Summary
우리는 세 번째 세대 렌티 바이러스 벡터를 사용하여 Echinococcus granulosus 의 다른 발달 단계에서 신속한 일시적인 형질 도입 기술을 설명합니다.
Abstract
낭포성 echinococcosis 또는 hydatid 질병은 송곳니의 장에 숨어있는 작은 촌충 인 Echinococcus granulosus 에 의해 야기 된 가장 중요한 동물 유행성 기생충 질병 중 하나입니다. 병인과 질병 조절 및 예방의 메커니즘을 이해하기 위해 유전자 연구를 적용해야 할 긴급한 필요성이 있다. 그러나 효과적인 유전자 평가 시스템의 부족은 Echinococcus 종을 포함한 cestode 기생충의 기능적 유전학에 대한 직접적인 해석을 방해합니다. 본 연구는 E. granulosus의 metacestode 및 strobilated 형태에서 렌티바이러스 유전자 일시적 형질도입의 가능성을 입증한다. 프로토스콜렉세스(PSCs)를 수성체 낭종으로부터 분리하고 특정 이족 배양 배지로 옮겨 스트로빌화된 웜으로 발전시켰다. 웜을 형질도입 과정 대조군으로서 HEK293T 세포와 함께 수확된 3세대 렌티바이러스로 형질감염시켰다. 24 h 및 48 h에 걸쳐 스트로빌화 된 웜에서 뚜렷한 형광이 검출되었으며, 이는 E. granulosus에서 일시적인 렌티 바이러스 형질도입을 나타냅니다. 이 연구는 촌충에서 렌티 바이러스 기반 일시적인 형질도입에 대한 첫 번째 시도를 제시하고 편평충 생물학에 대한 실험 연구에서 잠재적 인 영향을 미치는 유망한 결과를 보여줍니다.
Introduction
낭포성 echinococcosis (CE)는 Taeniidae 1,2 가족 내의 작은 촌충 인 Echinococcus granulosus에 의해 유발되는 가장 중요한 기생충 질병 중 하나입니다. E. granulosus에 대한 면역 진단 및 백신 개발에 대한 광범위한 연구가 수행되었습니다. 그러나 기생충 생물학의 분자 기초에 대한 부적절한 지식은 하이다티드 질병 3,4,5,6의 진단, 관리 및 예방에 큰 한계를 제기합니다.
최근 몇 년 동안, 게놈 시퀀싱 및 전사 방법의 개발로 인해, 여러 연구 그룹 7,8,9에 의해 편평충에 대한 광범위한 분자 연구가 수행되었습니다. 그러나 기생충의 세계에서, 기생 편평충의 유전자 전달 기술의 발전은 일부 원생동물10,11,12를 위해 개발 된 재현성이 높은 일시적인 형질도입 방법과 비교하여 여전히 제한적입니다.
바이러스 전달 시스템의 사용은 지난 20 년 동안 전이유전자 전달 및 유전자 / 단백질 조사를위한 필수 도구로 부상했습니다13. 렌티바이러스는 분열 세포와 비분열 세포를 모두 감염시켜 유사분열 후 세포 14,15,16을 감염시킬 수 있다. 최근의 증거는 포유동물 세포에서 렌티바이러스 기반 형질도입 시스템을 사용하는 것이 이전의 녹인/녹다운 기술의 한계 대부분을 극복할 수 있는 잠재력을 제공한다는 것을 나타낸다. GFP 발현과 같은 적절한 분자 마커를 갖는 발현 렌티바이러스 벡터의 설계 및 구축은 앞서16에서 설명되었다. 따라서, 우리는 E. granulosus의 protoscoleces 및 strobilated worms에서 GFP 리포터 유전자의 렌티바이러스 일시적 형질도입을 평가한다.
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Protocol
이 연구는 국립 의학 연구 개발 연구소 및 연구 윤리 검토위원회, No. 958680의 승인을 받았다. 렌티바이러스는 BSL-2 유기체로 분류되고; 따라서, 이 프로토콜의 모든 실험실 배양 절차는 멸균 실험실 관행을 사용하여 수행되었고, NIH 가이드라인에 따라 층류 후드 하에서 수행되었다. 도 1은 상이한 E. 과립 단계에 대한 연구 프로토콜의 개략적인 프리젠테이션을 도시한다.
