Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

Улавливание активно производимых микробных летучих органических соединений из образцов, связанных с человеком, с помощью вакуумной экстракции сорбента

Published: June 1, 2022 doi: 10.3791/62547
Automatic Translation
1, 1, 2, 3, 3, 3, 1
1Department of Molecular Biology and Biochemistry, University of California Irvine, 2Department of Ecology and Evolutionary Biology, University of California Irvine, 3Entech Instruments Inc.

Summary

Этот протокол описывает извлечение летучих органических соединений из биологического образца методом вакуумной экстракции сорбента, газовую хроматографию в сочетании с масс-спектрометрией с использованием Entech Sample Preparation Rail и анализ данных. Он также описывает культуру биологических образцов и зондирование стабильных изотопов.

Abstract

Летучие органические соединения (ЛОС) из биологических образцов имеют неизвестное происхождение. ЛОС могут происходить от хозяина или различных организмов из микробного сообщества хозяина. Чтобы распутать происхождение микробных ЛОС, был проведен анализ летучих головных пространств бактериальных моно- и кокультур золотистого стафилококка, Pseudomonas aeruginosa и Acinetobacter baumannii, а также исследование стабильных изотопов в биологических образцах кала, слюны, сточных вод и мокроты. Моно- и кокультуры использовались для идентификации летучего производства из отдельных видов бактерий или в сочетании со стабильным изотопным зондированием для идентификации активного метаболизма микробов из биологических образцов.

Для извлечения ЛОС использовалась вакуумная экстракция сорбента (VASE). VASE - это простой в использовании, коммерциализированный, не содержащий растворителей метод экстракции из пространства над головой для полулетучих и летучих соединений. Отсутствие растворителей и почти вакуумные условия, используемые во время экстракции, делают разработку метода относительно легкой и быстрой по сравнению с другими вариантами экстракции, такими как трет-бутилирование и твердофазная микроэкстракция. Описанный здесь рабочий процесс использовался для идентификации конкретных изменчивых сигнатур из моно- и сокультур. Кроме того, анализ зондирования стабильных изотопов связанных с человеком биологических образцов выявил ЛОС, которые либо обычно, либо уникально производились. В данной статье представлен общий рабочий процесс и экспериментальные соображения VASE в сочетании со стабильным изотопным зондированием живых микробных культур.

Introduction

Летучие органические соединения (ЛОС) имеют большие перспективы для обнаружения и идентификации бактерий, поскольку они выделяются всеми организмами, а различные микробы имеют уникальные сигнатуры ЛОС. Летучие молекулы использовались в качестве неинвазивного измерения для выявления различных респираторных инфекций, включая хроническую обструктивную болезнь легких1, туберкулез2 в моче3 и пневмонию, связанную с ИВЛ4, в дополнение к различению субъектов с муковисцидозом (МВ) от здоровых контрольных субъектов 5,6. Летучие сигнатуры даже использовались для различения специфических патогенных инфекций при муковисцидозе (Staphylococcus aureus7, Pseudomonas aeruginosa 8,9 и S. aureus vs. P. aeruginosa10). Однако из-за сложности таких биологических образцов часто бывает трудно точно определить источник конкретных ЛОС.

Одной из стратегий отделения летучих профилей от множественных инфекционных микробов является проведение анализа пространства над головой микроорганизмов как в моно-, так и в кокультуре11. Анализ пространства над головой исследует аналиты, испускаемые в «пространство головы» над образцом, а не те, которые встроены в сам образец. Микробные метаболиты часто характеризуются в монокультурах из-за сложности определения происхождения микробных метаболитов в сложных клинических образцах. Профилируя летучие вещества из бактериальных монокультур, типы летучих веществ, которые микроб производит in vitro , могут представлять собой базовую линию его летучего репертуара. Объединение бактериальных культур, например, создание кокультур и профилирование образующихся летучих молекул может выявить взаимодействия или перекрестное питание между бактериями12.

Другая стратегия идентификации микробного происхождения летучих молекул заключается в обеспечении источника питательных веществ, который помечен стабильным изотопом. Стабильные изотопы являются естественными, нерадиоактивными формами атомов с различным количеством нейтронов. В стратегии, которая использовалась с начала 1930-х годов для отслеживания активного метаболизма у животных13, микроорганизм питается от меченого источника питательных веществ и включает стабильный изотоп в свои метаболические пути. Совсем недавно стабильный изотоп в виде тяжелой воды (D2O) был использован для идентификации метаболически активного S. aureus в клиническом образце мокротыCF 14. В другом примере 13С-меченая глюкоза была использована для демонстрации перекрестного питания метаболитов между клиническими изолятами МВ P. aeruginosa и Rothia mucilaginosa12 .

С развитием методов масс-спектрометрии методы обнаружения летучих сигналов перешли от качественных наблюдений к более количественным измерениям. Используя масс-спектрометрию газовой хроматографии (GC-MS), обработка биологических образцов стала доступной для большинства лабораторных или клинических условий. Многие методы исследования летучих молекул использовались для профилирования образцов, таких как пищевые продукты, бактериальные культуры и другие биологические образцы, а также воздуха и воды для обнаружения загрязнения. Однако некоторые распространенные методы летучего отбора проб с высокой пропускной способностью требуют растворителя и не выполняются с преимуществами, предоставляемыми вакуумной экстракцией. Кроме того, для анализа 15,16,17,18,19 часто требуются большие объемы или количества (более 0,5 мл) отобранных материалов, хотя это специфично для субстрата и требует оптимизации для каждого типа образца и метода.

Здесь вакуумная экстракция сорбента (VASE) с последующей термической десорбцией на GC-MS использовалась для обследования летучих профилей бактериальных моно- и кокультур и выявления активно продуцируемых летучих веществ со стабильным изотопным зондированием из образцов фекалий человека, слюны, сточных вод и мокроты (рисунок 1). При ограниченных количествах образцов ЛОС извлекали всего из 15 мкл мокроты. Эксперименты по изотопному зондированию с образцами человека требовали добавления стабильного изотопного источника, такого как глюкоза 13° C, и среды для культивирования роста микробного сообщества. Активное производство летучих веществ было идентифицировано как более тяжелая молекула GC-MS. Экстракция летучих молекул в статическом вакууме позволила обнаружить летучие молекулы с повышенной чувствительностью 20,21,22.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Соображения по анализу сорбента Headspace Sorbent Pen (HSP) и анализа образцов

ПРИМЕЧАНИЕ: HSP, содержащий сорбент Tenax TA, был выбран для улавливания широкого спектра летучих веществ. Tenax имеет более низкое сродство к воде по сравнению с другими сорбентами, что позволяет ему улавливать больше ЛОС из образцов с более высокой влажностью. Tenax также имеет низкий уровень примесей и может быть кондиционирован для повторного использования. Выбор сорбента также производился с учетом колонны, установленной в ГК-МС (см. Таблицу материалов).

  1. Создание отрицательных элементов управления путем извлечения заготовок из среды и/или образцов с теми же условиями, которые используются для извлечения образца.
  2. Проанализируйте пустой HSP (ранее подтвержденный как чистый и свободный от значительного фона) на GC-MS перед анализом извлеченных образцов. Запустите заготовки между типами образцов (например, три реплики бактерий монокультуры, заготовки, три реплики бактерий кокультуры, заготовки и т. Д.).
  3. Ограничьте использование ароматных предметов личной гигиены или потребление вонючих продуктов до извлечения и анализа проб. В идеале, подготовьте образцы в вытяжке биобезопасности, которая не была очищена спиртом или другими летучими чистящими средствами в течение не менее 30 минут. Включите воздушный поток в вытяжке биобезопасности за 30-60 мин до пробоподготовки.
  4. Храните образцы на льду, чтобы ограничить высвобождение летучих веществ во время подготовки образцов.

2. Моно- и кокультурная подготовка

  1. В капюшоне биобезопасности инокулируют культуры A. baumannii, S. aureus и P. aeruginosa в среде роста Тодда Хьюитта. Инкубировать в течение ночи при 37 °C с перемешиванием 200 об/мин.
  2. После ночной инкубации выполните обработку культуры в вытяжке биобезопасности. Разбавляют каждую культуру до оптической плотности 0,05 при 500 нм.
  3. Смешайте кокультуры в равных частях и пипетку 200 мкл контрольной среды, моно- или кокультуры в каждую лунку 96-луночной пластины и поместите в инкубатор при 37 °C в течение 24 ч. Подготовьте вторую пластину для 48-часовой инкубации.
  4. По окончании инкубационного периода подготовьте пробы для экстракции в секции 4. Пипетки для жидких культур помещают в микроцентрифужные трубки и хранят при -80 °C.
    ПРИМЕЧАНИЕ: На этом этапе образцы могут быть сохранены при -80 °C для последующего извлечения, если это необходимо.

3. Зондирование стабильных изотопов при подготовке биологических образцов

ПРИМЕЧАНИЕ: Образцы фекалий и слюны были пожертвованы анонимными донорами с одобрения Совета по институциональному обзору Калифорнийского университета в Ирвине (HS# 2017-3867). Сточные воды поступали из Сан-Диего, штат Калифорния. Образцы мокроты были собраны у субъектов с муковисцидозом в рамках более крупного исследования, одобренного Советом по институциональному обзору Медицинской школы Мичиганского университета (HUM00037056).

  1. Выполняйте все биологические пробоотборники в вытяжке биобезопасности.
    1. Для подготовки образцов фекалий добавляют 1 мл деионизированной воды к 100 мг кала в микроцентрифужной трубке объемом 1,5 мл и вихрь в течение 3 мин. Выложить на лед, когда он не используется.
      1. К 15 мкл фекальной и водной смеси добавляют 485 мкл среды brain Heart Infusion (BHI) с 20 мМ 13С глюкозы или BHI с 30% дейтерия (D2O). Убедитесь, что конечный объем образца составляет 500 мкл. Подготовьте образцы в технических трех экземплярах.
    2. Для подготовки образцов сточных вод добавляют 500 мкл сточных вод к 500 мкл BHI с 20 мМ 13С глюкозы или BHI с 30%D2O для общего объема 1 мл. Подготовьте образцы в трех экземплярах. Выложить на лед, когда он не используется.
    3. Для подготовки образцов слюны добавляют 50 мкл слюны к 500 мкл BHI с 20 мМ 13С глюкозы или BHI с 30%D2O для общего объема 550 мкл. Подготовьте образцы в трех экземплярах. Выложить на лед, когда он не используется.
    4. Чтобы подготовить образцы мокроты для сравнения летучих веществ, присутствующих в образце до и после культивирования, выполните первую экстракцию с 15 мкл мокроты. Подготовьте образцы в трех экземплярах. Выложить на лед, когда он не используется. Перейдите к разделу 4 для извлечения образца и извлеките в течение 18 ч при 37 °C с перемешиванием 200 об/мин.
    5. После завершения первого извлечения образцов некультурной мокроты сохраните флаконы с мокротой. Добавьте 500 мкл BHI с 20 мМ глюкозы 13С во флаконы с мокротой от 3,5,1. Выложить на лед, когда он не используется.
  2. Перейдите к разделу 4 для извлечения образца.

4. Извлечение проб

  1. Поместите пустые флаконы с летучим органическим анализом (VOA) (20 мл) на холодную пластину и поместите холодную пластину на лед в вытяжку биобезопасности.
  2. Включите блок экстракции сорбента 5600 (SPEU) и отрегулируйте желаемую температуру, необходимую для каждого метода.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Для экспериментов по зондированию стабильных изотопов при 37 °C достижение заданного значения может занять до 15 мин. Для моно- и кокультурных экспериментов при 70 °C достижение заданного значения может занять до 60 мин.
  3. Собирайте чистые HSP, равные количеству подготовленных образцов, включая HSP для носителей или элементов управления образцами.
  4. Маркировка флаконов «Голос Америки» объемом 20 мл в соответствии с образцами, репликами и идентификаторами HSP по мере необходимости. Используйте маркер, который сопротивляется воде в случае, если конденсация образуется на внешней стороне флакона во время пребывания на льду.
  5. Внутри вытяжки биобезопасности открутите белый колпачок на флаконе, быстро вставьте образец во флакон и соберите черную крышку, вкладыш крышки и HSP.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Образцы не должны вступать в контакт с HSP, и объем образца будет зависеть от типа образца.
  6. Поместите флакон, содержащий образец и HSP, обратно на холодную пластину.
  7. Повторите шаги 4.5 и 4.6 для каждого образца. Выполните эти шаги для каждого образца, а не для всех сразу, чтобы предотвратить нагревание образца и, таким образом, преждевременное высвобождение летучих веществ.
  8. После того, как все образцы были подготовлены в стеклянных флаконах, выполните следующие шаги за пределами вытяжки биобезопасности на скамейке. Включите вакуумный насос, поместите флаконы под вакуум до 30 мм рт.ст. и удалите источник вакуума.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Флаконы не обязательно должны находиться на холодном лотке после завершения вакуумного применения.
  9. Дважды проверьте давление после помещения всех образцов под вакуум с помощью манометра. Если во флаконе есть утечка, убедитесь, что колпачок плотно прикручен и что белые уплотнительные кольца HSP и вкладышей крышки правильно установлены.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Скомпрометированное уплотнение может привести к снижению обнаружения летучих веществ по сравнению с флаконом в вакууме.
  10. Поместите флаконы в SPEU для оптимизации времени и температуры с перемешиванием при 200 об/мин. Экстрагировать культуры в течение 1 ч при 70 °C. Эксперименты по исследованию стабильных изотопов экстрагируют с образцами фекалий, сточных вод, слюны и мокроты в течение 18 ч при 37 °C.
  11. Поместите холодную пластину при -80 °C для использования после завершения периода экстракции.
  12. После завершения экстракции поместите образцы на холодную пластину на 15 минут, чтобы вытянуть водяной пар из HSP и пространства над головой флакона.
  13. Перенесите HSP на рукава.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Эксперимент может быть приостановлен здесь на срок до ~ 1 недели при комнатной температуре, прежде чем потерять более высоколетучие соединения из HSP.

5. Анализ образцов на газовой хроматографии - масс-спектрометре (ГК-МС)

  1. Используйте следующие настройки GC-MS (см. Таблицу материалов): 35 °C с 5-минутным удержанием, 10 °C/мин рампа до 170 °C и рампа 15 °C/мин до 230 °C с соотношением разделения 20:1 и общим временем работы 38 мин.
  2. Установите метод десорбции следующим образом: 2 мин, 70 °C предварительный нагрев; 2 мин 260 °C десорбция; 34 мин, 260 °C выпекание; и 2 мин, 70 °C после выпечки.
  3. Настройте последовательность образцов и начните пробег в соответствии с контрольно-измерительными приборами.
    1. Чтобы настроить последовательность в программном обеспечении Entech, откройте программу. В опциях справа от раскрывающегося меню инструмента выберите 5800 | Последовательность.
    2. Обратите внимание на таблицу последовательностей в программном обеспечении Entech, аналогичную таблице в программном обеспечении GC-MS. Присвойте столбцу Идентификатор образца имя в соответствии с номером текущего date_vial. Имейте в виду, что Name аналогичен Name в таблице последовательностей GC-MS, а метод 5800 определяет скорость повышения температуры, время удержания и т. Д. (открывает меню для выбора метода, созданного на шаге 5.2).
    3. Имейте в виду, что столбцы «Лоток» и « Положение » определяют, куда пойдет направляющая подготовки образцов (SPR) для получения HSP.
      1. Обратите внимание на два лотка с 30 пятнами каждый слева, расположенными в виде шести колонн с пятью пятнами в каждом. Положение лотка, которое находится слева и ближе всего к пользователю (спереди), — это положение 1, в то время как самое правое, самое дальнее — это положение 30.
      2. Обратите внимание, что эти лотки являются HSP A или B, где HSP B — это лоток ближе к SPR (самый внутренний лоток), а непосредственно за HSP B — HSP Blank. Поместите извлеченные образцы в лотки и выберите соответствующее место в последовательности.
    4. Сохраните таблицу последовательностей, выберите Выполнить слева, затем Начните с пустого в десорбере , если пустой HSP находится в десорбере (обозначен HSP, помеченным желтой меткой).
  4. Обратите внимание, что HSP будут обрабатываться SPR для каждого образца в последовательности. Дайте SPR прогреться, затем в верхней части экрана появится сообщение, чтобы подтвердить, находится ли пустое место в десорбере. Нажмите «Пропустить», чтобы подтвердить, что ручка есть. Разрешите SPR автоматически запускать все образцы, а последовательность на стороне GC-MS автоматически запишет данные в отдельные файлы.

6. Анализ данных

  1. Данные фильтра качества в программном обеспечении GC-MS (Таблица материалов).
    1. Просмотрите каждый пик на хроматограмме и аннотируйте пики, которые соответствуют библиотеке Национального института стандартов и технологий (NIST) (или с другой доступной библиотекой).
    2. Добавьте аннотированные пики хроматограммы в метод обработки. Установите критерии для выбора пиков, чтобы включить соединения с вероятностью более 75%, и убедитесь, что выравнивание каждого идентифицирующего иона соединения лежит в центре пика.
      1. Чтобы добавить пик к методу обработки, выберите Калибровать | Редактирование составных | Имя | вставить состав под внешний стандартный состав. Добавьте название соединения, время удержания, Quant Signal Target Ion. Добавьте три самых больших пика. Чтобы сохранить, нажмите кнопку ОК | Метод | Сохранить.
    3. После настройки метода процесса перейдите к разделу Quantitate | Вычисление и просмотр | QEdit Квантовый результат.
    4. Осмотрите каждое соединение, чтобы убедиться, что пики соответствуют ожидаемому времени удержания и выше фонового шума.
    5. После завершения QEdit выберите Выход из | Да , чтобы сохранить QEdits и вернуться к основной хроматограмме. Экспортируйте интеграцию областей, открыв файл слева. Выберите количественный | Создание отчета.
    6. Чтобы экспортировать файлы для использования в DExSI, выберите файл | Экспорт данных в формат AIA | Создайте новый каталог и выберите расположение для файла или Использовать существующий каталог.
    7. Наблюдайте за открытием нового окна для выбора файлов для экспорта. Переместите файлы в правую часть окна и нажмите « Процесс». Подождите от нескольких секунд до нескольких минут в зависимости от количества конвертируемых файлов.
  2. Исправьте содержание изотопов в DExSI в соответствии с инструкциями для программного обеспечения DExSI (https://github.com/DExSI/DExSI) и выполните анализ с помощью любимого программного обеспечения или программы (например, R). Скрипты, используемые для генерации рисунков, расположены по адресу https://github.com/joannlp/ VOC_SIP.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Моно- и кокультуры S. aureus, P. aeruginosa и A. baumannii
Моно- и кокультуры состояли из бактериальных видов S. aureus, P. aeruginosa и A. baumannii. Это распространенные условно-патогенные микроорганизмы, обнаруженные в ранах человека и хронических инфекциях. Для идентификации летучих молекул, присутствующих в моно- и кокультурах, проводили короткую 1-ч экстракцию при 70 °C с перемешиванием 200 об/мин. Из моно- и кокультур в 24- и 48-часовых временных точках было обнаружено 43 аннотированные летучие молекулы (рисунок 2), среди которых были альдегиды, кетоны, спирты, серные соединения, углеводороды, карбоновые кислоты или сложные эфиры и ароматические вещества. Было небольшое количество летучих молекул, которые были обнаружены только в определенных моно- или со-культурах в определенные моменты времени. Например, ацетоин и 3-гидрокси-2-бутанона ацетат были обнаружены только в культурах S. aureus в 48-часовой временной точке (рисунок 2).

Летучий 1-пропанол 2-метил был обнаружен только в совместной культуре P. aeruginosa и A. baumannii через 48 ч (рисунок 2). Этилацетат присутствовал в совместных культурах A. baumannii с S. aureus или P. aeruginosa через 48 ч (рисунок 2). Метаболиты гептан, 2,3-диметил и пентан, 2-метил были обнаружены в культуре A. baumannii только через 24 ч (рисунок 2). Ацетальдегид и этанол имели более высокие относительные концентрации в совместной культуре A. baumannii и S. aureus в 24-часовой временной точке по сравнению с 48 ч и любым из штаммов только в культуре (рисунок 2). Некоторые из летучих веществ были более распространены в культурах в 24- или 48-часовой временной точке. Короткоцепочечные жирные кислоты, включая уксусную кислоту, бутановую кислоту и пропановую кислоту, имели высокое относительное содержание в культурах через 48 ч, но не были обнаружены в 24-часовых культурах (рисунок 2). Гексан был более распространенным в контроле TH через 24 ч по сравнению с 48 ч (рисунок 2).

Стабильная изотопная маркировка образцов фекалий, сточных вод и слюны
Чтобы идентифицировать активное производство летучих молекул из биологического образца, был добавлен меченый источник питательных веществ, глюкоза 13C илиD2O и среда для поддержки роста микробного сообщества. Один уникальный образец был проанализирован из каждого из различных типов образцов фекалий, сточных вод и слюны в трех экземплярах. Наблюдалось большее включение 13C в полностью меченые летучие молекулы (Рисунок 3A-D) по сравнению с включением с дейтерием (Рисунок 3E). 13C был включен в 2-бутанон, 3-гидрокси; 2,3-бутандион; уксусная кислота; и фенол для всех образцов фекалий, сточных вод и слюны (рисунок 3А).

Другие меченые летучие вещества были обнаружены либо в двух, либо в одном типе образцов. Например, ацетон, бутановая кислота и пропановая кислота были обнаружены как меченые в слюне и сточных водах (рисунок 3B). Меченые летучие вещества, диметилтрисульфид и дисульфид диметил, были обогащены как в образцах фекалий, так и в образцах слюны (рисунок 3C). Летучие вещества, 1-пропанол, 2-бутанон, бензофенон, этанол и метилтиолацетат, обогащались только в сточных водах (рисунок 3D). Меченый летучий, 2,3-пентанедоин, был обогащен слюной (рисунок 3D). Дейтерий был включен в состав летучих веществ, уксусной кислоты; бензальдегид, 4-метил; диметилтрисульфид; и фенол из образцов слюны или сточных вод (рисунок 3Е). В дополнение к обогащенным изотопами летучим веществам были обнаружены летучие вещества, которые не содержали инкорпорированных стабильных изотопов. Например, пиразиновые соединения, за исключением пиразина, 2,5-диметила, были обнаружены в образцах фекалий, сточных вод и слюны, но не были полностью обогащены 13С (дополнительный рисунок S1).

Стабильная изотопная маркировка образцов мокроты
Стратегия маркировки стабильных изотопов была реализована для выявления активно продуцируемых летучих веществ с образцами мокроты от семи человек с муковисцидозом. Летучие вещества в образце сравнивали с теми, которые появились из образцов, культивированных со стабильной изотопной меткой. Каждый летучий компонент каждого образца анализировали дважды: до и после зондирования стабильных изотопов с глюкозой 13С и средой. Образцы, собранные у испытуемых, охватывали три различные временные точки или клинические состояния: исходный уровень, обострение и лечение23. Летучие вещества, обнаруженные как помеченные в образцах культивируемой мокроты, имели различное относительное содержание по сравнению с немаркированными летучими веществами из образцов некультивированной мокроты. Условия культивирования в экспериментах по зондированию стабильных изотопов с мокротой могут способствовать росту определенных микробов, что приводит к различиям в относительном количестве летучих веществ по сравнению с образцами некультивированной мокроты.

Например, уксусная кислота, диметилтрисульфид, ацетон и пропанал, 2-метил были более распространены в образцах культивируемой мокроты по сравнению с образцами некультивированной мокроты (рисунок 4). Обнаружение 13С-меченого этанола, который может присутствовать в переменных количествах в фоновом воздухе помещения, свидетельствует о том, что этанол активно продуцировался микробным метаболизмом из глюкозы 13С. Величина вариации была объяснена субъектом, оцененным с помощью перестановочного многомерного анализа дисперсии (PERMANOVA), а также была различной для двух различных изменчивых наборов данных (таблица 1 и дополнительный рисунок S2). Для 13С-меченой культивируемой мокроты 51% вариаций было объяснено субъектом, в то время как 33% вариаций было объяснено субъектом из летучих веществ в образцах некультивированной мокроты (таблица 1). Состав сообщества микробиома, определяемый секвенированием ампликона 16S рРНК от семи субъектов, был уникален для каждого субъекта (дополнительный рисунок S3), и индивидуальные сигнатуры также отражались как в культивируемых, так и в некультурных летучих молекулах мокроты.

В культивируемой мокроте было обнаружено 23 летучих вещества, которые были полностью помечены 13углеродом. Обогащенные изотопами (активные) летучие вещества, обнаруженные из образцов мокроты, были разными для каждого субъекта. Летучие вещества с изотопным обогащением, обнаруженные в образцах мокроты у всех семи испытуемых, составляли 2,3-бутандион; уксусная кислота; ацетон; диметилтрисульфид; дисульфид, диметил; и пиразин, 2,5-диметил (рисунок 5). Хотя эти летучие вещества были обнаружены у всех субъектов, обогащение изотопами для каждого субъекта варьировалось. Образцы субъекта 7 имели более высокое изотопное обогащение дисульфидом диметилом по сравнению с другими шестью субъектами (рисунок 5B). Ацетон был выше у субъектов 4 и 6 (рисунок 5). Некоторые летучие вещества были обогащены 13C только у определенных субъектов. Например, 1-бутанол, 3-метил и пропановая кислота, 2-метил были обогащены только в подмножестве образцов от субъекта 2 (рисунок 5). В дополнение к летучим веществам, обогащенным изотопами, были также обнаружены летучие вещества как немаркированные из той же культивируемой мокроты (дополнительный рисунок S4). Летучие вещества 2-пиперидинона; бензальдегид, 4-метил; бензотиазол; бутановая кислота, 3-метил; гексанал; гексан; изопропиловый спирт; фенол; пропановая кислота, 2-метил; и пирроло 1,2-апиразин-1,4-дион, гексагидро были обнаружены в образцах мокроты, но не были обогащены изотопами (дополнительный рисунок S4).

Figure 1
Рисунок 1: Схема протокола. Биологический образец помещается в стеклянный флакон и собирается с вкладышем крышки и ручкой сорбента Headspace. Вакуум прикладывается к флакону до тех пор, пока не будет достигнуто давление приблизительно 30 мм рт.ст. Источник вакуума удаляется, а флаконы помещаются в установку экстракции сорбента, где статическая экстракция выполняется с помощью тепла, перемешивания и времени. После экстракции флаконы помещают на холодный металлический блок для удаления воды из пространства над головой и HSP. HSP собираются и запускаются с помощью термической десорбции на GC-MS. Данные анализируются с помощью ChemStation, DExSI и R. Аббревиатуры: HSP = Headspace Sorbent Pen; GC-MS = газовая хроматография-масс-спектрометрия. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 2
Рисунок 2: Тепловая карта моно- и кокультур. ЛОС, обнаруженные из моно- и кокультур в 24- и 48-часовых временных точках. Кокультуры представляют собой комбинации букв, представляющих каждый штамм. Все образцы извлекали в течение 1 ч при 70 °C с перемешиванием 200 об/мин. Значения интенсивности тепловой карты представляют собой столбцовые Z-баллы, нормализованные метаболитом. Z-балл рассчитывался по разнице значений от среднего значения, деленному на стандартное отклонение значений. Дендрограмма была сгенерирована с параметром cluster_cols в функции pheatmap R. Дендрограмма представляет собой иерархическую кластеризацию, в которой метаболиты, которые группируются вместе, имеют более сходные Z-баллы в выборках. Сокращения: A = A. baumanii; P = P. aeruginosa; S = S. aureus; TH = тодд Хьюитт медиа (контроль). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 3
Рисунок 3: Процентное превращение 13С в летучую молекулярную массу в образцах фекалий, слюны и сточных вод в течение 18 ч одновременной инкубации и экстракции. Конверсия % была рассчитана для полностью меченых соединений путем взятия массы полностью меченого соединения (M+N) и деления ее на (M+N) + массу немаркированной летучей массы (M), где N - максимальное количество возможных атомов углерода (в A-D) или водорода (в E), которые могут быть помечены в каждой летучей молекуле. Соединения считаются полностью маркированными, когда все углероды летучих веществ заменяются 13С. В тех случаях, когда данные отсутствуют, летучие вещества не были обнаружены. Например, в (D) 1-пропанол не был обнаружен в образцах фекалий или слюны. Количество реплик на выборку = 3. (A) 13летучих веществ, меченных С, обнаруженных во всех типах образцов (фекалии, слюна и сточные воды). (B) 13летучих веществ, меченных С, обнаруженных только в образцах слюны и сточных вод. (C) 13летучих веществ, меченных С, обнаруженных в образцах фекалий и слюны. D) 13летучих веществ, меченных С, обнаруженных в одном из трех различных типов проб. (E) Меченые дейтерием летучие молекулы. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 4
Рисунок 4: Тепловая карта 13С-меченых летучих веществ из культивируемой мокроты и летучих молекул, обнаруженных из некультивированной мокроты. Меченые летучие вещества получены из экспериментов по зондированию стабильных изотопов, где глюкоза 13° C и инфузионная среда для сердца мозга были добавлены в мокроту на этапе экстракции для культивирования роста микробов и захвата активного производства летучих веществ. Немаркированные летучие молекулы были обнаружены непосредственно из образцов мокроты. Интенсивность тепловой карты равна Z-баллам, как описано в подписи к рисунку 2. Тем не менее, Z-баллы были рассчитаны в каждом эксперименте для экспериментов с культивируемой и некультурной мокротой. Дендрограмма была сгенерирована, как описано на рисунке 2. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 5
Рисунок 5: Процентное превращение 13С в летучую молекулярную массу в образцах мокроты от семи субъектов с муковисцидозом в течение 18 ч одновременной инкубации и экстракции. Преобразование % было рассчитано, как описано в заголовке на рисунке 3. Летучие вещества, не обнаруженные в образцах, указываются отсутствием данных. N = 1-3. (A) 13С-меченых летучих веществ, обнаруженных при более высоком процентном преобразовании в большинстве образцов мокроты. (B) 13С-меченых летучих веществ, обнаруженных при более низком процентном преобразовании в большинстве образцов мокроты. (C) 13С-меченых летучих веществ, обнаруженных при более низком процентном преобразовании в меньшинстве образцов мокроты. Сокращения: B = базовый уровень; E = обострение; T = лечение. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Степени свободы Р2 Значение P
Некультурная мокрота Тема 6 0.33 0.001
Клиническое состояние 2 0.01 0.46
Тематика: клиническое состояние 12 0.12 0.092
Культивируемая мокрота с глюкозой и средой 13С Тема 6 0.51 0.001
Клиническое состояние 2 0.02 0.095
Тематика: клиническое состояние 12 0.11 0.194

Таблица 1: Перестановочный многомерный анализ дисперсии (ПЕРМАНОВА) образцов мокроты. PERMANOVA была сгенерирована с использованием функции адониса из веганской упаковки в R.

Дополнительный рисунок S1: Относительное содержание меченых (M+N(макс.)) и немаркированных (M+0) летучих веществ в образцах фекалий, слюны и сточных вод. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.

Дополнительный рисунок S2: Неметрическое многомерное масштабирование культивируемой мокроты со стабильным изотопным зондированием и некультурной мокротой. (A) NMDS культивируемой мокроты с глюкозой 13С и средой была получена с k = 3 измерения. Значение напряжения составило 0,07. (B) NMDS некультурной мокроты был получен с k = 3 измерениями. Значение напряжения составило 0,13. Сокращения: NMDS = неметрическое многомерное масштабирование; B = базовый уровень; E = обострение; T = лечение. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.

Дополнительный рисунок S3: Состав микробного сообщества образцов мокроты от субъектов с муковисцидозом. Оценивается по секвенированию ампликона 16S рРНК в рамках более крупного исследования, дополнительная информация о подходе обнаружена в Carmody et al. 202019. от субъектов с муковисцидозом. Каждый сложенный столбик имеет свою точку времени. Сокращения: В = исходный уровень, Е = обострение, Т = лечение. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.

Дополнительный рисунок S4: Относительное содержание меченых (M+N(макс)) и немаркированных (M+0) летучих веществ в образцах мокроты у семи субъектов с муковисцидозом. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Для выявления летучего производства в культурах in vitro и связанных с человеком образцах был проведен летучий анализ моно- и кокультур P. aeruginosa, S. aureus и A. baumanii и стабильное изотопное зондирование различных биологических образцов. В анализе для моно- и ко-культур летучие вещества были обнаружены путем выполнения короткой экстракции в течение 1 ч при 70 °C. Летучий анализ моно- и кокультур позволил исследовать соединения, образующиеся как отдельными видами, так и во время их взаимодействия с другими видами. Существовали различия в относительном изобилии в разных типах культур и точках времени. В экспериментах по исследованию стабильных изотопов биологические образцы включали фекалии и слюну от здоровых субъектов, сточные воды и мокроту от субъектов с муковисцидозом. Профилирование стабильных изотопов позволило идентифицировать активно продуцируемые летучие молекулы путем экстракции в течение 18 ч при 37 °C. Длительное время экстракции при более низкой температуре обеспечило рост и метаболизм микробов, присутствующих в биологических образцах. Сравнение обогащения глюкозой 13С иD2O показало, что имело место более обширное обогащение изотопами с меченым 13С.

При извлечении различных типов образцов были предприняты начальные шаги оптимизации перед началом полного запуска. Во-первых, протестируйте различные тома образца в качестве пробного запуска. Для некоторых типов образцов, например, мокроты, были доступны только небольшие объемы образцов. Рекомендуется начинать с меньшего объема или меньшего количества образца, в зависимости от типа образца и доступных количеств образца. Не извлекайте большой объем или слишком большую часть образца, так как это может перегрузить столбец и загрязнить HSP. Перегрузка колонки может проявляться, когда пики в хроматограмме насыщены или появляются в последующих прогонах. Загрязнение HSP произошло, если перенос присутствует при повторном запуске HSP на GC-MS. В моно- и кокультурных экспериментах 200 мкл культуры было достаточно для обнаружения различных летучих веществ. В экспериментах по зондированию стабильных изотопов, в зависимости от типа образца, объем для каждого эксперимента варьировался от 500 мкл до 1 мл. Во-вторых, в зависимости от типа образца и интересующих соединений, время и температура экстракции, а также методы GC-MS и термической десорбции должны быть скорректированы для оптимизации обнаружения летучих веществ. Эти методы были определены как подходящие для интересующих аналитов и типа столбцов.

После оптимизации метода критические шаги в протоколе относились к этапам до и после извлечения. Во время пробоподготовки образцы помещали на лед, чтобы летучие вещества, присутствующие в образце, не выходили. Также важно было убедиться, что вакуумное уплотнение было плотным, а крышка была надежно закрыта. В противном случае произойдет неэффективная экстракция и снижение обнаружения летучих веществ из образца. Утечки могут возникать из-за уплотнительных колец вокруг вкладыша крышки или HSP. Чтобы убедиться, что флакон находится под вакуумом, перед извлечением использовался датчик, чтобы убедиться, что уплотнительные кольца все еще функционируют. Кроме того, после извлечения образцы помещали на ледяную глыбу таким образом, чтобы вода вытягивалась из пространства над головой на определенный период. Вода в колонке может привести к изменениям времени удержания и подавлению реакции РС, что приведет к неколичественным результатам. Возможность вытягивать любую избыточную воду из HSP до удаления из вакуумной втулки / флакона возможна из-за закрытой системной природы процесса VASE и способности извлекать воду обратно в самое холодное место в этой системе экстракции с использованием холодной пластины -80 ° C.

Эти методы имеют как ограничения, так и преимущества по отношению к альтернативным методам. Оценивая эксперименты с моно- и кокультурой, были обнаружены летучие сигнатуры, которые были специфичны для конкретного микроба или кокультуры. Были также изменения в летучих изобилиях с течением времени. Что касается экспериментов по зондированию стабильных изотопов в различных типах биологических образцов, маркировка дейтерия не привела к такому количеству обогащенных изотопами летучих веществ, как глюкоза 13° C. Метаболизм, необходимый для производства обогащенных изотопами летучих веществ с дейтерием, может быть более ограниченным. Кроме того, к биологическим образцам добавляли среду для усиления роста микробов, что может привести к изменениям в составе микробного сообщества. Условия культивирования экспериментов по зондированию стабильных изотопов могут быть выбраны для благоприятного роста определенных микробов в биологическом образце. Это было против короткой экстракции в течение одного часа при 70 ° C, предназначенной для обнаружения летучих веществ в образце сообщества до того, как один или несколько микробов начнут захватывать сообщество. Сложность микробного и химического состава типов образцов фекалий, сточных вод, слюны и мокроты затрудняет присвоение конкретных химических сигнатур любому конкретному микробному или человеческому происхождению без дополнительных анализов, таких как секвенирование. Этот метод обеспечил высокопроизводительную вакуумную экстракцию без растворителей, что привело к более чувствительному обнаружению образцов с малым объемом. Объемы, использованные для этих экспериментов, варьировались от 200 мкл до 1 мл культивируемых биологических образцов. В других случаях (данные не показаны) извлекались биологические образцы (например, образцы мокроты и фекалий) размером до 15 мкл или 10 мкг.

Для будущих применений метода может быть проанализирован широкий спектр типов образцов с небольшими или ограниченными объемами. Десятки образцов могут быть извлечены одновременно, а время работы будет зависеть от параметров конкретного прибора GC-MS. В случае зондирования стабильных изотопов в сочетании с метагеномным секвенированием существует возможность идентификации микробов, ответственных за выработку летучих молекул. Метагеном биологического образца может быть секвенирован до и после экстракции со стабильным изотопным зондированием для выявления изменений в составе микробного сообщества. Метагеномное секвенирование позволит идентифицировать гены, ответственные за производство обогащенных изотопами летучих молекул. Здесь приводится несколько примеров типов выборки и подходов, которые могут быть использованы в качестве входных данных для представленного протокола, который уже был создан в различных отраслях. Поскольку летучие молекулы являются важными диагностическими показателями, использование этого протокола может быть распространено на биологические лаборатории и клинические медицинские учреждения.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

V. L. V и S. J.B. D. были бывшими сотрудниками Entech Instruments Inc., а K. W. является членом университетской программы Entech. J.P., J.K. и C.I.R. не имеют конфликта интересов, о котором можно было бы заявить.

Acknowledgments

Мы благодарим Хизер Моэн и Линду М. Каликин за тщательное редактирование этой рукописи. Эта работа была поддержана NIH NHLBI (грант 5R01HL136647-04).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
13C glucose Sigma-Aldrich 389374-1G
2-Stg Diaph Pump Entech Instruments 01-10-20030
20 mL VOA vials Fisher Scientific 5719110
24 mm Black Caps with hole, no septum Entech Instruments 01-39-76044B holds lid liner in place on vial
24 mm vial liner for sorbent pens Entech Instruments SP-L024S allows pens to make a vacuum seal at top of vial
5600 Sorbent pen extraction unit (SPEU) Entech Instruments 5600-SPES 5600 Sorbent Pen Extraction Unit -120 VAC
96-well assay plates Genesee 25-224
Brain Heart Infusion (BHI) media Sigma-Aldrich 53286-500G
ChemStation Stofware Agilent
DB-624 column Agilent 122-1364E 60 m, 0.25 mm ID, 1.40 micron film thickness, in GC-MS
Deuterium oxide Sigma-Aldrich 151882-1L
Dexsi sofware Dexsi (open source)
GC-MS (7890A GC and 5975C inert XL MSD with Triple-Axis Detector) Agilent 7890A GC and 5975C inert XL MSD with triple-axis detector
Headspace Bundle HS-B01, 120VA Entech Instruments SP-HS-B01 Items for running headspace extraction included in bundle
Headspace sorbent pen (HSP) - blank Entech Instruments SP-HS-0
Headspace sorbent pen (HSP) Tenax TA (35/60 Mesh) Entech Instruments SP-HS-T3560
Microcentrifuge tubes (2 mL) VWR 53550-792
O-rings Entech Instruments SP-OR-L024
Sample Preparation Rail Entech Instruments
Sorbent pen thermal conditioner Entech Instruments 3801-SPTC
Todd Hewitt (TH) media Sigma T1438-500G

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Van Berkel, J. J. B. N., et al. A profile of volatile organic compounds in breath discriminates COPD patients from controls. Respiratory Medicine. 104 (4), 557-563 (2010).
  2. Nakhleh, M. K., et al. Detecting active pulmonary tuberculosis with a breath test using nanomaterial-based sensors. European Respiratory Journal. 43 (5), 1522-1525 (2014).
  3. Lim, S. H., et al. Rapid diagnosis of tuberculosis from analysis of urine volatile organic compounds. ACS Sensors. 1 (7), 852-856 (2016).
  4. Schnabel, R., et al. Analysis of volatile organic compounds in exhaled breath to diagnose ventilator-associated pneumonia. Scientific Reports. 5, 17179 (2015).
  5. Paff, T., et al. Exhaled molecular profiles in the assessment of cystic fibrosis and primary ciliary dyskinesia. Journal of Cystic Fibrosis. 12 (5), 454-460 (2013).
  6. Robroeks, C. M. H. H. T., et al. Metabolomics of volatile organic compounds in cystic fibrosis patients and controls. Pediatric Research. 68 (1), 75-80 (2010).
  7. Neerincx, A. H., et al. Hydrogen cyanide emission in the lung by Staphylococcus aureus. European Respiratory Journal. 48 (2), 577-579 (2016).
  8. Goeminne, P. C., et al. Detection of Pseudomonas aeruginosa in sputum headspace through volatile organic compound analysis. Respiratory Research. 13, 87 (2012).
  9. Joensen, O., et al. Exhaled breath analysis using Electronic Nose in cystic fibrosis and primary ciliary dyskinesia patients with chronic pulmonary infections. PLOS ONE. 9 (12), 115584 (2014).
  10. Nasir, M., et al. Volatile molecules from bronchoalveolar lavage fluid can 'rule-in' Pseudomonas aeruginosa and 'rule-out' Staphylococcus aureus infections in cystic fibrosis patients. Scientific Reports. 8 (1), 826 (2018).
  11. Tyc, O., Zweers, H., de Boer, W., Garbeva, P. Volatiles in inter-specific bacterial interactions. Frontiers in Microbiology. 6, 1412 (2015).
  12. Gao, B., et al. Tracking polymicrobial metabolism in cystic fibrosis airways: Pseudomonas aeruginosa metabolism and physiology are influenced by Rothia mucilaginosa-derived metabolites. mSphere. 3 (2), 00151 (2018).
  13. Schoenheimer, R., Rittenberg, D. Deuterium as an indicator in the study of intermediary metabolism. Science. 82 (2120), 156-157 (1935).
  14. Neubauer, C., et al. Refining the application of microbial lipids as tracers of Staphylococcus aureus growth rates in cystic fibrosis sputum. Journal of Bacteriology. 200 (24), 00365 (2018).
  15. Cordell, R. L., Pandya, H., Hubbard, M., Turner, M. A., Monks, P. S. GC-MS analysis of ethanol and other volatile compounds in micro-volume blood samples-quantifying neonatal exposure. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 405 (12), 4139-4147 (2013).
  16. Mayor, A. S. R. Optimisation of sample preparation for direct SPME-GC-MS analysis of murine and human faecal volatile organic compounds for metabolomic studies. Journal of Analytical & Bioanalytical Techniques. 5 (2), 184 (2014).
  17. Camarasu, C. C. Headspace SPME method development for the analysis of volatile polar residual solvents by GC-MS. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis. 23 (1), 197-210 (2000).
  18. Charry-Parra, G., DeJesus-Echevarria, M., Perez, F. J. Beer volatile analysis: optimization of HS/SPME coupled to GC/MS/FID. Journal of Food Science. 76 (2), 205-211 (2011).
  19. Bicchi, C., Cordero, C., Liberto, E., Rubiolo, P., Sgorbini, B. Automated headspace solid-phase dynamic extraction to analyse the volatile fraction of food matrices. Journal of Chromatography A. 1024 (1), 217-226 (2004).
  20. Trujillo-Rodríguez, M. J., Anderson, J. L., Dunham, S. J. B., Noad, V. L., Cardin, D. B. Vacuum-assisted sorbent extraction: An analytical methodology for the determination of ultraviolet filters in environmental samples. Talanta. 208, 120390 (2020).
  21. Mollamohammada, S., Hassan, A. A., Dahab, M. Immobilized algae-based treatment of herbicide-contaminated groundwater. Water Environment Research. 93 (2), 263-273 (2021).
  22. Psillakis, E. The effect of vacuum: an emerging experimental parameter to consider during headspace microextraction sampling. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 412 (24), 5989-5997 (2020).
  23. Carmody, L. A., et al. The daily dynamics of cystic fibrosis airway microbiota during clinical stability and at exacerbation. Microbiome. 3, 12 (2015).
  24. Carmody, L. A., et al. Fluctuations in airway bacterial communities associated with clinical states and disease stages in cystic fibrosis. PLOS ONE. 13 (3), 0194060 (2018).
  25. Mahboubi, M. A., et al. Culture-based and culture-independent bacteriologic analysis of cystic fibrosis respiratory specimens. Journal of Clinical Microbiology. 54 (3), 613-619 (2016).

Tags

Биохимия Выпуск 184 Летучие органические соединения GC-MS вакуумная экстракция сорбента экстракция в пространстве над головой клинические образцы зондирование стабильных изотопов
Улавливание активно производимых микробных летучих органических соединений из образцов, связанных с человеком, с помощью вакуумной экстракции сорбента
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Phan, J., Kapcia III, J., Rodriguez, … More

Phan, J., Kapcia III, J., Rodriguez, C. I., Vogel, V. L., Cardin, D. B., Dunham, S. J. B., Whiteson, K. Capturing Actively Produced Microbial Volatile Organic Compounds from Human-Associated Samples with Vacuum-Assisted Sorbent Extraction. J. Vis. Exp. (184), e62547, doi:10.3791/62547 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter