Summary
Nous décrivons une technique de transduction transitoire rapide à différents stades de développement d’Echinococcus granulosus en utilisant des vecteurs lentiviraux de troisième génération.
Abstract
L’échinococcose kystique ou maladie hydatide est l’une des maladies parasitaires zoonotiques les plus importantes causées par Echinococcus granulosus, un petit ténia hébergé dans l’intestin des chiens. Il est urgent de mener des recherches en génétique appliquée pour comprendre les mécanismes de la pathogenèse et du contrôle et de la prévention des maladies. Cependant, l’absence d’un système efficace d’évaluation des gènes entrave l’interprétation directe de la génétique fonctionnelle des parasites cestodes, y compris l’espèce Echinococcus . La présente étude démontre le potentiel de transduction transitoire du gène lentiviral dans les formes métacestode et strobilée d’E. granulosus. Les protoscoléces (CSP) ont été isolées à partir de kystes hydatides et transférées dans des milieux de culture biphasiques spécifiques pour se développer en vers strobilés. Les vers ont été transfectés avec le lentivirus de troisième génération récolté, ainsi que des cellules HEK293T comme contrôle du processus de transduction. Une fluorescence prononcée a été détectée chez les vers strobilés sur 24 h et 48 h, indiquant une transduction lentivirale transitoire chez E. granulosus. Ce travail présente la première tentative de transduction transitoire à base de lentivirus chez les ténias et démontre les résultats prometteurs avec des implications potentielles dans des études expérimentales sur la biologie des vers plats.
Introduction
L’échinococcose kystique (EC) est l’une des plus importantes maladies helminthes causées par Echinococcus granulosus, un petit ténia de la famille des Taeniidae 1,2. Des études approfondies sur le développement d’immunodiagnostics et de vaccins contre E. granulosus ont été réalisées. Cependant, une connaissance insuffisante de la base moléculaire de la biologie parasitaire pose des limites majeures dans le diagnostic, la gestion et la prévention de la maladie hydatide 3,4,5,6.
Au cours des dernières années, en raison du développement du séquençage du génome et des méthodes transcriptomiques, un large éventail d’études moléculaires ont été menées sur les vers plats par plusieurs groupes de recherche 7,8,9. Cependant, dans le monde des parasites, les progrès de la technologie de transfert de gènes chez les vers plats parasites sont encore limités par rapport aux méthodes de transduction transitoire hautement reproductibles développées pour certains protozoaires 10,11,12.
L’utilisation de systèmes d’administration virale est devenue un outil essentiel pour l’administration de transgènes et les études de gènes et de protéines au cours des deux dernières décennies13. Le lentivirus infecte à la fois les cellules en division et les cellules non divisées, ce qui permet d’infecter les cellules postmitotiques 14,15,16. Des preuves récentes indiquent que l’utilisation d’un système de transduction à base de lentivirus dans les cellules de mammifères offre le potentiel de surmonter la plupart des limites des techniques précédentes d’entrée et de renversement. La conception et la construction de vecteurs lentiviraux d’expression avec des marqueurs moléculaires appropriés, tels que l’expression GFP, ont été décrites précédemment16. Par conséquent, nous évaluons la transduction transitoire lentivirale d’un gène rapporteur GFP chez les protoscolèces et les vers strobilés d’E. granulosus.
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Protocol
Cette étude a été approuvée par le National Institute for Medical Research Development et le Research Ethics Review Committee, No. 958680. Les lentivirus sont classés comme organismes BSL-2; par conséquent, toutes les procédures de culture en laboratoire de ce protocole ont été effectuées à l’aide de pratiques de laboratoire stériles et menées sous une hotte à écoulement laminaire conformément aux directives des NIH. La figure 1 illustre une présentation schématique du protocole d’étude pour les différents stades d’E. granulosus .
1. Collecte des kystes hydatiques
- Recueillir les kystes hydatiques hépatiques de moutons naturellement infectés régulièrement abattus dans un abattoir.
- Stériliser complètement la surface du kyste à l’aide de gaze stérile et d’alcool à 70% avant d’aspirer les protoscolacées (PSC).
- Aspirer 20 à 50 mL de liquide hydaside dans des tubes coniques stériles de 50 mL.
- Après le drainage, épongez le kyste avec une lame tranchante, transférez la couche germinale dans un tube conique stérile de 50 mL et secouez-le pendant une courte période (~ 2 min) pour augmenter la collecte de CSP. Transférez la couche germinale dans un nouveau tube de 1,5 mL pour la caractérisation moléculaire.
- Lavez les CSP 3-5x avec une solution saline tamponnée au phosphate (PBS).