1. 수국 낭종 수집
- 도축장에서 일상적으로 도살되는 자연적으로 감염된 양으로부터 간 수다이드 낭종을 수집하십시오.
- protoscoleces (PSCs)를 흡입하기 전에 멸균 거즈와 70 % 알코올을 사용하여 낭종 표면을 완전히 살균하십시오.
- 흡인물 20-50 mL의 히다티드 유체를 멸균 50 mL 원뿔형 튜브로 배출합니다.
- 배수 후 날카로운 칼날로 낭종을 닦아내고 발아층을 멸균 된 50mL 원뿔형 튜브로 옮긴 다음 PSC의 수집을 늘리기 위해 단기간 (~ 2 분) 동안 흔들어 소모합니다. 분자 특성화를 위해 발아층을 새로운 1.5mL 튜브로 옮깁니다.
- PSCs 3-5x를 포스페이트 완충 식염수 (PBS)로 세척한다.
- PSCs를 5분 동안 0.1% 에오신으로 관찰하여 광학 현미경으로 PSC 생존율을 확인하였다. 문화에 대해 95 % 이상의 생존 능력을 가진 PSC를 사용하십시오.
- PSC 침전물을 2 mL의 펩신 (2 mg / mL, pH 2)으로 15-20 분 동안 처리하십시오.
- 개별 PSC를 분리하려면 PBS에서 PSC 침전물을 재현탁하고 멸균 거즈의 두 층을 통해 새로운 멸균 50mL 원뿔형 튜브로 통과시킵니다.
참고: 광학 현미경을 사용하여 PSC 퇴적물 50μL에 대한 세 가지 카운트의 평균을 계산합니다. 후속 시험의 경우 추정 값을 사용하여 PSC/μL을 결정합니다. 각각의 히다티드 낭종 단리물은 PCR-시퀀싱17 또는 고분해능 용융 곡선 분석(18)과 같은 분자 방법에 의해 뉴클레오티드 다형성에 기초하여 특성화되어야 한다.
2. 성인 벌레를 얻기 위해 E. granulosus의 PSCs의 Biphasic 재배
참고: 분리된 PSC는 층류 캐비닛 클래스 II 하에서 멸균 조건에서 배양되어야 합니다. 다음 단계19로 진행하기 전에 이phasic 배양 배지의 고체 및 액체 상을 별도로 준비한다.
- 두 단계로 구성되도록 이phasic 배양 배지를 준비한다.
- 고체상의 경우, 소 혈청 10 mL를 25 mL 플라스크에 첨가하고 76°C에서 20-30분 동안 응고되도록 방치한다.
- 액상 (변형 CMRL)의 경우, 100 mL의 열 불활성화 태아 송아지 혈청 (FCS), 36 mL의 5 % 효모 추출물, 5.6 mL의 30 % 포도당 (증류수 중), PBS의 5 % 담즙 1.4 mL, 20 mM HEPES 완충액 및 10 mM NaHCO3를 CMRL-1066 배지 260 mL에 섞는다. 마지막으로 페니실린 (100 IU / mL)과 스트렙토 마이신 (100 mg / mL)을 혼합물에 첨가하십시오.
- 액상 배지 10 mL를 각 25cm2 배양 플라스크에 첨가한다.
- 배양 플라스크에 ∼5,000 PSCs를 첨가하고, 플라스크를 CO2 인큐베이터(37°C, 5%CO2)로 옮긴다.
- 24-48시간 후, PSCs를 고상(소 혈청)을 갖는 새로운 플라스크로 옮기고 플라스크 당 동일한 신선한 액상 배지 1 mL를 첨가한다. 플라스크를 CO2 인큐베이터(37°C, 5%CO2 )로 옮긴다.
- 매 5-7일마다, 배지의 색깔의 변화 및 분화된 PSCs의 추정된 비율에 기초하여 배지를 신선한 액상 배지로 교체한다.
