Summary
Descrevemos uma técnica de transdução transitória rápida em diferentes estágios de desenvolvimento do Echinococcus granulosus usando vetores lentivirais de terceira geração.
Abstract
A echinocococose cística ou doença hídátida é uma das doenças parasitárias zoonóticas mais importantes causadas pelo Echinococcus granulosus, uma pequena tênia abrigada no intestino dos caninos. Há uma necessidade urgente de pesquisa genética aplicada para entender os mecanismos da patogênese e controle e prevenção de doenças. No entanto, a falta de um sistema de avaliação genética eficaz impede a interpretação direta da genética funcional dos parasitas cestode, incluindo as espécies de Echinococcus . O presente estudo demonstra o potencial da transdução transitória de genes lentiviral nas formas metacestode e estrobólicas de E. granulosus. Os protoscolés (PSCs) foram isolados de cistos de hidátíndicos e transferidos para meios específicos de cultura bifásica para se desenvolverem em vermes estrofiados. Os vermes foram transfectados com lentivírus de terceira geração colhidos, juntamente com células HEK293T como um controle de processo de transdução. Uma fluorescência pronunciada foi detectada nos vermes estroboscópicos ao longo de 24 h e 48 h, indicando transdução lentiviral transitória em E. granulosus. Este trabalho apresenta a primeira tentativa de transdução transitória baseada em lentivírus em tênias e demonstra os resultados promissores com potenciais implicações em estudos experimentais sobre biologia de vermes planos.
Introduction
A echinocococcose cística (CE) é uma das doenças helmintos mais importantes causadas pelo Echinococcus granulosus, uma pequena tênia dentro da família Taeniidae 1,2. Foram realizados estudos extensivos sobre o desenvolvimento de imunodiagnósticos e vacinas para e. granuloso. No entanto, o conhecimento inadequado sobre a base molecular da biologia dos parasitas apresenta grandes limitações no diagnóstico, manejo e prevenção da doença hídida 3,4,5,6.
Nos últimos anos, devido ao desenvolvimento de sequenciamento de genomas e métodos transcriptômicos, uma ampla gama de estudos moleculares têm sido realizados em flatworms por vários grupos de pesquisa 7,8,9. No entanto, no mundo dos parasitas, os avanços na tecnologia de transferência de genes em flatworms parasitas ainda são limitados em comparação com os métodos de transdução transitório altamente reprodutíveis desenvolvidos para alguns protozoários 10,11,12.
O uso de sistemas de entrega viral emergiu como uma ferramenta essencial para a entrega de transgenes e investigações de genes/proteínas nas últimas duas décadas13. O lentivírus infecta células divisórias e não-divisórias, possibilitando infectar células pós-médicos 14,15,16. Evidências recentes indicam que o uso de um sistema de transdução baseado em lentivírus em células de mamíferos oferece o potencial de superar a maioria das limitações das técnicas anteriores de knock-in/knock-down. O desenho e construção de vetores lentivirais de expressão com marcadores moleculares apropriados, como a expressão GFP, foram descritos anteriormente16. Portanto, avaliamos a transdução transitória lentiviral de um gene repórter GFP nas protoscolés e vermes estroboscópicos de E. granulosus.
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Protocol
Este estudo foi aprovado pelo Instituto Nacional de Desenvolvimento de Pesquisas Médicas e pelo Comitê de Revisão de Ética em Pesquisa, nº 958680. Os lentivírus são classificados como organismos BSL-2; portanto, todos os procedimentos de cultura laboratorial neste protocolo foram realizados utilizando práticas laboratoriais estéreis e conduzidos sob uma coifa de fluxo laminar de acordo com as diretrizes do NIH. A Figura 1 demonstra uma apresentação esquemática do protocolo de estudo para as diferentes etapas de E. granulosus .
1. Coleta de cistos de hidátida
- Recolher cistos de hidátínio hepático de ovelhas naturalmente infectadas rotineiramente abatidos em um matadouro.
- Esterilize completamente a superfície do cisto usando gaze estéril e 70% de álcool antes de aspirar os protoscolés (PSCs).
- Aspire 20-50 mL de fluido de hidátido em tubos cônicos estéreis de 50 mL.
- Depois de drenar, limpe o cisto com uma lâmina afiada, transfira a camada germinal em um tubo cônico estéril de 50 mL e agite-o por um curto período (~2 min) para aumentar a coleta de PSCs. Transfira a camada germinal para um novo tubo de 1,5 mL para caracterização molecular.
- Lave os PSCs 3-5x com soro fisiológico tamponado de fosfato (PBS).
- Observe os PSCs em eosina de 0,1% por 5 minutos para determinar a viabilidade do PSC sob um microscópio leve. Use PSCs com pelo menos 95% de viabilidade para cultura.
- Trate o PSC precipitado com 2 mL de pepsina (2 mg/mL, pH 2) por 15-20 min.
- Para isolar PSCs individuais, resuspenque o sedimento PSC em PBS e passe-o através de duas camadas de gaze estéril em um novo tubo cônico estéril de 50 mL.
NOTA: Calcule a média de três contagens em 50 μL de sedimentos PSC usando um microscópio leve. Para ensaios subsequentes, use o valor estimado para determinar PSCs/μL. Cada isolado de cisto de hídida deve ser caracterizado com base em polimorfismos de nucleotídeos por métodos moleculares, como pcr-sequenciamento17 ou análise de curva de fusão de alta resolução18.
2. Cultivo bifásico de PSCs de E. granulosus para obter vermes adultos
NOTA: Os PSCs isolados devem ser cultivados em condições estéreis sob um gabinete de fluxo laminar Classe II. Prepare as fases sólidas e líquidas do meio de cultura bifásica separadamente antes de prosseguir para os próximos passos19.
- Prepare o meio de cultura bifásica para consistir em duas fases.
- Para a fase sólida, adicione 10 mL de soro bovino a um frasco de 25 mL e deixe-o coagulado a 76 °C por 20-30 min.
- Para a fase líquida (CMRL modificada), misture 100 mL de soro de bezerro fetal inativado a calor (FCS), 36 mL de extrato de levedura de 5%, 5,6 mL de 30% de glicose (em água destilada), 1,4 mL de 5% de bile de cão em PBS, tampão HEPES de 20 mM e 10 mM NaHCO3 em 260 mL de cmrl-1066 médio. Por fim, adicione penicilina (100 UI/mL) e estreptomicina (100 mg/mL) à mistura.
- Adicione 10 mL do meio de fase líquida a cada frasco de culturade 25 cm 2 .
- Adicione ~5.000 PSCs ao frasco de cultura e transfira o frasco para a incubadora de CO2 (37 °C, 5% CO2).
- Após 24-48 h, transfira os PSCs para um novo frasco com a fase sólida (soro bovino) e adicione 1 mL do mesmo meio de fase líquida fresca por frasco. Transfira os frascos para a incubadora de CO2 (37 °C, 5% DE CO2).
- A cada 5 a 7 dias, substitua o meio por meio de fase líquida fresca com base em mudanças na cor do meio de cultura e na proporção estimada de PSCs diferenciados.
NOTA: Os protoscolés respondem rapidamente às mudanças ambientais após serem cultivadas, e a maioria delas sofre diferenciação dentro de 2-3 semanas. Devido ao consumo de nutrientes e ao crescimento e desenvolvimento de protoscolés, o pH do meio cultural muda, e sua cor muda para laranja e amarelo.
3. Cultivo monofásico de PSCs de E. granulosus
- Certifique-se de que o cultivo monofásico seja feito 24-48 h antes da transdução.
- Cultura ~5.000 PSCs em um frasco de cultura de 25 cm2 com RPMI e 10% de soro bovino fetal (FBS).
- Transfira os frascos para a incubadora de CO2 (37 °C, 5% DE CO2) até usar.
4. Cultura celular para produção e preparação de vírus
NOTA: As células de rim embrionário humano 293T (HEK293T) foram obtidas para a produção de vetores do Centro de Pesquisa de Patologia e Células-Tronco da Universidade kerman de Ciências Médicas.
- Transfira 5 ×10 células HEK293T para um frasco de25 cm 2 contendo 5 mL de DMEM com 10% de FBS, penicilina de 100 U/mL e estreptomicina de 100 μg/mL.
- Incubar as células HEK293T a 37 °C em 5% de CO2 e passá-las no meio de cultura completa a cada 48 h. Por fim, use células HEK293T de baixa passagem para transdução20.
5. Produção e preparação do vírus com os vetores lentivirais de terceira geração
NOTA: O vetor de lentivírus pCDH513b (vetor de transferência) e PLPII, PLPI e PMD2G (vetores auxiliares) foram usados para expressar o gene repórter do GFP. Veja a Tabela de Materiais e Figura Suplementar S1.
- Dia 1º:
- Depois de tentar experimentar as células HEK293T21 em placas de cultura de 6 poços, a semente 7 × 104 células por poço com DMEM fresco sem antibióticos contendo 10% de FBS.
- Use células com confluência de 50%-60% para transdução pelo método fosfato de cálcio.
- Dia 2:
- Substitua o meio de cultura celular 2-3 h antes do experimento com DMEM fresco sem antibióticos contendo 2% de FBS.
- Em um tubo de 1,5 mL, misture os plasmídeos lentivirais de terceira geração, incluindo 7 μg/μL pCDH513b (vetor de transferência), 4 μg/μL PLPII, 4 μg/μL PLPI e 2 μg/μL PMD2G (vetores auxiliares).
- Adicione o buffer HEPES (0,28 M NaCl, 0,05 M HEPES e 1,5 mM Na2HPO4; faixa de pH ideal, 7,00-7,28) à mistura a um volume de 422 μL.
- Adicione 16 μL de 1% de tampão Tris-EDTA (TE) à mistura.
- Adicione 62 μL de cloreto de cálcio de 2,5 mM aos tubos e misture bem.
- Adicione 500 μL de soro fisiológico 2x com tampo de HEPES (HBS) à mistura, gota a gota, dentro de 1-2 min usando uma pipeta Pasteur. Misture suavemente até obter uma solução semi-opaca e incubar a mistura por 20 minutos à temperatura ambiente.
- Adicione a mistura a cada prato lentamente e distribua-a com movimentos circulares lentos.
- Incubar as placas a 37 °C em uma incubadora de CO2 de 5% e substituir o meio após 4-6 h por DMEM sem antibióticos contendo 10% de FBS.
- Dia 3:
- Confirme a transdução transitória bem sucedida e a viabilidade celular usando um microscópio de fluorescência invertida.
- Dia 4:
- Colher vírus do meio de cultura coletando o supernanato de cada poço e armazená-los a -70 °C até o uso.
NOTA: As lentivírus colhidas podem ser concentradas e tituladas para transfecção precisa22.
- Colher vírus do meio de cultura coletando o supernanato de cada poço e armazená-los a -70 °C até o uso.
6. Transdução transitória de diferentes estágios de E. granulosus com o vírus
- Dia 1º:
- Use uma placa de cultura de 12 poços para transferência de genes. Cultura 5 × 103-5 × 10 células HEK293T em triplicado, com meio DMEM completo como referência interna.
- Cultura 150 PSCs frescos em triplicado em RPMI e 10% FBS.
- Cultura 30 vermes estrogonofados em triplicado em DMEM contendo FBS 10% inativados pelo calor.
NOTA: Todas as mídias de transdução devem ser livres de antibióticos. Mantenha três poços de controle não tratados para células HEK293T, PSCs e worms estrofes no processo. - Prepare uma mistura de 1 × 106 vírus com reagente de transfecção de 4 μg/mL (ver a Tabela de Materiais) para transduzir as células HEK293T e diferentes estágios do verme.
- Adicione a mistura a cada prato lentamente e distribua-a com movimentos circulares lentos. Incubar as placas por 4-6 h em uma incubadora de CO2 (37 °C, 5% CO2). Substitua o meio por cada amostra pelo mesmo meio de cultura completo para minimizar os efeitos tóxicos do reagente de transfecção.
- Dia 2:
- Repita as etapas 6.1.4-6.1.5 para aumentar a eficiência da transdução transitória para as células HEK293T, PSCs e worms estrofiados.
- Incubar todas as placas por 24-48 h em uma incubadora de CO2 com as mesmas condições de cultura baseadas no tipo de mídia celular.
- Dia 3:
- Verifique se a transdução é bem sucedida usando microscopia de fluorescência.
NOTA: Considere usar outros ensaios confirmatórios como PCR/qPCR20,23 ou ocidentais manchando24 técnicas no procedimento de transferência de genes.
- Verifique se a transdução é bem sucedida usando microscopia de fluorescência.
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Representative Results
Aqui, descrevemos uma técnica de transdução transitória rápida e eficiente em E. granulosus usando vetores lentivirais de terceira geração. Nós cultuamos PSCs em um meio de cultura bifásica para obter vermes estrofes, como descrito anteriormente25,26. Protoscolés se desenvolvem em vermes estrobofâneos após 6 semanas in vitro. Diferentes estágios de E. granulosus foram observados no meio de cultura bifásica, incluindo PSCs invaginados (Figura 2A), PSCs evagidos (Figura 2B) e vermes estrofados com primeira e terceira formação proglottid (Figura 2C-E). Os protoscoleces e os vermes estrogonofados obtidos a partir de culturas monofásicas e bifásicas, respectivamente, foram transfeinados com lentivírus expressos em GFP (Figura 3). Para evitar efeitos de autofluorescência, observações microscópicas foram comparadas com a fluorescência de fundo nos três grupos de amostras, e todas as amostras acima desse nível de fundo foram consideradas transfeminadas.
Ajustamos a iluminação do campo e reduzimos o obturador para evitar qualquer possível emissão de autofluorescência nas amostras de controle para cada tratamento. Verificamos então amostras lentiviras tratadas por vetores, em que a emissão de luz verde contra um campo negro foi considerada transdução transitória eficaz. Células HEK293T - o controle do processo de transdução transitória - claramente expressa GFP (Figura 3D). Os vermes adultos expressaram GFP mais distintamente na camada tegumental (Figura 3F); no entanto, os PSCs demonstraram um nível um pouco mais baixo de expressão GFP após 48 h. Alguns resíduos de fluidos de cisto e/ou detritos de camada germinal ao redor dos PSCs causaram alguma fluorescência ao fundo nas amostras transfeminadas. A intensidade da fluorescência nas células HEK293T e vermes estroboscópicos aumentou após 24 h e 48 h (pequenas alterações foram observadas em PSCs).
Figura 1: Apresentação esquemática do protocolo de estudo. Abreviação: PSCs = protoscoleces. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Os diferentes estágios de Echinococcus granulosus no meio da cultura bifásica. (A) PSCs invaginados, (B) PSCs evagidos, (C, D) vermes no processo de estromabilização, (E) vermes estrogonofeados com terceira formação proglote, (F) vermes em diferentes estágios de estrobilização no meio da cultura. Barras de escala = 200 μm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Transdução transitória de diferentes estágios de Echinococcus granulosus e a linha celular de controle em microscopia de luz e fluorescência. (A,D) células HEK293T como controle de processo de transdução, (B, E) protoscoleces e (C, F) vermes estrobilizados. (G, H, I) Microscopia de luz mista e florescence. Barras de escala = 50 μm, 100 μm e 500 μm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura suplementar S1: Mapa da clonagem cDNA pCDH-CMV-MCS-EF1-GreenPuro cDNA. Clique aqui para baixar este Arquivo.
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Discussion
Compreender a base molecular de nematoides e platyhelminthes biologia é crucial para entender a patogenicidade dos parasitas zoonóticos27. A falta de um sistema de avaliação genética eficaz é um grande obstáculo para a interpretação direta da genética funcional dos parasitas cestode, incluindo a espécie Echinococcus 12,27. O presente estudo demonstra o excelente potencial do lentivírus na transdução transitória de E. granulosus.
A transdução lentiviral combina a simplicidade de uso e a velocidade da transdução transitória com a forte expressão de linhas celulares estáveis para entregar transgenes às células mamíferas28. O principal objetivo deste trabalho foi ilustrar o processo de transdução de vetores lentiviral, que será fundamental no futuro estudo da Echinococcosis.
Pontos críticos específicos devem ser observados neste protocolo. Condições estritas de fluxo de trabalho estéril devem ser observadas devido à omissão de antibióticos no meio da cultura, sem os quais a contaminação bacteriana e fúngica pode ser esperada após as 24 horas. A contaminação microbiana reduz a motilidade e a viabilidade dos parasitas, e amostras transfeccionadas e de controle serão perdidas após 72 h.
Selecionar os estágios apropriados no ciclo de vida de Platyhelminthes e condições de cultura adequadas são fundamentais para a transdução genéticabem sucedida 12,27. Testamos nosso método de transdução lentiviral nos estágios metacestodo e estrogonofe. Os resultados mostraram que os vermes estrobofeinados foram mais responsivos à transdução transitória do gene do que os PSCs, o que pode ser o resultado da extensa estrutura tegumental nas formas estrobofeas. No entanto, devido à natureza da transdução lentiviral, a intensidade da fluorescência nos PSCs multicelulares e vermes estroboscópicos é tipicamente muito menor do que nas células26 da monocamada HEK293T.
O potencial de usar o Echinococcus como um novo modelo em flatworms para estudar fenômenos biológicos tem sido discutido há muito tempo. Portanto, uma melhor compreensão da biologia echinococcus como organismo modelo pode ser útil para expandir a pesquisa de células-tronco e regular a expressão genética e a biologia evolutiva de outros platilhelminths 8,29,30,31,32. Há uma necessidade urgente de pesquisa genética aplicada nos níveis genômico e transcriptômico para echinococcus e vários sistemas modelos de lombrigas parasitárias e livres. Portanto, o desenvolvimento de um processo eficaz de transferência de genes para tênias abre caminho para novas técnicas, como a eliminação de genes baseado em vírus ou a edição de genes mediados por CRISPR-Cas32,33. Este trabalho apresenta transdução lentiviral em um modelo de tênia e demonstra resultados promissores, com potenciais implicações para a biologia da larva plana. No entanto, estudos mais aprofundados são necessários para melhorar o método e desenvolver a aplicabilidade dessa técnica para experimentos futuros.
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Disclosures
Os autores não têm conflitos de interesse para divulgar.
Acknowledgments
A pesquisa relatada nesta publicação foi apoiada pelo Elite Researcher Grant Committee sob o prêmio número 958680 do Instituto Nacional de Desenvolvimento de Pesquisa Médica (NIMAD), Teerã, Irã.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 12-well culture plates | SPL Life Sciences | 30012 | |
| 25 cm2 culture flask | SPL Life Sciences | 70325 | |
| 6-well culture plates | SPL Life Sciences | 30006 | |
| Calcium chloride | Sigma-Aldrich | C4901-500G | Working concentration: 2.5 mM |
| CMRL 1066 medium | Thermo Fisher Scientific | 11530037 | |
| CO2 incubator | memmert | ICO150 | |
| D-(+)-Glucose | Sigma-Aldrich | G8270-1KG | |
| DMEM | Life Technology | 12100046 | |
| Dog bile | Isolated from a euthanized dog and sterilized by 0.2 μm syringe filter | ||
| Eosin Y | Sigma-Aldrich | E4009-5G | prepare 0.1% of Eosin for working exclusion test |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | DNAbiotech | DB9723-100ml | Heat inactivation of FBS (30 min in 40 °C) |
| Fetal Calf Serum (FCS) | DNAbiotech | DB9724-100ml | Heat inactivation of FCS (30 min in 40 °C) |
| HEK293T cells | BONbiotech | BN_0012.1.14 | Human embryonic kidney 293T |
| HEPES buffered saline (HBS) | Sigma-Aldrich | 51558-50ML | 2x concentrate |
| Inverted fluorescence microscope | OLYMPUS | IX51 | |
| Penicillin | Sigma-Aldrich | P3032-10MU | Working concentration: 100 IU/mL |
| Pepsin | Roche | 10108057001 | Working concentration: 2 mg/mL, pH 2 |
| Phosphate-buffered saline (PBS) | DNAbiotech | DB0011 | This reagent solve in less than 1 min in D.W |
| Polybrene (Transfection reagent) | Sigma-Aldrich | TR-1003-G | |
| RPMI medium | BioIdea | BI-1006-05 | |
| Sodium bicarbonate (NaHCO3) | Sigma-Aldrich | S5761-1KG | |
| Streptomycin | Sigma-Aldrich | S9137-25G | Working concentration: 100 μg/mL |
| Third-generation lentiviral plasmid (pCDH513b) | SBI System Biosciences (BioCat GmbH) | CD513B-1-SBI | Transfer vector (obtained commercially from Molecular Medicine Research Department of Iranian Academic Center for Education, Culture and Research (ACECR), Mashhad, Iran) |
| Third-generation lentiviral plasmid (pLPI and pLPII) | Invitrogen (Life Technologies) | K4975-00 | Helper vector (obtained commercially from Molecular Medicine Research Department of Iranian Academic Center for Education, Culture and Research (ACECR), Mashhad, Iran) |
| Third-generation lentiviral plasmid (pMD2G) | Addgene | Plasmid 12259 | Helper vector (obtained commercially from Molecular Medicine Research Department of Iranian Academic Center for Education, Culture and Research (ACECR), Mashhad, Iran) |
| Tris/EDTA Buffer (TE) | DNAbiotech | DB9713-100ml | |
| Trypsin | Sigma-Aldrich | T9935-50MG | 1x working solutions (pH 7.4–7.6) |
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