Summary
Üçüncü nesil lentiviral vektörler kullanılarak Echinococcus granulosus'un farklı gelişim evrelerinde hızlı geçici transdüksiyon tekniğini tanımladık.
Abstract
Kistik ekinokokkozis veya hidatik hastalık, köpeklerin bağırsağında bulunan küçük bir tenya olan Echinococcus granulosus'un neden olduğu en önemli zoonotik paraziter hastalıklardan biridir. Patogenezin ve hastalık kontrol ve korunma mekanizmalarının anlaşılması için uygulanan genetik araştırmalara acil ihtiyaç vardır. Bununla birlikte, etkili bir gen değerlendirme sisteminin olmaması, Echinococcus türleri de dahil olmak üzere cestod parazitlerinin fonksiyonel genetiğinin doğrudan yorumlanmasını engellemektedir. Bu çalışma, E. granulosus'un metacestod ve strobile formlarında lentiviral gen geçici transdüksiyonunun potansiyelini göstermektedir. Protoskoleces (PSC'ler) hidatik kistlerden izole edildi ve strobile solucanlara dönüşmek üzere spesifik bifazik kültür ortamına aktarıldı. Solucanlar, bir transdüksiyon süreci kontrolü olarak HEK293T hücreleri ile birlikte hasat edilmiş üçüncü nesil lentivirüs ile transfekte edildi. Strobillenmiş solucanlarda 24 saat ve 48 saat boyunca belirgin bir floresan tespit edildi ve bu da E. granulosus'ta geçici lentiviral transdüksiyonu gösterdi. Bu çalışma, tenyalarda lentivirüs bazlı geçici transdüksiyona yönelik ilk girişimi sunmakta ve yassı solucan biyolojisi üzerine yapılan deneysel çalışmalarda potansiyel etkileri olan umut verici sonuçları göstermektedir.
Introduction
Kistik ekinokokkozis (CE), Taeniidae 1,2 familyasında küçük bir tenya olan Echinococcus granulosus'un neden olduğu en önemli helmint hastalıklarından biridir. E. granulosus için immünodiagnostik ve aşı geliştirme konusunda kapsamlı çalışmalar yapılmıştır. Ancak parazit biyolojisinin moleküler temeli hakkında yetersiz bilgi sahibi olmak, hidatik hastalığının tanı, yönetim ve önlenmesinde önemli sınırlamalar getirmektedir 3,4,5,6.
Son yıllarda, genom dizilimi ve transkriptomik yöntemlerin gelişmesi nedeniyle, çeşitli araştırma grupları 7,8,9 tarafından yassı solucanlar üzerinde çok çeşitli moleküler çalışmalar yapılmıştır. Bununla birlikte, parazitler dünyasında, parazitik yassı solucanlarda gen transfer teknolojisindeki ilerlemeler, bazı protozoalar10,11,12 için geliştirilen yüksek oranda tekrarlanabilir geçici transdüksiyon yöntemleriyle karşılaştırıldığında hala sınırlıdır.
Viral dağıtım sistemlerinin kullanımı, son yirmi yılda transgen dağıtımı ve gen / protein araştırmaları için gerekli bir araç olarak ortaya çıkmıştır13. Lentivirus hem bölünen hem de bölünmeyen hücreleri enfekte eder, böylece postmitotik hücreleri enfekte etmeyi mümkün kılar14,15,16. Son kanıtlar, memeli hücrelerinde lentivirüs tabanlı bir transdüksiyon sistemi kullanmanın, önceki knock-in / knock-down tekniklerinin sınırlamalarının çoğunun üstesinden gelme potansiyeli sunduğunu göstermektedir. GFP ekspresyonu gibi uygun moleküler belirteçlere sahip ekspresyon lentiviral vektörlerinin tasarımı ve yapımı daha önce16 olarak tanımlanmıştır. Bu nedenle, E. granulosus'un protoskolekslerinde ve strobilated solucanlarında GFP muhabir geninin lentiviral geçici transdüksiyonunu değerlendiriyoruz.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Bu çalışma, Ulusal Tıbbi Araştırma Geliştirme Enstitüsü ve Araştırma Etiği İnceleme Komitesi, No. 958680 tarafından onaylanmıştır. Lentivirüsler BSL-2 organizmaları olarak sınıflandırılır; Bu nedenle, bu protokoldeki tüm laboratuvar kültürü prosedürleri steril laboratuvar uygulamaları kullanılarak gerçekleştirilmiş ve NIH kılavuzlarına göre laminer bir akış başlığı altında yürütülmüştür. Şekil 1 , farklı E. granulosus aşamaları için çalışma protokolünün şematik bir sunumunu göstermektedir.