- Observez les CSP dans 0,1 % d’éosine pendant 5 min pour déterminer la viabilité du CSP au microscope optique. Utilisez des CSP dont la viabilité pour la culture est d’au moins 95 %.
- Traiter le précipité de CSP avec 2 mL de pepsine (2 mg/mL, pH 2) pendant 15-20 min.
- Pour isoler les CSP individuels, remettez en suspension les sédiments de CSP dans le PBS et passez-les à travers deux couches de gaze stérile dans un nouveau tube conique stérile de 50 mL.
REMARQUE : Calculer la moyenne de trois dénombrements sur 50 μL de sédiments PSC à l’aide d’un microscope optique. Pour les essais ultérieurs, utilisez la valeur estimée pour déterminer les CSP/μL. Chaque isolat de kyste hydatide doit être caractérisé sur la base de polymorphismes nucléotidiques par des méthodes moléculaires, telles que le séquençage par PCR17 ou l’analyse de la courbe de fusion à haute résolution18.
2. Culture biphasique de CSP d’E . granulosus pour obtenir des vers adultes
REMARQUE : Les CSP isolés doivent être cultivés dans des conditions stériles dans une armoire à flux laminaire de classe II. Préparer séparément les phases solide et liquide du milieu de culture biphasique avant de passer aux étapes suivantes19.
- Préparer le milieu de culture biphasique à se composer de deux phases.
- Pour la phase solide, ajouter 10 mL de sérum bovin dans une fiole de 25 mL et laisser coaguler à 76 °C pendant 20-30 min.
- Pour la phase liquide (CMRL modifié), mélanger 100 mL de sérum de veau fœtal (FCS) inactivé par la chaleur, 36 mL d’extrait de levure à 5 %, 5,6 mL de glucose à 30 % (dans de l’eau distillée), 1,4 mL de bile de chien à 5 % dans le PBS, 20 mM de tampon HEPES et 10 mM de NaHCO3 dans 260 mL de milieu CMRL-1066. Enfin, ajouter la pénicilline (100 UI/mL) et la streptomycine (100 mg/mL) au mélange.
- Ajouter 10 mL du milieu de phase liquide à chaque fiole de culturede 25 cm 2 .
- Ajouter environ 5 000 CSP à la fiole de culture et transférer la fiole dans l’incubateur à CO2 (37 °C, 5 % de CO2).
- Après 24-48 h, transférer les CSP dans une nouvelle fiole avec la phase solide (sérum bovin) et ajouter 1 mL du même milieu liquide frais par fiole. Transférer les flacons dans l’incubateur à CO2 (37 °C, 5 % de CO2).
- Tous les 5 à 7 jours, remplacez le milieu par un milieu liquide frais en fonction des changements de couleur du milieu de culture et de la proportion estimée de CSP différenciés.
REMARQUE: Les protoscoléces réagissent rapidement aux changements environnementaux après avoir été cultivées, et la plupart d’entre elles subissent une différenciation dans les 2-3 semaines. En raison de la consommation de nutriments et de la croissance et du développement des protoscolèces, le pH du milieu de culture change et sa couleur se déplace vers l’orange et le jaune.
3. Culture monophasique de CSP d’E. granulosus
- Assurez-vous que la culture monophasique est faite 24-48 h avant la transduction.
- Culture ~5 000 CSP dans une fiole de culture de 25 cm2 avec RPMI et 10% de sérum bovin fœtal (FBS).
- Transférer les flacons dans l’incubateur à CO2 (37 °C, 5 % de CO2) jusqu’à utilisation.
4. Culture cellulaire pour la production et la préparation de virus
REMARQUE: Des cellules 293T (HEK293T) embryonnaires humaines ont été obtenues pour la production de vecteurs au centre de recherche sur la pathologie et les cellules souches de l’Université des sciences médicales de Kerman.
- Transférer 5 × 10 cellules HEK293T dans une fiole de 25 cm2 contenant 5 mL de DMEM avec 10 % de FBS, 100 U/mL de pénicilline et 100 μg/mL de streptomycine.
- Incuber les cellules HEK293T à 37 °C dans 5 % de CO2 et les passer dans le milieu de culture complet toutes les 48 h. Enfin, utilisez des cellules HEK293T à faible passage pour la transduction20.
5. Production et préparation du virus avec les vecteurs lentiviraux de troisième génération
REMARQUE: Le vecteur lentivirus pCDH513b (vecteur de transfert) et PLPII, PLPI et PMD2G (vecteurs auxiliaires) ont été utilisés pour exprimer le gène rapporteur GFP. Voir le tableau des matériaux et la figure supplémentaire S1.
