Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

לכידת תרכובות אורגניות נדיפות מיקרוביאליות המיוצרות באופן פעיל מדגימות הקשורות לבני אדם עם מיצוי סורבנט בסיוע ואקום

Published: June 1, 2022 doi: 10.3791/62547
Automatic Translation
1, 1, 2, 3, 3, 3, 1
1Department of Molecular Biology and Biochemistry, University of California Irvine, 2Department of Ecology and Evolutionary Biology, University of California Irvine, 3Entech Instruments Inc.

Summary

פרוטוקול זה מתאר מיצוי של תרכובות אורגניות נדיפות מדגימה ביולוגית בשיטת מיצוי סורבנט בסיוע ואקום, כרומטוגרפיית גז בשילוב עם ספקטרומטריית מסה באמצעות מסילת הכנת דגימות Entech וניתוח נתונים. הוא מתאר גם תרבית של דגימות ביולוגיות ובדיקת איזוטופים יציבה.

Abstract

לתרכובות אורגניות נדיפות (VOCs) מדגימות ביולוגיות יש מקורות לא ידועים. תרכובות אורגניות נדיפות עשויות להגיע מהמארח או מאורגניזמים שונים מתוך הקהילה המיקרוביאלית של המארח. כדי לנטרל את מקורם של תרכובות אורגניות נדיפות, בוצעו ניתוח נדיף של תרביות חד-פרצופיות וקו-תרביות חיידקים של סטפילוקוקוס אאורוס, Pseudomonas aeruginosa ו-Acinetobacter baumannii, ובדיקת איזוטופים יציבים בדגימות ביולוגיות של צואה, רוק, ביוב וכיח. תרביות חד-פעמיות וקו-קו-תרביות שימשו לזיהוי ייצור נדיף ממיני חיידקים בודדים או בשילוב עם בדיקת איזוטופים יציבה כדי לזהות את חילוף החומרים הפעיל של מיקרובים מהדגימות הביולוגיות.

מיצוי סורבנט בסיוע ואקום (VASE) שימש לחילוץ תרכובות אורגניות נדיפות. VASE היא שיטת מיצוי מרחב ראש קלה לשימוש, ממוסחרת ונטולת ממסים עבור תרכובות נדיפות למחצה ונדיפות. המחסור בממסים ותנאי הכמעט ואקום המשמשים במהלך המיצוי הופכים את פיתוח השיטה לקל ומהיר יחסית בהשוואה לאפשרויות מיצוי אחרות כגון טרט-בוטילציה ומיקרו-אקסטרהקציה של פאזה מוצקה. זרימת העבודה המתוארת כאן שימשה לזיהוי חתימות נדיפות ספציפיות מתרבויות חד-צדדיות וקו-תרבויות. יתר על כן, ניתוח של בדיקת האיזוטופים היציבה של דגימות ביולוגיות הקשורות לבני אדם זיהה תרכובות אורגניות נדיפות שיוצרו באופן נפוץ או ייחודי. מאמר זה מציג את זרימת העבודה הכללית ואת השיקולים הניסיוניים של VASE בשילוב עם בדיקה איזוטופית יציבה של תרביות מיקרוביאליות חיות.

Introduction

לתרכובות אורגניות נדיפות (VOC) יש הבטחה גדולה לזיהוי וזיהוי של חיידקים מכיוון שהן נפלטות מכל האורגניזמים, ולמיקרובים שונים יש חתימות VOC ייחודיות. מולקולות נדיפות שימשו כמדידה לא פולשנית לאיתור זיהומים שונים בדרכי הנשימה, כולל מחלת ריאות חסימתית כרונית1, שחפת2 בשתן3 ודלקת ריאות הקשורה למכונת הנשמה4, בנוסף להבחנה בין נבדקים עם סיסטיק פיברוזיס (CF) לבין נבדקי ביקורת בריאים 5,6. חתימות נדיפות אפילו שימשו להבחנה בין זיהומים פתוגנים ספציפיים ב- CF (Staphylococcus aureus7, Pseudomonas aeruginosa 8,9, ו- S. aureus לעומת P. aeruginosa10). עם זאת, עם המורכבות של דגימות ביולוגיות כאלה, לעתים קרובות קשה לאתר את המקור של תרכובות אורגניות נדיפות ספציפיות.

אסטרטגיה אחת לניתוק הפרופילים הנדיפים ממיקרובים מדביקים מרובים היא לבצע ניתוח מרחב ראש של מיקרואורגניזמים הן בתרבית מונו והן בתרבית משותפת11. ניתוח מרחב ראש בוחן את האנליטים הנפלטים לתוך "מרחב הראש" שמעל דגימה ולא את אלה המוטמעים במדגם עצמו. מטבוליטים מיקרוביאליים אופיינו לעתים קרובות בתרביות חד-תרבותיות בגלל הקושי לקבוע את מקורם של מטבוליטים מיקרוביאליים בדגימות קליניות מורכבות. על-ידי יצירת פרופילים של נדיפים מתרביות חד-תרביות של חיידקים, סוגי הנדיפים שמייצר מיקרוב במבחנה עשויים לייצג בסיס ברפרטואר הנדיף שלו. שילוב של תרביות חיידקים, למשל, יצירת תרביות משותפות ויצירת פרופיל של המולקולות הנדיפות המיוצרות עשוי לחשוף את האינטראקציות או ההזנה הצולבת בין החיידקים12.

אסטרטגיה נוספת לזיהוי המקור המיקרוביאלי של מולקולות נדיפות היא לספק מקור תזונתי המסומן באיזוטופ יציב. איזוטופים יציבים הם צורות טבעיות ולא רדיואקטיביות של אטומים עם מספר שונה של נויטרונים. באסטרטגיה שנעשה בה שימוש מאז תחילת שנות ה-30 של המאה ה-20 כדי להתחקות אחר חילוף חומרים פעיל בבעלי חייםבני 13, המיקרואורגניזם ניזון ממקור ההזנה המסומן ומשלב את האיזוטופ היציב במסלולים המטבוליים שלו. לאחרונה, איזוטופ יציב בצורה של מים כבדים (D2O) שימש לזיהוי S. aureus פעיל מטבולית בדגימת כיח קלינית CF14. בדוגמה אחרת, 13גלוקוז עם תווית C שימש להדגמת האכלה צולבת של מטבוליטים בין מבודדים קליניים של CF של P. aeruginosa ו Rothia mucilaginosa12 .

עם התקדמותן של טכניקות ספקטרומטריית מסות, שיטות לאיתור רמזים נדיפים עברו מתצפיות איכותיות למדידות כמותיות יותר. על ידי שימוש בספקטרומטריית מסה של כרומטוגרפיה של גז (GC-MS), עיבוד דגימות ביולוגיות הפך להיות בהישג יד עבור רוב ההגדרות המעבדתיות או הקליניות. שיטות רבות לסקר מולקולות נדיפות שימשו לפרופיל דגימות כגון מזון, תרביות חיידקים ודגימות ביולוגיות אחרות, ואוויר ומים לאיתור זיהום. עם זאת, מספר שיטות נפוצות של דגימה נדיפה עם תפוקה גבוהה דורשות ממס ואינן מבוצעות עם היתרונות המסופקים על ידי מיצוי ואקום. בנוסף, נפחים או כמויות גדולים יותר (מעל 0.5 מ"ל) של חומרים שנדגמו נדרשים לעתים קרובות לניתוח 15,16,17,17,18,19, אם כי זה ספציפי למצע ודורש אופטימיזציה עבור כל סוג מדגם ושיטה.

