necessità. Utilizzare un marcatore che resista all'acqua nel caso in cui si formi condensa all'esterno del flaconcino mentre si è sul ghiaccio.
- All'interno del cappuccio di biosicurezza, svitare il cappuccio bianco sulla fiala, pipettare rapidamente il campione nella fiala e assemblare il cappuccio nero, il coperchio e l'HSP.
NOTA: i campioni non devono entrare in contatto con l'HSP e il volume del campione dipenderà dal tipo di campione. - Riposizionare il flaconcino contenente il campione e l'HSP sulla piastra fredda.
- Ripetere i passaggi 4.5 e 4.6 per ogni campione. Eseguire questi passaggi per campione invece di tutti in una volta per prevenire il riscaldamento del campione e, quindi, il rilascio volatile prematuro.
- Una volta che tutti i campioni sono stati preparati nelle fiale di vetro, eseguire i seguenti passaggi all'esterno della cappa di biosicurezza sul banco. Accendere la pompa per vuoto, posizionare i flaconcini sotto vuoto a 30 mmHg e rimuovere la fonte di vuoto.
NOTA: non è necessario che i flaconcini si trovino sul vassoio freddo dopo che l'applicazione sottovuoto è stata completata. - Ricontrollare la pressione dopo aver posto tutti i campioni sotto vuoto utilizzando il manometro. Se un flaconcino presenta una perdita, assicurarsi che il cappuccio sia avvitato saldamente e che gli O-ring bianchi dell'HSP e le fodere del coperchio siano posizionati correttamente.
NOTA: una guarnizione compromessa può comportare una diminuzione del rilevamento volatile rispetto a un flaconcino sotto vuoto. - Posizionare i flaconcini nello SPEU per il tempo e la temperatura ottimizzati con agitazione a 200 giri/min. Estrarre colture per 1 ora a 70 °C. Estrarre esperimenti di indagine isotopica stabile con campioni di feci, acque reflue, saliva ed espettorato per 18 ore a 37 °C.
- Posizionare la piastra fredda a -80 °C per l'uso dopo il periodo di estrazione.
- Al termine dell'estrazione, posizionare i campioni sulla piastra fredda per 15 minuti per estrarre il vapore acqueo dall'HSP e dallo spazio di testa del flaconcino.
- Trasferire gli HSP nelle loro maniche.
NOTA: L'esperimento può essere messo in pausa qui per un massimo di ~ 1 settimana a temperatura ambiente prima di perdere i composti più altamente volatili dagli HSP.
5. Analizzare campioni sulla gascromatografia - spettrometro di massa (GC-MS)
- Utilizzare le seguenti impostazioni GC-MS (vedere la Tabella dei materiali): 35 °C con una tenuta di 5 minuti, una rampa di 10 °C/min a 170 °C e una rampa da 15 °C/min a 230 °C con un rapporto di divisione 20:1 e una durata totale di 38 min.
- Impostare il metodo di desorbimento come segue: 2 min, 70 °C di preriscaldamento; 2 min 260 °C di desorbimento; 34 min, cottura a 260 °C; e 2 min, 70 °C dopo la cottura.
- Impostare la sequenza di campioni e avviare la corsa in base alla strumentazione.
- Per impostare una sequenza sul software Entech, aprire il programma. Nelle opzioni a destra del menu a discesa dello strumento, selezionare 5800 | Sequenza.
- Osservare la tabella di sequenza nel software Entech simile a quella nel software GC-MS. Assegnare alla colonna ID esempio un nome in base al numero di date_vial corrente. Tenere presente che Nome è analogo a Nome nella tabella delle sequenze GC-MS e il Metodo 5800 determina la velocità della rampa di temperatura, i tempi di mantenimento, ecc. (apre un menu per selezionare il metodo generato nel passaggio 5.2).
- Tenere presente che le colonne Vassoio e Posizione determinano dove andrà la guida di preparazione del campione (SPR) per prelevare gli HSP.
- Osserva i due vassoi con 30 punti ciascuno all'immediata sinistra, disposti come sei colonne con cinque punti ciascuno. La posizione del vassoio più a sinistra e più vicina all'utente (anteriore) è la posizione 1, mentre la più a destra, più lontana è la posizione 30.
- Si noti che questi vassoi sono HSP A o B, dove HSP B è il vassoio più vicino all'SPR (vassoio più interno) e direttamente dietro HSP B è HSP Blank. Posizionare i campioni estratti nei vassoi e selezionare il punto sulla sequenza di conseguenza.
- Salvare la tabella delle sequenze, selezionare Esegui sul lato sinistro, quindi Inizia con vuoto nel desorbitore se l'HSP vuoto si trova nel desorbitore (indicato da un HSP contrassegnato da un'etichetta gialla).
- Si noti che gli HSP verranno gestiti dall'SPR per ogni campione nella sequenza. Lascia che l'SPR si riscaldi, quindi verrà visualizzato un messaggio nella parte superiore dello schermo per confermare se lo spazio vuoto è nel desorbitore. Clicca su Salta per confermare che la penna è lì. Consenti all'SPR di eseguire automaticamente tutti i campioni e la sequenza sul lato GC-MS registrerà automaticamente i dati in file separati.
6. Analisi dei dati
- Dati di filtro qualità sul software GC-MS (Table of Materials).
- Rivedi ogni picco sul cromatogramma e annota i picchi che corrispondono alla libreria del National Institute of Standards & Technology (NIST) (o con un'altra libreria disponibile).
- Aggiungere picchi cromatografici annotati al metodo di elaborazione. Impostare i criteri per la selezione dei picchi per includere composti con una probabilità superiore al 75% e assicurarsi che l'allineamento di ogni ione identificativo del composto si trovi all'interno del centro del picco.
- Per aggiungere un picco al metodo di elaborazione, selezionare Calibra | Modifica | composto Nome | inserire la mescola in Compound standard esterno. Aggiungere il nome del composto, il tempo di ritenzione, Quant Signal Target Ion. Aggiungi le tre vette più grandi. Per salvare, selezionare ok | Metodo | Salva.
- Una volta impostato il metodo di processo, procedere a Quantitate | Calcolare e visualizzare | QEdit Quant Risultato.
- Ispezionare ogni composto per assicurarsi che i picchi siano allineati con i tempi di ritenzione previsti e siano al di sopra del rumore di fondo.
- Una volta completato QEdit, selezionare Esci | Sì per salvare i QEdits e tornare al cromatogramma principale. Esporta le integrazioni di area aprendo il file sul lato sinistro. Seleziona Quantitate | Genera report.
- Per esportare i file da utilizzare in DExSI, selezionare File | Esporta dati in formato AIA | Creare una nuova directory e selezionare un percorso per il file o Usa directory esistente.
- Osservare l'apertura di una nuova finestra per selezionare i file da esportare. Sposta i file sul lato destro della finestra e fai clic su Elabora. Attendi da alcuni secondi a qualche minuto a seconda del numero di file convertiti.
- Correggere l'abbondanza di isotopi in DExSI secondo le istruzioni per il software DExSI (https://github.com/DExSI/DExSI) ed eseguire analisi con un software o un programma preferito (ad esempio, R). Gli script utilizzati per generare le figure si trovano in https://github.com/joannlp/
VOC_SIP .
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Representative Results
Mono- e co-colture di S. aureus, P. aeruginosa e A. baumannii
Le mono- e co-colture consistevano nelle specie batteriche S. aureus, P. aeruginosa e A. baumannii. Questi sono patogeni opportunistici comuni trovati nelle ferite umane e nelle infezioni croniche. Per identificare le molecole volatili presenti nelle mono- e co-colture, è stata eseguita una breve estrazione di 1 ora a 70 °C con agitazione a 200 giri/min. Dalle mono- e co-colture a timepoint di 24 e 48 ore, sono state rilevate 43 molecole volatili annotate (Figura 2) tra cui aldeidi, chetoni, alcoli, composti solforici, idrocarburi, acidi carbossilici o esteri e aromatici. C'era un piccolo numero di molecole volatili che sono state rilevate solo in alcune mono- o co-colture in determinati punti temporali. Ad esempio, l'acetoina e il 3-idrossi-2-butanone acetato sono stati rilevati solo nelle colture di S. aureus nel timepoint di 48 ore (Figura 2).
