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Genetics

इचिनोकोकस ग्रैनुलोसस के स्ट्रोबिलेटेड रूपों का क्षणिक पारगमन

Published: September 16, 2022 doi: 10.3791/62783
Automatic Translation
1, 2, 3, 2, 2, 4, 2
1Student Research Committee, School of Medicine, Kerman University of Medical Sciences, 2Research Center for Hydatid Disease in Iran, Kerman University of Medical Sciences, 3Department of Parasitology and Mycology, Faculty of Medicine, Kurdistan University of Medical Sciences, 4State Key Laboratory for Zoonotic Diseases, Key Laboratory of Zoonosis Research, Ministry of Education, Institute of Zoonosis, College of Veterinary Medicine, Jilin University

Summary

हम तीसरी पीढ़ी के लेंटिवायरल वैक्टर का उपयोग करके इचिनोकोकस ग्रैनुलोसस के विभिन्न विकास चरणों में एक तेजी से क्षणिक पारगमन तकनीक का वर्णन करते हैं।

Abstract

सिस्टिक इचिनोकोकोसिस या हाइडैटिड रोग सबसे महत्वपूर्ण जूनोटिक परजीवी रोगों में से एक है जो इचिनोकोकस ग्रैनुलोसस के कारण होता है, जो कुत्तों की आंत में एक छोटा टेपवर्म होता है। रोगजनन और रोग नियंत्रण और रोकथाम के तंत्र को समझने के लिए अनुप्रयुक्त आनुवंशिक अनुसंधान की तत्काल आवश्यकता है। हालांकि, एक प्रभावी जीन मूल्यांकन प्रणाली की कमी सेस्टोड परजीवी के कार्यात्मक आनुवंशिकी की प्रत्यक्ष व्याख्या में बाधा उत्पन्न होती है, जिसमें इचिनोकोकस प्रजातियां भी शामिल हैं। वर्तमान अध्ययन मेटासेस्टोड और स्ट्रोबिलेटेड रूपों में लेंटिवायरल जीन क्षणिक पारगमन की क्षमता को दर्शाता है ई। प्रोटोस्कोलेस (पीएससी) को हाइडैटिड अल्सर से अलग किया गया था और स्ट्रोबिलेटेड कीड़े में विकसित करने के लिए विशिष्ट बिफेसिक संस्कृति मीडिया में स्थानांतरित किया गया था। कीड़े को तीसरी पीढ़ी के लेंटिवायरस के साथ ट्रांसफेक्ट किया गया था, साथ ही एचईके 293 टी कोशिकाओं के साथ एक पारगमन प्रक्रिया नियंत्रण के रूप में। 24 घंटे और 48 घंटे से अधिक स्ट्रोबिलेटेड कीड़े में एक स्पष्ट प्रतिदीप्ति का पता चला था, जो ई ग्रैनुलोसस में क्षणिक लेंटिवायरल पारगमन का संकेत देता है। यह काम टेपवर्म में लेंटीवायरस-आधारित क्षणिक पारगमन पर पहला प्रयास प्रस्तुत करता है और फ्लैटवर्म जीव विज्ञान पर प्रयोगात्मक अध्ययनों में संभावित निहितार्थ के साथ आशाजनक परिणामों को प्रदर्शित करता है।

Introduction

सिस्टिक इचिनोकोकोसिस (सीई) इचिनोकोकस ग्रैनुलोसस के कारण होने वाली सबसे महत्वपूर्ण हेल्मिंथ बीमारियों में से एक है, जो परिवार के भीतर एक छोटा टेपवर्म है टेनिडे 1,2। ई ग्रैनुलोसस के लिए इम्यूनोडायग्नोस्टिक और वैक्सीन विकास पर व्यापक अध्ययन किए गए हैं। हालांकि, परजीवी जीव विज्ञान के आणविक आधार के बारे में अपर्याप्त ज्ञान हाइडैटिड रोग 3,4,5,6 के निदान, प्रबंधन और रोकथाम में प्रमुख सीमाएं पैदा करता है।

हाल के वर्षों में, जीनोम अनुक्रमण और ट्रांसक्रिप्टोमिक विधियों के विकास के कारण, कई शोध समूहों 7,8,9 द्वारा फ्लैटवर्म पर आणविक अध्ययनकी एक विस्तृत श्रृंखला आयोजित की गई है। हालांकि, परजीवी की दुनिया में, परजीवी फ्लैटवर्म में जीन हस्तांतरण प्रौद्योगिकी में प्रगति अभी भी कुछ प्रोटोजोआ10,11,12 के लिए विकसित अत्यधिक प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य क्षणिक पारगमन विधियों की तुलना में सीमित है।