כאן, נעשה שימוש במיצוי סורבנט בסיוע ואקום (VASE) ולאחר מכן בספיגה תרמית ב-GC-MS כדי לסקור את הפרופילים הנדיפים של תרביות חד-תאיות חיידקיות ו-co-co ולזהות נדיפים המיוצרים באופן פעיל עם איזוטופים יציבים הנבדקים מצואה אנושית, רוק, ביוב ודגימות כיח (איור 1). עם כמויות דגימה מוגבלות, תרכובות אורגניות נדיפות הוצאו מתוך 15 μL בלבד של כיח. ניסויי בדיקת איזוטופים עם דגימות אנושיות דרשו הוספת מקור איזוטופי יציב, כגון גלוקוז 13C, ומדיה לטיפוח הצמיחה של הקהילה המיקרוביאלית. הייצור הפעיל של נדיפים זוהה כמולקולה כבדה יותר על ידי GC-MS. מיצוי של מולקולות נדיפות תחת ואקום סטטי אפשר זיהוי של מולקולות נדיפות עם רגישות מוגברת 20,21,22.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. עט סורבנט מרחב ראש (HSP) ושיקולי ניתוח מדגם

הערה: ה-HSP המכיל את ה-Tenax TA הסורבנטי נבחר כדי ללכוד מגוון רחב של נדיפים. לטנאקס יש זיקה נמוכה יותר למים בהשוואה לסורבנטים אחרים, מה שמאפשר לה ללכוד יותר תרכובות אורגניות נדיפות מדגימות בעלות לחות גבוהה יותר. לטנאקס יש גם רמה נמוכה של זיהומים וניתן להתנות אותה לשימוש חוזר. בחירת סורבנט נעשתה גם תוך התחשבות בעמודה המותקנת ב- GC-MS (ראה טבלת החומרים).

  1. צור פקדים שליליים על-ידי חילוץ מדיה ו/או ריקי דגימה עם אותם תנאים המשמשים לחילוץ דגימה.
  2. נתחו HSP ריק (שאושר בעבר כנקי ונטול רקע משמעותי) ב-GC-MS לפני ניתוח דגימות שחולצו. הפעל ריקים בין סוגי דגימות (למשל, שלושה שכפולים של חיידקים חד-תרבית, ריק, שלושה שכפולים של תרבית משותפת של חיידקים, ריק וכו').
  3. הגבילו את השימוש בפריטי טיפוח אישי ריחניים או את הצריכה של מזונות מסריחים לפני מיצוי וניתוח הדגימה. באופן אידיאלי, הכינו דגימות במכסה מנוע בטיחות ביולוגית שלא טוהר על ידי אלכוהול או חומרי ניקוי נדיפים אחרים במשך 30 דקות לפחות. הפעילו את זרימת האוויר במכסה המנוע של בטיחות ביולוגית למשך 30-60 דקות לפני הכנת הדגימה.
  4. שמור דגימות על קרח כדי להגביל שחרור נדיף במהלך הכנת הדגימה.

2. הכנה למונו-תרבות ולתרבות משותפת

  1. במכסה המנוע הביו-בטיחותי, חסן תרבויות של A. baumannii, S. aureus ו- P. aeruginosa במדיית הצמיחה של טוד יואיט. דגירה למשך הלילה ב-37 מעלות צלזיוס עם תסיסה של 200 סל"ד.
  2. לאחר הדגירה הלילית, בצעו טיפול בתרבית במכסה המנוע של הבטיחות הביולוגית. דיללו כל תרבית לצפיפות אופטית 0.05 ב-500 ננומטר.
  3. ערבבו תרבויות משותפות בחלקים שווים, ופיפטה 200 μL של מדיית בקרה, מונו-תרבות או תרבות משותפת לכל באר של צלחת של 96 בארות, והניחו בחממה של 37 מעלות צלזיוס למשך 24 שעות. הכינו צלחת שנייה לדגירה של 48 שעות.
  4. בסוף תקופת הדגירה, להכין דגימות למיצוי בסעיף 4. תרביות נוזליות פיפטה לצינורות מיקרוצנטריפוגה ומאחסנות בטמפרטורה של -80 מעלות צלזיוס.
    הערה: בשלב זה, ניתן לאחסן דגימות בטמפרטורה של -80 °C כדי לחלץ מאוחר יותר במידת הצורך.

3. בדיקת איזוטופים יציבה בהכנת דגימות ביולוגיות

הערה: דגימות הצואה והרוק נתרמו מתורמים אנונימיים באישור המועצה לביקורת מוסדית של אוניברסיטת קליפורניה באירווין (HS# 2017-3867). הביוב הגיע מסן דייגו, קליפורניה. דגימות הכיח נאספו מנבדקים עם סיסטיק פיברוזיס כחלק ממחקר גדול יותר שאושר על ידי מועצת הביקורת המוסדית של בית הספר לרפואה של אוניברסיטת מישיגן (HUM00037056).

  1. בצע את כל תכשירי הדגימה הביולוגית במכסה המנוע של בטיחות ביולוגית.
    1. כדי להכין דגימות צואה, הוסיפו 1 מ"ל של מים שעברו דה-יוניזציה ל-100 מ"ג של צואה בצינור מיקרו-צנטריפוגה של 1.5 מ"ל ובמערבולת למשך 3 דקות. מניחים על קרח כאשר אינם בשימוש.
      1. ל-15 μL של תערובת צואה ומים, הוסיפו 485 μL של מדיום עירוי לב המוח (BHI) עם 20 mM 13C גלוקוז, או BHI עם 30% דאוטריום (D2O). ודא שהנפח הסופי של הדגימה הוא 500 μL. הכן דגימות בטריפליקטים טכניים.
    2. כדי להכין דגימות ביוב, הוסיפו 500 μL של ביוב ל-500 μL של BHI עם 20 mM 13C גלוקוז או BHI עם 30% D2O בנפח כולל של 1 מ"ל. הכינו דוגמאות במשולש. מניחים על קרח כאשר אינם בשימוש.
    3. כדי להכין דגימות רוק, הוסיפו 50 μL של רוק ל-500 μL של BHI עם 20 mM 13C גלוקוז או BHI עם 30% D2O לנפח כולל של 550 μL. הכינו דגימות בטריפליקט. מניחים על קרח כאשר אינם בשימוש.
    4. כדי להכין דגימות כיח כדי להשוות את הנדיפים הקיימים בדגימה לפני ואחרי התרבות, בצע מיצוי ראשון עם 15 μL של כיח. הכינו דוגמאות במשולש. מניחים על קרח כאשר אינם בשימוש. המשך לסעיף 4 לחילוץ דגימה, וחלץ במשך 18 שעות ב-37 °C עם תסיסה של 200 סל"ד.
    5. לאחר השלמת המיצוי הראשון של דגימות כיח לא תרבותיות, שמור את הבקבוקונים עם כיח. הוסף 500 μL של BHI עם 20 mM 13C גלוקוז לבקבוקונים עם כיח מ 3.5.1. מניחים על קרח כאשר אינם בשימוש.
  2. המשך לסעיף 4 לחילוץ דגימה.

4. מיצוי לדוגמה

  1. הניחו בקבוקוני אנליזה אורגנית נדיפים ריקים (VOA) (20 מ"ל) על הצלחת הקרה, והניחו את הצלחת הקרה על קרח במכסה המנוע של הבטיחות הביולוגית.
  2. הפעילו את יחידת מיצוי עט הסורבנט 5600 (SPEU), והתאימו את עצמכם לטמפרטורה הרצויה כנדרש עבור כל שיטה.
    הערה: לניסויים יציבים בבדיקת איזוטופים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס, הגעה לנקודת הסט יכולה להימשך עד 15 דקות. עבור ניסויים בתרבית חד-גונית וקו-תרבותית בטמפרטורה של 70 מעלות צלזיוס, הגעה לנקודת ה-setpoint יכולה להימשך עד 60 דקות.
  3. אסוף HSPs נקיים השווה למספר הדגימות שהוכנו, כולל HSPs עבור מדיה או בקרות לדוגמה.
  4. תייג בקבוקוני VOA בגודל 20 מ"ל לפי דגימות, שכפולים ומזהי HSP לפי הצורך. השתמשו בסמן המתנגד למים במקרה שנוצרת עיבוי על החלק החיצוני של הבקבוקון בזמן שאתם על הקרח.
  5. בתוך מכסה המנוע של הבטיחות הביולוגית, שחררו את הכובע הלבן על הבקבוקון, זרקו במהירות דגימה לתוך הבקבוקון, והרכיבו את הכובע השחור, תוחם המכסה וה-HSP.
    הערה: דוגמאות לא אמורות לבוא במגע עם ה- HSP, ונפח הדגימה יהיה תלוי בסוג המדגם.
  6. הניחו את הבקבוקון המכיל את הדגימה ואת HSP בחזרה על הצלחת הקרה.
  7. חזור על שלבים 4.5 ו- 4.6 עבור כל דגימה. בצע שלבים אלה לכל דגימה במקום בבת אחת כדי למנוע התחממות דגימה ובכך, שחרור נדיף מוקדם.
  8. לאחר שכל הדגימות הוכנו בבקבוקוני הזכוכית, בצע את הצעדים הבאים מחוץ למכסה המנוע של הבטיחות הביולוגית על הספסל. הפעילו את משאבת הוואקום, הניחו את הבקבוקונים תחת ואקום ל-30 מ"מ כספית והסירו את מקור הוואקום.
    הערה: הבקבוקונים אינם צריכים להיות על המגש הקר לאחר השלמת יישום ואקום.
  9. בדוק שוב את הלחץ לאחר הצבת כל הדגימות תחת ואקום באמצעות מד הלחץ. אם לבקבוקון יש נזילה, יש לוודא כי המכסה מוברג בחוזקה, וכי טבעות ה- O הלבנות של תוחמי ה- HSP והמכסה נמצאים במקומן כראוי.
    הערה: אטם פגום יכול לגרום לירידה בזיהוי נדיף בהשוואה לבקבוקון תחת ואקום.
  10. הניחו בקבוקונים ב-SPEU לזמן ולטמפרטורה הממוטבים עם תסיסה ב-200 סל"ד. תמציות תרבויות למשך שעה אחת ב-70 מעלות צלזיוס. חלץ ניסויי בדיקה איזוטופים יציבים עם דגימות צואה, ביוב, רוק וכיח במשך 18 שעות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס.
  11. הניחו את הצלחת הקרה בטמפרטורה של -80 מעלות צלזיוס לשימוש לאחר השלמת תקופת החילוץ.
  12. כאשר השאיבה הושלמה, הניחו דגימות על הצלחת הקרה במשך 15 דקות כדי לשאוב אדי מים מה-HSP וממרחב הראש של הבקבוקון.
  13. העבירו את ה-HSPs לשרוולים שלהם.
    הערה: ניתן להשהות את הניסוי כאן עד כשבוע בטמפרטורת החדר לפני שתאבד את התרכובות הנדיפות יותר מה-HSPs.

5. לנתח דגימות על כרומטוגרפיית הגז - ספקטרומטר מסה (GC-MS)

  1. השתמש בהגדרות GC-MS הבאות (ראה את טבלת החומרים): 35 °C עם החזקה של 5 דקות, רמפה של 10 °C לדקה עד 170 °C, ורמפה של 15 °C /min ל-230 °C עם יחס מפוצל של 20:1 וזמן ריצה כולל של 38 דקות.
  2. הגדר את שיטת ההשמדה כדלקמן: 2 דקות, 70 °C מראש חימום; 2 דקות 260 °C ספיגה; 34 דקות, 260 מעלות צלזיוס לאפייה; ו 2 דקות, 70 מעלות צלזיוס לאחר אפייה.
  3. הגדר את רצף הדגימות, והתחל את הריצה לפי מכשור.
    1. כדי להגדיר רצף בתוכנת Entech, פתח את התוכנית. באפשרויות שמימין לתפריט הנפתח של המכשיר, בחר 5800 | רצף.
    2. שימו לב לטבלת הרצף בתוכנת Entech הדומה לזו שבתוכנת GC-MS. תן שם לעמודה מזהה לדוגמה בהתאם למספר date_vial הנוכחי. זכור כי שם מקביל לשם בטבלת הרצף GC-MS, ושיטת 5800 קובעת את קצב רמפת הטמפרטורה, זמני ההחזקה וכו ' (פותח תפריט לבחירת השיטה שנוצרה בשלב 5.2).
    3. זכור שהעמודות 'מגש' ו'מיקום' קובעות לאן ילך מסילת ההכנה לדוגמה (SPR) כדי לאסוף את ה-HSPs.
      1. התבונן בשני המגשים עם 30 כתמים כל אחד משמאל, ערוכים כשישה עמודים עם חמישה כתמים כל אחד. מיקום המגש השמאלי ביותר והקרוב ביותר למשתמש (הקדמי) הוא מיקום 1, בעוד שהמיקום הימני ביותר, הרחוק ביותר, הוא מיקום 30.
      2. שים לב שמגשים אלה הם HSP A או B, כאשר HSP B הוא המגש הקרוב יותר ל- SPR (המגש הפנימי ביותר), ומיד מאחורי HSP B נמצא HSP Blank. מניחים את הדגימות שחולצו לתוך המגשים, ובוחרים את הנקודה ברצף בהתאם.
    4. שמור את טבלת הרצף, בחר הפעל בצד שמאל ולאחר מכן התחל עם ריק ב- desorber אם ה- HSP הריק נמצא ב- desorber (מסומן על-ידי HSP המסומן בתווית צהובה).
  4. שים לב ש- HSPs יטופלו על ידי ה- SPR עבור כל דגימה ברצף. תן ל- SPR להתחמם, ואז תופיע הודעה בחלק העליון של המסך כדי לאשר אם הריק נמצא ב- desorber. לחץ על דלג כדי לוודא שהעט נמצא שם. אפשר ל- SPR להפעיל את כל הדוגמאות באופן אוטומטי, והרצף בצד GC-MS יתעד את הנתונים באופן אוטומטי בקבצים נפרדים.