L'1-propanolo 2-metile volatile è stato rilevato solo nella co-coltura di P. aeruginosa e A. baumannii a 48 h (Figura 2). L'acetato di etile era presente nelle co-colture di A. baumannii con S. aureus o P. aeruginosa a 48 ore (Figura 2). I metaboliti eptano, 2,3-dimetile e pentano, 2-metile sono stati rilevati solo nella coltura di A. baumannii a 24 ore (Figura 2). L'acetaldeide e l'etanolo avevano abbondanze relative più elevate nella co-coltura di A. baumannii e S. aureus al timepoint di 24 ore rispetto a 48 ore e in uno dei ceppi nella sola coltura (Figura 2). Alcuni dei volatili erano più abbondanti nelle colture a 24 o 48 ore di tempo. Gli acidi grassi a catena corta, tra cui l'acido acetico, l'acido butanoico e l'acido propanoico, erano ad alta abbondanza relativa nelle colture a 48 ore, ma non sono stati rilevati nelle colture di 24 ore (Figura 2). L'esano era più abbondante nel controllo TH a 24 ore rispetto a 48 ore (Figura 2).
Etichettatura isotopica stabile di campioni fecali, fognari e salivari
Per identificare la produzione attiva di molecole volatili da un campione biologico, sono stati aggiunti una fonte di nutrienti etichettata, 13C glucosio o D2O e mezzi per supportare la crescita della comunità microbica. Un campione unico è stato analizzato da ciascuno dei diversi tipi di campioni di campioni fecali, fognari e salivari in triplice copia. C'è stata una maggiore incorporazione del 13C in molecole volatili completamente etichettate (Figura 3A-D) rispetto all'incorporazione con deuterio (Figura 3E). Il 13C è stato incorporato in 2-butanone, 3-idrossi; 2,3-butandione; acido acetico; e fenolo per tutti i campioni di feci, acque reflue e saliva (Figura 3A).
Gli altri volatili etichettati sono stati rilevati in due o un tipo di campione. Ad esempio, l'acetone, l'acido butanoico e l'acido propanoico sono stati rilevati come etichettati nella saliva e nelle acque reflue (Figura 3B). I volatili marcati, dimetil trisolfuro e disolfuro dimetile, sono stati arricchiti sia in campioni fecali che di saliva (Figura 3C). I volatili, 1-propanolo, 2-butanone, benzofenone, etanolo e metiltiolacetato, sono stati arricchiti solo nelle acque reflue (Figura 3D). La sostanza volatile marcata, 2,3-pentanedoina, è stata arricchita in saliva (Figura 3D). Il deuterio è stato incorporato nei volatili, acido acetico; benzaldeide, 4-metile; trisolfuro di dimetile; e fenolo, da campioni di saliva o di acque reflue (Figura 3E). Oltre ai volatili arricchiti con isotopi, sono stati rilevati volatili che non contenevano isotopi stabili incorporati. Ad esempio, i composti pirazinici, ad eccezione della pirazina, il 2,5-dimetile, sono stati rilevati in campioni fecali, fognari e saliva, ma non sono stati completamente arricchiti con 13C (Figura supplementare S1).
Etichettatura isotopica stabile di campioni di espettorato
La strategia di etichettatura degli isotopi stabili è stata implementata per identificare le sostanze volatili prodotte attivamente con campioni di espettorato di sette soggetti umani con fibrosi cistica. Le sostanze volatili nel campione sono state confrontate con quelle emerse da campioni coltivati con un'etichetta isotopica stabile. Ogni componente volatile di ciascun campione è stato analizzato due volte: prima e dopo il sondaggio isotopico stabile con glucosio e mezzi a 13C. I campioni raccolti dai soggetti abbracciavano tre diversi punti temporali o stati clinici: basale, esacerbazione e trattamento23. Le sostanze volatili rilevate come etichettate nei campioni di espettorato coltivati avevano abbondanze relative diverse rispetto alle sostanze volatili non etichettate dai campioni di espettorato non coltivati. Le condizioni di coltivazione negli esperimenti di indagine isotopica stabile con l'espettorato possono favorire la crescita di alcuni microbi, portando a differenze nell'abbondanza relativa di sostanze volatili rispetto ai campioni di espettorato non coltivati.
Ad esempio, l'acido acetico, il dimetil trisolfuro, l'acetone e il 2-metile propanale erano più abbondanti nei campioni di espettorato coltivati rispetto ai campioni di espettorato non coltivati (Figura 4). Il rilevamento di 13etanolo marcato con C, che può essere presente in quantità variabili nell'aria della stanza di fondo, fornisce la prova che l'etanolo è stato prodotto attivamente dal metabolismo microbico dal glucosio a 13C. La quantità di variazione è stata spiegata per soggetto come valutato dall'analisi multivariata permutazionale della varianza (PERMANOVA) ed è stata anche diversa per i due diversi set di dati volatili (Tabella 1 e Figura supplementare S2). Per i 13espettorato in coltura marcati C, il 51% della variazione è stata spiegata dal soggetto, mentre il 33% della variazione è stata spiegata dal soggetto dai volatili nei campioni di espettorato non coltivati (Tabella 1). La composizione della comunità del microbioma determinata dal sequenziamento dell'amplicon rRNA 16S dai sette soggetti era unica per ciascun soggetto (Figura supplementare S3) e le firme individuali si riflettevano anche nelle molecole volatili dell'espettorato coltivate e non coltivate rilevate.
Nell'espettorato coltivato, sono state rilevate 23 sostanze volatili che sono state completamente etichettate con 13atomi di carbonio. I volatili (attivi) arricchiti di isotopi rilevati dai campioni di espettorato erano diversi per ciascun soggetto. I volatili con arricchimento isotopico rilevati nei campioni di espettorato di tutti e sette i soggetti erano 2,3-butandione; acido acetico; acetone; trisolfuro di dimetile; disolfuro, dimetile; e pirazina, 2,5-dimetile (Figura 5). Sebbene tali sostanze volatili siano state rilevate in tutti i soggetti, l'arricchimento isotopico per ciascun soggetto variava. I campioni del soggetto 7 avevano un maggiore arricchimento isotopico del disolfuro dimetile rispetto agli altri sei soggetti (Figura 5B). L'acetone era più alto nei soggetti 4 e 6 (Figura 5). Alcuni volatili sono stati arricchiti con 13C solo in alcuni soggetti. Ad esempio, 1-butanolo, acido 3-metile e propanoico, 2-metile sono stati arricchiti solo in un sottoinsieme di campioni del soggetto 2 (Figura 5). Oltre ai volatili arricchiti con isotopi, c'erano anche sostanze volatili rilevate come non etichettate dallo stesso espettorato coltivato (Figura supplementare S4). Volatili 2-piperidinone; benzaldeide, 4-metile; benzotiazolo; acido butanoico, 3-metile; esanale; esano; alcool isopropilico; fenolo; acido propanoico, 2-metile; e pirrolo 1,2-apirazina-1,4-dione, l'esaidro sono stati rilevati nei campioni di espettorato, ma non sono stati arricchiti con isotopi (Figura supplementare S4).