- Jour 1 :
- Après avoir trypsinisé les cellules HEK293T21 dans des plaques de culture à 6 puits, ensemencez 7 × 104 cellules par puits avec du DMEM frais sans antibiotique contenant 10% de FBS.
- Utilisez des cellules à une confluence de 50% à 60% pour la transduction par la méthode du phosphate de calcium.
- Jour 2:
- Remplacez le milieu de culture cellulaire 2-3 h avant l’expérience avec du DMEM frais sans antibiotique contenant 2% de FBS.
- Dans un tube de 1,5 mL, mélanger les plasmides lentiviraux de troisième génération, y compris 7 μg/μL pCDH513b (vecteur de transfert), 4 μg/μL PLPII, 4 μg/μL PLPI et 2 μg/μL PMD2G (vecteurs auxiliaires).
- Ajouter le tampon HEPES (0,28 M NaCl, 0,05 M HEPES et 1,5 mM Na2HPO4; plage de pH optimale, 7,00-7,28) au mélange à un volume de 422 μL.
- Ajouter 16 μL de tampon Tris-EDTA (TE) à 1 % au mélange.
- Ajouter 62 μL de chlorure de calcium de 2,5 mM aux tubes et bien mélanger.
- Ajouter 500 μL de 2x solution saline tamponnée HEPES (HBS) au mélange, goutte à goutte, dans les 1-2 minutes à l’aide d’une pipette Pasteur. Mélanger doucement jusqu’à l’obtention d’une solution semi-opaque et incuber le mélange pendant 20 min à température ambiante.
- Ajouter le mélange à chaque plaque lentement et le répartir avec des mouvements circulaires lents.
- Incuber les plaques à 37 °C dans un incubateur à 5 % de CO2 et remplacer le milieu après 4-6 h par du DMEM sans antibiotique contenant 10 % de FBS.
- Jour 3:
- Confirmer la transduction transitoire réussie et la viabilité cellulaire à l’aide d’un microscope à fluorescence inversée.
- Jour 4:
- Récoltez les virus du milieu de culture en collectant le surnageant de chaque puits et conservez-les à -70 °C jusqu’à leur utilisation.
REMARQUE: Les lentivirus récoltés pourraient être concentrés et titrés pour une transfection précise22.
- Récoltez les virus du milieu de culture en collectant le surnageant de chaque puits et conservez-les à -70 °C jusqu’à leur utilisation.
6. Transduction transitoire de différents stades d’E. granulosus avec le virus
- Jour 1 :
- Utilisez une plaque de culture à 12 puits pour le transfert de gènes. Culture 5 × 103-5 × 104 cellules HEK293T en triple, avec un milieu DMEM complet comme référence interne.
- Culture 150 PSC frais en triple exemplaire en RPMI et 10% FBS.
- Culture 30 vers strobilés en triple exemplaire dans du DMEM contenant 10% de FBS inactivés par la chaleur.
REMARQUE: Tous les milieux de transduction doivent être sans antibiotiques. Conservez trois puits témoins non traités pour les cellules HEK293T, les CSP et les vers strobilés dans le processus. - Préparer un mélange de 1 × 106 virus avec un réactif de transfection de 4 μg/mL (voir la Table des matériaux) pour transduire les cellules HEK293T et les différents stades du ver.
- Ajouter le mélange à chaque plaque lentement et le répartir avec des mouvements circulaires lents. Incuber les plaques pendant 4-6 h dans un incubateur à CO2 (37 °C, 5% co2). Remplacer le milieu de chaque échantillon par le même milieu de culture complet afin de minimiser les effets toxiques du réactif de transfection.
- Jour 2:
- Répétez les étapes 6.1.4 à 6.1.5 pour augmenter l’efficacité de la transduction transitoire pour les cellules HEK293T, les PSC et les vers strobilés.
- Incuber toutes les plaques pendant 24-48 h dans un incubateur à CO2 avec les mêmes conditions de culture en fonction du type de milieu cellulaire.
- Jour 3:
- Vérifiez si la transduction réussit en utilisant la microscopie à fluorescence.
REMARQUE: Envisagez d’utiliser d’autres tests de confirmation comme la PCR / qPCR20,23 ou les techniques de transfert Western24 dans la procédure de transfert de gènes.
- Vérifiez si la transduction réussit en utilisant la microscopie à fluorescence.
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Representative Results
Nous décrivons ici une technique de transduction transitoire rapide et efficace chez E. granulosus en utilisant des vecteurs lentiviraux de troisième génération. Nous avons cultivé des CSP dans un milieu de culture biphasique pour obtenir des vers strobilés, comme décrit précédemment25,26. Les protoscolèces se développent en vers strobilés après 6 semaines in vitro. Différents stades d’E. granulosus ont été observés dans le milieu de culture biphasique, y compris les CSP invaginés (Figure 2A), les CSP évacués (Figure 2B) et les vers strobilés avec première et troisième formation de proglottes (Figure 2C-E). Les protoscolèces et les vers strobilés obtenus à partir de cultures monophasiques et biphasiques, respectivement, ont été transfectés avec des lentivirus exprimant la GFP (Figure 3). Pour éviter les effets d’autofluorescence, des observations microscopiques ont été comparées à la fluorescence de fond dans les trois groupes d’échantillons, et tous les échantillons au-dessus de ce niveau de fond ont été considérés comme transfectés.
Nous avons ajusté l’éclairage du champ et abaissé l’obturateur pour éviter toute émission d’autofluorescence possible dans les échantillons de contrôle pour chaque traitement. Nous avons ensuite vérifié des échantillons traités par vecteur lentiviral, dans lesquels l’émission de lumière verte contre un champ noir était considérée comme une transduction transitoire efficace. Cellules HEK293T - le contrôle du processus de transduction transitoire - GFP clairement exprimé (Figure 3D). Les vers adultes exprimaient la BPF le plus distinctement dans la couche tégumentale (figure 3F); toutefois, les CSP ont démontré un niveau un peu plus faible d’expression de la GFP après 48 h. Certains résidus de liquide kystique et/ou débris de couche germinale autour des CSP ont provoqué une certaine fluorescence en arrière-plan dans les échantillons transfectés. L’intensité de la fluorescence dans les cellules HEK293T et les vers strobilés a augmenté après 24 h et 48 h (des changements mineurs ont été observés dans les CSP).
Figure 1 : Présentation schématique du protocole d’étude. Abréviation : PSCs = protoscoléces. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 2 : Les différents stades d’Echinococcus granulosus en milieu de culture biphasique. (A) CSP invaginés, (B) CSP évaginés, (C, D) vers en cours de strobilation, (E) vers strobilés avec troisième formation de proglottes, (F) vers à différents stades de strobilation dans le milieu de culture. Barres d’échelle = 200 μm. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 3: Transduction transitoire des différents stades d’Echinococcus granulosus et de la lignée cellulaire témoin en microscopie à lumière et à fluorescence. (A,D) Cellules HEK293T comme contrôle du processus de transduction, (B, E) protoscolèces et (C, F) vers strobilés. (G, H, I) Microscopie mixte de lumière et de florescence. Barres d’échelle = 50 μm, 100 μm et 500 μm. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure supplémentaire S1 : Carte du vecteur de clonage et d’expression de l’ADNc pCDH-CMV-MCS-EF1-GreenPuro. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.
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Discussion
Comprendre la base moléculaire des nématodes et la biologie de Platyhelminthes est crucial pour comprendre la pathogénicité des parasites zoonotiques27. L’absence d’un système efficace d’évaluation des gènes est un obstacle majeur à l’interprétation directe de la génétique fonctionnelle des parasites cestodes, y compris les espèces d’Echinococcus 12,27. La présente étude démontre l’excellent potentiel du lentivirus dans la transduction transitoire d’E. granulosus.
La transduction lentivirale combine la simplicité d’utilisation et la rapidité de la transduction transitoire avec la forte expression de lignées cellulaires stables pour délivrer des transgènes aux cellules de mammifères28. L’objectif principal de ce travail était d’illustrer le processus de transduction du vecteur lentiviral, qui sera essentiel dans la recherche future sur l’échinococcose.
Des points critiques spécifiques doivent être notés dans ce protocole. Des conditions de flux de travail stériles strictes doivent être observées en raison de l’omission d’antibiotiques dans le milieu de culture, sans lesquelles une contamination bactérienne et fongique peut être attendue après 24 heures. La contamination microbienne réduit la motilité et la viabilité des parasites, et les échantillons transfectés et témoins seront perdus après 72 h.
La sélection des étapes appropriées du cycle de vie des Platyhelminthes et des conditions de culture appropriées est la clé d’une transductiongénique réussie 12,27. Nous avons testé notre méthode de transduction lentivirale dans les stades métacestode et strobilé. Les résultats ont montré que les vers strobilés étaient plus sensibles à la transduction transitoire du gène que les CSP, ce qui pourrait être le résultat de la structure tégumentale étendue dans les formes strobilées. Cependant, en raison de la nature de la transduction lentivirale, l’intensité de fluorescence dans les CSP multicellulaires et les vers strobilés est généralement beaucoup plus faible que dans les cellules monocouches HEK293T26.
Le potentiel de l’utilisation d’Echinococcus comme nouveau modèle chez les vers plats pour l’étude des phénomènes biologiques a longtemps été discuté. Par conséquent, une meilleure compréhension de la biologie de l’échinocoque en tant qu’organisme modèle peut être utile pour élargir la recherche sur les cellules souches et réguler l’expression génique et la biologie évolutive d’autres platyhelminthes 8,29,30,31,32. Il existe un besoin urgent de recherche génétique appliquée aux niveaux génomique et transcriptomique pour Echinococcus et divers systèmes modèles de vers plats parasites et libres. Par conséquent, le développement d’un processus efficace de transfert de gènes pour les ténias ouvre la voie à de nouvelles techniques, telles que l’entrée de gènes à base de virus ou l’édition de gènes médiée par CRISPR-Cas32,33. Ce travail présente la transduction lentivirale dans un modèle de ténia et démontre des résultats prometteurs, avec des implications potentielles pour la biologie des vers plats. Cependant, des études plus approfondies sont nécessaires pour améliorer la méthode et développer l’applicabilité de cette technique pour de futures expériences.
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Disclosures
Les auteurs n’ont aucun conflit d’intérêts à divulguer.
Acknowledgments
La recherche rapportée dans cette publication a été soutenue par Elite Researcher Grant Committee sous le numéro de bourse 958680 de l’Institut national pour le développement de la recherche médicale (NIMAD), Téhéran, Iran.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 12-well culture plates | SPL Life Sciences | 30012 | |
| 25 cm2 culture flask | SPL Life Sciences | 70325 | |
| 6-well culture plates | SPL Life Sciences | 30006 | |
| Calcium chloride | Sigma-Aldrich | C4901-500G | Working concentration: 2.5 mM |
| CMRL 1066 medium | Thermo Fisher Scientific | 11530037 | |
| CO2 incubator | memmert | ICO150 | |
| D-(+)-Glucose | Sigma-Aldrich | G8270-1KG | |
| DMEM | Life Technology | 12100046 | |
| Dog bile | Isolated from a euthanized dog and sterilized by 0.2 μm syringe filter | ||
| Eosin Y | Sigma-Aldrich | E4009-5G | prepare 0.1% of Eosin for working exclusion test |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | DNAbiotech | DB9723-100ml | Heat inactivation of FBS (30 min in 40 °C) |
| Fetal Calf Serum (FCS) | DNAbiotech | DB9724-100ml | Heat inactivation of FCS (30 min in 40 °C) |
| HEK293T cells | BONbiotech | BN_0012.1.14 | Human embryonic kidney 293T |
| HEPES buffered saline (HBS) | Sigma-Aldrich | 51558-50ML | 2x concentrate |
| Inverted fluorescence microscope | OLYMPUS | IX51 | |
| Penicillin | Sigma-Aldrich | P3032-10MU | Working concentration: 100 IU/mL |
| Pepsin | Roche | 10108057001 | Working concentration: 2 mg/mL, pH 2 |
| Phosphate-buffered saline (PBS) | DNAbiotech | DB0011 | This reagent solve in less than 1 min in D.W |
| Polybrene (Transfection reagent) | Sigma-Aldrich | TR-1003-G | |
| RPMI medium | BioIdea | BI-1006-05 | |
| Sodium bicarbonate (NaHCO3) | Sigma-Aldrich | S5761-1KG | |
| Streptomycin | Sigma-Aldrich | S9137-25G | Working concentration: 100 μg/mL |
| Third-generation lentiviral plasmid (pCDH513b) | SBI System Biosciences (BioCat GmbH) | CD513B-1-SBI | Transfer vector (obtained commercially from Molecular Medicine Research Department of Iranian Academic Center for Education, Culture and Research (ACECR), Mashhad, Iran) |
| Third-generation lentiviral plasmid (pLPI and pLPII) | Invitrogen (Life Technologies) | K4975-00 | Helper vector (obtained commercially from Molecular Medicine Research Department of Iranian Academic Center for Education, Culture and Research (ACECR), Mashhad, Iran) |
| Third-generation lentiviral plasmid (pMD2G) | Addgene | Plasmid 12259 | Helper vector (obtained commercially from Molecular Medicine Research Department of Iranian Academic Center for Education, Culture and Research (ACECR), Mashhad, Iran) |
| Tris/EDTA Buffer (TE) | DNAbiotech | DB9713-100ml | |
| Trypsin | Sigma-Aldrich | T9935-50MG | 1x working solutions (pH 7.4–7.6) |
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