6. ניתוח נתונים

  1. נתוני מסנן איכות בתוכנת GC-MS (טבלת חומרים).
    1. סקור כל פסגה בכרומטוגרמה, ותבאר פסגות התואמות את ספריית המכון הלאומי לתקנים וטכנולוגיה (NIST) (או עם ספרייה זמינה אחרת).
    2. הוסף שיאי כרומטוגרמה מבוארים לשיטת העיבוד. קבעו את הקריטריונים לבחירת פסגות כך שיכללו תרכובות עם הסתברות של יותר מ-75%, וודאו שהיישור של כל יון מזהה של התרכובת נמצא במרכז השיא.
      1. כדי להוסיף שיא לשיטת העיבוד, בחר כיול | עריכת מתחם | שם | הוסף תרכובת תחת תרכובת סטנדרטית חיצונית. הוסף את שם המתחם, זמן שמירה, יון יעד אות קוונטי. הוסף את שלוש הפסגות הגדולות ביותר. כדי לשמור, בחר אישור | שיטה | שמור.
    3. לאחר הגדרת שיטת התהליך, המשך ל - Quantitate | חישוב והצגת | QEdit Quant תוצאה.
    4. בדקו כל תרכובת כדי לוודא שהשיאים תואמים את זמני השמירה הצפויים שלהם ונמצאים מעל רעשי הרקע.
    5. לאחר השלמת QEdit, בחר יציאה | כן כדי לשמור את QEdits ולחזור לכרומטוגרמה הראשית. ייצא את שילובי השטח על-ידי פתיחת הקובץ בצד שמאל. בחר | כמות צור דוח.
    6. כדי לייצא קבצים לשימוש ב- DExSI, בחר קובץ | ייצוא נתונים לתבנית AIA | צור ספריה חדשה ובחר מיקום עבור הקובץ או השתמש בספריה הקיימת.
    7. התבונן בחלון חדש שנפתח כדי לבחור קבצים לייצוא. הזז את הקבצים לצד ימין של החלון ולחץ על תהליך. המתן מספר שניות עד מספר דקות בהתאם למספר הקבצים שהומרו.
  2. נכון לשפע איזוטופים ב-DExSI על פי הוראות לתוכנת DExSI (https://github.com/DExSI/DExSI), ולבצע ניתוח עם תוכנה או תוכנה מועדפת (למשל, R). סקריפטים המשמשים ליצירת הדמויות ממוקמים https://github.com/joannlp/ VOC_SIP.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

תרבויות מונו-שותפות של S. aureus, P. aeruginosa ו- A. baumannii
התרביות המונו-ותרביות המשותפות כללו את מיני החיידקים S. aureus, P. aeruginosa ו-A. baumannii. אלה הם פתוגנים אופורטוניסטיים נפוצים שנמצאים בפצעים אנושיים ובזיהומים כרוניים. כדי לזהות את המולקולות הנדיפות הקיימות בתרביות המונו והקו-קו, מיצוי קצר של שעה אחת בוצע ב-70 מעלות צלזיוס עם תסיסה של 200 סל"ד. מתוך התרביות המונו-ותרביות המשותפות בנקודות זמן של 24 ו-48 שעות, זוהו 43 מולקולות נדיפות מבוארות (איור 2) ביניהן אלדהידים, קטונים, אלכוהולים, תרכובות גופרתיות, פחמימנים, חומצות קרבוקסיליות או אסטרים, וארומטיים. היו מספר קטן של מולקולות נדיפות שזוהו רק בתרביות מונו או קו-קו מסוימות בנקודות זמן מסוימות. לדוגמה, אצטוין ו-3-הידרוקסי-2-בוטאנון אצטט זוהו רק בתרביות S. aureus בנקודת הזמן של 48 שעות (איור 2).

1-פרופנול נדיף 2-מתיל זוהה רק בתרבית המשותפת P. aeruginosa ו-A. baumannii ב-48 שעות (איור 2). אתיל אצטט היה נוכח בתרביות המשותפות של A. baumannii עם S. aureus או P. aeruginosa ב-48 שעות (איור 2). המטבוליטים הפטאן, 2,3-דימתיל ופנטאן, 2-מתיל זוהו רק בתרבית A. baumannii ב-24 שעות (איור 2). לאצטלדהיד ולאתנול היה שפע יחסי גבוה יותר בתרבות המשותפת A. baumannii ו-S. aureus בנקודת הזמן של 24 שעות בהשוואה ל-48 שעות, ולכל אחד מהזנים בתרבית בלבד (איור 2). חלק מהתנודתיות היו נפוצות יותר בתרבויות בנקודת הזמן של 24 או 48 שעות. חומצות שומן קצרות שרשרת, כולל חומצה אצטית, חומצה בוטנואית וחומצה פרופנואית, היו בשפע יחסי גבוה בתרביות של 48 שעות, אך לא זוהו בתרביות של 24 שעות (איור 2). הקסאן היה נפוץ יותר בבקרת TH ב-24 שעות לעומת 48 שעות (איור 2).

תיוג איזוטופים יציב של דגימות צואה, ביוב ורוק
כדי לזהות ייצור פעיל של מולקולות נדיפות מדגימה ביולוגית, נוספו מקור תזונתי מסומן, 13C גלוקוז או D2O, ומדיה כדי לתמוך בצמיחת הקהילה המיקרוביאלית. דגימה ייחודית אחת נותחה מכל אחד מסוגי הדגימות השונים של דגימות צואה, ביוב ורוק במשולש. היה יותר שילוב של 13C במולקולות נדיפות עם תווית מלאה (איור 3A-D) בהשוואה לשילוב עם דאוטריום (איור 3E). ה-13C שולבו ב-2-בוטאנון, 3-הידרוקסי; 2,3-בוטנדיונה; חומצה אצטית; ופנול עבור כל דגימות הצואה, הביוב והרוק (איור 3A).

שאר הנדיפים המסומנים זוהו בשני סוגי דגימות או באחד מהם. לדוגמה, אצטון, חומצה בוטנואית וחומצה פרופנואית זוהו כמסומנים ברוק ובביוב (איור 3B). הנדיפים המסומנים, דימתיל טריסולפיד ודיסולפיד דימתיל, הועשרו הן בדגימות צואה והן בדגימות רוק (איור 3C). נדיפים, 1-פרופנול, 2-בוטנון, בנזופנון, אתנול ומתיל תיולאצטט, הועשרו רק בשפכים (איור 3D). התווית נדיפה, 2,3-פנטנדואין, הועשרה ברוק (איור 3D). דאוטריום שולב בנדיפים, חומצה אצטית; בנזלדהיד, 4-מתיל; דימתיל טריסולפיד; ופנול, מדגימות רוק או ביוב (איור 3E). בנוסף לנדיפים מועשרי האיזוטופים, זוהו נדיפים שלא הכילו איזוטופים יציבים משולבים. לדוגמה, תרכובות פיראזין, למעט פיראזין, 2,5-דימתיל, זוהו בדגימות צואה, ביוב ורוק, אך לא הועשרו במלואן ב-13C (איור משלים S1).