वायरल डिलीवरी सिस्टम का उपयोग पिछले दो दशकों में ट्रांसजीन डिलीवरी और जीन / प्रोटीन जांच के लिए एक आवश्यक उपकरण के रूप मेंउभरा है। लेंटीवायरस विभाजित और गैर-विभाजित कोशिकाओं दोनों को संक्रमित करता है, इस प्रकार पोस्टमिटोटिक कोशिकाओं को 14,15,16 को संक्रमित करना संभव बनाता है। हाल के साक्ष्य इंगित करते हैं कि स्तनधारी कोशिकाओं में लेंटिवायरस-आधारित पारगमन प्रणाली का उपयोग करने से पिछली नॉक-इन / नॉक-डाउन तकनीकों की अधिकांश सीमाओं को दूर करने की क्षमता मिलती है। जीएफपी अभिव्यक्ति जैसे उपयुक्त आणविक मार्करों के साथ अभिव्यक्ति लेंटिवायरल वैक्टर के डिजाइन और निर्माण को पहले16 वर्णित किया गया है। इसलिए, हम प्रोटोस्कोलेस और स्ट्रोबिलेटेड कीड़े में जीएफपी रिपोर्टर जीन के लेंटिवायरल क्षणिक पारगमन का मूल्यांकन करते हैं ई।

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Protocol

इस अध्ययन को नेशनल इंस्टीट्यूट फॉर मेडिकल रिसर्च डेवलपमेंट और रिसर्च एथिक्स रिव्यू कमेटी, नंबर 958680 द्वारा अनुमोदित किया गया था। लेंटिवायरस को बीएसएल -2 जीवों के रूप में वर्गीकृत किया गया है; इसलिए, इस प्रोटोकॉल में सभी प्रयोगशाला संस्कृति प्रक्रियाओं को बाँझ प्रयोगशाला प्रथाओं का उपयोग करके किया गया था और एनआईएच दिशानिर्देशों के अनुसार लामिना प्रवाह हुड के तहत आयोजित किया गया था। चित्रा 1 विभिन्न ई ग्रैनुलोसस चरणों के लिए अध्ययन प्रोटोकॉल की एक योजनाबद्ध प्रस्तुति को दर्शाता है।

1. हाइडैटिड अल्सर एकत्र करना

  1. एक बूचड़खाने में नियमित रूप से वध स्वाभाविक रूप से संक्रमित भेड़ से जिगर हाइडैटिड अल्सर ले लीजिए।
  2. प्रोटोस्कोलेस (पीएससी) की आकांक्षा से पहले बाँझ धुंध और 70% अल्कोहल का उपयोग करके पुटी की सतह को पूरी तरह से निष्फल करें।
  3. बाँझ 50 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूबों में हाइडैटिड तरल पदार्थ के 20-50 मिलीलीटर की आकांक्षा।
  4. निकासी के बाद, एक तेज ब्लेड के साथ पुटी को बाहर निकालें, रोगाणु परत को बाँझ 50 एमएल शंक्वाकार ट्यूब में स्थानांतरित करें, और पीएससी के संग्रह को बढ़ाने के लिए इसे थोड़ी अवधि (~ 2 मिनट) के लिए हिलाएं।
  5. फॉस्फेट-बफर खारा (पीबीएस) के साथ पीएससी 3-5x धो लें।
  6. एक प्रकाश माइक्रोस्कोप के तहत पीएससी व्यवहार्यता निर्धारित करने के लिए 5 मिनट के लिए 0.1% ईओसिन में पीएससी का निरीक्षण करें। संस्कृति के लिए कम से कम 95% व्यवहार्यता के साथ पीएससी का उपयोग करें।
  7. 15-20 मिनट के लिए पेप्सिन (2 मिलीग्राम / एमएल, पीएच 2) के 2 मिलीलीटर के साथ पीएससी अवक्षेप का इलाज करें।
  8. व्यक्तिगत पीएससी को अलग करने के लिए, पीबीएस में पीएससी तलछट को फिर से निलंबित करें और इसे बाँझ धुंध की दो परतों के माध्यम से एक नए बाँझ 50 एमएल शंक्वाकार ट्यूब में पास करें।
    नोट: एक प्रकाश माइक्रोस्कोप का उपयोग कर पीएससी तलछट के 50 μL पर तीन मायने रखता है के औसत की गणना करें। बाद के परीक्षणों के लिए, पीएससी / μL निर्धारित करने के लिए अनुमानित मूल्य का उपयोग करें। प्रत्येक हाइडैटिड पुटी आइसोलेट को आणविक तरीकों से न्यूक्लियोटाइड बहुरूपताओं के आधार पर विशेषता दी जानी चाहिए, जैसे पीसीआर-अनुक्रमण17 या उच्च-रिज़ॉल्यूशन पिघलने वक्र विश्लेषण18.

