Summary
Vi beskriver en rask forbigående transduksjonsteknikk i ulike utviklingsstadier av Echinococcus granulosus ved hjelp av tredje generasjons lentivirale vektorer.
Abstract
Cystisk echinococcosis eller hydatid sykdom er en av de viktigste zoonotiske parasittiske sykdommene forårsaket av Echinococcus granulosus, en liten båndorm som ligger i tarmen av hjørnetenner. Det er et presserende behov for anvendt genetisk forskning for å forstå mekanismene for patogenese og sykdomskontroll og forebygging. Mangelen på et effektivt genevalueringssystem hindrer imidlertid direkte tolkning av funksjonell genetikk av cestode parasitter, inkludert Echinococcus-arten . Den nåværende studien viser potensialet for lentiviral gen forbigående transduksjon i metacestod og strobilerte former for E. granulosus. Protoscoleces (PSCs) ble isolert fra hydatidcyster og overført til spesifikke bifasiske kulturmedier for å utvikle seg til strobilerte ormer. Ormene ble transfektert med høstet tredjegenerasjons lentivirus, sammen med HEK293T-celler som en transduksjonsprosesskontroll. En uttalt fluorescens ble oppdaget i de stromvede ormene over 24 timer og 48 timer, noe som indikerer forbigående lentiviral transduksjon i E. granulosus. Dette arbeidet presenterer det første forsøket på lentivirusbasert forbigående transduksjon i båndmask og demonstrerer de lovende resultatene med potensielle implikasjoner i eksperimentelle studier på flatormbiologi.
Introduction
Cystisk echinococcosis (CE) er en av de viktigste helminth sykdommene forårsaket av Echinococcus granulosus, en liten båndorm i familien Taeniidae 1,2. Det er utført omfattende studier på immunodiagnostisk utvikling og vaksineutvikling for E. granulosus. Imidlertid utgjør utilstrekkelig kunnskap om det molekylære grunnlaget for parasittbiologi store begrensninger i diagnostisering, styring og forebygging av hydatidsykdom 3,4,5,6.
I de senere år, på grunn av utviklingen av genomsekvensering og transkripsjonsmetoder, har det blitt utført et bredt spekter av molekylære studier på flatormer av flere forskningsgrupper 7,8,9. Men i en verden av parasitter er fremskritt innen genoverføringsteknologi i parasittiske flatormer fortsatt begrenset sammenlignet med de svært reproduserbare forbigående transduksjonsmetodene utviklet for noen protozoer 10,11,12.
Bruken av virale leveringssystemer har fremstått som et viktig verktøy for transgene leveranser og gen-/proteinundersøkelser de siste to tiårene13. Lentivirus infiserer både splittende og ikke-splittende celler, og gjør det dermed mulig å infisere postmitotiske celler 14,15,16. Nyere bevis indikerer at bruk av et lentivirusbasert transduksjonssystem i pattedyrceller gir potensial til å overvinne de fleste begrensningene i tidligere knock-in / knock-down teknikker. Design og konstruksjon av uttrykks lentivirale vektorer med passende molekylære markører, som GFP-uttrykk, har blitt beskrevet tidligere16. Derfor evaluerer vi lentiviral forbigående transduksjon av et GFP-reportergen i protoscoleces og strobilerte ormer av E. granulosus.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Denne studien ble godkjent av National Institute for Medical Research Development and the Research Ethics Review Committee, nr. Lentivirus er klassifisert som BSL-2 organismer; Derfor ble alle laboratoriekulturprosedyrer i denne protokollen utført ved hjelp av steril laboratoriepraksis og utført under en laminær strømningshette i henhold til NIH-retningslinjer. Figur 1 viser en skjematisk presentasjon av studieprotokollen for de ulike E. granulosusstadiene .
1. Innsamling av hydatidcyster
- Samle leverhydatidcyster fra naturlig infiserte sauer som rutinemessig slaktes på en abattoir.