1. Kist hidatik toplanması
- Bir mezbahada rutin olarak kesilen doğal olarak enfekte olmuş koyunlardan karaciğer hidatik kistlerini toplayın.
- Protoskolesleri (PSC'ler) aspire etmeden önce steril gazlı bez ve% 70 alkol kullanarak kist yüzeyini tamamen sterilize edin.
- 20-50 mL hidatit sıvısını steril 50 mL konik tüplere aspire edin.
- Boşalttıktan sonra, kisti keskin bir bıçakla lekeleyin, germinal tabakayı steril bir 50 mL konik tüpe aktarın ve PSC'lerin toplanmasını arttırmak için kısa bir süre (~ 2 dakika) sallayın.
- PSC'leri 3-5x fosfat tamponlu salin (PBS) ile yıkayın.
- Bir ışık mikroskobu altında PSC'nin yaşayabilirliğini belirlemek için PSC'leri 5 dakika boyunca %0,1 eozin içinde gözlemleyin. Kültür için en az %95 uygulanabilirliğe sahip PSC'ler kullanın.
- PSC çökeltiyi 15-20 dakika boyunca 2 mL pepsin (2 mg / mL, pH 2) ile tedavi edin.
- Tek tek PSC'leri izole etmek için, PBS'deki PSC tortusunu yeniden askıya alın ve iki kat steril gazlı bezden yeni bir steril 50 mL konik tüpe geçirin.
NOT: Bir ışık mikroskobu kullanarak 50 μL PSC tortuları üzerinde ortalama üç sayım hesaplayın. Sonraki denemelerde, PSC'leri/μL'yi belirlemek için tahmini değeri kullanın. Her bir kist hidatik izolatı, PCR dizilimi17 veya yüksek çözünürlüklü erime eğrisi analizi18 gibi moleküler yöntemlerle nükleotid polimorfizmlerine dayanarak karakterize edilmelidir.
2. Yetişkin solucanlar elde etmek için E. granulosus'un PSC'lerinin bifazik yetiştiriciliği
NOT: İzole PSC'ler, laminer akış kabini Sınıf II altında steril koşullarda kültürlenmelidir. Sonraki adımlara geçmeden önce bifazik kültür ortamının katı ve sıvı fazlarını ayrı ayrı hazırlayın19.
- Bifazik kültür ortamını iki aşamadan oluşacak şekilde hazırlayın.
- Katı faz için, 25 mL'lik bir şişeye 10 mL sığır serumu ekleyin ve 20-30 dakika boyunca 76 ° C'de pıhtılaşmaya bırakın.
- Sıvı faz (modifiye CMRL) için, 100 mL ısıyla inaktive edilmiş fetal buzağı serumu (FCS), 36 mL% 5 maya ekstresi, 5.6 mL% 30 glikoz (damıtılmış suda), PBS'de 1.4 mL% 5 köpek safrası, 20 mM HEPES tamponu ve 260 mL CMRL-1066 ortamında 10 mM NaHCO3 karıştırın. Son olarak, karışıma penisilin (100 IU / mL) ve streptomisin (100 mg / mL) ekleyin.
- Her 25cm2 kültür şişesine 10 mL sıvı faz ortamı ekleyin.