2. वयस्क कीड़े प्राप्त करने के लिए ई ग्रैनुलोसस के पीएससी की बिफैसिक खेती

नोट: पृथक पीएससी को लामिना प्रवाह कैबिनेट कक्षा द्वितीय के तहत बाँझ परिस्थितियों में सुसंस्कृत किया जाना चाहिए। अगले चरणों19 पर आगे बढ़ने से पहले बिफैसिक संस्कृति माध्यम के ठोस और तरल चरणों को अलग से तैयार करें।

  1. दो चरणों से मिलकर बिफैसिक संस्कृति माध्यम तैयार करें।
    1. ठोस चरण के लिए, 25 मिलीलीटर फ्लास्क में 10 मिलीलीटर गोजातीय सीरम जोड़ें और इसे 20-30 मिनट के लिए 76 डिग्री सेल्सियस पर जमा करने के लिए छोड़ दें।
    2. तरल चरण (संशोधित सीएमआरएल) के लिए, गर्मी-निष्क्रिय भ्रूण बछड़ा सीरम (एफसीएस) के 100 मिलीलीटर, 5% खमीर निकालने के 36 एमएल, 30% ग्लूकोज के 5.6 एमएल (आसुत जल में), पीबीएस में 5% कुत्ते पित्त के 1.4 एमएल, 20 एमएम एचईपीईएस बफर, और सीएमआरएल -1066 के 260 एमएल में 10 एमएम एनएएचसीओ3 मिलाएं। अंत में, मिश्रण में पेनिसिलिन (100 आईयू / एमएल) और स्ट्रेप्टोमाइसिन (100 मिलीग्राम / एमएल) जोड़ें।
  2. प्रत्येक 25 सेमी2 संस्कृति फ्लास्क के लिए तरल चरण माध्यम के 10 मिलीलीटर जोड़ें।
  3. संस्कृति फ्लास्क में ~ 5,000 पीएससी जोड़ें और फ्लास्क को सीओ2 इनक्यूबेटर (37 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ2) में स्थानांतरित करें।
  4. 24-48 घंटे के बाद, ठोस चरण (गोजातीय सीरम) के साथ एक नए फ्लास्क में पीएससी को स्थानांतरित करें और प्रति फ्लास्क उसी ताजा तरल चरण माध्यम के 1 मिलीलीटर जोड़ें। सीओ2 इनक्यूबेटर (37 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ2) में फ्लास्क स्थानांतरण।
  5. हर 5-7 दिनों में, संस्कृति माध्यम के रंग में परिवर्तन और विभेदित पीएससी के अनुमानित अनुपात के आधार पर ताजा तरल चरण माध्यम के साथ माध्यम को प्रतिस्थापित करें।
    नोट: प्रोटोस्कोलेस सुसंस्कृत होने के बाद पर्यावरणीय परिवर्तनों के लिए जल्दी से प्रतिक्रिया करते हैं, और उनमें से अधिकांश 2-3 सप्ताह के भीतर भेदभाव से गुजरते हैं। पोषक तत्वों और प्रोटोस्कोलेस की वृद्धि और विकास की खपत के कारण, संस्कृति माध्यम का पीएच बदल जाता है, और इसका रंग नारंगी और पीले रंग की ओर स्थानांतरित हो जाता है।

3. ई ग्रैनुलोसस के पीएससी की मोनोफैसिक खेती

  1. सुनिश्चित करें कि मोनोफैसिक खेती पारगमन से 24-48 घंटे पहले की जाती है।
    1. आरपीएमआई और 10% भ्रूण गोजातीय सीरम (एफबीएस) के साथ25 सेमी 2 संस्कृति फ्लास्क में संस्कृति ~ 5,000 पीएससी।
    2. उपयोग तक सीओ2 इनक्यूबेटर (37 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ2) में फ्लास्क स्थानांतरित करें।

4. वायरस उत्पादन और तैयारी के लिए सेल संस्कृति

नोट: मानव भ्रूण गुर्दे 293 टी (एचईके 293 टी) कोशिकाओं को पैथोलॉजी और स्टेम सेल रिसर्च सेंटर, कर्मन यूनिवर्सिटी ऑफ मेडिकल साइंसेज से वेक्टर उत्पादन के लिए प्राप्त किया गया था।

  1. एमएल पेनिसिलिन, और100 μg / एमएल स्ट्रेप्टोमाइसिन के साथ डीएमईएम के 5 एमएल युक्त25 सेमी 2 फ्लास्क में 5 × 5 एचईके 293 टी कोशिकाओं को स्थानांतरित करें।
  2. 5% सीओ 2 में 37 डिग्री सेल्सियस पर एचईके2 9 3 टी कोशिकाओं सेते हैं और उन्हें हर 48 घंटे में पूर्ण संस्कृति माध्यम में पारित करते हैं। अंत में, पारगमन 20 के लिए कम-मार्ग एचईके293 टी कोशिकाओं का उपयोग करें।

5. तीसरी पीढ़ी के लेंटिवायरल वैक्टर के साथ वायरस का उत्पादन और तैयारी

नोट: लेंटिवायरस वेक्टर पीसीडीएच 513 बी (ट्रांसफर वेक्टर) और पीएलपीआईआई, पीएलपीआई, और पीएमडी 2 जी (हेल्पर वैक्टर) का उपयोग जीएफपी रिपोर्टर जीन को व्यक्त करने के लिए किया गया था। सामग्री और पूरक चित्रा एस 1 की तालिका देखें।

  1. पहला दिन:
    1. 6-अच्छी तरह से संस्कृति प्लेटों में एचईके 2 9 3 टी कोशिकाओं21 को ट्रिप्सिनाइज करने के बाद, बीज 7 × 104 कोशिकाएं ताजा एंटीबायोटिक मुक्त डीएमईएम युक्त 10% एफबीएस के साथ अच्छी तरह से।
    2. कैल्शियम फॉस्फेट विधि द्वारा पारगमन के लिए 50% -60% संगम पर कोशिकाओं का उपयोग करें।
  2. दूसरा दिन:
    1. 2 % एफबीएस युक्त ताजा एंटीबायोटिक मुक्त डीएमईएम के साथ प्रयोग से पहले सेल संस्कृति माध्यम 2-3 घंटे बदलें।
    2. 1.5 एमएल ट्यूब में, तीसरी पीढ़ी के लेंटिवायरल प्लास्मिड को मिलाएं, जिसमें 7 μg / μL पीसीडीएच 513 बी (ट्रांसफर वेक्टर), 4 μg / μL PLPII, 4 μg / μL PLPI, और 2 μg / μL पीएमडी 2 जी (सहायक वैक्टर) शामिल हैं।
    3. मिश्रण में422 μL की मात्रा में एचईपीईएस बफर (0.28एम एनएसीएल, 0.05 एम एचईपीईएस, और 1.5 एमएम एनए 2 एचपीओ 4; इष्टतम पीएच रेंज, 7.00-7.28) जोड़ें।
    4. मिश्रण में 1% ट्रिस-ईडीटीए (टीई) बफर के 16 μL जोड़ें।
    5. ट्यूबों में 2.5 एमएम कैल्शियम क्लोराइड के 62 μL जोड़ें और अच्छी तरह से मिलाएं।
    6. मिश्रण के लिए 2x HEPES-बफ़र्ड खारा (HBS) के 500 μL जोड़ें, ड्रॉप द्वारा ड्रॉप, एक पाश्चर विंदुक का उपयोग कर 1-2 मिनट के भीतर । धीरे-धीरे मिलाएं जब तक कि एक अर्ध-अपारदर्शी समाधान प्राप्त न हो जाए, और कमरे के तापमान पर 20 मिनट के लिए मिश्रण सेते हैं।
    7. प्रत्येक प्लेट में मिश्रण को धीरे-धीरे जोड़ें और इसे धीमी परिपत्र गति के साथ वितरित करें।
    8. एक 5% सीओ2 इनक्यूबेटर में 37 डिग्री सेल्सियस पर प्लेटों सेते हैं और 10% एफबीएस युक्त एंटीबायोटिक मुक्त डीएमईएम के साथ 4-6 घंटे के बाद माध्यम को प्रतिस्थापित करें।
  3. तीसरा दिन:
    1. एक उल्टे प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोप का उपयोग कर सफल क्षणिक पारगमन और सेल व्यवहार्यता की पुष्टि करें।
  4. चौथा दिन:
    1. प्रत्येक कुएं के सतह पर तैरनेवाला इकट्ठा करके संस्कृति माध्यम से हार्वेस्ट वायरस और उपयोग होने तक उन्हें -70 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
      नोट: कटाई लेंटिवायरस को सटीक अभिकर्मक22 के लिए केंद्रित और शीर्षक दिया जा सकता है।

6. वायरस के साथ ई ग्रैनुलोसस के विभिन्न चरणों का क्षणिक पारगमन

  1. पहला दिन:
    1. जीन स्थानांतरण के लिए 12-अच्छी तरह से संस्कृति प्लेट का उपयोग करें। संस्कृति 5 × 103-5 × 104 एचईके 293 टी कोशिकाओं को तीन गुना में, आंतरिक संदर्भ के रूप में पूर्ण डीएमईएम माध्यम के साथ।
    2. संस्कृति आरपीएमआई और 10% एफबीएस में ट्रिप्लिकेट में 150 ताजा पीएससी।
    3. संस्कृति डीएमईएम में ट्रिप्लिकेट में 30 स्ट्रोबिलेटेड कीड़े जिसमें 10% गर्मी-निष्क्रिय एफबीएस होते हैं।
      नोट: सभी पारगमन मीडिया एंटीबायोटिक मुक्त होना चाहिए। इस प्रक्रिया में एचईके 293 टी कोशिकाओं, पीएससी और स्ट्रोबिलेटेड कीड़े के लिए तीन गैर-उपचारित नियंत्रण कुएं रखें।
    4. एमएल अभिकर्मक अभिकर्मक (सामग्री की तालिका देखें) के साथ 1 × 106 वायरस का मिश्रण तैयार करें ताकि एचईके 293 टी कोशिकाओं और कीड़े के विभिन्न चरणों को ट्रांसड्यूस किया जा सके।
    5. प्रत्येक प्लेट में मिश्रण को धीरे-धीरे जोड़ें और इसे धीमी परिपत्र गति के साथ वितरित करें। एक सीओ 2 इनक्यूबेटर (37 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ2 ) में 4-6घंटे के लिए प्लेटों सेते हैं। अभिकर्मक अभिकर्मक के विषाक्त प्रभाव को कम करने के लिए एक ही पूर्ण संस्कृति माध्यम के साथ प्रत्येक नमूने के लिए माध्यम को बदलें।
  2. दूसरा दिन:
    1. एचईके 293 टी कोशिकाओं, पीएससी और स्ट्रोबिलेटेड कीड़े के लिए क्षणिक पारगमन की दक्षता बढ़ाने के लिए चरण 6.1.4-6.1.5 दोहराएं।
    2. सेल मीडिया के प्रकार के आधार पर एक ही संस्कृति की स्थिति के साथ एक सीओ2 इनक्यूबेटर में 24-48 घंटे के लिए सभी प्लेटों सेते हैं।
  3. तीसरा दिन:
    1. जाँचें कि क्या ट्रांसडक्शन प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी का उपयोग करके सफल है।
      क्यूपीसीआर20,23 या जीन ट्रांसफर प्रक्रिया में पश्चिमी सोख्ता 24 तकनीकों जैसे आगे की पुष्टिकरण परखका उपयोग करने पर विचार करें।

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Representative Results

यहां, हम तीसरी पीढ़ी के लेंटिवायरल वैक्टर का उपयोग करके ई ग्रैनुलोसस में एक तेजी से और कुशल क्षणिक पारगमन तकनीक का वर्णन करते हैं। हमने स्ट्रोबिलेटेड कीड़े प्राप्त करने के लिए एक द्विध्रुवी संस्कृति माध्यम में पीएससी को सुसंस्कृत किया, जैसा कि पहले25,26 वर्णित है। इन विट्रो में 6 सप्ताह के बाद प्रोटोस्कोलेस स्ट्रोबिलेटेड कीड़े में विकसित होते हैं। ई ग्रैनुलोसस के विभिन्न चरणों को द्विदलीय संस्कृति माध्यम में देखा गया था, जिसमें आक्रामक पीएससी (चित्रा 2 ए), वाजिनेटेड पीएससी (चित्रा 2 बी), और पहले और तीसरे प्रोग्लोटिड गठन (चित्रा 2 सी-ई) के साथ स्ट्रोबिलेटेड कीड़े शामिल थे। प्रोटोस्कोलेसेस और मोनोफैसिक और बाइफैसिक संस्कृतियों से प्राप्त स्ट्रोबिलेटेड कीड़े, क्रमशः, जीएफपी-एक्सप्रेसिंग लेंटिवायरस (चित्रा 3) से संक्रमित थे। ऑटोफ्लोरेसेंस प्रभाव से बचने के लिए, सूक्ष्म टिप्पणियों की तुलना नमूनों के सभी तीन समूहों में पृष्ठभूमि प्रतिदीप्ति के साथ की गई थी, और इस पृष्ठभूमि स्तर से ऊपर के सभी नमूनों को ट्रांसफेक्टेड माना जाता था।

हमने क्षेत्र रोशनी को समायोजित किया और प्रत्येक उपचार के लिए नियंत्रण नमूनों में किसी भी संभावित ऑटोफ्लोरेसेंस उत्सर्जन को रोकने के लिए शटर को कम किया। फिर हमने लेंटिवायरल वेक्टर-उपचारित नमूनों की जांच की, जिसमें एक काले क्षेत्र के खिलाफ हरे रंग की रोशनी उत्सर्जन को प्रभावी क्षणिक पारगमन माना जाता था। एचईके 2 9 3 टी कोशिकाओं- क्षणिक पारगमन प्रक्रिया नियंत्रण-स्पष्ट रूप से व्यक्त जीएफपी (चित्रा 3 डी)। वयस्क कीड़े ने जीएफपी को टेगुमेंटल परत (चित्रा 3 एफ) में सबसे स्पष्ट रूप से व्यक्त किया; हालांकि, पीएससी ने 48 घंटे के बाद जीएफपी अभिव्यक्ति के कुछ हद तक निचले स्तर का प्रदर्शन किया। पीएससी के चारों ओर कुछ पुटी द्रव अवशेष और / या जर्मिनल परत मलबे ने ट्रांसफेक्टेड नमूनों में पृष्ठभूमि में कुछ प्रतिदीप्ति का कारण बना। एचईके 293 टी कोशिकाओं और स्ट्रोबिलेटेड कीड़े में प्रतिदीप्ति की तीव्रता 24 घंटे और 48 घंटे के बाद बढ़ गई (पीएससी में मामूली परिवर्तन देखे गए)।

Figure 1
चित्रा 1: अध्ययन प्रोटोकॉल की एक योजनाबद्ध प्रस्तुति। संक्षिप्त नाम: पीएससी = प्रोटोस्कोलेस। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 2
चित्रा 2: बिफैसिक संस्कृति माध्यम में इचिनोकोकस ग्रैनुलोसस के विभिन्न चरण। (ए) आक्रमणकारी पीएससी, (बी) पीएससी, (सी, डी) स्ट्रोबिलेशन की प्रक्रिया में कीड़े, (ई) तीसरे प्रोग्लोटिड गठन के साथ स्ट्रोबिलेटेड कीड़े, (एफ) संस्कृति माध्यम में स्ट्रोबिलेशन के विभिन्न चरणों में कीड़े। स्केल सलाखों = 200 μm. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 3
चित्रा 3: इचिनोकोकस ग्रैनुलोसस के विभिन्न चरणों का क्षणिक पारगमन और प्रकाश और प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी में नियंत्रण सेल लाइन। (ए, डी) पारगमन प्रक्रिया नियंत्रण के रूप में एचईके 293 टी कोशिकाएं, (बी, ई) प्रोटोस्कोलेस, और (सी, एफ) स्ट्रोबिलेटेड कीड़े। (जी, एच, आई) मिश्रित प्रकाश और पुष्पक्रम माइक्रोस्कोपी। स्केल बार = 50 μm, 100 μm, और 500 μm। कृपया इस आकृति का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें।

पूरक चित्रा एस 1: पीसीडीएच-सीएमवी-एमसीएस-ईएफ 1-ग्रीनपुरो सीडीएनए क्लोनिंग और अभिव्यक्ति वेक्टर का नक्शा। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

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Discussion

जूनोटिक परजीवी की रोगजनकता को समझने के लिए नेमाटोड और प्लैटिहेल्मिंथेस जीव विज्ञान के आणविक आधार को समझना महत्वपूर्ण है27. एक प्रभावी जीन मूल्यांकन प्रणाली की कमी सेस्टोड परजीवी के कार्यात्मक आनुवंशिकी की प्रत्यक्ष व्याख्या के लिए एक बड़ी बाधा है, जिसमें इचिनोकोकस प्रजातियां 12,27 शामिल हैं। वर्तमान अध्ययन ई ग्रैनुलोसस क्षणिक पारगमन में लेंटीवायरस की उत्कृष्ट क्षमता को दर्शाता है।

लेंटिवायरल पारगमन स्तनधारी कोशिकाओं को ट्रांसजेन देने के लिए स्थिर सेल लाइनों की मजबूत अभिव्यक्ति के साथ क्षणिक पारगमन के उपयोग और गति की सादगी को जोड़ती है28. इस काम का प्रमुख लक्ष्य लेंटिवायरल वेक्टर ट्रांसडक्शन की प्रक्रिया को चित्रित करना था, जो भविष्य के इचिनोकोकोसिस अनुसंधान में महत्वपूर्ण होगा।
विशिष्ट महत्वपूर्ण बिंदुओं इस प्रोटोकॉल में ध्यान दिया जाना चाहिए। संस्कृति माध्यम में एंटीबायोटिक दवाओं की चूक के कारण सख्त बाँझ वर्कफ़्लो स्थितियों को देखा जाना चाहिए, जिसके बिना 24 घंटे के बाद जीवाणु और कवक संदूषण की उम्मीद की जा सकती है। माइक्रोबियल संदूषण परजीवी की गतिशीलता और व्यवहार्यता को कम करता है, और 72 घंटे के बाद ट्रांसफेक्टेड और नियंत्रण नमूने दोनों खो जाएंगे।

प्लैटिहेल्मिंथेस के जीवन चक्र में उपयुक्त चरणों का चयन करना और उपयुक्त संस्कृति स्थितियां सफल जीन पारगमन12,27 की कुंजी हैं। हमने मेटासेस्टोड और स्ट्रोबिलेटेड चरणों में हमारी लेंटिवायरल पारगमन विधि का परीक्षण किया। परिणामों से पता चला है कि स्ट्रोबिलेटेड कीड़े पीएससी की तुलना में जीन के क्षणिक पारगमन के लिए अधिक उत्तरदायी थे, जो स्ट्रोबिलेटेड रूपों में व्यापक टेगुमेंटल संरचना का परिणाम हो सकता है। हालांकि, लेंटिवायरल पारगमन की प्रकृति के कारण, बहुकोशिकीय पीएससी और स्ट्रोबिलेटेड कीड़े में प्रतिदीप्ति तीव्रता आमतौर पर मोनोलेयर एचईके 293 टी कोशिकाओं26 की तुलना में बहुत कम होती है।

जैविक घटनाओं का अध्ययन करने के लिए फ्लैटवर्म में एक नए मॉडल के रूप में इचिनोकोकस का उपयोग करने की क्षमता पर लंबे समय से चर्चा की गई है। इसलिए, एक मॉडल जीव के रूप में इचिनोकोकस जीव विज्ञान की बेहतर समझ स्टेम सेल अनुसंधान का विस्तार करने और अन्य प्लैटिहेल्मिंथ 8,29,30,31,32 के जीन अभिव्यक्ति और विकासवादी जीव विज्ञान को विनियमित करने के लिए उपयोगी हो सकती है। इचिनोकोकस और विभिन्न परजीवी और मुक्त रहने वाले फ्लैटवर्म मॉडल सिस्टम के लिए जीनोमिक और ट्रांसक्रिप्टोमिक स्तरों पर अनुप्रयुक्त आनुवंशिक अनुसंधान की तत्काल आवश्यकता है। इसलिए, टेपवर्म के लिए एक प्रभावी जीन हस्तांतरण प्रक्रिया विकसित करने से नई तकनीकों का मार्ग प्रशस्त होता है, जैसे कि वायरस-आधारित जीन नॉक-इन या सीआरआईएसपीआर-कैस-मध्यस्थता जीन संपादन32,33। यह काम एक टेपवर्म मॉडल में लेंटिवायरल पारगमन प्रस्तुत करता है और फ्लैटवर्म जीव विज्ञान के लिए संभावित निहितार्थ के साथ आशाजनक परिणामों को प्रदर्शित करता है। हालांकि, विधि में सुधार करने और भविष्य के प्रयोगों के लिए इस तकनीक की प्रयोज्यता विकसित करने के लिए अधिक गहन अध्ययन की आवश्यकता है।

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Disclosures

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए हितों का कोई टकराव नहीं है।

Acknowledgments

इस प्रकाशन में रिपोर्ट किए गए शोध को नेशनल इंस्टीट्यूट फॉर मेडिकल रिसर्च डेवलपमेंट (एनआईएमएडी), तेहरान, ईरान से पुरस्कार संख्या 958680 के तहत एलीट रिसर्चर ग्रांट कमेटी द्वारा समर्थित किया गया था।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
12-well culture plates SPL Life Sciences 30012
25 cm2 culture flask SPL Life Sciences 70325
6-well culture plates SPL Life Sciences 30006
Calcium chloride Sigma-Aldrich C4901-500G Working concentration: 2.5 mM
CMRL 1066 medium Thermo Fisher Scientific 11530037
CO2 incubator memmert ICO150
D-(+)-Glucose Sigma-Aldrich G8270-1KG
DMEM Life Technology 12100046
Dog bile Isolated from a euthanized dog and sterilized by 0.2 μm syringe filter
Eosin Y Sigma-Aldrich E4009-5G prepare 0.1% of Eosin for working exclusion test
Fetal Bovine Serum (FBS) DNAbiotech DB9723-100ml Heat inactivation of FBS (30 min in 40 °C)
Fetal Calf Serum (FCS) DNAbiotech DB9724-100ml Heat inactivation of FCS (30 min in 40 °C)
HEK293T cells BONbiotech BN_0012.1.14 Human embryonic kidney 293T
HEPES buffered saline (HBS) Sigma-Aldrich 51558-50ML 2x concentrate
Inverted fluorescence microscope OLYMPUS IX51
Penicillin Sigma-Aldrich P3032-10MU Working concentration: 100 IU/mL
Pepsin Roche 10108057001 Working concentration: 2 mg/mL, pH 2
Phosphate-buffered saline (PBS) DNAbiotech DB0011 This reagent solve in less than 1 min in D.W
Polybrene (Transfection reagent) Sigma-Aldrich TR-1003-G
RPMI medium BioIdea BI-1006-05
Sodium bicarbonate (NaHCO3) Sigma-Aldrich S5761-1KG
Streptomycin Sigma-Aldrich S9137-25G Working concentration: 100 μg/mL
Third-generation lentiviral plasmid (pCDH513b) SBI System Biosciences (BioCat GmbH) CD513B-1-SBI Transfer vector (obtained commercially from Molecular Medicine Research Department of Iranian Academic Center for Education, Culture and Research (ACECR), Mashhad, Iran)
Third-generation lentiviral plasmid (pLPI and pLPII) Invitrogen (Life Technologies) K4975-00 Helper vector (obtained commercially from Molecular Medicine Research Department of Iranian Academic Center for Education, Culture and Research (ACECR), Mashhad, Iran)
Third-generation lentiviral plasmid (pMD2G) Addgene Plasmid 12259 Helper vector (obtained commercially from Molecular Medicine Research Department of Iranian Academic Center for Education, Culture and Research (ACECR), Mashhad, Iran)
Tris/EDTA Buffer (TE) DNAbiotech DB9713-100ml
Trypsin Sigma-Aldrich T9935-50MG 1x working solutions (pH 7.4–7.6)

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References

  1. Deplazes, P., et al. Global distribution of alveolar and cystic echinococcosis. Advances in Parasitology. 95, 315 (2017).
  2. Borhani, M., et al. Echinococcoses in Iran, Turkey, and Pakistan: Old diseases in the new millennium. Clinical Microbiology Reviews. 34 (3), 0029020 (2021).
  3. Eckert, J., Thompson, R. C. A. Historical aspects of echinococcosis. Advances in Parasitology. 95, 1-64 (2017).
  4. Romig, T., et al. Ecology and life cycle patterns of Echinococcus species. Advances in Parasitology. 95, 213 (2017).
  5. Craig, P. S., Hegglin, D., Lightowlers, M. W., Torgerson, P. R., Wang, Q. Echinococcosis: control and prevention. Advances in Parasitology. 95, 55 (2016).
  6. Deplazes, P., et al. Global distribution of alveolar and cystic echinococcosis. Advances in Parasitology. 95 (1), 315 (2017).
  7. Tsai, I. I. J., et al. The genomes of four tapeworm species reveal adaptations to parasitism. Nature. 496 (7443), 57-63 (2013).
  8. Koziol, U., Brehm, K. Recent advances in Echinococcus genomics and stem cell research. Veterinary Parasitology. 213 (3-4), 92-102 (2015).
  9. Zheng, H., et al. The genome of the hydatid tapeworm Echinococcus granulosus. Nature Genetics. 45 (10), 1168-1175 (2013).
  10. Pérez-Victoria, J. M., Torres, A. P. T. C., Gamarro, F., Castanys, S. ABC transporters in the protozoan parasite Leishmania. International Microbiology. 4 (3), 159-166 (2001).
  11. Ehrenkaufer, G. M., Singh, U. Transient and stable transfection in the protozoan parasite Entamoeba invadens. Molecular and Biochemical Parasitology. 184 (1), 59-62 (2012).
  12. Moguel, B., Bobes, R. J., Carrero, J. C., Laclette, J. P. Transfection of Platyhelminthes. BioMed Research International. 2015, 206161 (2015).
  13. Tang, Y., Garson, K., Li, L., Vanderhyden, B. C. Optimization of lentiviral vector production using polyethylenimine-mediated transfection. Oncology Letters. 9 (1), 55-62 (2015).
  14. Mann, V. H., Suttiprapa, S., Rinaldi, G., Brindley, P. J. Establishing transgenic schistosomes. PLoS Neglected Tropical Diseases. 5 (8), 1230 (2011).
  15. Balcaitis, S., Weinstein, J. R., Li, S., Chamberlain, J. S., Möller, T. Lentiviral transduction of microglial cells. Glia. 50 (1), 48-55 (2005).
  16. Sastry, L., Johnson, T., Hobson, M. J., Smucker, B., Cornetta, K. Titering lentiviral vectors: comparison of DNA, RNA and marker expression methods. Gene Therapy. 9 (17), 1155-1162 (2002).
  17. Bowles, J., Blair, D., McManus, D. P. Genetic variants within the genus Echinococcus identified by mitochondrial DNA sequencing. Molecular and Biochemical Parasitology. 54 (2), 165-173 (1992).
  18. Rostami, S., et al. High resolution melting technique for molecular epidemiological studies of cystic echinococcosis: differentiating G1, G3, and G6 genotypes of Echinococcus granulosus sensu lato. Parasitology Research. 112 (10), 3441-3447 (2013).
  19. Mousavi, S. M., et al. Biological and morphological consequences of dsRNA-induced suppression of tetraspanin mRNA in developmental stages of Echinococcus granulosus. Parasites and Vectors. 13 (1), 190 (2020).
  20. Afgar, A., et al. MiR-339 and especially miR-766 reactivate the expression of tumor suppressor genes in colorectal cancer cell lines through DNA methyltransferase 3B gene inhibition. Cancer Biology & Therapy. 17 (11), 1126-1138 (2016).
  21. Ricardo, R., Phelan, K. Trypsinizing and subculturing mammalian cells. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (16), e755 (2008).
  22. Wang, X., McManus, M. Lentivirus production. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (32), e1499 (2009).
  23. Li, M., Husic, N., Lin, Y., Snider, B. J. Production of lentiviral vectors for transducing cells from the central nervous system. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (63), e4031 (2012).
  24. Eslami, A., Lujan, J. Western blotting: sample preparation to detection. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (44), e2359 (2010).
  25. Dezaki, E. S., et al. Comparison of ex vivo harvested and in vitro cultured materials from Echinococcus granulosus by measuring expression levels of five genes putatively involved in the development and maturation of adult worms. Parasitology Research. 115 (11), 4405-4416 (2016).
  26. Mousavi, S. M., et al. Calmodulin-specific small interfering RNA induces consistent expression suppression and morphological changes in Echinococcus granulosus. Scientific Reports. 9 (1), 1-9 (2019).
  27. Aboobaker, A. A., Blaxter, M. L. Functional genomics for parasitic nematodes and platyhelminths. Trends in Parasitology. 20 (4), 178-184 (2004).
  28. Elegheert, J., et al. Lentiviral transduction of mammalian cells for fast, scalable and high-level production of soluble and membrane proteins. Nature Protocols. 13 (12), 2991 (2018).
  29. Mizukami, C., et al. Gene silencing in Echinococcus multilocularis protoscoleces using RNA interference. Parasitology International. 59 (4), 647-652 (2010).
  30. Thompson, R. C. A., Jenkins, D. J. Echinococcus as a model system: biology and epidemiology. International Journal for Parasitology. 44 (12), 865-877 (2014).
  31. Thompson, R. C. A. Biology and systematics of Echinococcus. Advances in Parasitology. Thompson, R. C. A., Deplazes, P., Lymbery, A. J. 95, 65-109 (2017).
  32. Brehm, K., Koziol, U. Echinococcus-host interactions at cellular and molecular levels. Advances in Parasitology. 95, 147-212 (2017).
  33. Moguel, B., et al. Transient transgenesis of the tapeworm Taenia crassiceps. SpringerPlus. 4, 496 (2015).

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आनुवंशिकी अंक 187 लेंटीवायरस क्षणिक पारगमन इचिनोकोकस ग्रैनुलोसस जीएफपी मेटासेस्टोड प्रोटोस्कोलेसेस
<em>इचिनोकोकस ग्रैनुलोसस</em> के स्ट्रोबिलेटेड रूपों का क्षणिक पारगमन
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