תיוג איזוטופים יציב של דגימות כיח
אסטרטגיית תיוג האיזוטופים היציבה יושמה לזיהוי נדיפים המיוצרים באופן פעיל עם דגימות כיח משבעה נבדקים אנושיים עם סיסטיק פיברוזיס. הנדיפים בדגימה הושוו לאלה שצמחו מדגימות בתרבית עם תווית איזוטופ יציבה. כל מרכיב נדיף של כל דגימה נותח פעמיים: לפני ואחרי בדיקת איזוטופים יציבה עם גלוקוז ומדיה של 13C. הדגימות שנאספו מהנבדקים השתרעו על פני שלוש נקודות זמן או מצבים קליניים שונים: בסיס, החמרה וטיפול23. הנדיפים שזוהו כפי שהם מסומנים בדגימות כיח מתורבתות היו בעלי שפע יחסי שונה בהשוואה לנדיפים ללא תווית מדגימות כיח לא מתורבתות. תנאי התרבות בניסויי בדיקת האיזוטופים היציבים עם כיח עשויים להעדיף צמיחה של מיקרובים מסוימים, מה שיוביל להבדלים בשפע יחסי של נדיפים בהשוואה לדגימות כיח לא תרבותיות.

לדוגמה, חומצה אצטית, דימתיל טריסולפיד, אצטון ופרופנל, 2-מתיל היו נפוצים יותר בדגימות כיח מתורבתות בהשוואה לדגימות כיח לא תרבותיות (איור 4). גילוי 13אתנול עם תווית C, שיכול להיות נוכח בכמויות משתנות באוויר בחדר הרקע, מספק עדות לכך שהאתנול יוצר באופן פעיל על ידי חילוף חומרים מיקרוביאלי מגלוקוז של 13C. כמות השונות הוסברה על ידי הנבדק כפי שהוערך על ידי ניתוח רב משתני פרמוטציוני של שונות (PERMANOVA) והייתה שונה גם עבור שני מערכי הנתונים הנדיפים השונים (טבלה 1 ואיור משלים S2). עבור 13כיח מתורבת עם תווית C, 51% מהווריאציה הוסברה על ידי הנבדק, בעוד ש-33% מהווריאציה הוסברה על ידי הנבדק מהנדיפים בדגימות כיח לא תרבותיות (טבלה 1). הרכב קהילת המיקרוביום כפי שנקבע על ידי ריצוף 16S rRNA amplicon משבעת הנבדקים היה ייחודי לכל נבדק (איור משלים S3), והחתימות האינדיבידואליות השתקפו גם במולקולות הנדיפות של כיח מתורבתות ולא מתורבתות שזוהו.

בכחיח מתורבת התגלו 23 נדיפים שסומנו במלואם ב-13פחמן. הנדיפים מועשרי האיזוטופים (הפעילים) שזוהו מדגימות כיח היו שונים עבור כל נבדק. הנדיפים עם העשרת האיזוטופים שזוהו בדגימות כיח מכל שבעת הנבדקים היו 2,3-butanedione; חומצה אצטית; אצטון; דימתיל טריסולפיד; דיסולפיד, דימתיל; ופיראזין, 2,5-דימתיל (איור 5). למרות שנדיפים אלה זוהו בכל הנבדקים, העשרת האיזוטופים עבור כל נבדק הייתה שונה. דגימות מנבדק 7 היו בעלות העשרה איזוטופית גבוהה יותר של דיסולפיד דימתיל בהשוואה לששת הנבדקים האחרים (איור 5B). אצטון היה גבוה יותר בנבדקים 4 ו-6 (איור 5). חלק מהנדיפים הועשרו ב-13מעלות צלזיוס רק בנבדקים מסוימים. לדוגמה, 1-בוטאנול, 3-מתיל וחומצה פרופנואית, 2-מתיל הועשרו רק בתת-קבוצה של דגימות מנבדק 2 (איור 5). בנוסף לנדיפים מועשרים באיזוטופים, היו גם נדיפים שזוהו כלא מתויגים מאותו כיח מתורבת (איור משלים S4). נדיפים 2-פיפרידינון; בנזלדהיד, 4-מתיל; בנזותיאזול; חומצה בוטנואית, 3-מתיל; הקסנל; הקסאן; אלכוהול איזופרופיל; פנול; חומצה פרופנואית, 2-מתיל; ופירולו 1,2-אפראזין-1,4-דיון, הקסהידרו זוהו בדגימות כיח, אך לא היו מועשרים באיזוטופים (איור משלים S4).

Figure 1
איור 1: פרוטוקול סכמטי. דגימה ביולוגית מונחת לתוך בקבוקון זכוכית ומורכבת עם תוחם המכסה ועט הסורבנט של Headspace. ואקום מופעל על הבקבוקון עד שמגיעים ללחץ של כ-30 מ"מ כספית. מקור הוואקום מוסר, והבקבוקונים ממוקמים ביחידת מיצוי הדירים הסורבנטית, שם מתבצעת מיצוי סטטי בעזרת חום, תסיסה וזמן. לאחר החילוץ, בקבוקונים ממוקמים על בלוק מתכת קר כדי להסיר מים ממרחב הראש ו- HSP. ה-HSPs נאספים ומופעלים באמצעות ספיגה תרמית ב-GC-MS. הנתונים מנותחים באמצעות ChemStation, DExSI ו- R. קיצורים: HSP = עט סורבנט מרחב ראש; GC-MS = כרומטוגרפיית גז-ספקטרומטריית מסה. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

Figure 2
איור 2: מפת חום של תרבויות חד-הוריות וקו-תרבויות. תרכובות אורגניות נדיפות זוהו מתרבויות חד-פעמיות ומשותפות בנקודות זמן של 24 ו-48 שעות. התרבויות המשותפות הן צירופי האותיות המייצגים כל זן. כל הדגימות הוצאו במשך שעה אחת ב-70 מעלות צלזיוס עם תסיסה של 200 סל"ד. ערכי עוצמת מפת חום הם ציוני עמודה Z, המנורמלים על-ידי מטבוליט. ציון Z חושב על ידי הפרש הערך מממוצע הערכים, חלקי סטיית התקן של הערכים. הדנדרוגרמה נוצרה עם אפשרות cluster_cols בפונקציית הפסיון של R. הדנדרוגרמה מייצגת אשכולות היררכיים שבהם מטבוליטים שמתקבצים יחדיו הם בעלי ציוני Z דומים יותר בין דגימות. קיצורים: A = A. baumanii; P = P. aeruginosa; S = S. aureus; TH = טוד יואיט מדיה (שליטה). אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

