Summary
Vi beskriver en hurtig forbigående transduktionsteknik i forskellige udviklingsstadier af Echinococcus granulosus ved hjælp af tredje generations lentivirale vektorer.
Abstract
Cystisk echinococcosis eller hydatid sygdom er en af de vigtigste zoonotiske parasitære sygdomme forårsaget af Echinococcus granulosus, en lille bændelorm, der er indeholdt i tarmene hos hjørnetænder. Der er et presserende behov for anvendt genetisk forskning for at forstå mekanismerne for patogenese og sygdomsbekæmpelse og forebyggelse. Manglen på et effektivt genevalueringssystem hindrer imidlertid en direkte fortolkning af cestodeparasitternes funktionelle genetik, herunder Echinococcus-arterne . Denne undersøgelse viser potentialet for lentiviral gentransduktion i metacestode og strobilerede former af E. granulosus. Protoscoleces (PSC'er) blev isoleret fra hydatidcyster og overført til specifikke bifasiske kulturmedier for at udvikle sig til strobilerede orme. Ormene blev transficeret med høstet tredje generations lentivirus sammen med HEK293T-celler som en transduktionsproceskontrol. En udtalt fluorescens blev påvist i de strobilerede orme over 24 timer og 48 timer, hvilket indikerer forbigående lentiviral transduktion i E. granulosus. Dette arbejde præsenterer det første forsøg på lentivirusbaseret forbigående transduktion i bændelorm og demonstrerer de lovende resultater med potentielle konsekvenser i eksperimentelle undersøgelser af fladormbiologi.
Introduction
Cystisk echinococcosis (CE) er en af de vigtigste helminth sygdomme forårsaget af Echinococcus granulosus, en lille bændelorm inden for familien Taeniidae 1,2. Omfattende undersøgelser af immundiagnostisk og vaccineudvikling for E. granulosus er blevet udført. Utilstrækkelig viden om det molekylære grundlag for parasitbiologi udgør imidlertid store begrænsninger i diagnosticering, styring og forebyggelse af hydatidsygdom 3,4,5,6.
På grund af udviklingen af genomsekventering og transkriptomiske metoder er der i de senere år udført en lang række molekylære undersøgelser på fladorme af flere forskergrupper 7,8,9. I parasitternes verden er fremskridtene inden for genoverførselsteknologi i parasitære fladorme dog stadig begrænsede sammenlignet med de meget reproducerbare transiente transduktionsmetoder, der er udviklet til nogle protozoer 10,11,12.
Brugen af virale leveringssystemer har vist sig at være et vigtigt redskab til transgenlevering og gen/ proteinundersøgelser i løbet af de sidste to årtier13. Lentivirus inficerer både delende og ikke-delende celler, hvilket gør det muligt at inficere postmitotiske celler 14,15,16. Nylige beviser tyder på, at brug af et lentivirusbaseret transduktionssystem i pattedyrceller giver mulighed for at overvinde de fleste af begrænsningerne i tidligere knock-in / knock-down teknikker. Design og konstruktion af ekspressionslentivirale vektorer med passende molekylære markører, såsom GFP-ekspression, er tidligere beskrevet16. Derfor evaluerer vi lentiviral transient transduktion af et GFP-reportergen i protoscoleces og strobilated orme af E. granulosus.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Denne undersøgelse blev godkendt af National Institute for Medical Research Development og Research Ethics Review Committee, nr. 958680. Lentivirus er klassificeret som BSL-2 organismer; derfor blev alle laboratoriekulturprocedurer i denne protokol udført ved hjælp af steril laboratoriepraksis og udført under en laminær flowhætte i henhold til NIH-retningslinjer. Figur 1 viser en skematisk præsentation af undersøgelsesprotokollen for de forskellige E. granulosus-stadier .
1. Indsamling af hydatidcyster
- Indsamle leverhydatidcyster fra naturligt inficerede får, der rutinemæssigt slagtes på et slagteri.