참고: 프로토스콜렉스는 배양 후 환경 변화에 빠르게 반응하며, 대부분은 2-3주 이내에 분화를 겪습니다. 영양소의 소비와 프로토스콜렉스의 성장과 발달로 인해 배양액의 pH가 변하고 색상이 주황색과 노란색으로 바뀝니다.
3. E. granulosus의 PSCs의 단식 재배
- 단식 재배가 형질도입 24-48 시간 전에 이루어 지도록하십시오.
- 25cm2 배양 플라스크에서 ∼5,000 PSCs를 RPMI 및 10% 소 태아 혈청(FBS)으로 배양한다.
- 플라스크를 사용할 때까지 CO2 인큐베이터(37°C, 5%CO2)로 옮긴다.
4. 바이러스 생산 및 준비를위한 세포 배양
참고: 인간 배아 신장 293T (HEK293T) 세포는 Kerman University of Medical Sciences의 병리학 및 줄기 세포 연구 센터로부터 벡터 생산을 위해 수득되었다.
- 5 × 10개의5개의 HEK293T 세포를 10% FBS, 100 U/mL 페니실린 및 100 μg/mL 스트렙토마이신이 있는 DMEM 5 mL를 함유하는25 cm2 플라스크로 옮깁니다.
- HEK293T 세포를 5% CO2에서 37°C에서 인큐베이션하고, 이를 매 48시간마다 완전 배지에 계대시킨다. 마지막으로, 형질도입(20)을 위해 저역 HEK293T 세포를 사용한다.
5. 3세대 렌티바이러스 벡터를 이용한 바이러스의 제조 및 제조
참고: 렌티바이러스 벡터 pCDH513b(전사 벡터) 및 PLPII, PLPI 및 PMD2G(헬퍼 벡터)를 사용하여 GFP 리포터 유전자를 발현하였다. 재료 표 및 보충 그림 S1을 참조하십시오.
- 1일차:
- HEK293T 세포21을 6-웰 배양 플레이트에서 트립신화한 후, 시드 7 × 10% FBS를 함유하는 신선한 항생제 프리 DMEM으로 웰당 10개의4개 세포를 수득하였다.
- 인산칼슘 방법에 의한 형질도입을 위해 50%-60% 컨플루언시에서 세포를 사용한다.
- 2일차:
- 실험 2-3 h 전에 세포 배양 배지를 2% FBS를 함유하는 신선한 항생제 무함유 DMEM으로 교체한다.
- 1.5mL 튜브에서 7μg/μL pCDH513b(전사 벡터), 4μg/μL PLPII, 4μg/μL PLPI 및 2μg/μL PMD2G(헬퍼 벡터)를 포함한 3세대 렌티바이러스 플라스미드를 혼합합니다.
- 상기 혼합물에 HEPES 완충액 (0.28 M NaCl, 0.05 M HEPES, 및 1.5 mMNa2HPO4; 최적 pH 범위, 7.00-7.28)을 422 μL의 부피로 첨가한다.
- 16 μL의 1% Tris-EDTA (TE) 완충액을 상기 혼합물에 첨가한다.
- 62 μL의 2.5 mM 염화칼슘을 튜브에 첨가하고 잘 섞는다.
- 500 μL의 2x HEPES-완충 식염수 (HBS)를 파스퇴르 피펫을 사용하여 1-2 분 이내에 적하하여 혼합물에 첨가한다. 반불투명 용액이 얻어질 때까지 부드럽게 혼합하고, 혼합물을 실온에서 20분 동안 인큐베이션한다.
- 혼합물을 각 접시에 천천히 넣고 느린 원형 동작으로 분배하십시오.
- 플레이트를 5%CO2 인큐베이터에서 37°C에서 인큐베이션하고, 4-6시간 후에 배지를 10% FBS를 함유하는 항생제가 없는 DMEM으로 교체한다.
- 3일차:
- 거꾸로 형광 현미경을 사용하여 성공적인 일시적 형질도입 및 세포 생존율을 확인한다.
- 4일차:
- 배양 배지로부터 바이러스를 수확하여 각 웰의 상청액을 수집하고, 이를 사용 전까지 -70°C에 보관한다.
참고: 수확된 렌티바이러스는 정확한 트랜스펙션(22)을 위해 농축되고 적정될 수 있다.