- Kültür şişesine ~5.000 PSC ekleyin ve şişeyi CO 2 inkübatörüne aktarın (37 °C, %5 CO2).
- 24-48 saat sonra, PSC'leri katı fazlı (sığır serumu) yeni bir şişeye aktarın ve şişe başına aynı taze sıvı faz ortamından 1 mL ekleyin. Şişeleri CO 2 inkübatörüne aktarın (37 °C, %5 CO2).
- Her 5-7 günde bir, kültür ortamının rengindeki değişikliklere ve farklılaştırılmış PSC'lerin tahmini oranına bağlı olarak ortamı taze sıvı faz ortamı ile değiştirin.
NOT: Protoscoleces kültürlendikten sonra çevresel değişikliklere hızlı bir şekilde tepki verir ve çoğu 2-3 hafta içinde farklılaşır. Besin maddelerinin tüketimi ve protoscoleces'in büyümesi ve gelişmesi nedeniyle, kültür ortamının pH'ı değişir ve rengi turuncu ve sarıya doğru kayar.
3. E. granulosus'un PSC'lerinin monofazik yetiştiriciliği
- Monofazik ekimin transdüksiyondan 24-48 saat önce yapıldığından emin olun.
- RPMI ve% 10 fetal sığır serumu (FBS) ile25 cm2'lik bir kültür şişesinde kültür ~ 5.000 PSC.
- Şişeleri kullanıma kadar CO 2 inkübatörüne (37 °C, %5 CO2) aktarın.
4. Virüs üretimi ve hazırlanması için hücre kültürü
NOT: Kerman Tıp Bilimleri Üniversitesi Patoloji ve Kök Hücre Araştırma Merkezi'nden vektör üretimi için insan embriyonik böbrek 293T (HEK293T) hücreleri elde edilmiştir.
- 5 × 105 HEK293T hücresini, %10 FBS, 100 U/mL penisilin ve 100 μg/mL streptomisin içeren 5 mL DMEM içeren25 cm2'lik bir şişeye aktarın.
- HEK293T hücrelerini 37 ° C'de% 5 CO2'de inkübe edin ve her 48 saatte bir tam kültür ortamında geçirin. Son olarak, transdüksiyon20 için düşük pasajlı HEK293T hücreleri kullanın.
5. Üçüncü nesil lentiviral vektörlerle virüsün üretimi ve hazırlanması
NOT: GFP muhabir genini eksprese etmek için lentivirüs vektörü pCDH513b (transfer vektörü) ve PLPII, PLPI ve PMD2G (yardımcı vektörler) kullanılmıştır. Bkz. Malzeme tablosu ve Ek Şekil S1.
- 1. Gün:
- HEK293T hücreleri21'i 6 kuyucuklu kültür plakalarında tripsinize ettikten sonra, tohum 7 ×% 10 FBS içeren taze antibiyotik içermeyen DMEM ile kuyu başına 10 4 hücre.
- Kalsiyum fosfat yöntemi ile transdüksiyon için% 50-60 akıcılıkta hücreler kullanın.
- 2. Gün:
- Deneyden 2-3 saat önce hücre kültürü ortamını % 2 FBS içeren taze antibiyotik içermeyen DMEM ile değiştirin.
- 1,5 mL'lik bir tüpte, 7 μg/μL pCDH513b (transfer vektörü), 4 μg/μL PLPII, 4 μg/μL PLPI ve 2 μg/μL PMD2G (yardımcı vektörler) dahil olmak üzere üçüncü nesil lentiviral plazmidleri karıştırın.
- Karışıma HEPES tamponunu (0,28 M NaCl, 0,05 M HEPES ve 1,5 mM Na2HPO4; optimum pH aralığı, 7,00-7,28) 422 μL'lik bir hacme ekleyin.
- Karışıma 16 μL %1 Tris-EDTA (TE) tamponu ekleyin.
- Tüplere 62 μL 2,5 mM kalsiyum klorür ekleyin ve iyice karıştırın.
- Bir Pasteur pipeti kullanarak karışıma 500 μL 2x HEPES-tamponlu salin (HBS) ekleyin, damla damla, damla damla. Yarı opak bir çözelti elde edilene kadar hafifçe karıştırın ve karışımı oda sıcaklığında 20 dakika inkübe edin.
- Karışımı her plakaya yavaşça ekleyin ve yavaş dairesel hareketlerle dağıtın.
- Plakaları% 5 CO2 inkübatöründe 37 ° C'de inkübe edin ve 4-6 saat sonra ortamı % 10 FBS içeren antibiyotiksiz DMEM ile değiştirin.
- 3. Gün:
- Ters çevrilmiş floresan mikroskobu kullanarak başarılı geçici transdüksiyonu ve hücre canlılığını onaylayın.
- 4. Gün:
- Her bir kuyucuğun süpernatantını toplayarak virüsleri kültür ortamından toplayın ve kullanıma kadar -70 ° C'de saklayın.
NOT: Hasat edilen lentivirüsler konsantre edilebilir ve hassas transfeksiyon için titre edilebilir22.
- Her bir kuyucuğun süpernatantını toplayarak virüsleri kültür ortamından toplayın ve kullanıma kadar -70 ° C'de saklayın.
6. E. granulosus'un farklı evrelerinin virüs ile geçici transdüksiyonu
- 1. Gün:
- Gen transferi için 12 kuyucuklu bir kültür plakası kullanın. Kültür 5 × 103-5 × 104 HEK293T hücreleri üçlü olarak, iç referans olarak tam DMEM ortamı ile.
- Kültür RPMI ve %10 FBS'de üçlü olarak 150 taze PSC.
- Kültür 30% 10 ısı-inaktive FBS içeren DMEM'de üçlü olarak strobilated solucanlar.
NOT: Tüm transdüksiyon ortamları antibiyotiksiz olmalıdır. Bu süreçte HEK293T hücreleri, PSC'ler ve strobilated solucanlar için üç adet tedavi edilmemiş kontrol kuyusu bulundurun. - HEK293T hücrelerini ve solucanın farklı aşamalarını dönüştürmek için 4 μg / mL transfeksiyon reaktifi ile 1 × 106 virüsün bir karışımını hazırlayın ( Malzeme Tablosuna bakınız).
- Karışımı her plakaya yavaşça ekleyin ve yavaş dairesel hareketlerle dağıtın. Plakaları bir CO 2 inkübatöründe 4-6 saat boyunca inkübe edin (37 ° C,% 5 CO2). Transfeksiyon reaktifinin toksik etkilerini en aza indirmek için her numunenin ortamını aynı tam kültür ortamıyla değiştirin.
- 2. Gün:
- HEK293T hücreleri, PSC'ler ve strobilated solucanlar için geçici iletim verimliliğini artırmak üzere 6.1.4-6.1.5 arasındaki adımları yineleyin.
- Tüm plakaları, hücre ortamının tipine bağlı olarak aynı kültür koşullarına sahip bir CO2 inkübatöründe 24-48 saat boyunca inkübe edin.
- 3. Gün:
- Floresan mikroskobu kullanarak transdüksiyonun başarılı olup olmadığını kontrol edin.
NOT: Gen transfer prosedüründe PCR / qPCR 20,23 veya Western blotting24 teknikleri gibi daha fazla doğrulayıcı tahlil kullanmayı düşünün.