- Steriliser cysteoverfladen fuldstændigt ved hjælp af sterilt gasbind og 70% alkohol, før protoscoleces (PSC'er) aspireres.
- Aspirer 20-50 ml hydatidvæske ud i sterile 50 ml koniske rør.
- Efter dræning skal du blotte cysten med et skarpt blad, overføre kimlaget til et sterilt 50 ml konisk rør og ryste det i en kort periode (~ 2 min) for at øge samlingen af PSC'er. Overfør kimlaget til et nyt 1,5 ml rør til molekylær karakterisering.
- PSC'erne vaskes 3-5x med fosfatbufferet saltvand (PBS).
- Psc'erne observeres i 0,1% eosin i 5 minutter for at bestemme PSC-levedygtigheden under et lysmikroskop. Brug PSC'er med mindst 95% levedygtighed for kultur.
- Behandl PSC-bundfaldet med 2 ml pepsin (2 mg / ml, pH 2) i 15-20 minutter.
- For at isolere individuelle PSC'er skal PSC-sedimentet resuspenderes i PBS og føre det gennem to lag sterilt gasbind til et nyt sterilt 50 ml konisk rør.
BEMÆRK: Beregn gennemsnittet af tre tællinger på 50 μL PSC-sedimenter ved hjælp af et lysmikroskop. Til efterfølgende forsøg skal du bruge den estimerede værdi til at bestemme PSC'er /μL. Hvert hydatidcystisolat skal karakteriseres baseret på nukleotidpolymorfier ved molekylære metoder, såsom PCR-sekventering17 eller højopløsnings smeltekurveanalyse18.
2. Bifasisk dyrkning af PSC'er af E. granulosus for at opnå voksne orme
BEMÆRK: Isolerede PSC'er skal dyrkes under sterile forhold under et laminært flowskab klasse II. Forbered de faste og flydende faser af det bifasiske kulturmedium separat, inden du går videre til næste trin19.
- Forbered det bifasiske kulturmedium til at bestå af to faser.
- I den faste fase tilsættes 10 ml bovint serum til en 25 ml kolbe og lade den koagulere ved 76 °C i 20-30 minutter.
- Til væskefasen (modificeret CMRL) blandes 100 ml varmeinaktiveret føtalt kalveserum (FCS), 36 ml 5% gærekstrakt, 5,6 ml 30% glucose (i destilleret vand), 1,4 ml 5% hundegald i PBS, 20 mM HEPES-buffer og 10 ml NaHCO3 i 260 ml CMRL-1066-medium. Til sidst tilsættes penicillin (100 IE/ml) og streptomycin (100 mg/ml) til blandingen.
- Der tilsættes 10 ml væskefasemedium til hver 25 cm2 kulturkolbe.
- Der tilsættes ~5.000 PSC'er til kulturkolben, og kolben overføres til CO2 -inkubatoren (37 °C, 5 % CO2).
- Efter 24-48 timer overføres PSC'erne til en ny kolbe med fast fase (bovint serum) og der tilsættes 1 ml af det samme friske flydende fasemedium pr. kolbe. Kolberne overføres til CO2 -inkubatoren (37 °C, 5 % CO2).
- Hver 5-7 dage udskiftes mediet med frisk flydende fasemedium baseret på ændringer i kulturmediets farve og den estimerede andel af differentierede PSC'er.
BEMÆRK: Protoscoleces reagerer hurtigt på miljøændringer efter dyrkning, og de fleste af dem gennemgår differentiering inden for 2-3 uger. På grund af forbruget af næringsstoffer og protoscoleces vækst og udvikling ændres kulturmediets pH, og dets farve skifter mod orange og gul.
3. Monofasisk dyrkning af PSC'er af E. granulosus
- Sørg for, at monofasisk dyrkning udføres 24-48 timer før transduktion.
- Dyrkning ~ 5.000 PSC'er i en 25 cm2 kulturkolbe med RPMI og 10% føtalt bovint serum (FBS).
- Kolberne overføres til CO2 -inkubatoren (37 °C, 5 % CO2) indtil brug.
4. Cellekultur til virusproduktion og -forberedelse
BEMÆRK: Humane embryonale nyre 293T (HEK293T) celler blev opnået til vektorproduktion fra Pathology and Stem Cell Research Center, Kerman University of Medical Sciences.
- Overfør 5 × 105 HEK293T-celler til en 25 cm2 kolbe indeholdende 5 ml DMEM med 10% FBS, 100 U / ml penicillin og 100 μg / ml streptomycin.
- HEK293T-cellerne inkuberes ved 37 °C i 5 % CO2 , og de føres i det komplette dyrkningsmedium hver 48. time. Endelig skal du bruge HEK293T-celler med lav passage til transduktion20.
5. Produktion og fremstilling af viruset med tredje generationens lentivirale vektorer
BEMÆRK: Lentivirusvektoren pCDH513b (overførselsvektor) og PLPII, PLPI og PMD2G (hjælpervektorer) blev brugt til at udtrykke GFP-reportergenet. Se materialetabel og supplerende figur S1.
- Dag 1:
- Efter forsøg på HEK293T-cellerne21 i 6-brønds kulturplader, frø 7 × 104 celler pr. Brønd med frisk antibiotikafri DMEM indeholdende 10% FBS.
- Brug celler ved 50% -60% sammenløb til transduktion ved calciumphosphatmetoden.
- Dag 2:
- Udskift cellekulturmediet 2-3 timer før forsøget med frisk antibiotikafri DMEM indeholdende 2% FBS.
- I et 1,5 ml rør blandes tredjegenerations lentivirale plasmider, herunder 7 μg/μL pCDH513b (overførselsvektor), 4 μg/μL PLPII, 4 μg/μL PLPI og 2 μg/μL PMD2G (hjælpervektorer).
- Der tilsættes HEPES-buffer (0,28 M NaCl, 0,05 M HEPES og 1,5 mM Na2HPO4; optimalt pH-område, 7,00-7,28) til blandingen til et volumen på 422 μL.
- Der tilsættes 16 μL 1% Tris-EDTA (TE) buffer til blandingen.
- Tilsæt 62 μL 2,5 mM calciumchlorid til rørene og bland godt.
- Tilsæt 500 μL 2x HEPES-bufferet saltvand (HBS) til blandingen, dråbe for dråbe, inden for 1-2 minutter ved hjælp af en Pasteur-pipette. Bland forsigtigt, indtil der opnås en semi-uigennemsigtig opløsning, og inkuber blandingen i 20 minutter ved stuetemperatur.
- Tilsæt blandingen langsomt til hver plade og fordel den med langsomme cirkulære bevægelser.
- Pladerne inkuberes ved 37 °C i en 5% CO2-inkubator , og mediet udskiftes efter 4-6 timer med antibiotikafrit DMEM indeholdende 10% FBS.
- Dag 3:
- Bekræft vellykket forbigående transduktion og cellelevedygtighed ved hjælp af et omvendt fluorescensmikroskop.
- Dag 4:
- Høst vira fra dyrkningsmediet ved at samle hver brønds supernatant og opbevar dem ved -70 ° C indtil brug.
BEMÆRK: Høstede lentivirus kunne koncentreres og titreres for præcis transfektion22.
- Høst vira fra dyrkningsmediet ved at samle hver brønds supernatant og opbevar dem ved -70 ° C indtil brug.
6. Forbigående transduktion af forskellige stadier af E. granulosus med virussen
- Dag 1:
- Brug en 12-brønds kulturplade til genoverførsel. Kultur 5 × 103-5 × 104 HEK293T celler i tre eksemplarer, med komplet DMEM-medium som intern reference.
- Kultur 150 friske PSC'er i tre eksemplarer i RPMI og 10% FBS.
- Kultur 30 strobilerede orme i tre eksemplarer i DMEM indeholdende 10% varmeinaktiveret FBS.
BEMÆRK: Alle transduktionsmedier skal være antibiotikafrie. Opbevar tre ikke-behandlede kontrolbrønde til HEK293T-celler, PSC'er og strobilerede orme i processen. - Forbered en blanding af 1 × 106 vira med 4 μg / ml transfektionsreagens (se materialetabellen) for at transducere HEK293T-cellerne og forskellige stadier af ormen.
- Tilsæt blandingen langsomt til hver plade og fordel den med langsomme cirkulære bevægelser. Inkuber pladerne i 4-6 timer i en CO2-inkubator (37 ° C, 5% CO2). Substratet for hver prøve erstattes med det samme komplette dyrkningsmedium for at minimere transfektionsreagensets toksiske virkninger.
- Dag 2:
- Trin 6.1.4-6.1.5 gentages for at øge effektiviteten af forbigående transduktion for HEK293T-celler, PSC'er og strobilerede orme.
- Inkuber alle pladerne i 24-48 timer i en CO2-inkubator med de samme kulturbetingelser baseret på typen af cellemedier.
- Dag 3:
- Kontroller, om transduktionen er vellykket ved hjælp af fluorescensmikroskopi.
BEMÆRK: Overvej at bruge yderligere bekræftende assays som PCR / qPCR20,23 eller Western blotting24 teknikker i genoverførselsproceduren.
- Kontroller, om transduktionen er vellykket ved hjælp af fluorescensmikroskopi.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Her beskriver vi en hurtig og effektiv transient transduktionsteknik i E. granulosus ved hjælp af tredje generations lentivirale vektorer. Vi dyrkede PSC'er i et bifasisk dyrkningsmedium for at opnå strobilerede orme, som beskrevet tidligere25,26. Protoscoleces udvikler sig til strobilerede orme efter 6 uger in vitro. Forskellige stadier af E. granulosus blev observeret i det bifasiske dyrkningsmedium, herunder invaginerede PSC'er (figur 2A), evaginerede PSC'er (figur 2B) og strobilerede orme med første og tredje proglottiddannelse (figur 2C-E). Protoscoleces og de strobilerede orme opnået fra henholdsvis monofasiske og bifasiske kulturer blev transficeret med GFP-ekspressive lentivirus (figur 3). For at undgå autofluorescenseffekter blev mikroskopiske observationer sammenlignet med baggrundsfluorescensen i alle tre grupper af prøver, og alle prøver over dette baggrundsniveau blev betragtet som transinficerede.
Vi justerede feltbelysningen og sænkede lukkeren for at forhindre enhver mulig autofluorescensemission i kontrolprøverne for hver behandling. Vi kontrollerede derefter lentivirale vektorbehandlede prøver, hvor emission af grønt lys mod et sort felt blev betragtet som effektiv forbigående transduktion. HEK293T-celler - den forbigående transduktionsproceskontrol - klart udtrykt GFP (figur 3D). De voksne orme udtrykte GFP tydeligst i tegumentallaget (figur 3F); PSC'er demonstrerede dog et noget lavere niveau af GFP-udtryk efter 48 timer. Nogle cystevæskerester og / eller kimlagsaffald omkring PSC'erne forårsagede en vis fluorescens i baggrunden i de transinficerede prøver. Intensiteten af fluorescens i HEK293T-celler og strobilerede orme steg efter 24 timer og 48 timer (mindre ændringer blev observeret i PSC'er).
Figur 1: En skematisk præsentation af undersøgelsesprotokollen. Forkortelse: PSC 'er = protoscoleces. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 2: De forskellige stadier af Echinococcus granulosus i bifasisk dyrkningsmedium. (A) Invaginerede PSC'er, (B) evaginerede PSC'er, (C, D) orme i strobilationsprocessen, (E) strobilerede orme med tredje proglottiddannelse, (F) orme i forskellige stadier af strobilation i kulturmediet. Skalabjælker = 200 μm. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 3: Transient transduktion af forskellige stadier af Echinococcus granulosus og kontrolcellelinjen i lys- og fluorescensmikroskopi. (A,D) HEK293T-celler som transduktionsproceskontrol, (B, E) protoscoleces og (C, F) strobilerede orme. (G, H, I) Blandet lys og florescensmikroskopi. Skalastænger = 50 μm, 100 μm og 500 μm. Klik her for at se en større version af denne figur.
Supplerende figur S1: Kort over pCDH-CMV-MCS-EF1-GreenPuro cDNA kloning og ekspressionsvektor. Klik her for at downloade denne fil.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
At forstå det molekylære grundlag for nematoder og Platyhelminthes biologi er afgørende for at forstå patogeniciteten af zoonotiske parasitter27. Manglen på et effektivt genevalueringssystem er en væsentlig hindring for den direkte fortolkning af cestodeparasitternes funktionelle genetik, herunder Echinococcus-arterne 12,27. Denne undersøgelse viser det fremragende potentiale af lentivirus i E. granulosus forbigående transduktion.
Lentiviral transduktion kombinerer enkelheden i brugen og hastigheden af forbigående transduktion med den stærke ekspression af stabile cellelinjer for at levere transgener til pattedyrceller28. Hovedformålet med dette arbejde var at illustrere processen med lentiviral vektortransduktion, som vil være kritisk i fremtidig Echinococcosis-forskning.
Specifikke kritiske punkter skal noteres i denne protokol. Strenge sterile arbejdsgangsbetingelser skal overholdes på grund af udeladelsen af antibiotika i kulturmediet, uden hvilken bakteriel og svampeforurening kan forventes efter 24 timer. Mikrobiel kontaminering reducerer parasitternes bevægelighed og levedygtighed, og både transinficerede og kontrolprøver vil gå tabt efter 72 timer.
Valg af passende stadier i Platyhelminthes livscyklus og egnede dyrkningsbetingelser er nøglen til vellykket gentransduktion12,27. Vi testede vores lentivirale transduktionsmetode i metacestode og strobilated stadier. Resultaterne viste, at strobilerede orme var mere lydhøre over for forbigående transduktion af genet end PSC'erne, hvilket kan være resultatet af den omfattende tegumentale struktur i de strobilerede former. På grund af arten af lentiviral transduktion er fluorescensintensiteten i de flercellede PSC'er og strobilerede orme typisk meget lavere end i monolag HEK293T-celler26.
Potentialet for at bruge Echinococcus som en ny model i flatworms til at studere biologiske fænomener er længe blevet diskuteret. Derfor kan en bedre forståelse af Echinococcus biologi som en modelorganisme være nyttig til at udvide stamcelleforskning og regulere genekspression og evolutionær biologi af andre platyhelminths 8,29,30,31,32. Der er et presserende behov for anvendt genetisk forskning på genomiske og transkriptomiske niveauer for Echinococcus og forskellige parasitære og fritlevende flatworm modelsystemer. Derfor baner udviklingen af en effektiv genoverførselsproces for bændelorm vejen for nye teknikker, såsom virusbaseret gen knock-in eller CRISPR-Cas-medieret genredigering32,33. Dette arbejde præsenterer lentiviral transduktion i en bændelormsmodel og demonstrerer lovende resultater med potentielle konsekvenser for fladormbiologi. Der er dog behov for mere dybtgående undersøgelser for at forbedre metoden og udvikle anvendeligheden af denne teknik til fremtidige eksperimenter.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingen interessekonflikter at afsløre.
Acknowledgments
Forskning rapporteret i denne publikation blev støttet af Elite Researcher Grant Committee under tildelingsnummer 958680 fra National Institute for Medical Research Development (NIMAD), Teheran, Iran.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 12-well culture plates | SPL Life Sciences | 30012 | |
| 25 cm2 culture flask | SPL Life Sciences | 70325 | |
| 6-well culture plates | SPL Life Sciences | 30006 | |
| Calcium chloride | Sigma-Aldrich | C4901-500G | Working concentration: 2.5 mM |
| CMRL 1066 medium | Thermo Fisher Scientific | 11530037 | |
| CO2 incubator | memmert | ICO150 | |
| D-(+)-Glucose | Sigma-Aldrich | G8270-1KG | |
| DMEM | Life Technology | 12100046 | |
| Dog bile | Isolated from a euthanized dog and sterilized by 0.2 μm syringe filter | ||
| Eosin Y | Sigma-Aldrich | E4009-5G | prepare 0.1% of Eosin for working exclusion test |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | DNAbiotech | DB9723-100ml | Heat inactivation of FBS (30 min in 40 °C) |
| Fetal Calf Serum (FCS) | DNAbiotech | DB9724-100ml | Heat inactivation of FCS (30 min in 40 °C) |
| HEK293T cells | BONbiotech | BN_0012.1.14 | Human embryonic kidney 293T |
| HEPES buffered saline (HBS) | Sigma-Aldrich | 51558-50ML | 2x concentrate |
| Inverted fluorescence microscope | OLYMPUS | IX51 | |
| Penicillin | Sigma-Aldrich | P3032-10MU | Working concentration: 100 IU/mL |
| Pepsin | Roche | 10108057001 | Working concentration: 2 mg/mL, pH 2 |
| Phosphate-buffered saline (PBS) | DNAbiotech | DB0011 | This reagent solve in less than 1 min in D.W |
| Polybrene (Transfection reagent) | Sigma-Aldrich | TR-1003-G | |
| RPMI medium | BioIdea | BI-1006-05 | |
| Sodium bicarbonate (NaHCO3) | Sigma-Aldrich | S5761-1KG | |
| Streptomycin | Sigma-Aldrich | S9137-25G | Working concentration: 100 μg/mL |
| Third-generation lentiviral plasmid (pCDH513b) | SBI System Biosciences (BioCat GmbH) | CD513B-1-SBI | Transfer vector (obtained commercially from Molecular Medicine Research Department of Iranian Academic Center for Education, Culture and Research (ACECR), Mashhad, Iran) |
| Third-generation lentiviral plasmid (pLPI and pLPII) | Invitrogen (Life Technologies) | K4975-00 | Helper vector (obtained commercially from Molecular Medicine Research Department of Iranian Academic Center for Education, Culture and Research (ACECR), Mashhad, Iran) |
| Third-generation lentiviral plasmid (pMD2G) | Addgene | Plasmid 12259 | Helper vector (obtained commercially from Molecular Medicine Research Department of Iranian Academic Center for Education, Culture and Research (ACECR), Mashhad, Iran) |
| Tris/EDTA Buffer (TE) | DNAbiotech | DB9713-100ml | |
| Trypsin | Sigma-Aldrich | T9935-50MG | 1x working solutions (pH 7.4–7.6) |
References
- Deplazes, P., et al. Global distribution of alveolar and cystic echinococcosis. Advances in Parasitology. 95, 315 (2017).
- Borhani, M., et al. Echinococcoses in Iran, Turkey, and Pakistan: Old diseases in the new millennium. Clinical Microbiology Reviews. 34 (3), 0029020 (2021).
- Eckert, J., Thompson, R. C. A.
- Romig, T., et al. Ecology and life cycle patterns of Echinococcus species. Advances in Parasitology. 95, 213 (2017).
- Craig, P. S., Hegglin, D., Lightowlers, M. W., Torgerson, P. R., Wang, Q.
- Deplazes, P., et al. Global distribution of alveolar and cystic echinococcosis. Advances in Parasitology. 95 (1), 315 (2017).
- Tsai, I. I. J., et al. The genomes of four tapeworm species reveal adaptations to parasitism. Nature. 496 (7443), 57-63 (2013).
- Koziol, U., Brehm, K. Recent advances in Echinococcus genomics and stem cell research. Veterinary Parasitology. 213 (3-4), 92-102 (2015).
- Zheng, H., et al. The genome of the hydatid tapeworm Echinococcus granulosus. Nature Genetics. 45 (10), 1168-1175 (2013).
- Pérez-Victoria, J. M., Torres, A. P. T. C., Gamarro, F., Castanys, S. ABC transporters in the protozoan parasite Leishmania. International Microbiology. 4 (3), 159-166 (2001).
- Ehrenkaufer, G. M., Singh, U. Transient and stable transfection in the protozoan parasite Entamoeba invadens. Molecular and Biochemical Parasitology. 184 (1), 59-62 (2012).
- Moguel, B., Bobes, R. J., Carrero, J. C., Laclette, J. P.
- Tang, Y., Garson, K., Li, L., Vanderhyden, B. C. Optimization of lentiviral vector production using polyethylenimine-mediated transfection. Oncology Letters. 9 (1), 55-62 (2015).
- Mann, V. H., Suttiprapa, S., Rinaldi, G., Brindley, P. J.
- Balcaitis, S., Weinstein, J. R., Li, S., Chamberlain, J. S., Möller, T.
- Sastry, L., Johnson, T., Hobson, M. J., Smucker, B., Cornetta, K. Titering lentiviral vectors: comparison of DNA, RNA and marker expression methods. Gene Therapy. 9 (17), 1155-1162 (2002).
- Bowles, J., Blair, D., McManus, D. P. Genetic variants within the genus Echinococcus identified by mitochondrial DNA sequencing. Molecular and Biochemical Parasitology. 54 (2), 165-173 (1992).
- Rostami, S., et al. High resolution melting technique for molecular epidemiological studies of cystic echinococcosis: differentiating G1, G3, and G6 genotypes of Echinococcus granulosus sensu lato. Parasitology Research. 112 (10), 3441-3447 (2013).
- Mousavi, S. M., et al. Biological and morphological consequences of dsRNA-induced suppression of tetraspanin mRNA in developmental stages of Echinococcus granulosus. Parasites and Vectors. 13 (1), 190 (2020).
- Afgar, A., et al. MiR-339 and especially miR-766 reactivate the expression of tumor suppressor genes in colorectal cancer cell lines through DNA methyltransferase 3B gene inhibition. Cancer Biology & Therapy. 17 (11), 1126-1138 (2016).
- Ricardo, R., Phelan, K. Trypsinizing and subculturing mammalian cells. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (16), e755 (2008).
- Wang, X., McManus, M.
- Li, M., Husic, N., Lin, Y., Snider, B. J. Production of lentiviral vectors for transducing cells from the central nervous system. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (63), e4031 (2012).
- Eslami, A., Lujan, J. Western blotting: sample preparation to detection. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (44), e2359 (2010).
- Dezaki, E. S., et al. Comparison of ex vivo harvested and in vitro cultured materials from Echinococcus granulosus by measuring expression levels of five genes putatively involved in the development and maturation of adult worms. Parasitology Research. 115 (11), 4405-4416 (2016).
- Mousavi, S. M., et al. Calmodulin-specific small interfering RNA induces consistent expression suppression and morphological changes in Echinococcus granulosus. Scientific Reports. 9 (1), 1-9 (2019).
- Aboobaker, A. A., Blaxter, M. L. Functional genomics for parasitic nematodes and platyhelminths. Trends in Parasitology. 20 (4), 178-184 (2004).
- Elegheert, J., et al. Lentiviral transduction of mammalian cells for fast, scalable and high-level production of soluble and membrane proteins. Nature Protocols. 13 (12), 2991 (2018).
- Mizukami, C., et al. Gene silencing in Echinococcus multilocularis protoscoleces using RNA interference. Parasitology International. 59 (4), 647-652 (2010).
- Thompson, R. C. A., Jenkins, D. J. Echinococcus as a model system: biology and epidemiology. International Journal for Parasitology. 44 (12), 865-877 (2014).
- Thompson, R. C. A. Biology and systematics of Echinococcus. Advances in Parasitology. Thompson, R. C. A., Deplazes, P., Lymbery, A. J. 95, 65-109 (2017).
- Brehm, K., Koziol, U. Echinococcus-host interactions at cellular and molecular levels. Advances in Parasitology. 95, 147-212 (2017).
- Moguel, B., et al. Transient transgenesis of the tapeworm Taenia crassiceps. SpringerPlus. 4, 496 (2015).