- 배양 배지로부터 바이러스를 수확하여 각 웰의 상청액을 수집하고, 이를 사용 전까지 -70°C에 보관한다.
6. 바이러스와 함께 E. granulosus 의 다른 단계의 일시적인 형질도입
- 1일차:
- 유전자 전달을 위해 12-웰 배양 플레이트를 사용하십시오. 5 × 103-5 × 104개의 HEK293T 세포를 내부 참조로서 완전한 DMEM 배지와 함께 삼중으로 배양한다.
- RPMI와 10 % FBS에서 150 개의 신선한 PSC를 세 배로 배양하십시오.
- 10% 열 불활성화 FBS를 함유하는 DMEM에서 삼중으로 30개의 스트로빌화된 웜을 배양한다.
참고: 모든 형질도입 배지는 항생제가 없어야 합니다. 이 과정에서 HEK293T 세포, PSC 및 스트로빌화 된 웜에 대해 세 개의 처리되지 않은 대조군 웰을 유지하십시오. - HEK293T 세포와 웜의 여러 단계를 형질감염시키기 위해 1 × 106 바이러스와 4 μg/mL 형질감염 시약 ( 물질 표 참조)을 혼합하여 준비하십시오.
- 혼합물을 각 접시에 천천히 넣고 느린 원형 동작으로 분배하십시오. 플레이트를 CO2 인큐베이터 (37°C, 5%CO2)에서 4-6 시간 동안 인큐베이션한다. 형질감염 시약의 독성 영향을 최소화하기 위해 각 샘플에 대한 배지를 동일한 완전한 배양 배지로 교체한다.
- 2일차:
- HEK293T 세포, PSC 및 스트로빌화된 웜에 대한 일시적 형질도입의 효율을 높이려면 6.1.4-6.1.5단계를 반복한다.
- 모든 플레이트를 세포 배지의 유형에 따라 동일한 배양 조건으로CO2 인큐베이터에서 24-48시간 동안 인큐베이션한다.
- 3일차:
- 형질도입이 형광 현미경을 사용하여 성공적인지 여부를 확인한다.
참고: 유전자 전달 절차에서 PCR/qPCR20,23 또는 웨스턴 블롯팅 24 기술과 같은 추가 확인 검정을 사용하는 것을 고려하십시오.
- 형질도입이 형광 현미경을 사용하여 성공적인지 여부를 확인한다.
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Representative Results
여기에서, 우리는 세 번째 세대 렌티바이러스 벡터를 사용하여 E. granulosus에서 신속하고 효율적인 일시적 형질도입 기술을 기술한다. PSCs를 이phasic 배지에서 배양하여 앞서 기술한 바와 같이 스트로빌화된 웜을 수득하였다(25,26). Protoscolece는 시험관 내에서 6 주 후에 스트로빌 화 된 웜으로 발전합니다. E. granulosus의 상이한 단계는 질내 PSC (도 2A), 질내 PSC (도 2B), 및 첫 번째 및 세 번째 proglottid 형성 (도 2C-E)을 갖는 스트로빌화된 웜을 포함하는 이phasic 배양 배지에서 관찰되었다. 프로토콜렉세스 및 단식 및 이phasic 배양물로부터 수득된 스트로빌화된 웜을 각각 GFP 발현 렌티바이러스로 형질감염시켰다(도 3). 자기 형광 효과를 피하기 위해, 현미경 관찰은 샘플의 세 그룹 모두에서 배경 형광과 비교되었고, 이 배경 수준 이상의 모든 샘플은 형질감염된 것으로 간주되었다.
우리는 현장 조명을 조정하고 셔터를 낮추어 각 처리에 대한 제어 샘플에서 가능한 자기 형광 방출을 방지했습니다. 이어서, 렌티바이러스 벡터-처리된 샘플을 검사하였고, 여기서 검정장에 대한 녹색 발광은 효과적인 일시적 형질도입으로 간주되었다. HEK293T 세포-일시적 형질도입 과정 대조군-발현된 GFP를 명확하게 발현시킨다 (도 3D). 성인 웜은 tegumental 층에서 GFP를 가장 뚜렷하게 표현했습니다 (그림 3F); 그러나, PSCs는 48 h 후에 GFP 발현의 다소 더 낮은 수준을 입증하였다. PSC 주변의 일부 낭종 유체 잔류 물 및 / 또는 발아층 파편은 형질 감염된 샘플의 배경에서 약간의 형광을 일으켰습니다. HEK293T 세포 및 스트로빌화된 웜에서의 형광의 강도는 24 h 및 48 h 후에 증가하였다 (PSCs에서 경미한 변화가 관찰되었다).
그림 1: 연구 프로토콜의 개략적인 프레젠테이션. 약어: PSC = protoscoleces. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2 : 이phasic 배양 배지에서 Echinococcus granulosus의 다른 단계. (A) 질내 PSC, (B) 질내 PSC, (C, D) 스트로빌 화 과정에서 웜, (E) 세 번째 프로글로티드 형성을 가진 스트로빌 화 웜, (F) 배양 배지에서 스트로빌레이션의 다른 단계의 웜. 배율 막대 = 200μm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
도 3: 광과 형광 현미경에서 Echinococcus granulosus 및 대조군 세포주의 상이한 단계의 일시적인 형질도입 . (A,D) 형질도입 과정 대조군으로서의 HEK293T 세포, (B, E) 프로토스콜렉세스, 및 (C, F) 스트로빌화된 웜. (G, H, I) 혼합 빛과 꽃차례 현미경. 배율 막대 = 50μm, 100μm 및 500μm입니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
보충 도 S1: pCDH-CMV-MCS-EF1-GreenPuro cDNA 클로닝 및 발현 벡터의 맵. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
선충류와 Platyhelminthes 생물학의 분자 기초를 이해하는 것은 동물 유행성 기생충의 병원성을 이해하는 데 중요합니다27. 효과적인 유전자 평가 시스템의 부족은 Echinococcus 종12,27을 포함한 cestode 기생충의 기능적 유전학의 직접적인 해석에 큰 장애물입니다. 본 연구는 E. granulosus transient transduction에서 lentivirus의 우수한 잠재력을 입증한다.
렌티바이러스 형질도입은 사용의 단순성 및 일시적 형질도입의 속도를 안정한 세포주의 강력한 발현과 결합하여 포유동물 세포(28)에 전이유전자를 전달한다. 이 연구의 주요 목표는 렌티 바이러스 벡터 형질도입 과정을 설명하는 것이 었으며, 이는 향후 Echinococcosis 연구에서 중요 할 것입니다.
이 프로토콜에서 특정 중요 사항을 기록해야 합니다. 배양 배지에 항생제가 누락되어 엄격한 멸균 작업 조건을 준수해야하며, 24 시간 후에 박테리아 및 곰팡이 오염이 발생할 수 있습니다. 미생물 오염은 기생충의 운동성과 생존력을 감소시키고, 형질감염 및 대조 샘플 모두 72시간 후에 손실될 것이다.
Platyhelminthes의 수명주기 및 적절한 배양 조건에서 적절한 단계를 선택하는 것이 성공적인 유전자 전달12,27의 핵심입니다. 우리는 메타세스토드 및 스트로빌화 단계에서 렌티바이러스 형질도입 방법을 테스트했습니다. 결과는 스트로빌화 된 웜이 PSCs보다 유전자의 일시적인 형질도입에 더 반응한다는 것을 보여 주었고, 이는 스트로빌 된 형태의 광범위한 tegumental 구조의 결과 일 수 있습니다. 그러나, 렌티바이러스 형질도입의 특성으로 인해, 다세포 PSC 및 스트로빌화된 웜에서의 형광 강도는 전형적으로 단층 HEK293T 세포(26)에서보다 훨씬 낮다.
생물학적 현상을 연구하기위한 편평충의 새로운 모델로 Echinococcus를 사용할 가능성은 오랫동안 논의되어 왔습니다. 따라서, 모델 유기체로서의 에치노코커스 생물학에 대한 더 나은 이해는 줄기 세포 연구를 확장하고 다른 플라티헬민 스 8,29,30,31,32의 유전자 발현 및 진화 생물학을 조절하는데 유용할 수 있다. Echinococcus 및 다양한 기생 및 자유 살아있는 편평충 모델 시스템에 대한 게놈 및 전사체 수준에서 응용 유전 연구가 시급히 필요합니다. 따라서, 촌충에 대한 효과적인 유전자 전달 공정을 개발하는 것은 바이러스 기반 유전자 녹인 또는 CRISPR-Cas-매개된 유전자 편집(32,33)과 같은 새로운 기술을 위한 길을 열어준다. 이 연구는 촌충 모델에서 렌티 바이러스 형질 도입을 제시하고 유망한 결과를 보여 주며 편평한 웜 생물학에 잠재적 인 영향을 미칩니다. 그러나 방법을 개선하고 향후 실험에 대한이 기술의 적용 가능성을 개발하기 위해보다 심층적 인 연구가 필요합니다.
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Disclosures
저자는 공개 할 이해 상충이 없습니다.
Acknowledgments
이 간행물에서보고 된 연구는 엘리트 연구원 보조금위원회가이란 테헤란의 국립 의학 연구 개발 연구소 (NIMAD)의 수상 번호 958680으로 지원되었습니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 12-well culture plates | SPL Life Sciences | 30012 | |
| 25 cm2 culture flask | SPL Life Sciences | 70325 | |
| 6-well culture plates | SPL Life Sciences | 30006 | |
| Calcium chloride | Sigma-Aldrich | C4901-500G | Working concentration: 2.5 mM |
| CMRL 1066 medium | Thermo Fisher Scientific | 11530037 | |
| CO2 incubator | memmert | ICO150 | |
| D-(+)-Glucose | Sigma-Aldrich | G8270-1KG | |
| DMEM | Life Technology | 12100046 | |
| Dog bile | Isolated from a euthanized dog and sterilized by 0.2 μm syringe filter | ||
| Eosin Y | Sigma-Aldrich | E4009-5G | prepare 0.1% of Eosin for working exclusion test |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | DNAbiotech | DB9723-100ml | Heat inactivation of FBS (30 min in 40 °C) |
| Fetal Calf Serum (FCS) | DNAbiotech | DB9724-100ml | Heat inactivation of FCS (30 min in 40 °C) |
| HEK293T cells | BONbiotech | BN_0012.1.14 | Human embryonic kidney 293T |
| HEPES buffered saline (HBS) | Sigma-Aldrich | 51558-50ML | 2x concentrate |
| Inverted fluorescence microscope | OLYMPUS | IX51 | |
| Penicillin | Sigma-Aldrich | P3032-10MU | Working concentration: 100 IU/mL |
| Pepsin | Roche | 10108057001 | Working concentration: 2 mg/mL, pH 2 |
| Phosphate-buffered saline (PBS) | DNAbiotech | DB0011 | This reagent solve in less than 1 min in D.W |
| Polybrene (Transfection reagent) | Sigma-Aldrich | TR-1003-G | |
| RPMI medium | BioIdea | BI-1006-05 | |
| Sodium bicarbonate (NaHCO3) | Sigma-Aldrich | S5761-1KG | |
| Streptomycin | Sigma-Aldrich | S9137-25G | Working concentration: 100 μg/mL |
| Third-generation lentiviral plasmid (pCDH513b) | SBI System Biosciences (BioCat GmbH) | CD513B-1-SBI | Transfer vector (obtained commercially from Molecular Medicine Research Department of Iranian Academic Center for Education, Culture and Research (ACECR), Mashhad, Iran) |
| Third-generation lentiviral plasmid (pLPI and pLPII) | Invitrogen (Life Technologies) | K4975-00 | Helper vector (obtained commercially from Molecular Medicine Research Department of Iranian Academic Center for Education, Culture and Research (ACECR), Mashhad, Iran) |
| Third-generation lentiviral plasmid (pMD2G) | Addgene | Plasmid 12259 | Helper vector (obtained commercially from Molecular Medicine Research Department of Iranian Academic Center for Education, Culture and Research (ACECR), Mashhad, Iran) |
| Tris/EDTA Buffer (TE) | DNAbiotech | DB9713-100ml | |
| Trypsin | Sigma-Aldrich | T9935-50MG | 1x working solutions (pH 7.4–7.6) |
References
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