Figura 1: Schema del protocollo. Un campione biologico viene inserito in una fiala di vetro e assemblato con il coperchio e Headspace Sorbent Pen. Un vuoto viene applicato al flaconcino fino a raggiungere una pressione di circa 30 mmHg. La sorgente di vuoto viene rimossa e le fiale vengono collocate nell'unità di estrazione della penna assorbente dove viene eseguita un'estrazione statica con l'aiuto di calore, agitazione e tempo. Dopo l'estrazione, le fiale vengono posizionate su un blocco metallico freddo per rimuovere l'acqua dallo spazio di testa e dall'HSP. Gli HSP vengono raccolti ed eseguiti tramite desorbimento termico sul GC-MS. I dati vengono analizzati con ChemStation, DExSI e R. Abbreviazioni: HSP = Headspace Sorbent Pen; GC-MS = gascromatografia-spettrometria di massa. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: Mappa di calore di mono- e co-colture. COV rilevati da mono- e co-colture a timepoint di 24 e 48 ore. Le co-culture sono le combinazioni delle lettere che rappresentano ogni ceppo. Tutti i campioni sono stati estratti per 1 ora a 70 °C con agitazione a 200 giri/min. I valori di intensità della mappa di calore sono i punteggi Z della colonna, normalizzati dal metabolita. Il punteggio Z è stato calcolato dalla differenza di valore dalla media dei valori, divisa per la deviazione standard dei valori. Il dendrogramma è stato generato con l'opzione cluster_cols nella funzione pheatmap di R. Il dendrogramma rappresenta un clustering gerarchico in cui i metaboliti che si raggruppano insieme hanno punteggi Z più simili tra i campioni. Abbreviazioni: A = A. baumanii; P = P. aeruginosa; S = S. aureus; TH = Todd Hewitt media (controllo). Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: Conversione percentuale di 13C in massa molecolare volatile in campioni fecali, saliva e fognari durante 18 ore di incubazione ed estrazione simultanee. La conversione % è stata calcolata per i composti completamente etichettati prendendo la massa del composto completamente etichettato (M + N) e dividendolo per (M + N) + la massa della massa volatile non etichettata (M), dove N è il numero massimo di carboni possibili (in A-D) o idrogeno (in E) che possono essere etichettati in ciascuna molecola volatile. I composti sono considerati completamente etichettati quando tutti i carboni del volatile sono sostituiti da 13C. Dove mancano i dati, il volatile non è stato rilevato. Ad esempio, in (D), 1-propanolo non è stato rilevato in campioni fecali o salivari. Numero di repliche per campione = 3. (A) I 13volatili marcati con C rilevati in tutti i tipi di campione (feci, saliva e acque reflue). (B) I 13volatili marcati con L'etichetta C rilevati solo nei campioni di saliva e acque reflue. (C) I 13volatili marcati con C rilevati nei campioni di feci e saliva. (D) I 13volatili marcati con la C rilevati in uno dei tre diversi tipi di campione. (E) Le molecole volatili marcate con deuterio. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4: Mappa termica di 13sostanze volatili marcate con C da espettorato in coltura e molecole volatili rilevate da espettorato non coltivato. I volatili etichettati provengono dagli esperimenti di indagine isotopica stabile in cui il glucosio 13C e il mezzo di infusione cardiaca cerebrale sono stati aggiunti all'espettorato durante la fase di estrazione per coltivare la crescita microbica e catturare la produzione volatile attiva. Le molecole volatili non etichettate sono state rilevate direttamente da campioni di espettorato. Le intensità della mappa di calore sono Z-score come descritto nella didascalia della Figura 2. Tuttavia, i punteggi Z sono stati calcolati all'interno di ciascun esperimento per gli esperimenti di espettorato coltivato e non coltivato. Il dendrogramma è stato generato come descritto nella Figura 2. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 5: Conversione percentuale di 13C in massa molecolare volatile in campioni di espettorato da sette soggetti con fibrosi cistica durante 18 ore di incubazione ed estrazione simultanee. La conversione % è stata calcolata come descritto nella didascalia della figura 3. I volatili non rilevati nei campioni sono indicati dall'assenza di dati. N = 1-3. (A) I 13volatili marcati con C rilevati a una conversione percentuale più elevata nella maggior parte dei campioni di espettorato. (B) I 13volatili marcati con C rilevati a una conversione percentuale inferiore nella maggior parte dei campioni di espettorato. (C) I 13volatili marcati con C rilevati a una conversione percentuale inferiore in una minoranza dei campioni di espettorato. Abbreviazioni: B = baseline; E = esacerbazione; T = trattamento. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
| Gradi di libertà | R2 · | Valore P | ||
| Espettorato incolto | Oggetto | 6 | 0.33 | 0.001 |
| Stato clinico | 2 | 0.01 | 0.46 | |
| Oggetto: Stato clinico | 12 | 0.12 | 0.092 | |
| Espettorato coltivato con glucosio e mezzi 13C | Oggetto | 6 | 0.51 | 0.001 |
| Stato clinico | 2 | 0.02 | 0.095 | |
| Oggetto: stato clinico | 12 | 0.11 | 0.194 |
Tabella 1: Analisi multivariata permutata della varianza (PERMANOVA) di campioni di espettorato. Il PERMANOVA è stato generato utilizzando la funzione adonis dal pacchetto vegano in R.