Figure 3
איור 3: אחוז המרה של 13C למסת מולקולות נדיפות בדגימות צואה, רוק וביוב במהלך 18 שעות של דגירה ושאיבה בו-זמנית. המרת % חושבה עבור תרכובות המסומנות במלואן על ידי לקיחת המסה של התרכובת המסומנת במלואה (M+N) וחלוקתה ב- (M+N) + המסה של המסה הנדיפה ללא תווית (M), כאשר N הוא המספר המרבי של פחמנים אפשריים (ב - A-D) או מימן (ב- E) שניתן לסמן בכל מולקולה נדיפה. תרכובות נחשבות לסימון מלא כאשר כל הפחמנים של הנדיפים מוחלפים ב-13מעלות צלזיוס. כאשר הנתונים חסרים, התנודתיות לא זוהתה. לדוגמה, ב-(D), 1-פרופנול לא זוהה בדגימות צואה או רוק. מספר השכפולים לכל מדגם = 3. (A) 13הנדיפים המסומנים ב-C זוהו בכל סוגי הדגימות (צואה, רוק וביוב). (B) 13הנדיפים המסומנים ב-C זוהו רק בדגימות רוק וביוב. (C) 13הנדיפים המסומנים ב-C שזוהו בצואה ובדגימות רוק. (D) 13הנדיפים המסומנים ב-C זוהו באחד משלושת סוגי הדגימות השונים. (E) המולקולות הנדיפות המסומנות על ידי דאוטריום. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

Figure 4
איור 4: מפת חום של 13נדיפים בעלי תווית C מתוך כיח מתורבת ומולקולות נדיפות שזוהו מכיח לא מתורבת. הנדיפים המסומנים מגיעים מניסויי בדיקת האיזוטופים היציבים שבהם 13C גלוקוז ומדיום עירוי לב במוח נוספו לכיח במהלך שלב המיצוי כדי לטפח צמיחה מיקרוביאלית וללכוד ייצור נדיף פעיל. המולקולות הנדיפות ללא תווית זוהו ישירות מדגימות כיח. עוצמות מפת החום הן ציוני Z כמתואר בכיתוב של איור 2. עם זאת, ציוני ה-Z חושבו בתוך כל ניסוי עבור ניסויי כיח מתורבתים ולא תרבותיים. הדנדרוגרמה נוצרה כמתואר באיור 2. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

Figure 5
איור 5: אחוז המרה של 13C למסת מולקולה נדיפה בדגימות כיח משבעה נבדקים עם סיסטיק פיברוזיס במהלך 18 שעות של דגירה ומיצוי בו-זמניים. ההמרה % חושבה כמתואר בכיתוב של איור 3. תנודות שלא זוהו בדגימות מסומנות על ידי היעדר נתונים. N = 1-3. (A) 13הנדיפים המסומנים ב-C זוהו בהמרה באחוזים גבוהים יותר ברוב דגימות הכיח. (B) 13הנדיפים המסומנים ב-C זוהו בהמרה באחוזים נמוכים יותר ברוב דגימות הכיח. (C) 13הנדיפים המסומנים ב-C זוהו בהמרה באחוזים נמוכים יותר במיעוט מדגימות הכיח. קיצורים: B = קו בסיס; E = החמרה; T = טיפול. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

דרגות חופש ₪2 ערך P
כיח לא תרבותי נושא 6 0.33 0.001
מצב קליני 2 0.01 0.46
נושא: מצב קליני 12 0.12 0.092
כיח תרבית עם 13C גלוקוז ומדיה נושא 6 0.51 0.001
מצב קליני 2 0.02 0.095
נושא: מצב קליני 12 0.11 0.194

טבלה 1: ניתוח רב-משתני מעוות של שונות (PERMANOVA) של דגימות כיח. ה-PERMANOVA נוצרה באמצעות פונקציית אדוניס מהאריזה הטבעונית ב-R.

איור משלים S1: השפע היחסי של נדיפים מסומנים (M+N(max)) וללא תווית (M+0) על פני דגימות צואה, רוק וביוב. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.

איור משלים S2: קנה מידה רב-ממדי לא מטרי של כיח מתורבת עם בדיקה איזוטופית יציבה וכיח לא תרבותי. (A) NMDS של כיח מתורבת עם 13C גלוקוז ומדיה נוצר עם k = 3 ממדים. ערך הלחץ היה 0.07. (B) NMDS של כיח לא תרבותי נוצר עם k = 3 ממדים. ערך הלחץ היה 0.13. קיצורים: NMDS = קנה מידה רב-ממדי לא מטרי; B = קו בסיס; E = החמרה; T = טיפול. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.

איור משלים S3: הרכב קהילתי מיקרוביאלי של דגימות כיח מנבדקים עם סיסטיק פיברוזיס. הוערך על ידי ריצוף 16S rRNA amplicon כחלק ממחקר גדול יותר, מידע נוסף על הגישה שנמצאה ב- Carmody et al. 202019. מנבדקים עם סיסטיק פיברוזיס. כל סרגל מוערם הוא נקודת זמן שונה. קיצורים: B = קו בסיס, E = החמרה, T = טיפול. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.

איור S4 משלים: השפע היחסי של נדיפים מסומנים (M+N(מקסימום)) וללא תווית (M+0) על פני דגימות כיח משבעה נבדקים עם סיסטיק פיברוזיס. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

כדי לזהות ייצור נדיף בתרביות חוץ גופיות ובדגימות הקשורות לבני אדם, בוצע ניתוח נדיף של תרבויות מונו וקו-קו של P. aeruginosa, S. aureus ו- A. baumanii ובדיקת איזוטופים יציבה של דגימות ביולוגיות שונות. בניתוח עבור התרביות המונו-ותרביות המשותף, נדיפים זוהו על ידי ביצוע מיצוי קצר במשך שעה אחת ב-70 מעלות צלזיוס. הניתוח ההפכפך של תרבויות מונו ותרבויות משותפות איפשר את הסקר של התרכובות המיוצרות הן על ידי מינים בודדים והן במהלך האינטראקציות שלהם עם מינים אחרים. היו הבדלים בשפע היחסי בין סוגי התרבויות השונים ונקודות הזמן השונות. בניסויי בדיקת האיזוטופים היציבים, הדגימות הביולוגיות כללו צואה ורוק מנבדקים בריאים, שפכים וכיח מנבדקים עם סיסטיק פיברוזיס. פרופיל איזוטופים יציב איפשר זיהוי של מולקולות נדיפות המיוצרות באופן פעיל על ידי חילוץ במשך 18 שעות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס. זמן המיצוי הארוך עם טמפרטורה נמוכה יותר איפשר צמיחה וחילוף חומרים של מיקרובים הנמצאים בדגימות הביולוגיות. השוואה בין העשרות 13C גלוקוז ו-D2O הראתה כי הייתה העשרה איזוטופית נרחבת יותר עם התווית 13C.