- Steriliser cysteoverflaten fullstendig ved hjelp av steril gasbind og 70% alkohol før du aspirerer protoscoleces (PSC).
- Aspirer 20-50 ml hydatidvæske ut i sterile 50 ml koniske rør.
- Etter drenering, flekk ut cysten med et skarpt blad, overfør germinallaget til et sterilt 50 ml konisk rør, og rist det i en kort periode (~ 2 min) for å øke samlingen av PSCer. Overfør germinallaget til et nytt 1,5 ml rør for molekylær karakterisering.
- Vask PSC 3-5x med fosfatbufret saltvann (PBS).
- Vær oppmerksom på PSC-ene i 0,1 % eosin i 5 minutter for å fastslå PSC-levedyktigheten under et lysmikroskop. Bruk PSCer med minst 95 % levedyktighet for kultur.
- Behandle PSC-bunnfallet med 2 ml pepsin (2 mg/ml, pH 2) i 15-20 min.
- For å isolere individuelle PSCer, resuspender PSC-sedimentet i PBS og send det gjennom to lag steril gasbind til et nytt sterilt 50 ml konisk rør.
MERK: Beregn gjennomsnittet av tre tellinger på 50 μL PSC-sedimenter ved hjelp av et lett mikroskop. For senere studier bruker du den estimerte verdien til å bestemme PSCer/μL. Hver hydatidcystisolasjon bør karakteriseres basert på nukleotidpolymorfier ved molekylære metoder, for eksempel PCR-sekvensering17 eller høyoppløselig smeltekurveanalyse18.
2. Bifasisk dyrking av PSCer av E. granulosus for å oppnå voksne ormer
MERK: Isolerte PSCer skal dyrkes under sterile forhold under et laminært strømningsskap klasse II. Forbered de faste og flytende fasene i det bifasiske kulturmediet separat før du går videre til neste trinn19.
- Forbered det bifasiske kulturmediet til å bestå av to faser.
- For den faste fasen, tilsett 10 ml storfeserum i en 25 ml kolbe og la den koagulere ved 76 °C i 20-30 minutter.
- For væskefasen (modifisert CMRL), bland 100 ml varmeinaktivert fosterkalvserum (FCS), 36 ml 5% gjærekstrakt, 5,6 ml 30% glukose (i destillert vann), 1,4 ml 5% hunde galle i PBS, 20 mM HEPES buffer og 10 mM NaHCO3 i 260 ml CMRL-1066 medium. Til slutt tilsett penicillin (100 IE/ml) og streptomycin (100 mg/ml) i blandingen.
- Tilsett 10 ml av væskefasemediet til hver 25 cm2 kulturflaske.
- Tilsett ~5000 PSCer i kulturflasken og overfør kolben til CO 2-inkubatoren (37 °C, 5 % CO2).
- Etter 24-48 timer, overfør PSC-ene til en ny kolbe med den faste fasen (bovint serum) og tilsett 1 ml av samme friske væskefasemedium per kolbe. Overfør kolbeene til CO 2-inkubatoren (37 °C, 5 % CO2).
- Hver 5-7 dager erstatter du mediet med friskt væskefasemedium basert på endringer i fargen på kulturmediet og den estimerte andelen differensierte PSCer.
MERK: Protoscoleces reagerer raskt på miljøendringer etter å ha blitt dyrket, og de fleste av dem gjennomgår differensiering innen 2-3 uker. På grunn av forbruket av næringsstoffer og protoscoleces vekst og utvikling, endres pH i kulturmediet, og fargen skifter mot oransje og gul.
3. Monofasisk dyrking av PSCer av E. granulosus
- Sørg for at monofasisk dyrking gjøres 24-48 timer før transduksjon.
- Kultur ~ 5000 PSCer i en 25 cm2 kulturflaske med RPMI og 10% foster bovint serum (FBS).
- Overfør kolbeene til CO 2-inkubatoren (37 °C, 5 % CO2) til bruk.
4. Cellekultur for virusproduksjon og forberedelse
MERK: Humane embryonale nyre 293T (HEK293T) celler ble oppnådd for vektorproduksjon fra Patologi og Stamcelleforskningssenter, Kerman University of Medical Sciences.
- Overfør 5 × 105 HEK293T celler til en 25 cm2 kolbe som inneholder 5 ml DMEM med 10% FBS, 100 U / ml penicillin og 100 μg / ml streptomycin.
- Inkuber HEK293T-cellene ved 37 °C i 5 % CO2 og før dem inn i hele kulturmediet hver 48. Til slutt, bruk lavpassasje HEK293T celler for transduksjon20.
5. Produksjon og fremstilling av viruset med tredje generasjons lentivirale vektorer
MERK: Lentivirusvektoren pCDH513b (overføringsvektor) og PLPII, PLPI og PMD2G (hjelpervektorer) ble brukt til å uttrykke GFP-reportergenet. Se tabell over materialer og tilleggsfigur S1.
- Dag 1:
- Etter å ha prøvd HEK293T-cellene21 i 6-brønns kulturplater, frø 7 × 104 celler per brønn med fersk antibiotikafri DMEM som inneholder 10% FBS.
- Bruk celler ved 50% -60% samløp for transduksjon ved kalsiumfosfatmetoden.
- Dag 2:
- Bytt ut cellekulturmediet 2-3 timer før eksperimentet med fersk antibiotikafri DMEM som inneholder 2% FBS.
- I et 1,5 ml rør blander du tredje generasjons lentivirale plasmider, inkludert 7 μg/μL pCDH513b (overføringsvektor), 4 μg/μL PLPII, 4 μg/μL PLPI og 2 μg/μL PMD2G (hjelpevektorer).
- Tilsett HEPES-buffer (0,28 M NaCl, 0,05 M HEPES og 1,5 mM Na2HPO4; optimal pH-område, 7,00-7,28) i blandingen til et volum på 422 μL.
- Tilsett 16 μL 1 % Tris-EDTA (TE)-buffer i blandingen.
- Tilsett 62 μL 2,5 mM kalsiumklorid til rørene og bland godt.
- Tilsett 500 μL 2x HEPES-bufret saltvann (HBS) i blandingen, dråpe for dråpe, innen 1-2 min ved hjelp av en Pasteur pipette. Bland forsiktig til en semi-ugjennomsiktig løsning oppnås, og inkuber blandingen i 20 minutter ved romtemperatur.
- Tilsett blandingen langsomt til hver plate og fordel den med langsomme sirkulære bevegelser.
- Inkuber platene ved 37 °C i en 5 % CO 2-inkubator og skift ut mediet etter 4-6 timer med antibiotikafri DMEM som inneholder 10 % FBS.
- Dag 3:
- Bekreft vellykket forbigående transduksjon og celle levedyktighet ved hjelp av et invertert fluorescensmikroskop.
- Dag 4:
- Høst virus fra kulturmediet ved å samle hver brønns supernatant og lagre dem ved -70 °C til bruk.
MERK: Høstede lentivirus kan konsentreres og titreres for presis transfeksjon22.
- Høst virus fra kulturmediet ved å samle hver brønns supernatant og lagre dem ved -70 °C til bruk.
6. Forbigående transduksjon av ulike stadier av E. granulosus med viruset
- Dag 1:
- Bruk en 12-brønns kulturplate for genoverføring. Kultur 5 × 103-5 × 104 HEK293T celler i triplikat, med komplett DMEM medium som intern referanse.
- Kultur 150 ferske PSCer i triplikat i RPMI og 10% FBS.
- Kultur 30 strobilerte ormer i triplikat i DMEM som inneholder 10% varmeinaktivert FBS.
MERK: Alle transduksjonsmedier må være antibiotikafrie. Hold tre ikke-behandlede kontrollbrønner for HEK293T-celler, PSCer og strobilerte ormer i prosessen. - Forbered en blanding av 1 × 106 virus med 4 μg/ml transfeksjonsreagens (se materialtabellen) for å transdusere HEK293T-cellene og forskjellige stadier av ormen.
- Tilsett blandingen langsomt til hver plate og fordel den med langsomme sirkulære bevegelser. Inkuber platene i 4-6 timer i en CO 2-inkubator (37 °C, 5 % CO2). Bytt ut mediet for hver prøve med samme komplette kulturmedium for å minimere de toksiske effektene av transfeksjonsreagenset.
- Dag 2:
- Gjenta trinn 6.1.4-6.1.5 for å øke effektiviteten til forbigående transduksjon for HEK293T-cellene, PSC-ene og desbilerte ormene.
- Inkuber alle platene i 24-48 timer i en CO 2-inkubator med samme kulturforhold basert på typen cellemedier.
- Dag 3:
- Kontroller om transduksjonen er vellykket ved å bruke fluorescensmikroskopi.
MERK: Vurder å bruke ytterligere bekreftende analyser som PCR/qPCR20,23 eller Western blotting24 teknikker i genoverføringsprosedyren.
- Kontroller om transduksjonen er vellykket ved å bruke fluorescensmikroskopi.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Her beskriver vi en rask og effektiv forbigående transduksjonsteknikk i E. granulosus ved hjelp av tredje generasjons lentivirale vektorer. Vi dyrket PSCer i et bifasisk kulturmedium for å oppnå strobilerte ormer, som beskrevet tidligere25,26. Protoscoleces utvikler seg til strobilerte ormer etter 6 uker in vitro. Ulike stadier av E. granulosus ble observert i det bifasiske kulturmediet, inkludert invaginerte PSCer (figur 2A), evaginerte PSCer (figur 2B) og strobilerte ormer med første og tredje proglottiddannelse (figur 2C-E). Protoscoleces og de strobilerte ormene hentet fra henholdsvis monofasiske og bifasiske kulturer ble transfektert med GFP-uttrykkende lentivirus (figur 3). For å unngå autofluorescenseffekter ble mikroskopiske observasjoner sammenlignet med bakgrunnsfluorescens i alle tre gruppene av prøver, og alle prøver over dette bakgrunnsnivået ble ansett som transfekterte.
Vi justerte feltbelysningen og senket lukkeren for å forhindre mulig autofluorescensutslipp i kontrollprøvene for hver behandling. Deretter sjekket vi lentivirale vektorbehandlede prøver, der grønt lysutslipp mot et svart felt ble ansett som effektiv forbigående transduksjon. HEK293T celler - den forbigående transduksjonsprosessen kontroll-tydelig uttrykt GFP (Figur 3D). De voksne ormene uttrykte GFP mest tydelig i det tegumentale laget (figur 3F); PSCer viste imidlertid et noe lavere nivå av GFP-uttrykk etter 48 timer. Noen cystevæskerester og/eller germinallagrester rundt PSC-ene forårsaket noe fluorescens i bakgrunnen i de transfiserte prøvene. Intensiteten av fluorescens i HEK293T-celler og strobilerte ormer økte etter 24 timer og 48 timer (mindre endringer ble observert i PSCer).
Figur 1: En skjematisk presentasjon av studieprotokollen. Forkortelse: PSCer = protoscoleces. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: De ulike stadiene av Echinococcus granulosus i bifasisk kulturmedium. (A) Invaginerte PSCer, (B) evaginerte PSCer, (C, D) ormer i ferd med strobilasjon, (E) strobilerte ormer med tredje proglottiddannelse, (F) ormer i forskjellige stadier av strobilasjon i kulturmediet. Skalastenger = 200 μm. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: Forbigående transduksjon av ulike stadier av Echinococcus granulosus og kontrollcellelinjen i lys- og fluorescensmikroskopi. (A,D) HEK293T-celler som transduksjonsprosesskontroll, (B, E) protoscoleces og (C, F) strobilerte ormer. (G, H, I) Blandet lys og florescensmikroskopi. Skalastenger = 50 μm, 100 μm og 500 μm. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Supplerende figur S1: Kart over pCDH-CMV-MCS-EF1-GreenPuro cDNA kloning og uttrykksvektor. Klikk her for å laste ned denne filen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Å forstå det molekylære grunnlaget for nematoder og Platyhelminthes biologi er avgjørende for å forstå patogeniteten til zoonotiske parasitter27. Mangelen på et effektivt genevalueringssystem er et stort hinder for direkte tolkning av funksjonell genetikk av cestodparasitter, inkludert Echinococcus art12,27. Den nåværende studien viser det utmerkede potensialet for lentivirus i E. granulosus forbigående transduksjon.
Lentiviral transduksjon kombinerer enkelheten i bruk og hastigheten på forbigående transduksjon med det sterke uttrykket av stabile cellelinjer for å levere transgenes til pattedyrceller28. Hovedmålet med dette arbeidet var å illustrere prosessen med lentiviral vektortransduksjon, som vil være kritisk i fremtidig Echinococcosis forskning.
Bestemte kritiske punkter må noterres i denne protokollen. Strenge sterile arbeidsflytforhold bør observeres på grunn av utelatelse av antibiotika i kulturmediet, uten hvilken bakteriell og soppforurensning kan forventes etter 24 timer. Mikrobiell forurensning reduserer parasittenes motilitet og levedyktighet, og både transfekterte og kontrollprøver vil gå tapt etter 72 timer.
Å velge de riktige stadiene i platyhelminthes livssyklus og egnede kulturforhold er nøkkelen til vellykket gentransduksjon 12,27. Vi testet vår lentivirale transduksjonsmetode i metacestod og strobilerte stadier. Resultatene viste at strobilerte ormer var mer lydhøre for forbigående transduksjon av genet enn PSC-ene, noe som kan være et resultat av den omfattende tegumentale strukturen i de stromerte formene. På grunn av arten av lentiviral transduksjon er fluorescensintensiteten i multicellulære PSCer og strobilerte ormer vanligvis mye lavere enn i monolayer HEK293T-cellene26.
Potensialet for å bruke Echinococcus som en ny modell i flatorm for å studere biologiske fenomener har lenge vært diskutert. Derfor kan en bedre forståelse av Echinococcus biologi som modellorganisme være nyttig for å utvide stamcelleforskning og regulere genuttrykket og evolusjonsbiologien til andre platyhelminther 8,29,30,31,32. Det er et presserende behov for anvendt genetisk forskning på genomiske og transkripsjonsnivåer for Echinococcus og ulike parasittiske og frittlevende flatormmodellsystemer. Derfor baner utvikling av en effektiv genoverføringsprosess for båndmask veien for nye teknikker, for eksempel virusbasert gen-knock-in eller CRISPR-Cas-mediert genredigering32,33. Dette arbeidet presenterer lentiviral transduksjon i en båndormmodell og demonstrerer lovende resultater, med potensielle implikasjoner for flatormbiologi. Imidlertid kreves det mer dyptgående studier for å forbedre metoden og utvikle anvendelsen av denne teknikken for fremtidige eksperimenter.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingen interessekonflikter å avsløre.
Acknowledgments
Forskning rapportert i denne publikasjonen ble støttet av Elite Researcher Grant Committee under tildelingsnummer 958680 fra National Institute for Medical Research Development (NIMAD), Teheran, Iran.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 12-well culture plates | SPL Life Sciences | 30012 | |
| 25 cm2 culture flask | SPL Life Sciences | 70325 | |
| 6-well culture plates | SPL Life Sciences | 30006 | |
| Calcium chloride | Sigma-Aldrich | C4901-500G | Working concentration: 2.5 mM |
| CMRL 1066 medium | Thermo Fisher Scientific | 11530037 | |
| CO2 incubator | memmert | ICO150 | |
| D-(+)-Glucose | Sigma-Aldrich | G8270-1KG | |
| DMEM | Life Technology | 12100046 | |
| Dog bile | Isolated from a euthanized dog and sterilized by 0.2 μm syringe filter | ||
| Eosin Y | Sigma-Aldrich | E4009-5G | prepare 0.1% of Eosin for working exclusion test |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | DNAbiotech | DB9723-100ml | Heat inactivation of FBS (30 min in 40 °C) |
| Fetal Calf Serum (FCS) | DNAbiotech | DB9724-100ml | Heat inactivation of FCS (30 min in 40 °C) |
| HEK293T cells | BONbiotech | BN_0012.1.14 | Human embryonic kidney 293T |
| HEPES buffered saline (HBS) | Sigma-Aldrich | 51558-50ML | 2x concentrate |
| Inverted fluorescence microscope | OLYMPUS | IX51 | |
| Penicillin | Sigma-Aldrich | P3032-10MU | Working concentration: 100 IU/mL |
| Pepsin | Roche | 10108057001 | Working concentration: 2 mg/mL, pH 2 |
| Phosphate-buffered saline (PBS) | DNAbiotech | DB0011 | This reagent solve in less than 1 min in D.W |
| Polybrene (Transfection reagent) | Sigma-Aldrich | TR-1003-G | |
| RPMI medium | BioIdea | BI-1006-05 | |
| Sodium bicarbonate (NaHCO3) | Sigma-Aldrich | S5761-1KG | |
| Streptomycin | Sigma-Aldrich | S9137-25G | Working concentration: 100 μg/mL |
| Third-generation lentiviral plasmid (pCDH513b) | SBI System Biosciences (BioCat GmbH) | CD513B-1-SBI | Transfer vector (obtained commercially from Molecular Medicine Research Department of Iranian Academic Center for Education, Culture and Research (ACECR), Mashhad, Iran) |
| Third-generation lentiviral plasmid (pLPI and pLPII) | Invitrogen (Life Technologies) | K4975-00 | Helper vector (obtained commercially from Molecular Medicine Research Department of Iranian Academic Center for Education, Culture and Research (ACECR), Mashhad, Iran) |
| Third-generation lentiviral plasmid (pMD2G) | Addgene | Plasmid 12259 | Helper vector (obtained commercially from Molecular Medicine Research Department of Iranian Academic Center for Education, Culture and Research (ACECR), Mashhad, Iran) |
| Tris/EDTA Buffer (TE) | DNAbiotech | DB9713-100ml | |
| Trypsin | Sigma-Aldrich | T9935-50MG | 1x working solutions (pH 7.4–7.6) |
References
- Deplazes, P., et al. Global distribution of alveolar and cystic echinococcosis. Advances in Parasitology. 95, 315 (2017).
- Borhani, M., et al. Echinococcoses in Iran, Turkey, and Pakistan: Old diseases in the new millennium. Clinical Microbiology Reviews. 34 (3), 0029020 (2021).
- Eckert, J., Thompson, R. C. A.
- Romig, T., et al. Ecology and life cycle patterns of Echinococcus species. Advances in Parasitology. 95, 213 (2017).
- Craig, P. S., Hegglin, D., Lightowlers, M. W., Torgerson, P. R., Wang, Q.
- Deplazes, P., et al. Global distribution of alveolar and cystic echinococcosis. Advances in Parasitology. 95 (1), 315 (2017).
- Tsai, I. I. J., et al. The genomes of four tapeworm species reveal adaptations to parasitism. Nature. 496 (7443), 57-63 (2013).
- Koziol, U., Brehm, K. Recent advances in Echinococcus genomics and stem cell research. Veterinary Parasitology. 213 (3-4), 92-102 (2015).
- Zheng, H., et al. The genome of the hydatid tapeworm Echinococcus granulosus. Nature Genetics. 45 (10), 1168-1175 (2013).
- Pérez-Victoria, J. M., Torres, A. P. T. C., Gamarro, F., Castanys, S. ABC transporters in the protozoan parasite Leishmania. International Microbiology. 4 (3), 159-166 (2001).
- Ehrenkaufer, G. M., Singh, U. Transient and stable transfection in the protozoan parasite Entamoeba invadens. Molecular and Biochemical Parasitology. 184 (1), 59-62 (2012).
- Moguel, B., Bobes, R. J., Carrero, J. C., Laclette, J. P.
- Tang, Y., Garson, K., Li, L., Vanderhyden, B. C. Optimization of lentiviral vector production using polyethylenimine-mediated transfection. Oncology Letters. 9 (1), 55-62 (2015).
- Mann, V. H., Suttiprapa, S., Rinaldi, G., Brindley, P. J.
- Balcaitis, S., Weinstein, J. R., Li, S., Chamberlain, J. S., Möller, T.
- Sastry, L., Johnson, T., Hobson, M. J., Smucker, B., Cornetta, K. Titering lentiviral vectors: comparison of DNA, RNA and marker expression methods. Gene Therapy. 9 (17), 1155-1162 (2002).
- Bowles, J., Blair, D., McManus, D. P. Genetic variants within the genus Echinococcus identified by mitochondrial DNA sequencing. Molecular and Biochemical Parasitology. 54 (2), 165-173 (1992).
- Rostami, S., et al. High resolution melting technique for molecular epidemiological studies of cystic echinococcosis: differentiating G1, G3, and G6 genotypes of Echinococcus granulosus sensu lato. Parasitology Research. 112 (10), 3441-3447 (2013).
- Mousavi, S. M., et al. Biological and morphological consequences of dsRNA-induced suppression of tetraspanin mRNA in developmental stages of Echinococcus granulosus. Parasites and Vectors. 13 (1), 190 (2020).
- Afgar, A., et al. MiR-339 and especially miR-766 reactivate the expression of tumor suppressor genes in colorectal cancer cell lines through DNA methyltransferase 3B gene inhibition. Cancer Biology & Therapy. 17 (11), 1126-1138 (2016).
- Ricardo, R., Phelan, K. Trypsinizing and subculturing mammalian cells. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (16), e755 (2008).
- Wang, X., McManus, M.
- Li, M., Husic, N., Lin, Y., Snider, B. J. Production of lentiviral vectors for transducing cells from the central nervous system. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (63), e4031 (2012).
- Eslami, A., Lujan, J. Western blotting: sample preparation to detection. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (44), e2359 (2010).
- Dezaki, E. S., et al. Comparison of ex vivo harvested and in vitro cultured materials from Echinococcus granulosus by measuring expression levels of five genes putatively involved in the development and maturation of adult worms. Parasitology Research. 115 (11), 4405-4416 (2016).
- Mousavi, S. M., et al. Calmodulin-specific small interfering RNA induces consistent expression suppression and morphological changes in Echinococcus granulosus. Scientific Reports. 9 (1), 1-9 (2019).
- Aboobaker, A. A., Blaxter, M. L. Functional genomics for parasitic nematodes and platyhelminths. Trends in Parasitology. 20 (4), 178-184 (2004).
- Elegheert, J., et al. Lentiviral transduction of mammalian cells for fast, scalable and high-level production of soluble and membrane proteins. Nature Protocols. 13 (12), 2991 (2018).
- Mizukami, C., et al. Gene silencing in Echinococcus multilocularis protoscoleces using RNA interference. Parasitology International. 59 (4), 647-652 (2010).
- Thompson, R. C. A., Jenkins, D. J. Echinococcus as a model system: biology and epidemiology. International Journal for Parasitology. 44 (12), 865-877 (2014).
- Thompson, R. C. A. Biology and systematics of Echinococcus. Advances in Parasitology. Thompson, R. C. A., Deplazes, P., Lymbery, A. J. 95, 65-109 (2017).
- Brehm, K., Koziol, U. Echinococcus-host interactions at cellular and molecular levels. Advances in Parasitology. 95, 147-212 (2017).
- Moguel, B., et al. Transient transgenesis of the tapeworm Taenia crassiceps. SpringerPlus. 4, 496 (2015).