Figura supplementare S1: L'abbondanza relativa di sostanze volatili marcate (M + N (max)) e non etichettate (M + 0) su campioni fecali, saliva e fognari. Fare clic qui per scaricare questo file.
Figura supplementare S2: Ridimensionamento multidimensionale non metrico dell'espettorato coltivato con sonda isotopica stabile ed espettorato non coltivato. (A) L'NMDS dell'espettorato coltivato con glucosio e mezzi 13C è stato generato con k = 3 dimensioni. Il valore dello stress era 0,07. (B) L'NMDS dell'espettorato non coltivato è stato generato con k = 3 dimensioni. Il valore dello stress era 0,13. Abbreviazioni: NMDS = ridimensionamento multidimensionale non metrico; B = basale; E = esacerbazione; T = trattamento. Fare clic qui per scaricare questo file.
Figura supplementare S3: Composizione della comunità microbica di campioni di espettorato da soggetti con fibrosi cistica. Valutato dal sequenziamento dell'amplicone dell'rRNA 16S come parte di uno studio più ampio, ulteriori informazioni sull'approccio trovato in Carmody et al. 202019. da soggetti con fibrosi cistica. Ogni barra impilata è un punto temporale diverso. Abbreviazioni: B = basale, E = esacerbazione, T = trattamento. Fare clic qui per scaricare questo file.
Figura supplementare S4: L'abbondanza relativa di sostanze volatili marcate (M + N (max)) e non etichettate (M + 0) su campioni di espettorato di sette soggetti con fibrosi cistica. Fare clic qui per scaricare questo file.
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Discussion
Per identificare la produzione volatile in colture in vitro e campioni associati all'uomo, sono state eseguite analisi volatili di mono- e co-colture di P. aeruginosa, S. aureus e A. baumanii e sondaggi isotopici stabili di diversi campioni biologici. Nell'analisi per le mono- e co-colture, i volatili sono stati rilevati eseguendo una breve estrazione per 1 ora a 70 °C. L'analisi volatile di mono- e co-colture ha permesso l'indagine dei composti prodotti sia dalle singole specie che durante le loro interazioni con altre specie. C'erano differenze nelle abbondanze relative tra i diversi tipi di cultura e punti temporali. Negli esperimenti di indagine degli isotopi stabili, i campioni biologici includevano feci e saliva di soggetti sani, acque reflue ed espettorato di soggetti con fibrosi cistica. Il profilo isotopico stabile ha permesso l'identificazione di molecole volatili prodotte attivamente estraendo per 18 ore a 37 °C. Il lungo tempo di estrazione con una temperatura più bassa ha permesso la crescita e il metabolismo dei microbi presenti nei campioni biologici. Confrontando gli arricchimenti di glucosio 13C e D2O ha mostrato che c'era un arricchimento isotopico più esteso con 13C etichettato.