בעת חילוץ סוגי דגימות שונים, היו צעדי אופטימיזציה ראשוניים שננקטו לפני תחילת ריצה מלאה. ראשית, בדוק נפחים שונים של דגימה כהפעלת ניסוי. עבור סוגים מסוימים של דגימות, כיח, למשל, רק נפחי מדגם קטנים היו זמינים. מומלץ להתחיל תחילה עם נפח נמוך יותר או כמות קטנה יותר של דגימה, בהתאם לסוג המדגם וכמויות הדגימה הזמינות. אל תחלץ נפח גדול או יותר מדי מהדגימה מכיוון שהיא עלולה להציף את העמודה ולזהם את ה- HSP. עומס יתר בעמודות יכול להיות ניכר כאשר פסגות בכרומטוגרמה רוויות או מופיעות בריצות הבאות. זיהום HSP התרחש אם הנשיאה קיימת כאשר HSP מופעל מחדש ב- GC-MS. בניסויי התרבית המונו-ותרבית המשותפת, 200 μL של תרבית הספיקו כדי לזהות מגוון של נדיפים. בניסויי בדיקת האיזוטופים היציבים, בהתאם לסוג הדגימה, הנפח של כל ניסוי נע בין 500 μL ל-1 מ"ל. שנית, בהתאם לסוג המדגם ולתרכובות המעניינות, יהיה צורך להתאים את זמן החילוץ והטמפרטורה, כמו גם את שיטות ה- GC-MS וההשמדה התרמית כדי לייעל את הגילוי הנדיף. שיטות אלה נקבעו כמתאימות לאנליטים של עניין וסוג עמודה.

לאחר אופטימיזציה של השיטה, השלבים הקריטיים בפרוטוקול התייחסו לשלבים שלפני החילוץ ובעקבותיו. במהלך הכנת הדגימה, הדגימות הונחו על קרח, כך שהנדיפים שנכחו בדגימה לא נמלטו. כמו כן, היה חשוב לוודא כי אטם הוואקום הדוק, והמכסה סגור היטב. אחרת, תהיה מיצוי לא יעיל וזיהוי מופחת של הנדיפים מהמדגם. דליפות יכולות לנבוע מטבעות ה-O סביב אניית המכסה או ה-HSP. כדי להבטיח שהבקבוקון נמצא תחת ואקום, נעשה שימוש במד לפני החילוץ כדי לוודא שטבעות ה-O עדיין מתפקדות. בנוסף, לאחר השאיבה, הדגימות הונחו על גוש הקרח כך שהמים נמשכו מחוץ למרחב הראש לתקופה מוגדרת. מים בעמודה עלולים להוביל לשינויים בזמני השמירה ולדיכוי תגובת הטרשת הנפוצה, ובכך להוביל לתוצאות לא כמותיות. היכולת למשוך כל עודפי מים מתוך ה-HSPs לפני ההסרה ממכלול שרוול הוואקום/בקבוקון אפשרית בגלל אופי המערכת הסגורה של תהליך ה-VASE, והיכולת לשאוב מים בחזרה לנקודה הקרה ביותר במערכת החילוץ באמצעות הצלחת הקרה של -80 מעלות צלזיוס.

ישנן מגבלות ויתרונות לשיטות אלה ביחס לשיטות חלופיות. בהערכת הניסויים של מונו-תרבית וקו-תרבית, זוהו חתימות נדיפות שהיו ספציפיות למיקרוב מסוים או לתרבית משותפת מסוימת. היו גם שינויים בשפע ההפכפך לאורך זמן. באשר לניסויים היציבים בבדיקת איזוטופים בסוגים השונים של דגימות ביולוגיות, תיוג דאוטריום לא הביא למספר רב של נדיפים מועשרים באיזוטופים כמו גלוקוז 13C. חילוף החומרים הנדרש לייצור נדיפים מועשרים באיזוטופים עם דאוטריום עשוי להיות מוגבל יותר. בנוסף, נוספה מדיה לדגימות הביולוגיות כדי לשפר את הצמיחה המיקרוביאלית, מה שעלול להוביל לשינויים בהרכב הקהילה המיקרוביאלית. תנאי תרבית של ניסויים יציבים בבדיקת איזוטופים עשויים להיות בחירה לצמיחה מועדפת של מיקרובים מסוימים בדגימה ביולוגית. זה היה בניגוד למיצוי הקצר למשך שעה אחת בטמפרטורה של 70 מעלות צלזיוס שנועד לזהות את הנדיפים בדגימת הקהילה לפני שאחד או מעטים מהמיקרובים מתחילים להשתלט על הקהילה. המורכבות של ההרכבים המיקרוביאליים והכימיים של סוגי דגימות הצואה, הביוב, הרוק והכיח מקשה על הקצאת חתימות כימיות ספציפיות לכל מקור מיקרוביאלי או אנושי נתון ללא ניתוחים נוספים כגון ריצוף. שיטה זו סיפקה מיצוי ואקום בתפוקה גבוהה, ללא ממסים, שהוביל לזיהוי רגיש יותר של דגימות בנפח נמוך. הנפחים ששימשו לניסויים אלה נעו בין 200 μL ל-1 מ"ל של דגימות ביולוגיות מתורבתות. במקרים אחרים (נתונים שלא הוצגו), הוצאו דגימות ביולוגיות (למשל, דגימות כיח וצואה) עד כדי 15 מיקרול או 10 מיקרוגרם.

עבור יישומים עתידיים של השיטה, ניתן לנתח מגוון רחב של סוגי דגימות עם נפחים קטנים או מוגבלים. ניתן היה לחלץ עשרות דגימות בו זמנית, וזמן הריצה יהיה תלוי בפרמטרים של מכשיר GC-MS הספציפי. במקרה של בדיקת איזוטופים יציבה, בשילוב עם ריצוף מטא-גנומי, קיימת אפשרות לזהות את המיקרובים האחראים לייצור המולקולות הנדיפות. ניתן היה לרצף את המטא-גנום של הדגימה הביולוגית לפני ואחרי החילוץ עם בדיקת איזוטופים יציבה כדי לזהות שינויים בהרכב הקהילה המיקרוביאלית. ריצוף מטגנומי יאפשר זיהוי של גנים האחראים לייצור המולקולות הנדיפות המועשרות באיזוטופים. מודגשות כאן כמה דוגמאות של סוגי המדגם והגישות שיכולים לשמש כקלט עבור הפרוטוקול המוצג, שכבר הוקם בתעשיות שונות. מאחר שמולקולות נדיפות הן אינדיקטורים אבחוניים חשובים, ניתן להרחיב את השימוש בפרוטוקול זה למעבדות ביולוגיות ולמסגרות בריאות קליניות.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

V. L. V ו- S. J.B. D. היו עובדים לשעבר של Entech Instruments Inc., ו- K. W. הוא חבר בתוכנית האוניברסיטאית של Entech. ל- J. P., J. K., ו- C. I. R. אין ניגודי עניינים להצהיר עליהם.