- Floresan mikroskobu kullanarak transdüksiyonun başarılı olup olmadığını kontrol edin.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Burada, E. granulosus'ta üçüncü nesil lentiviral vektörler kullanılarak hızlı ve etkili bir geçici transdüksiyon tekniği tanımlanmıştır. PSC'leri, daha önce25,26'da tanımlandığı gibi, strobillenmiş solucanlar elde etmek için bifazik bir kültür ortamında kültürledik. Protoscoleces in vitro 6 hafta sonra strobilated solucanlar haline gelir. Bifazik kültür ortamında, invaginasyonlu PSC'ler (Şekil 2A), evajine PSC'ler (Şekil 2B) ve birinci ve üçüncü proglottid formasyonlu strobile solucanlar (Şekil 2C-E) dahil olmak üzere E. granulosus'un farklı aşamaları gözlenmiştir. Protoscoleces ve sırasıyla monofazik ve bifazik kültürlerden elde edilen strobillenmiş solucanlar, GFP eksprese eden lentivirüslerle transfekte edildi (Şekil 3). Otofloresan etkilerinden kaçınmak için, mikroskobik gözlemler her üç örnek grubundaki arka plan floresansı ile karşılaştırıldı ve bu arka plan seviyesinin üzerindeki tüm örnekler transfekte edilmiş olarak kabul edildi.
Saha aydınlatmasını ayarladık ve her işlem için kontrol numunelerinde olası otofloresan emisyonunu önlemek için deklanşörü indirdik. Daha sonra lentiviral vektörle işlenmiş örnekleri kontrol ettik, burada siyah alana karşı yeşil ışık emisyonu etkili geçici transdüksiyon olarak kabul edildi. HEK293T hücreleri - geçici iletim işlemi kontrolü - GFP'yi açıkça ifade etti (Şekil 3D). Yetişkin solucanlar GFP'yi tegumental tabakada en belirgin şekilde ifade ettiler (Şekil 3F); Bununla birlikte, PSC'ler 48 saat sonra biraz daha düşük bir GFP ekspresyonu seviyesi göstermiştir. PSC'lerin etrafındaki bazı kist sıvı kalıntıları ve / veya germinal tabaka kalıntıları, transfekte edilen örneklerde arka planda bir miktar floresana neden olmuştur. HEK293T hücrelerinde ve strobillenmiş solucanlarda floresan yoğunluğu 24 saat ve 48 saat sonra artmıştır (PSC'lerde küçük değişiklikler gözlenmiştir).
Şekil 1: Çalışma protokolünün şematik bir sunumu. Kısaltma: PSC'ler = protoscoleces. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: Bifazik kültür ortamında Echinococcus granulosus'un farklı evreleri. (A) İnvaginasyonlu PSC'ler, (B) kaçamak PSC'ler, (C, D) strobilasyon sürecinde solucanlar, (E) üçüncü proglottid formasyonuna sahip strobillenmiş solucanlar, (F) kültür ortamında strobilasyonun farklı aşamalarında solucanlar. Ölçek çubukları = 200 μm. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: Işık ve floresan mikroskopisinde Echinococcus granulosus'un farklı aşamalarının ve kontrol hücre hattının geçici transdüksiyonu . (A,D) Transdüksiyon proses kontrolü olarak HEK293T hücreleri, (B, E) protoskoleksler ve (C, F) strobile solucanlar. (G, H, I) Karışık ışık ve floresans mikroskopisi. Ölçek çubukları = 50 μm, 100 μm ve 500 μm. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Ek Şekil S1: pCDH-CMV-MCS-EF1-GreenPuro cDNA klonlama ve ekspresyon vektörünün haritası. Bu Dosyayı indirmek için lütfen tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Nematodların moleküler temelini ve Platyhelminthes biyolojisini anlamak, zoonotik parazitlerin patojenitesini anlamak için çok önemlidir27. Etkili bir gen değerlendirme sisteminin olmaması, Echinococcus türleri12,27 de dahil olmak üzere cestod parazitlerinin fonksiyonel genetiğinin doğrudan yorumlanmasının önünde büyük bir engeldir. Bu çalışma, E. granulosus geçici transdüksiyonunda lentivirüsün mükemmel potansiyelini göstermektedir.
Lentiviral transdüksiyon, transgenleri memeli hücrelerine iletmek için kullanımın basitliğini ve geçici transdüksiyonun hızını kararlı hücre hatlarının güçlü ekspresyonuyla birleştirir28. Bu çalışmanın temel amacı, gelecekteki Ekinokokkoz araştırmalarında kritik olacak olan lentiviral vektör transdüksiyonu sürecini göstermekti.
Bu protokolde belirli kritik noktalara dikkat edilmelidir. Kültür ortamında antibiyotiklerin ihmal edilmesi nedeniyle sıkı steril iş akışı koşulları gözlenmelidir, bu olmadan 24 saat sonra bakteri ve mantar kontaminasyonu beklenebilir. Mikrobiyal kontaminasyon, parazitlerin hareketliliğini ve yaşayabilirliğini azaltır ve hem transfekte hem de kontrol numuneleri 72 saat sonra kaybolacaktır.
Platyhelminthes'in yaşam döngüsünde uygun aşamaların ve uygun kültür koşullarının seçilmesi, başarılı gen transdüksiyonunun anahtarıdır12,27. Lentiviral transdüksiyon yöntemimizi metasetot ve strobile fazlarda test ettik. Sonuçlar, strobillenmiş solucanların, genin geçici transdüksiyonuna PSC'lerden daha duyarlı olduğunu gösterdi; bu, strobillenmiş formlardaki geniş tegumental yapının bir sonucu olabilir. Bununla birlikte, lentiviral transdüksiyonun doğası gereği, çok hücreli PSC'lerdeki ve strobillenmiş solucanlardaki floresan yoğunluğu tipik olarak tek katmanlı HEK293T hücrelerinden çok daha düşüktür26.
Echinococcus'u biyolojik fenomenleri incelemek için yassı solucanlarda yeni bir model olarak kullanma potansiyeli uzun zamandır tartışılmaktadır. Bu nedenle, Echinococcus biyolojisinin model bir organizma olarak daha iyi anlaşılması, kök hücre araştırmalarını genişletmek ve diğer platyhelmintlerin gen ekspresyonunu ve evrimsel biyolojisini düzenlemek için yararlı olabilir 8,29,30,31,32. Echinococcus ve çeşitli parazitik ve serbest yaşayan yassı kurt model sistemleri için genomik ve transkriptomik seviyelerde uygulanan genetik araştırmalara acil ihtiyaç vardır. Bu nedenle, tenyalar için etkili bir gen transfer süreci geliştirmek, virüs tabanlı gen knock-in veya CRISPR-Cas aracılı gen düzenleme gibi yeni tekniklerin yolunu açmaktadır32,33. Bu çalışma, bir tenya modelinde lentiviral transdüksiyonu sunar ve yassı solucan biyolojisi için potansiyel etkileri olan umut verici sonuçlar gösterir. Bununla birlikte, yöntemi iyileştirmek ve bu tekniğin gelecekteki deneyler için uygulanabilirliğini geliştirmek için daha derinlemesine çalışmalara ihtiyaç vardır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarların açıklayacağı bir çıkar çatışması yoktur.
Acknowledgments
Bu yayında bildirilen araştırmalar, Tahran, İran'daki Ulusal Tıbbi Araştırma Geliştirme Enstitüsü'nden (NIMAD) 958680 ödül numarası altında Elit Araştırmacı Hibe Komitesi tarafından desteklenmiştir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 12-well culture plates | SPL Life Sciences | 30012 | |
| 25 cm2 culture flask | SPL Life Sciences | 70325 | |
| 6-well culture plates | SPL Life Sciences | 30006 | |
| Calcium chloride | Sigma-Aldrich | C4901-500G | Working concentration: 2.5 mM |
| CMRL 1066 medium | Thermo Fisher Scientific | 11530037 | |
| CO2 incubator | memmert | ICO150 | |
| D-(+)-Glucose | Sigma-Aldrich | G8270-1KG | |
| DMEM | Life Technology | 12100046 | |
| Dog bile | Isolated from a euthanized dog and sterilized by 0.2 μm syringe filter | ||
| Eosin Y | Sigma-Aldrich | E4009-5G | prepare 0.1% of Eosin for working exclusion test |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | DNAbiotech | DB9723-100ml | Heat inactivation of FBS (30 min in 40 °C) |
| Fetal Calf Serum (FCS) | DNAbiotech | DB9724-100ml | Heat inactivation of FCS (30 min in 40 °C) |
| HEK293T cells | BONbiotech | BN_0012.1.14 | Human embryonic kidney 293T |
| HEPES buffered saline (HBS) | Sigma-Aldrich | 51558-50ML | 2x concentrate |
| Inverted fluorescence microscope | OLYMPUS | IX51 | |
| Penicillin | Sigma-Aldrich | P3032-10MU | Working concentration: 100 IU/mL |
| Pepsin | Roche | 10108057001 | Working concentration: 2 mg/mL, pH 2 |
| Phosphate-buffered saline (PBS) | DNAbiotech | DB0011 | This reagent solve in less than 1 min in D.W |
| Polybrene (Transfection reagent) | Sigma-Aldrich | TR-1003-G | |
| RPMI medium | BioIdea | BI-1006-05 | |
| Sodium bicarbonate (NaHCO3) | Sigma-Aldrich | S5761-1KG | |
| Streptomycin | Sigma-Aldrich | S9137-25G | Working concentration: 100 μg/mL |
| Third-generation lentiviral plasmid (pCDH513b) | SBI System Biosciences (BioCat GmbH) | CD513B-1-SBI | Transfer vector (obtained commercially from Molecular Medicine Research Department of Iranian Academic Center for Education, Culture and Research (ACECR), Mashhad, Iran) |
| Third-generation lentiviral plasmid (pLPI and pLPII) | Invitrogen (Life Technologies) | K4975-00 | Helper vector (obtained commercially from Molecular Medicine Research Department of Iranian Academic Center for Education, Culture and Research (ACECR), Mashhad, Iran) |
| Third-generation lentiviral plasmid (pMD2G) | Addgene | Plasmid 12259 | Helper vector (obtained commercially from Molecular Medicine Research Department of Iranian Academic Center for Education, Culture and Research (ACECR), Mashhad, Iran) |
| Tris/EDTA Buffer (TE) | DNAbiotech | DB9713-100ml | |
| Trypsin | Sigma-Aldrich | T9935-50MG | 1x working solutions (pH 7.4–7.6) |
References
- Deplazes, P., et al. Global distribution of alveolar and cystic echinococcosis. Advances in Parasitology. 95, 315 (2017).
- Borhani, M., et al. Echinococcoses in Iran, Turkey, and Pakistan: Old diseases in the new millennium. Clinical Microbiology Reviews. 34 (3), 0029020 (2021).
- Eckert, J., Thompson, R. C. A.
- Romig, T., et al. Ecology and life cycle patterns of Echinococcus species. Advances in Parasitology. 95, 213 (2017).
- Craig, P. S., Hegglin, D., Lightowlers, M. W., Torgerson, P. R., Wang, Q.
- Deplazes, P., et al. Global distribution of alveolar and cystic echinococcosis. Advances in Parasitology. 95 (1), 315 (2017).
- Tsai, I. I. J., et al. The genomes of four tapeworm species reveal adaptations to parasitism. Nature. 496 (7443), 57-63 (2013).
- Koziol, U., Brehm, K. Recent advances in Echinococcus genomics and stem cell research. Veterinary Parasitology. 213 (3-4), 92-102 (2015).
- Zheng, H., et al. The genome of the hydatid tapeworm Echinococcus granulosus. Nature Genetics. 45 (10), 1168-1175 (2013).
- Pérez-Victoria, J. M., Torres, A. P. T. C., Gamarro, F., Castanys, S. ABC transporters in the protozoan parasite Leishmania. International Microbiology. 4 (3), 159-166 (2001).
- Ehrenkaufer, G. M., Singh, U. Transient and stable transfection in the protozoan parasite Entamoeba invadens. Molecular and Biochemical Parasitology. 184 (1), 59-62 (2012).
- Moguel, B., Bobes, R. J., Carrero, J. C., Laclette, J. P.
- Tang, Y., Garson, K., Li, L., Vanderhyden, B. C. Optimization of lentiviral vector production using polyethylenimine-mediated transfection. Oncology Letters. 9 (1), 55-62 (2015).
- Mann, V. H., Suttiprapa, S., Rinaldi, G., Brindley, P. J.
- Balcaitis, S., Weinstein, J. R., Li, S., Chamberlain, J. S., Möller, T.
- Sastry, L., Johnson, T., Hobson, M. J., Smucker, B., Cornetta, K. Titering lentiviral vectors: comparison of DNA, RNA and marker expression methods. Gene Therapy. 9 (17), 1155-1162 (2002).
- Bowles, J., Blair, D., McManus, D. P. Genetic variants within the genus Echinococcus identified by mitochondrial DNA sequencing. Molecular and Biochemical Parasitology. 54 (2), 165-173 (1992).
- Rostami, S., et al. High resolution melting technique for molecular epidemiological studies of cystic echinococcosis: differentiating G1, G3, and G6 genotypes of Echinococcus granulosus sensu lato. Parasitology Research. 112 (10), 3441-3447 (2013).
- Mousavi, S. M., et al. Biological and morphological consequences of dsRNA-induced suppression of tetraspanin mRNA in developmental stages of Echinococcus granulosus. Parasites and Vectors. 13 (1), 190 (2020).
- Afgar, A., et al. MiR-339 and especially miR-766 reactivate the expression of tumor suppressor genes in colorectal cancer cell lines through DNA methyltransferase 3B gene inhibition. Cancer Biology & Therapy. 17 (11), 1126-1138 (2016).
- Ricardo, R., Phelan, K. Trypsinizing and subculturing mammalian cells. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (16), e755 (2008).
- Wang, X., McManus, M.
- Li, M., Husic, N., Lin, Y., Snider, B. J. Production of lentiviral vectors for transducing cells from the central nervous system. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (63), e4031 (2012).
- Eslami, A., Lujan, J. Western blotting: sample preparation to detection. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (44), e2359 (2010).
- Dezaki, E. S., et al. Comparison of ex vivo harvested and in vitro cultured materials from Echinococcus granulosus by measuring expression levels of five genes putatively involved in the development and maturation of adult worms. Parasitology Research. 115 (11), 4405-4416 (2016).
- Mousavi, S. M., et al. Calmodulin-specific small interfering RNA induces consistent expression suppression and morphological changes in Echinococcus granulosus. Scientific Reports. 9 (1), 1-9 (2019).
- Aboobaker, A. A., Blaxter, M. L. Functional genomics for parasitic nematodes and platyhelminths. Trends in Parasitology. 20 (4), 178-184 (2004).
- Elegheert, J., et al. Lentiviral transduction of mammalian cells for fast, scalable and high-level production of soluble and membrane proteins. Nature Protocols. 13 (12), 2991 (2018).
- Mizukami, C., et al. Gene silencing in Echinococcus multilocularis protoscoleces using RNA interference. Parasitology International. 59 (4), 647-652 (2010).
- Thompson, R. C. A., Jenkins, D. J. Echinococcus as a model system: biology and epidemiology. International Journal for Parasitology. 44 (12), 865-877 (2014).
- Thompson, R. C. A. Biology and systematics of Echinococcus. Advances in Parasitology. Thompson, R. C. A., Deplazes, P., Lymbery, A. J. 95, 65-109 (2017).
- Brehm, K., Koziol, U. Echinococcus-host interactions at cellular and molecular levels. Advances in Parasitology. 95, 147-212 (2017).
- Moguel, B., et al. Transient transgenesis of the tapeworm Taenia crassiceps. SpringerPlus. 4, 496 (2015).