Durante l'estrazione di diversi tipi di campione, sono stati eseguiti passaggi iniziali di ottimizzazione prima di iniziare un'esecuzione completa. Innanzitutto, testare volumi diversi di un campione come esecuzione di prova. Per alcuni tipi di campione, l'espettorato, ad esempio, erano disponibili solo piccoli volumi di campioni. Si consiglia di iniziare prima con un volume inferiore o una quantità minore di campione, a seconda del tipo di campione e delle quantità di campione disponibili. Non estrarre un grande volume o troppo del campione perché potrebbe sopraffare la colonna e contaminare l'HSP. Il sovraccarico della colonna può essere evidente quando i picchi nel cromatogramma sono saturi o compaiono nelle esecuzioni successive. La contaminazione da HSP si è verificata se il carryover è presente quando l'HSP viene rieseguito sul GC-MS. Negli esperimenti di mono- e co-coltura, 200 μL di coltura erano sufficienti per rilevare una varietà di sostanze volatili. Negli esperimenti di sonda di isotopi stabili, a seconda del tipo di campione, il volume per ciascun esperimento variava da 500 μL a 1 mL. In secondo luogo, a seconda del tipo di campione e dei composti di interesse, il tempo e la temperatura di estrazione, nonché i metodi GC-MS e di desorbimento termico dovranno essere regolati per ottimizzare il rilevamento volatile. Questi metodi sono stati ritenuti appropriati per gli analiti di interesse e il tipo di colonna.
Dopo aver ottimizzato il metodo, i passaggi critici nel protocollo riguardavano i passaggi precedenti e successivi all'estrazione. Durante la preparazione del campione, i campioni sono stati posti sul ghiaccio in modo che le sostanze volatili presenti nel campione non sfuggissero. Era anche importante assicurarsi che la guarnizione sottovuoto fosse ermetica e che il coperchio fosse chiuso saldamente. Altrimenti, ci sarebbe un'estrazione inefficiente e una diminuzione del rilevamento dei volatili dal campione. Le perdite possono derivare dagli O-ring attorno al coperchio o all'HSP. Per garantire che la fiala fosse sotto vuoto, prima dell'estrazione è stato utilizzato un misuratore per assicurarsi che gli O-ring fossero ancora funzionanti. Inoltre, dopo l'estrazione, i campioni sono stati posti sul blocco di ghiaccio in modo che l'acqua fosse estratta dallo spazio di testa per un determinato periodo. L'acqua nella colonna potrebbe portare a cambiamenti nei tempi di ritenzione e alla soppressione della risposta della SM, portando così a risultati non quantitativi. La possibilità di estrarre l'acqua in eccesso dagli HSP prima della rimozione dal manicotto sottovuoto/gruppo flaconcino è possibile grazie alla natura del sistema chiuso del processo VASE e alla capacità di estrarre l'acqua nel punto più freddo all'interno di tale sistema di estrazione utilizzando la piastra fredda a -80 °C.
Ci sono sia limitazioni che vantaggi a questi metodi rispetto ai metodi alternativi. Valutando gli esperimenti di mono- e co-coltura, sono state rilevate firme volatili specifiche per un particolare microbo o co-coltura. Ci sono stati anche cambiamenti nelle abbondanze volatili nel tempo. Per quanto riguarda gli esperimenti di indagine isotopica stabile nei diversi tipi di campioni biologici, l'etichettatura del deuterio non ha portato a tanti volatili arricchiti con isotopi come il glucosio 13C. Il metabolismo necessario per produrre sostanze volatili arricchite con isotopi con deuterio può essere più limitato. Inoltre, i media sono stati aggiunti ai campioni biologici per migliorare la crescita microbica, che può portare a cambiamenti nella composizione della comunità microbica. Le condizioni di coltura degli esperimenti di sonda isotopica stabile possono essere selezionate per la crescita favorita di alcuni microbi in un campione biologico. Ciò si opponeva alla breve estrazione per un'ora a 70 ° C progettata per rilevare le sostanze volatili nel campione della comunità prima che uno o pochi microbi iniziassero a prendere il sopravvento sulla comunità. La complessità delle composizioni microbiche e chimiche dei tipi di campioni fecali, fognari, saliva ed espettorato rende difficile l'assegnazione di firme chimiche specifiche a una data origine microbica o umana senza ulteriori analisi come il sequenziamento. Questo metodo ha fornito un'estrazione sottovuoto ad alta produttività e priva di solventi che ha portato a un rilevamento più sensibile di campioni a basso volume. I volumi utilizzati per questi esperimenti variavano da 200 μL a 1 mL di campioni biologici coltivati. In altri casi (dati non mostrati), sono stati estratti campioni biologici (ad esempio, campioni di espettorato e fecale) a partire da 15 μL o 10 μg.
Per le future applicazioni del metodo, una vasta gamma di tipi di campioni potrebbe essere analizzata con volumi piccoli o limitati. Decine di campioni potrebbero essere estratti contemporaneamente e il tempo di esecuzione dipenderebbe dai parametri dello specifico strumento GC-MS. Nel caso del sondaggio isotopico stabile, quando accoppiato con il sequenziamento metagenomico, c'è la possibilità di identificare i microbi responsabili della produzione delle molecole volatili. Il metagenoma del campione biologico potrebbe essere sequenziato prima e dopo l'estrazione con un sondaggio isotopico stabile per identificare i cambiamenti nella composizione della comunità microbica. Il sequenziamento metagenomico consentirebbe l'identificazione dei geni responsabili della produzione delle molecole volatili arricchite con isotopi. Di seguito sono evidenziati alcuni esempi dei tipi e degli approcci di esempio che potrebbero essere utilizzati come input per il protocollo presentato, che è già stato stabilito in diversi settori. Poiché le molecole volatili sono importanti indicatori diagnostici, l'uso di questo protocollo potrebbe essere esteso ai laboratori biologici e alle strutture cliniche sanitarie.
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Disclosures
V. L. V e S. J.B. D. erano ex dipendenti di Entech Instruments Inc., e K. W. è membro del programma universitario di Entech. J. P., J. K. e C. I. R. non hanno conflitti di interesse da dichiarare.
Acknowledgments
Ringraziamo Heather Maughan e Linda M. Kalikin per l'attenta redazione di questo manoscritto. Questo lavoro è stato supportato da NIH NHLBI (sovvenzione 5R01HL136647-04).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 13C glucose | Sigma-Aldrich | 389374-1G | |
| 2-Stg Diaph Pump | Entech Instruments | 01-10-20030 | |
| 20 mL VOA vials | Fisher Scientific | 5719110 | |
| 24 mm Black Caps with hole, no septum | Entech Instruments | 01-39-76044B | holds lid liner in place on vial |
| 24 mm vial liner for sorbent pens | Entech Instruments | SP-L024S | allows pens to make a vacuum seal at top of vial |
| 5600 Sorbent pen extraction unit (SPEU) | Entech Instruments | 5600-SPES | 5600 Sorbent Pen Extraction Unit -120 VAC |
| 96-well assay plates | Genesee | 25-224 | |
| Brain Heart Infusion (BHI) media | Sigma-Aldrich | 53286-500G | |
| ChemStation Stofware | Agilent | ||
| DB-624 column | Agilent | 122-1364E | 60 m, 0.25 mm ID, 1.40 micron film thickness, in GC-MS |
| Deuterium oxide | Sigma-Aldrich | 151882-1L | |
| Dexsi sofware | Dexsi (open source) | ||
| GC-MS (7890A GC and 5975C inert XL MSD with Triple-Axis Detector) | Agilent | 7890A GC and 5975C inert XL MSD with triple-axis detector | |
| Headspace Bundle HS-B01, 120VA | Entech Instruments | SP-HS-B01 | Items for running headspace extraction included in bundle |
| Headspace sorbent pen (HSP) - blank | Entech Instruments | SP-HS-0 | |
| Headspace sorbent pen (HSP) Tenax TA (35/60 Mesh) | Entech Instruments | SP-HS-T3560 | |
| Microcentrifuge tubes (2 mL) | VWR | 53550-792 | |
| O-rings | Entech Instruments | SP-OR-L024 | |
| Sample Preparation Rail | Entech Instruments | ||
| Sorbent pen thermal conditioner | Entech Instruments | 3801-SPTC | |
| Todd Hewitt (TH) media | Sigma | T1438-500G |
References
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