Acknowledgments

אנו מודים להת'ר מוהן ולינדה מ. קאליקין על העריכה הקפדנית של כתב יד זה. עבודה זו נתמכה על ידי NIH NHLBI (מענק 5R01HL136647-04).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
13C glucose Sigma-Aldrich 389374-1G
2-Stg Diaph Pump Entech Instruments 01-10-20030
20 mL VOA vials Fisher Scientific 5719110
24 mm Black Caps with hole, no septum Entech Instruments 01-39-76044B holds lid liner in place on vial
24 mm vial liner for sorbent pens Entech Instruments SP-L024S allows pens to make a vacuum seal at top of vial
5600 Sorbent pen extraction unit (SPEU) Entech Instruments 5600-SPES 5600 Sorbent Pen Extraction Unit -120 VAC
96-well assay plates Genesee 25-224
Brain Heart Infusion (BHI) media Sigma-Aldrich 53286-500G
ChemStation Stofware Agilent
DB-624 column Agilent 122-1364E 60 m, 0.25 mm ID, 1.40 micron film thickness, in GC-MS
Deuterium oxide Sigma-Aldrich 151882-1L
Dexsi sofware Dexsi (open source)
GC-MS (7890A GC and 5975C inert XL MSD with Triple-Axis Detector) Agilent 7890A GC and 5975C inert XL MSD with triple-axis detector
Headspace Bundle HS-B01, 120VA Entech Instruments SP-HS-B01 Items for running headspace extraction included in bundle
Headspace sorbent pen (HSP) - blank Entech Instruments SP-HS-0
Headspace sorbent pen (HSP) Tenax TA (35/60 Mesh) Entech Instruments SP-HS-T3560
Microcentrifuge tubes (2 mL) VWR 53550-792
O-rings Entech Instruments SP-OR-L024
Sample Preparation Rail Entech Instruments
Sorbent pen thermal conditioner Entech Instruments 3801-SPTC
Todd Hewitt (TH) media Sigma T1438-500G

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Van Berkel, J. J. B. N., et al. A profile of volatile organic compounds in breath discriminates COPD patients from controls. Respiratory Medicine. 104 (4), 557-563 (2010).
  2. Nakhleh, M. K., et al. Detecting active pulmonary tuberculosis with a breath test using nanomaterial-based sensors. European Respiratory Journal. 43 (5), 1522-1525 (2014).
  3. Lim, S. H., et al. Rapid diagnosis of tuberculosis from analysis of urine volatile organic compounds. ACS Sensors. 1 (7), 852-856 (2016).
  4. Schnabel, R., et al. Analysis of volatile organic compounds in exhaled breath to diagnose ventilator-associated pneumonia. Scientific Reports. 5, 17179 (2015).
  5. Paff, T., et al. Exhaled molecular profiles in the assessment of cystic fibrosis and primary ciliary dyskinesia. Journal of Cystic Fibrosis. 12 (5), 454-460 (2013).
  6. Robroeks, C. M. H. H. T., et al. Metabolomics of volatile organic compounds in cystic fibrosis patients and controls. Pediatric Research. 68 (1), 75-80 (2010).
  7. Neerincx, A. H., et al. Hydrogen cyanide emission in the lung by Staphylococcus aureus. European Respiratory Journal. 48 (2), 577-579 (2016).
  8. Goeminne, P. C., et al. Detection of Pseudomonas aeruginosa in sputum headspace through volatile organic compound analysis. Respiratory Research. 13, 87 (2012).
  9. Joensen, O., et al. Exhaled breath analysis using Electronic Nose in cystic fibrosis and primary ciliary dyskinesia patients with chronic pulmonary infections. PLOS ONE. 9 (12), 115584 (2014).
  10. Nasir, M., et al. Volatile molecules from bronchoalveolar lavage fluid can 'rule-in' Pseudomonas aeruginosa and 'rule-out' Staphylococcus aureus infections in cystic fibrosis patients. Scientific Reports. 8 (1), 826 (2018).
  11. Tyc, O., Zweers, H., de Boer, W., Garbeva, P. Volatiles in inter-specific bacterial interactions. Frontiers in Microbiology. 6, 1412 (2015).
  12. Gao, B., et al. Tracking polymicrobial metabolism in cystic fibrosis airways: Pseudomonas aeruginosa metabolism and physiology are influenced by Rothia mucilaginosa-derived metabolites. mSphere. 3 (2), 00151 (2018).
  13. Schoenheimer, R., Rittenberg, D. Deuterium as an indicator in the study of intermediary metabolism. Science. 82 (2120), 156-157 (1935).
  14. Neubauer, C., et al. Refining the application of microbial lipids as tracers of Staphylococcus aureus growth rates in cystic fibrosis sputum. Journal of Bacteriology. 200 (24), 00365 (2018).
  15. Cordell, R. L., Pandya, H., Hubbard, M., Turner, M. A., Monks, P. S. GC-MS analysis of ethanol and other volatile compounds in micro-volume blood samples-quantifying neonatal exposure. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 405 (12), 4139-4147 (2013).
  16. Mayor, A. S. R. Optimisation of sample preparation for direct SPME-GC-MS analysis of murine and human faecal volatile organic compounds for metabolomic studies. Journal of Analytical & Bioanalytical Techniques. 5 (2), 184 (2014).
  17. Camarasu, C. C. Headspace SPME method development for the analysis of volatile polar residual solvents by GC-MS. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis. 23 (1), 197-210 (2000).
  18. Charry-Parra, G., DeJesus-Echevarria, M., Perez, F. J. Beer volatile analysis: optimization of HS/SPME coupled to GC/MS/FID. Journal of Food Science. 76 (2), 205-211 (2011).
  19. Bicchi, C., Cordero, C., Liberto, E., Rubiolo, P., Sgorbini, B. Automated headspace solid-phase dynamic extraction to analyse the volatile fraction of food matrices. Journal of Chromatography A. 1024 (1), 217-226 (2004).
  20. Trujillo-Rodríguez, M. J., Anderson, J. L., Dunham, S. J. B., Noad, V. L., Cardin, D. B. Vacuum-assisted sorbent extraction: An analytical methodology for the determination of ultraviolet filters in environmental samples. Talanta. 208, 120390 (2020).
  21. Mollamohammada, S., Hassan, A. A., Dahab, M. Immobilized algae-based treatment of herbicide-contaminated groundwater. Water Environment Research. 93 (2), 263-273 (2021).
  22. Psillakis, E. The effect of vacuum: an emerging experimental parameter to consider during headspace microextraction sampling. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 412 (24), 5989-5997 (2020).
  23. Carmody, L. A., et al. The daily dynamics of cystic fibrosis airway microbiota during clinical stability and at exacerbation. Microbiome. 3, 12 (2015).
  24. Carmody, L. A., et al. Fluctuations in airway bacterial communities associated with clinical states and disease stages in cystic fibrosis. PLOS ONE. 13 (3), 0194060 (2018).
  25. Mahboubi, M. A., et al. Culture-based and culture-independent bacteriologic analysis of cystic fibrosis respiratory specimens. Journal of Clinical Microbiology. 54 (3), 613-619 (2016).

Tags

ביוכימיה גיליון 184 תרכובות אורגניות נדיפות GC-MS מיצוי סורבנט בסיוע ואקום מיצוי מרחב ראש דגימות קליניות בדיקת איזוטופים יציבה
לכידת תרכובות אורגניות נדיפות מיקרוביאליות המיוצרות באופן פעיל מדגימות הקשורות לבני אדם עם מיצוי סורבנט בסיוע ואקום
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Phan, J., Kapcia III, J., Rodriguez, … More

Phan, J., Kapcia III, J., Rodriguez, C. I., Vogel, V. L., Cardin, D. B., Dunham, S. J. B., Whiteson, K. Capturing Actively Produced Microbial Volatile Organic Compounds from Human-Associated Samples with Vacuum-Assisted Sorbent Extraction. J. Vis. Exp. (184), e62547, doi:10.3791/62547 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter