Summary
Wir beschreiben eine schnelle transiente Transduktionstechnik in verschiedenen Entwicklungsstadien von Echinococcus granulosus unter Verwendung von lentiviralen Vektoren der dritten Generation.
Abstract
Die zystische Echinokokkose oder Hydatiden-Krankheit ist eine der wichtigsten zoonotischen parasitären Erkrankungen, die durch Echinococcus granulosus , einen kleinen Bandwurm, der im Darm von Hunden untergebracht ist, verursacht wird. Es besteht ein dringender Bedarf an angewandter genetischer Forschung, um die Mechanismen der Pathogenese und der Krankheitsbekämpfung und -prävention zu verstehen. Das Fehlen eines effektiven Genbewertungssystems behindert jedoch die direkte Interpretation der funktionellen Genetik von Cestodparasiten, einschließlich der Echinococcus-Spezies . Die vorliegende Studie zeigt das Potenzial der transienten Transduktion des lentiviralen Gens in den Metazestoden und strobilierten Formen von E. granulosus. Protoscoleces (PSCs) wurden aus Hydatidenzysten isoliert und auf spezifische biphasische Kulturmedien übertragen, um sich zu strobilierten Würmern zu entwickeln. Die Würmer wurden mit geerntetem Lentivirus der dritten Generation transfiziert, zusammen mit HEK293T-Zellen als Transduktionsprozesskontrolle. Eine ausgeprägte Fluoreszenz wurde bei den strobierten Würmern über 24 h und 48 h nachgewiesen, was auf eine transiente lentivirale Transduktion in E. granulosus hinweist. Diese Arbeit präsentiert den ersten Versuch einer lentivirusbasierten transienten Transduktion in Bandwürmern und zeigt die vielversprechenden Ergebnisse mit möglichen Implikationen in experimentellen Studien zur Plattwurmbiologie.
Introduction
Die zystische Echinokokkose (CE) ist eine der wichtigsten Helminthenerkrankungen, die durch Echinococcus granulosus, einen kleinen Bandwurm innerhalb der Familie Taeniidae 1,2, verursacht wird. Umfangreiche Studien zur Immundiagnostik und Impfstoffentwicklung für E. granulosus wurden durchgeführt. Unzureichende Kenntnisse über die molekularen Grundlagen der Parasitenbiologie stellen jedoch große Einschränkungen bei der Diagnose, Behandlung und Prävention der Hydatidenkrankheitdar 3,4,5,6.
In den letzten Jahren wurden aufgrund der Entwicklung von Genomsequenzierungs- und transkriptomischen Methoden eine breite Palette von molekularen Studien an Plattwürmern von mehreren Forschungsgruppendurchgeführt 7,8,9. In der Welt der Parasiten sind die Fortschritte in der Gentransfertechnologie bei parasitären Plattwürmern jedoch im Vergleich zu den hochreproduzierbaren transienten Transduktionsmethoden, die für einige Protozoen entwickelt wurden, immer noch begrenzt10,11,12.
Der Einsatz viraler Abgabesysteme hat sich in den letzten zwei Jahrzehnten zu einem wesentlichen Instrument für die Transgenabgabe und Gen-/Proteinuntersuchungen entwickelt13. Lentivirus infiziert sowohl sich teilende als auch nicht teilende Zellen, wodurch es möglich wird, postmitotische Zellen zu infizieren14,15,16. Jüngste Erkenntnisse deuten darauf hin, dass die Verwendung eines Lentivirus-basierten Transduktionssystems in Säugetierzellen das Potenzial bietet, die meisten Einschränkungen früherer Knock-in/Knock-down-Techniken zu überwinden. Das Design und die Konstruktion von lentiviralen Expressionsvektoren mit geeigneten molekularen Markern, wie der GFP-Expression, wurden bereitsbeschrieben 16. Daher untersuchen wir die lentivirale transiente Transduktion eines GFP-Reportergens in den Protoscoleces und strobilierten Würmern von E. granulosus.
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Protocol
Diese Studie wurde vom National Institute for Medical Research Development und dem Research Ethics Review Committee, Nr. 958680, genehmigt. Lentiviren werden als BSL-2-Organismen klassifiziert; Daher wurden alle Laborkulturverfahren in diesem Protokoll unter Verwendung steriler Laborpraktiken durchgeführt und unter einer laminaren Durchflusshaube gemäß den NIH-Richtlinien durchgeführt. Abbildung 1 zeigt eine schematische Darstellung des Studienprotokolls für die verschiedenen E. granulosus-Stadien .
1. Sammeln von Hydatidenzysten
- Sammeln Sie Leberhydatidenzysten von natürlich infizierten Schafen, die routinemäßig in einem Schlachthof geschlachtet werden.
- Sterilisieren Sie die Zystenoberfläche vollständig mit steriler Gaze und 70% Alkohol, bevor Sie die Protoscoleces (PSCs) absaugen.
- Saugen Sie 20-50 ml Hydatidenflüssigkeit in sterile 50 ml konische Röhrchen ab.
- Nach dem Abtropfen die Zyste mit einer scharfen Klinge auslöschen, die Keimschicht in ein steriles konisches 50-ml-Röhrchen überführen und für kurze Zeit (~ 2 min) schütteln, um die Sammlung von PSCs zu erhöhen. Übertragen Sie die Keimschicht zur molekularen Charakterisierung auf ein neues 1,5-ml-Röhrchen.
- Waschen Sie die PSCs 3-5x mit phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS).
- Beobachten Sie die PSCs in 0,1% Eosin für 5 Minuten, um die PSC-Lebensfähigkeit unter einem Lichtmikroskop zu bestimmen. Verwenden Sie PSCs mit einer Lebensfähigkeit von mindestens 95% für die Kultur.
- Behandeln Sie den PSC-Niederschlag mit 2 ml Pepsin (2 mg / ml, pH 2) für 15-20 min.
- Um einzelne PSCs zu isolieren, suspendieren Sie das PSC-Sediment in PBS und leiten Sie es durch zwei Schichten steriler Gaze in ein neues steriles 50 ml konisches Röhrchen.
HINWEIS: Berechnen Sie den Durchschnitt von drei Zählungen auf 50 μL PSC-Sedimenten mit einem Lichtmikroskop. Verwenden Sie für nachfolgende Versuche den geschätzten Wert, um die PSCs/μL zu bestimmen. Jedes Hydatidenzystenisolat sollte auf der Grundlage von Nukleotidpolymorphismen durch molekulare Methoden wie PCR-Sequenzierung17 oder hochauflösende Schmelzkurvenanalyse18 charakterisiert werden.
2. Biphasische Kultivierung von PSCs von E. granulosus , um erwachsene Würmer zu erhalten
HINWEIS: Isolierte PSCs sollten unter sterilen Bedingungen unter einem Laminar-Flow-Schrank der Klasse II kultiviert werden. Bereiten Sie die festen und flüssigen Phasen des biphasischen Kulturmediums separat vor, bevor Sie mit den nächsten Schritten19 fortfahren.
- Bereiten Sie das biphasische Kulturmedium so vor, dass es aus zwei Phasen besteht.
- Für die feste Phase 10 ml Rinderserum in einen 25 ml Kolben geben und bei 76 °C für 20-30 min koagulieren lassen.
- Für die flüssige Phase (modifizierte CMRL) mischen Sie 100 ml hitzeinaktiviertes fetales Kälberserum (FCS), 36 ml 5% Hefeextrakt, 5,6 ml 30% Glucose (in destilliertem Wasser), 1,4 ml 5% Hundegalle in PBS, 20 mM HEPES-Puffer und 10 mMNaHCO 3 in 260 ml CMRL-1066-Medium. Schließlich Penicillin (100 IE / ml) und Streptomycin (100 mg / ml) zu der Mischung hinzufügen.
- 10 ml des flüssigen Phasenmediums in jeden 25 cm2 Kulturkolben geben.
- Geben Sie ~ 5.000 PSCs in den Kulturkolben und geben Sie den Kolben in den CO 2 -Inkubator (37 °C, 5% CO2).
- Nach 24-48 h werden die PSCs in einen neuen Kolben mit der festen Phase (Rinderserum) überführt und 1 ml des gleichen frischen flüssigen Phasenmediums pro Kolben zugegeben. Überführung der Kolben in den CO 2 Inkubator (37 °C, 5 % CO2).
- Ersetzen Sie das Medium alle 5-7 Tage durch frisches flüssiges Phasenmedium, basierend auf Änderungen der Farbe des Kulturmediums und dem geschätzten Anteil differenzierter PSCs.
HINWEIS: Protoscoleces reagieren schnell auf Umweltveränderungen nach der Kultivierung, und die meisten von ihnen werden innerhalb von 2-3 Wochen differenziert. Aufgrund des Verbrauchs von Nährstoffen und des Wachstums und der Entwicklung von Protoscoleces ändert sich der pH-Wert des Kulturmediums und seine Farbe verschiebt sich in Richtung Orange und Gelb.
3. Monophasische Kultivierung von PSCs von E. granulosus
- Stellen Sie sicher, dass die monophasische Kultivierung 24-48 h vor der Transduktion durchgeführt wird.
- Kultur ~ 5.000 PSCs in einem 25 cm2 Kulturkolben mit RPMI und 10% fetalem Rinderserum (FBS).
- Die Kolben bis zur Verwendung in den CO 2 Inkubator (37 °C, 5 % CO2) geben.
4. Zellkultur zur Virusproduktion und -aufbereitung
HINWEIS: Menschliche embryonale Nierenzellen 293T (HEK293T) wurden für die Vektorproduktion vom Pathology and Stem Cell Research Center der Kerman University of Medical Sciences gewonnen.
- Übertragen Sie 5 × 10 5 HEK293T-Zellen in einen 25 cm2-Kolben, der5 ml DMEM mit 10% FBS, 100 U/ml Penicillin und 100 μg/ml Streptomycin enthält.
- Die HEK293T-Zellen bei 37 °C in 5% CO2 inkubieren und alle 48 h im kompletten Kulturmedium passieren. Verwenden Sie schließlich HEK293T-Zellen mit niedriger Passage für die Transduktion20.
5. Produktion und Präparation des Virus mit den lentiviralen Vektoren der dritten Generation
HINWEIS: Der Lentivirus-Vektor pCDH513b (Transfervektor) und PLPII, PLPI und PMD2G (Hilfsvektoren) wurden verwendet, um das GFP-Reporter-Gen zu exprimieren. Siehe Materialtabelle und ergänzende Abbildung S1.
- Tag 1:
- Nach der Trypsinisierung der HEK293T-Zellen21 in 6-Well-Kulturplatten werden 7 × 104 Zellen pro Well mit frischem, antibiotikafreiem DMEM mit 10% FBS ausgesät.
- Verwenden Sie Zellen mit 50% -60% Konfluenz für die Transduktion durch die Calciumphosphatmethode.
- Tag 2:
- Ersetzen Sie das Zellkulturmedium 2-3 h vor dem Experiment durch frisches, antibiotikafreies DMEM mit 2% FBS.
- Mischen Sie in einer 1,5-ml-Röhre die lentiviralen Plasmide der dritten Generation, einschließlich 7 μg/μL pCDH513b (Transfervektor), 4 μg/μL PLPII, 4 μg/μL PLPI und 2 μg/μL PMD2G (Hilfsvektoren).
- HEPES-Puffer (0,28 M NaCl, 0,05 M HEPES und 1,5 mM Na2HPO4; optimaler pH-Bereich, 7,00-7,28) zu der Mischung auf ein Volumen von 422 μL.
- 16 μL 1% Tris-EDTA (TE)-Puffer in die Mischung geben.
- 62 μL 2,5 mM Calciumchlorid in die Röhrchen geben und gut mischen.
- Geben Sie 500 μL 2x HEPES-gepufferte Kochsalzlösung (HBS) zu der Mischung, tropfenweise, innerhalb von 1-2 min mit einer Pasteur-Pipette. Mischen Sie vorsichtig, bis eine halbundurchsichtige Lösung erhalten wird, und inkubieren Sie die Mischung für 20 Minuten bei Raumtemperatur.
- Fügen Sie die Mischung langsam zu jeder Platte hinzu und verteilen Sie sie mit langsamen kreisenden Bewegungen.
- Inkubieren Sie die Platten bei 37 °C in einem 5% CO2 Inkubator und ersetzen Sie das Medium nach 4-6 h durch antibiotikafreies DMEM mit 10% FBS.
- Tag 3:
- Bestätigen Sie die erfolgreiche transiente Transduktion und Zelllebensfähigkeit mit einem inversen Fluoreszenzmikroskop.
- Tag 4:
- Ernten Sie Viren aus dem Kulturmedium, indem Sie den Überstand jedes Brunnens sammeln und bis zur Verwendung bei -70 ° C lagern.
HINWEIS: Geerntete Lentiviren könnten für eine präzise Transfektion konzentriert und titriert werden22.
- Ernten Sie Viren aus dem Kulturmedium, indem Sie den Überstand jedes Brunnens sammeln und bis zur Verwendung bei -70 ° C lagern.
6. Transiente Transduktion verschiedener Stadien von E. granulosus mit dem Virus
- Tag 1:
- Verwenden Sie eine 12-Well-Kulturplatte für den Gentransfer. Kultur 5 × 103-5 × 10 4 HEK293T Zellen in dreifacher Ausfertigung, mit vollständigem DMEM-Medium alsinterner Referenz.
- Kultur 150 frische PSCs in dreifacher Ausfertigung in RPMI und 10% FBS.
- Kultur 30 strobilierte Würmer in dreifacher Ausfertigung in DMEM mit 10% hitzeinaktiviertem FBS.
HINWEIS: Alle Transduktionsmedien müssen antibiotikafrei sein. Bewahren Sie dabei drei unbehandelte Kontrollquellen für HEK293T-Zellen, PSCs und stroboskopierte Würmer auf. - Bereiten Sie eine Mischung aus 1 × 106 Viren mit 4 μg/ml Transfektionsreagenz (siehe Materialtabelle) vor, um die HEK293T-Zellen und verschiedene Stadien des Wurms zu transduzieren.
- Fügen Sie die Mischung langsam zu jeder Platte hinzu und verteilen Sie sie mit langsamen kreisenden Bewegungen. Inkubieren Sie die Platten für 4-6 h in einem CO 2 Inkubator (37 °C, 5% CO2). Ersetzen Sie das Medium für jede Probe durch das gleiche vollständige Kulturmedium, um die toxischen Wirkungen des Transfektionsreagenzes zu minimieren.
- Tag 2:
- Wiederholen Sie die Schritte 6.1.4-6.1.5, um die Effizienz der transienten Transduktion für die HEK293T-Zellen, PSCs und stroboskopierten Würmer zu erhöhen.
- Inkubieren Sie alle Platten für 24-48 h in einem CO2 -Inkubator mit den gleichen Kulturbedingungen basierend auf der Art des Zellmediums.
- Tag 3:
- Überprüfen Sie, ob die Transduktion erfolgreich ist, indem Sie die Fluoreszenzmikroskopie verwenden.
HINWEIS: Erwägen Sie die Verwendung weiterer Bestätigungsassays wie PCR/qPCR 20,23 oder Western Blotting 24-Techniken im Gentransferverfahren.
- Überprüfen Sie, ob die Transduktion erfolgreich ist, indem Sie die Fluoreszenzmikroskopie verwenden.
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Representative Results
Hier beschreiben wir eine schnelle und effiziente transiente Transduktionstechnik in E. granulosus unter Verwendung von lentiviralen Vektoren der dritten Generation. Wir kultivierten PSCs in einem biphasischen Kulturmedium, um strobazierte Würmer zu erhalten, wie zuvor beschrieben25,26. Protoscoleces entwickeln sich nach 6 Wochen in vitro zu strobilierten Würmern. Im biphasischen Kulturmedium wurden verschiedene Stadien von E. granulosus beobachtet, darunter invaginate PSCs (Abbildung 2A), evaginate PSCs (Abbildung 2B) und strobilisierte Würmer mit erster und dritter Proglottidenbildung (Abbildung 2C-E). Protoscoleces und die aus monophasischen bzw. biphasischen Kulturen gewonnenen strobilierten Würmer wurden mit GFP-exprimierenden Lentiviren transfiziert (Abbildung 3). Um Autofluoreszenzeffekte zu vermeiden, wurden mikroskopische Beobachtungen mit der Hintergrundfluoreszenz in allen drei Probengruppen verglichen, und alle Proben oberhalb dieses Hintergrundniveaus wurden als transfiziert betrachtet.
Wir haben die Feldbeleuchtung angepasst und den Verschluss abgesenkt, um eine mögliche Autofluoreszenzemission in den Kontrollproben für jede Behandlung zu verhindern. Wir überprüften dann lentivirale vektorbehandelte Proben, wobei die Grünlichtemission gegen ein Schwarzfeld als effektive transiente Transduktion angesehen wurde. HEK293T-Zellen - der transiente Transduktionsprozess - deutlich exprimiertes GFP (Abbildung 3D). Die erwachsenen Würmer drückten GFP am deutlichsten in der tegumentalen Schicht aus (Abbildung 3F); PSCs zeigten jedoch nach 48 h ein etwas niedrigeres Niveau der GFP-Expression. Einige Zystenflüssigkeitsrückstände und / oder Keimschichtablagerungen um die PSCs verursachten eine gewisse Fluoreszenz im Hintergrund in den transfizierten Proben. Die Intensität der Fluoreszenz in HEK293T-Zellen und strobilierten Würmern nahm nach 24 h und 48 h zu (geringfügige Veränderungen wurden bei PSCs beobachtet).
Abbildung 1: Eine schematische Darstellung des Studienprotokolls. Abkürzung: PSCs = Protoscoleces. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 2: Die verschiedenen Stadien von Echinococcus granulosus im biphasischen Kulturmedium. (A) Invaginate PSCs, (B) evaginate PSCs, (C, D) Würmer im Prozess der Strobilation, (E) Strobilated Würmer mit dritter Proglottidbildung, (F) Würmer in verschiedenen Stadien der Strobilation im Kulturmedium. Maßstabsbalken = 200 μm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 3: Transiente Transduktion verschiedener Stadien von Echinococcus granulosus und der Kontrollzelllinie in der Licht- und Fluoreszenzmikroskopie . (A,D) HEK293T-Zellen als Transduktionsprozesskontrolle, (B, E) Protoscoleces und (C, F) strobilierte Würmer. (G, H, I) Gemischte Licht- und Fluoreszenzmikroskopie. Maßstabsbalken = 50 μm, 100 μm und 500 μm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Ergänzende Abbildung S1: Karte des pCDH-CMV-MCS-EF1-GreenPuro cDNA-Klonierungs- und Expressionsvektors. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.
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Discussion
Das Verständnis der molekularen Grundlagen von Nematoden und Platyhelminthesbiologie ist entscheidend für das Verständnis der Pathogenität zoonotischer Parasiten27. Das Fehlen eines effektiven Genbewertungssystems ist ein großes Hindernis für die direkte Interpretation der funktionellen Genetik von Cestodparasiten, einschließlich Echinococcus-Spezies 12,27. Die vorliegende Studie zeigt das ausgezeichnete Potenzial von Lentivirus in der transienten Transduktion von E. granulosus.
Die lentivirale Transduktion kombiniert die Einfachheit der Verwendung und Geschwindigkeit der transienten Transduktion mit der starken Expression stabiler Zelllinien, um Transgene an Säugetierzellen zu liefern28. Das Hauptziel dieser Arbeit war es, den Prozess der lentiviralen Vektortransduktion zu veranschaulichen, der in der zukünftigen Echinokokkose-Forschung von entscheidender Bedeutung sein wird.
Spezifische kritische Punkte müssen in diesem Protokoll beachtet werden. Aufgrund des Weglassens von Antibiotika im Kulturmedium sollten strenge sterile Arbeitsablaufbedingungen beachtet werden, ohne die nach 24 h mit einer bakteriellen und pilzlichen Kontamination zu rechnen ist. Mikrobielle Kontamination reduziert die Motilität und Lebensfähigkeit der Parasiten, und sowohl transfizierte als auch Kontrollproben gehen nach 72 h verloren.
Die Auswahl der geeigneten Stadien im Lebenszyklus von Platyhelminthen und geeignete Kulturbedingungen sind der Schlüssel zu einer erfolgreichen Gentransduktion12,27. Wir testeten unsere lentivirale Transduktionsmethode in den Metazestoden- und Strobilationsstadien. Die Ergebnisse zeigten, dass strobilisierte Würmer besser auf die transiente Transduktion des Gens ansprachen als die PSCs, was das Ergebnis der umfangreichen tegumentalen Struktur in den strobilierten Formen sein könnte. Aufgrund der Art der lentiviralen Transduktion ist die Fluoreszenzintensität in den multizellulären PSCs und strobillierten Würmern jedoch typischerweise viel niedriger als in einschichtigen HEK293T-Zellen26.
Das Potenzial der Verwendung von Echinococcus als neues Modell bei Plattwürmern zur Untersuchung biologischer Phänomene wird seit langem diskutiert. Daher kann ein besseres Verständnis der Echinococcus-Biologie als Modellorganismus nützlich sein, um die Stammzellforschung zu erweitern und die Genexpression und Evolutionsbiologie anderer Platyhelminthen 8,29,30,31,32 zu regulieren. Es besteht ein dringender Bedarf an angewandter genetischer Forschung auf genomischer und transkriptomischer Ebene für Echinococcus und verschiedene parasitäre und freilebende Plattwurm-Modellsysteme. Daher ebnet die Entwicklung eines effektiven Gentransferprozesses für Bandwürmer den Weg für neue Techniken, wie virusbasiertes Gen-Knock-in oder CRISPR-Cas-vermitteltes Gen-Editing32,33. Diese Arbeit präsentiert die lentivirale Transduktion in einem Bandwurmmodell und zeigt vielversprechende Ergebnisse mit möglichen Auswirkungen auf die Plattwurmbiologie. Es sind jedoch eingehendere Studien erforderlich, um die Methode zu verbessern und die Anwendbarkeit dieser Technik für zukünftige Experimente zu entwickeln.
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Disclosures
Die Autoren haben keine Interessenkonflikte offenzulegen.
Acknowledgments
Die in dieser Veröffentlichung berichtete Forschung wurde vom Elite Researcher Grant Committee unter der Preisnummer 958680 des National Institute for Medical Research Development (NIMAD), Teheran, Iran, unterstützt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 12-well culture plates | SPL Life Sciences | 30012 | |
| 25 cm2 culture flask | SPL Life Sciences | 70325 | |
| 6-well culture plates | SPL Life Sciences | 30006 | |
| Calcium chloride | Sigma-Aldrich | C4901-500G | Working concentration: 2.5 mM |
| CMRL 1066 medium | Thermo Fisher Scientific | 11530037 | |
| CO2 incubator | memmert | ICO150 | |
| D-(+)-Glucose | Sigma-Aldrich | G8270-1KG | |
| DMEM | Life Technology | 12100046 | |
| Dog bile | Isolated from a euthanized dog and sterilized by 0.2 μm syringe filter | ||
| Eosin Y | Sigma-Aldrich | E4009-5G | prepare 0.1% of Eosin for working exclusion test |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | DNAbiotech | DB9723-100ml | Heat inactivation of FBS (30 min in 40 °C) |
| Fetal Calf Serum (FCS) | DNAbiotech | DB9724-100ml | Heat inactivation of FCS (30 min in 40 °C) |
| HEK293T cells | BONbiotech | BN_0012.1.14 | Human embryonic kidney 293T |
| HEPES buffered saline (HBS) | Sigma-Aldrich | 51558-50ML | 2x concentrate |
| Inverted fluorescence microscope | OLYMPUS | IX51 | |
| Penicillin | Sigma-Aldrich | P3032-10MU | Working concentration: 100 IU/mL |
| Pepsin | Roche | 10108057001 | Working concentration: 2 mg/mL, pH 2 |
| Phosphate-buffered saline (PBS) | DNAbiotech | DB0011 | This reagent solve in less than 1 min in D.W |
| Polybrene (Transfection reagent) | Sigma-Aldrich | TR-1003-G | |
| RPMI medium | BioIdea | BI-1006-05 | |
| Sodium bicarbonate (NaHCO3) | Sigma-Aldrich | S5761-1KG | |
| Streptomycin | Sigma-Aldrich | S9137-25G | Working concentration: 100 μg/mL |
| Third-generation lentiviral plasmid (pCDH513b) | SBI System Biosciences (BioCat GmbH) | CD513B-1-SBI | Transfer vector (obtained commercially from Molecular Medicine Research Department of Iranian Academic Center for Education, Culture and Research (ACECR), Mashhad, Iran) |
| Third-generation lentiviral plasmid (pLPI and pLPII) | Invitrogen (Life Technologies) | K4975-00 | Helper vector (obtained commercially from Molecular Medicine Research Department of Iranian Academic Center for Education, Culture and Research (ACECR), Mashhad, Iran) |
| Third-generation lentiviral plasmid (pMD2G) | Addgene | Plasmid 12259 | Helper vector (obtained commercially from Molecular Medicine Research Department of Iranian Academic Center for Education, Culture and Research (ACECR), Mashhad, Iran) |
| Tris/EDTA Buffer (TE) | DNAbiotech | DB9713-100ml | |
| Trypsin | Sigma-Aldrich | T9935-50MG | 1x working solutions (pH 7.4–7.6) |
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