Summary
We beschrijven een snelle transiënte transductietechniek in verschillende ontwikkelingsstadia van Echinococcus granulosus met behulp van lentivirale vectoren van de derde generatie.
Abstract
Cystische echinokokkose of hydatidziekte is een van de belangrijkste zoönotische parasitaire ziekten veroorzaakt door Echinococcus granulosus, een kleine lintworm in de darm van honden. Er is dringend behoefte aan toegepast genetisch onderzoek om de mechanismen van pathogenese en ziektebestrijding en -preventie te begrijpen. Het ontbreken van een effectief genevaluatiesysteem belemmert echter de directe interpretatie van de functionele genetica van cestodeparasieten, waaronder de Echinococcus-soorten . De huidige studie toont het potentieel aan van lentivirale gentransiënte transductie in de metacestode en gestrobileerde vormen van E. granulosus. Protoscoleces (PSC's) werden geïsoleerd uit hydatid cysten en overgebracht naar specifieke bifasische kweekmedia om zich te ontwikkelen tot gestrobileerde wormen. De wormen werden getransfecteerd met geoogst lentivirus van de derde generatie, samen met HEK293T-cellen als transductieprocescontrole. Een uitgesproken fluorescentie werd gedetecteerd in de gestrobileerde wormen gedurende 24 uur en 48 uur, wat wijst op voorbijgaande lentivirale transductie in E. granulosus. Dit werk presenteert de eerste poging tot lentivirus-gebaseerde transductie in lintwormen en toont de veelbelovende resultaten met mogelijke implicaties in experimentele studies over platwormbiologie.
Introduction
Cystische echinokokkose (CE) is een van de belangrijkste helmintziekten veroorzaakt door Echinococcus granulosus, een kleine lintworm binnen de familie Taeniidae 1,2. Uitgebreide studies over immunodiagnostische en vaccinontwikkeling voor E. granulosus zijn uitgevoerd. Onvoldoende kennis over de moleculaire basis van parasietbiologie vormt echter grote beperkingen in de diagnose, het beheer en de preventie van hydatidziekte 3,4,5,6.
In de afgelopen jaren is, als gevolg van de ontwikkeling van genoomsequencing en transcriptomische methoden, een breed scala aan moleculaire studies uitgevoerd op platwormen door verschillende onderzoeksgroepen 7,8,9. In de wereld van parasieten is de vooruitgang in genoverdrachtstechnologie bij parasitaire platwormen echter nog steeds beperkt in vergelijking met de zeer reproduceerbare transductiemethoden die zijn ontwikkeld voor sommige protozoa 10,11,12.
Het gebruik van virale toedieningssystemen is de afgelopen twee decennia naar voren gekomen als een essentieel hulpmiddel voor transgene levering en gen / eiwitonderzoeken13. Lentivirus infecteert zowel delende als niet-delende cellen, waardoor het mogelijk is om postmitotische cellen 14,15,16 te infecteren. Recent bewijs geeft aan dat het gebruik van een op lentivirus gebaseerd transductiesysteem in zoogdiercellen het potentieel biedt om de meeste beperkingen van eerdere knock-in / knock-down-technieken te overwinnen. Het ontwerp en de constructie van expressie lentivirale vectoren met geschikte moleculaire markers, zoals GFP-expressie, zijn eerder beschreven16. Daarom evalueren we lentivirale transiënte transductie van een GFP reporter-gen in de protoscoleces en gestrobileerde wormen van E. granulosus.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Deze studie werd goedgekeurd door het National Institute for Medical Research Development en de Research Ethics Review Committee, nr. 958680. Lentivirussen zijn geclassificeerd als BSL-2 organismen; daarom werden alle laboratoriumkweekprocedures in dit protocol uitgevoerd met behulp van steriele laboratoriumpraktijken en uitgevoerd onder een laminaire stromingskap volgens de NIH-richtlijnen. Figuur 1 toont een schematische presentatie van het onderzoeksprotocol voor de verschillende E. granulosusstadia .
1. Hydatid cysten verzamelen
- Verzamel leverhydatid cysten van natuurlijk geïnfecteerde schapen die routinematig worden geslacht in een slachthuis.
- Steriliseer het cysteoppervlak volledig met steriel gaas en 70% alcohol voordat u de protoscoleces (PSC's) aanzuigt.
- Aspirateer 20-50 ml hydatidvloeistof uit in steriele conische buisjes van 50 ml.
- Na het draineren, veeg de cyste uit met een scherp mes, breng de kiemlaag over in een steriele conische buis van 50 ml en schud deze gedurende een korte periode (~ 2 min) om de verzameling PSC's te vergroten. Breng de kiemlaag over naar een nieuwe buis van 1,5 ml voor moleculaire karakterisering.
- Was de PSC's 3-5x met fosfaat-gebufferde zoutoplossing (PBS).
- Observeer de PSC's in 0,1% eosine gedurende 5 minuten om de levensvatbaarheid van de PSC onder een lichtmicroscoop te bepalen. Gebruik PSC's met een levensvatbaarheid van ten minste 95% voor cultuur.
- Behandel het PSC-neerslag met 2 ml pepsine (2 mg/ml, pH 2) gedurende 15-20 minuten.
- Om individuele PSC's te isoleren, resuspendeert u het PSC-sediment in PBS en voert u het door twee lagen steriel gaas in een nieuwe steriele conische buis van 50 ml.
OPMERKING: Bereken het gemiddelde van drie tellingen op 50 μL PSC-sedimenten met behulp van een lichtmicroscoop. Gebruik voor volgende onderzoeken de geschatte waarde om PSC's/μL te bepalen. Elk hydatid cystisolaat moet worden gekarakteriseerd op basis van nucleotidepolymorfismen door moleculaire methoden, zoals PCR-sequencing17 of smeltcurveanalyse met hoge resolutie18.
2. Bifasische teelt van PSC's van E. granulosus om volwassen wormen te verkrijgen
OPMERKING: Geïsoleerde PSC's moeten in steriele omstandigheden worden gekweekt onder een laminaire stromingskast klasse II. Bereid de vaste en vloeibare fasen van het bifasische kweekmedium afzonderlijk voor voordat u doorgaat naar de volgende stappen19.
- Bereid het bifasische kweekmedium voor om uit twee fasen te bestaan.
- Voeg voor de vaste fase 10 ml runderserum toe aan een kolf van 25 ml en laat het gedurende 20-30 minuten stollen bij 76 °C.
- Meng voor de vloeibare fase (gemodificeerd CMRL) 100 ml warmte-geïnactiveerd foetaal kalfsserum (FCS), 36 ml 5% gistextract, 5,6 ml 30% glucose (in gedestilleerd water), 1,4 ml 5% hondengal in PBS, 20 mM HEPES-buffer en 10 mM NaHCO3 in 260 ml CMRL-1066 medium. Voeg ten slotte penicilline (100 IE / ml) en streptomycine (100 mg / ml) toe aan het mengsel.
- Voeg 10 ml van het vloeibare fasemedium toe aan elke kweekkolf van25 cm 2 .
- Voeg ~5.000 PSC's toe aan de kweekkolf en breng de kolf over naar de CO2-incubator (37 °C, 5% CO2).
- Breng na 24-48 uur de PSC's over in een nieuwe kolf met de vaste fase (runderserum) en voeg 1 ml van hetzelfde verse vloeibare fasemedium per kolf toe. Breng de kolven over in de CO2-incubator (37 °C, 5% CO2).
- Vervang het medium om de 5-7 dagen door vers vloeibaar fasemedium op basis van veranderingen in de kleur van het kweekmedium en het geschatte aandeel gedifferentieerde PSC's.
OPMERKING: Protoscoleces reageren snel op veranderingen in de omgeving nadat ze zijn gekweekt, en de meeste van hen ondergaan differentiatie binnen 2-3 weken. Door de consumptie van voedingsstoffen en de groei en ontwikkeling van protoscoleces verandert de pH van het kweekmedium en verschuift de kleur naar oranje en geel.
3. Monofasische teelt van psc's van E. granulosus
- Zorg ervoor dat monofasische teelt 24-48 uur vóór transductie wordt gedaan.
- Kweek ~5.000 PSC's in een 25 cm2 kweekkolf met RPMI en 10% foetaal runderserum (FBS).
- Breng de kolven over in de CO2-incubator (37 °C, 5% CO2) tot gebruik.
4. Celkweek voor virusproductie en -bereiding
OPMERKING: Menselijke embryonale nier 293T (HEK293T) cellen werden verkregen voor vectorproductie van het Pathology and Stem Cell Research Center, Kerman University of Medical Sciences.
- Breng 5 × 105 HEK293T-cellen over naar eenkolf van 25 cm 2 met 5 ml DMEM met 10% FBS, 100 U/ml penicilline en 100 μg/ml streptomycine.
- Incubeer de HEK293T-cellen bij 37 °C in 5% CO2 en passeer ze elke 48 uur in het volledige kweekmedium. Gebruik ten slotte hek293T-cellen met lage doorgang voor transductie20.
5. Productie en bereiding van het virus met de lentivirale vectoren van de derde generatie
OPMERKING: De lentivirusvector pCDH513b (transfervector) en PLPII, PLPI en PMD2G (helpervectoren) werden gebruikt om het GFP-reportergen tot expressie te brengen. Zie de tabel met materialen en aanvullende figuur S1.
- Dag 1:
- Na het trypsiniseren van de HEK293T-cellen21 in 6-well kweekplaten, zaad 7 × 104 cellen per put met verse antibioticavrije DMEM die 10% FBS bevat.
- Gebruik cellen met 50% -60% confluentie voor transductie door de calciumfosfaatmethode.
- Dag 2:
- Vervang het celkweekmedium 2-3 uur voor het experiment door verse antibioticavrije DMEM met 2% FBS.
- Meng in een buis van 1,5 ml de lentivirale plasmiden van de derde generatie, waaronder 7 μg/μL pCDH513b (transfervector), 4 μg/μL PLPII, 4 μg/μL PLPI en 2 μg/μL PMD2G (helpervectoren).
- Voeg de HEPES-buffer (0,28 M NaCl, 0,05 M HEPES en 1,5 mM Na2HPO4; optimaal pH-bereik, 7,00-7,28) toe aan het mengsel tot een volume van 422 μL.
- Voeg 16 μL 1% Tris-EDTA (TE) buffer toe aan het mengsel.
- Voeg 62 μL 2,5 mM calciumchloride toe aan de buisjes en meng goed.
- Voeg druppelsgewijs 500 μL 2x HEPES-gebufferde zoutoplossing (HBS) toe aan het mengsel , druppelsgewijs, binnen 1-2 minuten met behulp van een Pasteur-pipet. Meng voorzichtig tot een half-ondoorzichtige oplossing is verkregen en incubeer het mengsel gedurende 20 minuten bij kamertemperatuur.
- Voeg het mengsel langzaam toe aan elke plaat en verdeel het met langzame cirkelvormige bewegingen.
- Incubeer de platen bij 37 °C in een 5% CO2-incubator en vervang het medium na 4-6 uur door antibioticavrije DMEM met 10% FBS.
- Dag 3:
- Bevestig succesvolle transiënte transductie en levensvatbaarheid van cellen met behulp van een omgekeerde fluorescentiemicroscoop.
- Dag 4:
- Oogst virussen uit het kweekmedium door het supernatant van elke put te verzamelen en bewaar ze bij -70 °C tot gebruik.
OPMERKING: Geoogste lentivirussen kunnen worden geconcentreerd en getitreerd voor nauwkeurige transfectie22.
- Oogst virussen uit het kweekmedium door het supernatant van elke put te verzamelen en bewaar ze bij -70 °C tot gebruik.
6. Voorbijgaande transductie van verschillende stadia van E. granulosus met het virus
- Dag 1:
- Gebruik een kweekplaat met 12 putten voor genoverdracht. Kweek 5 × 103-5 × 104 HEK293T cellen in drievoud, met volledig DMEM-medium als interne referentie.
- Kweek 150 verse PSC's in drievoud in RPMI en 10% FBS.
- Kweek 30 gestroopte wormen in drievoud in DMEM met 10% warmte-geïnactiveerde FBS.
OPMERKING: Alle transductiemedia moeten antibioticavrij zijn. Houd drie niet-behandelde controleputten voor HEK293T-cellen, PSC's en gestrobileerde wormen in het proces. - Bereid een mengsel van 1 × 106 virussen met 4 μg/ml transfectiereagens (zie de materiaaltabel) om de HEK293T-cellen en verschillende stadia van de worm te transduceren.
- Voeg het mengsel langzaam toe aan elke plaat en verdeel het met langzame cirkelvormige bewegingen. Incubeer de platen gedurende 4-6 uur in een CO2-incubator (37 °C, 5% CO2). Vervang het medium voor elk monster door hetzelfde volledige kweekmedium om de toxische effecten van het transfectiereagens tot een minimum te beperken.
- Dag 2:
- Herhaal stap 6.1.4-6.1.5 om de efficiëntie van transiënte transductie voor de HEK293T-cellen, PSC's en gestroopte wormen te verhogen.
- Incubeer alle platen gedurende 24-48 uur in een CO2-incubator met dezelfde kweekomstandigheden op basis van het type celmedia.
- Dag 3:
- Controleer of de transductie succesvol is met behulp van fluorescentiemicroscopie.
OPMERKING: Overweeg het gebruik van verdere bevestigende testen zoals PCR / qPCR20,23 of Western blotting24-technieken in de genoverdrachtsprocedure.
- Controleer of de transductie succesvol is met behulp van fluorescentiemicroscopie.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Hier beschrijven we een snelle en efficiënte transiënte transductietechniek in E. granulosus door gebruik te maken van lentivirale vectoren van de derde generatie. We kweekten PSC's in een bifasisch kweekmedium om gestrobileerde wormen te verkrijgen, zoals eerder beschreven25,26. Protoscoleces ontwikkelen zich na 6 weken in vitro tot gestrobileerde wormen. Verschillende stadia van E. granulosus werden waargenomen in het bifasische kweekmedium, waaronder invaginated PSC's (figuur 2A), geëvacueerde PSC's (figuur 2B) en gestrobileerde wormen met eerste en derde proglottide vorming (figuur 2C-E). Protoscoleces en de gestrobileerde wormen verkregen uit respectievelijk monofasische en bifasische culturen werden getransfecteerd met GFP-tot expressie brengende lentivirussen (figuur 3). Om autofluorescentie-effecten te voorkomen, werden microscopische waarnemingen vergeleken met de achtergrondfluorescentie in alle drie de groepen monsters, en alle monsters boven dit achtergrondniveau werden als getransfecteerd beschouwd.
We hebben de veldverlichting aangepast en de sluiter verlaagd om mogelijke autofluorescentie-emissie in de controlemonsters voor elke behandeling te voorkomen. Vervolgens controleerden we lentivirale vectorbehandelde monsters, waarbij groene lichtemissie tegen een zwart veld werd beschouwd als effectieve transiënte transductie. HEK293T-cellen - de transiënte transductieprocescontrole - drukten duidelijk GFP uit (figuur 3D). De volwassen wormen drukten GFP het duidelijkst uit in de tegumentale laag (figuur 3F); PSC's vertoonden echter een iets lager niveau van GFP-expressie na 48 uur. Sommige cystevloeistofresten en/of kiemlaagresten rond de PSC's veroorzaakten enige fluorescentie op de achtergrond in de getransfecteerde monsters. De intensiteit van fluorescentie in HEK293T-cellen en gestrobileerde wormen nam toe na 24 uur en 48 uur (kleine veranderingen werden waargenomen in PSC's).
Figuur 1: Een schematische presentatie van het onderzoeksprotocol. Afkorting: PSCs = protoscoleces. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: De verschillende stadia van Echinococcus granulosus in bifasisch kweekmedium. (A) Verzwelkte PSC's, (B) geëvacueerde PSC's, (C, D) wormen in het proces van strobilatie, (E) gestrobileerde wormen met derde proglottide vorming, (F) wormen in verschillende stadia van strobilatie in het kweekmedium. Schaalbalken = 200 μm. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 3: Transiënte transductie van verschillende stadia van Echinococcus granulosus en de controlecellijn in licht- en fluorescentiemicroscopie. (A,D) HEK293T-cellen als transductieprocescontrole, (B, E) protoscoleces en (C, F) gestroopte wormen. (G, H, I) Gemengde licht- en florescentiemicroscopie. Schaalbalken = 50 μm, 100 μm en 500 μm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Aanvullende figuur S1: Kaart van pCDH-CMV-MCS-EF1-GreenPuro cDNA-kloon- en expressievector. Klik hier om dit bestand te downloaden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Het begrijpen van de moleculaire basis van nematoden en Platyhelminthes biologie is cruciaal voor het begrijpen van de pathogeniciteit van zoönotische parasieten27. Het ontbreken van een effectief genevaluatiesysteem is een groot obstakel voor de directe interpretatie van functionele genetica van cestodeparasieten, waaronder Echinococcus-soorten 12,27. De huidige studie toont het uitstekende potentieel van lentivirus in E. granulosus transiënte transductie.
Lentivirale transductie combineert de eenvoud van gebruik en de snelheid van transiënte transductie met de sterke expressie van stabiele cellijnen om transgenen aan zoogdiercellen te leveren28. Het belangrijkste doel van dit werk was om het proces van lentivirale vectortransductie te illustreren, dat van cruciaal belang zal zijn in toekomstig Echinokokkose-onderzoek.
Specifieke kritieke punten moeten in dit protocol worden genoteerd. Strikte steriele workflowomstandigheden moeten in acht worden genomen vanwege het weglaten van antibiotica in het kweekmedium, zonder welke bacteriële en schimmelbesmetting na 24 uur kan worden verwacht. Microbiële besmetting vermindert de beweeglijkheid en levensvatbaarheid van de parasieten, en zowel getransfecteerde als controlemonsters zullen na 72 uur verloren gaan.
Het selecteren van de juiste stadia in de levenscyclus van Platyhelminthes en geschikte kweekomstandigheden zijn de sleutel tot succesvolle gentransductie 12,27. We hebben onze lentivirale transductiemethode getest in de metacestode- en strobilated-stadia. De resultaten toonden aan dat gestrobileerde wormen beter reageerden op voorbijgaande transductie van het gen dan de PSC's, wat het gevolg kan zijn van de uitgebreide tegumentale structuur in de gestrobileerde vormen. Vanwege de aard van lentivirale transductie is de fluorescentie-intensiteit in de meercellige PSC's en gestrobileerde wormen echter meestal veel lager dan in monolaag HEK293T-cellen26.
Het potentieel van het gebruik van Echinococcus als een nieuw model bij platwormen voor het bestuderen van biologische verschijnselen is al lang besproken. Daarom kan een beter begrip van Echinococcus biology als modelorganisme nuttig zijn voor het uitbreiden van stamcelonderzoek en het reguleren van de genexpressie en evolutionaire biologie van andere platyhelminths 8,29,30,31,32. Er is dringend behoefte aan toegepast genetisch onderzoek op genomisch en transcriptomisch niveau voor Echinococcus en verschillende parasitaire en vrijlevende platwormmodelsystemen. Daarom maakt het ontwikkelen van een effectief genoverdrachtsproces voor lintwormen de weg vrij voor nieuwe technieken, zoals virusgebaseerde gen knock-in of CRISPR-Cas-gemedieerde genbewerking32,33. Dit werk presenteert lentivirale transductie in een lintwormmodel en toont veelbelovende resultaten, met mogelijke implicaties voor de platwormbiologie. Er zijn echter meer diepgaande studies nodig om de methode te verbeteren en de toepasbaarheid van deze techniek voor toekomstige experimenten te ontwikkelen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben geen belangenconflicten te onthullen.
Acknowledgments
Onderzoek gerapporteerd in deze publicatie werd ondersteund door Elite Researcher Grant Committee onder toekenningsnummer 958680 van het National Institute for Medical Research Development (NIMAD), Teheran, Iran.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 12-well culture plates | SPL Life Sciences | 30012 | |
| 25 cm2 culture flask | SPL Life Sciences | 70325 | |
| 6-well culture plates | SPL Life Sciences | 30006 | |
| Calcium chloride | Sigma-Aldrich | C4901-500G | Working concentration: 2.5 mM |
| CMRL 1066 medium | Thermo Fisher Scientific | 11530037 | |
| CO2 incubator | memmert | ICO150 | |
| D-(+)-Glucose | Sigma-Aldrich | G8270-1KG | |
| DMEM | Life Technology | 12100046 | |
| Dog bile | Isolated from a euthanized dog and sterilized by 0.2 μm syringe filter | ||
| Eosin Y | Sigma-Aldrich | E4009-5G | prepare 0.1% of Eosin for working exclusion test |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | DNAbiotech | DB9723-100ml | Heat inactivation of FBS (30 min in 40 °C) |
| Fetal Calf Serum (FCS) | DNAbiotech | DB9724-100ml | Heat inactivation of FCS (30 min in 40 °C) |
| HEK293T cells | BONbiotech | BN_0012.1.14 | Human embryonic kidney 293T |
| HEPES buffered saline (HBS) | Sigma-Aldrich | 51558-50ML | 2x concentrate |
| Inverted fluorescence microscope | OLYMPUS | IX51 | |
| Penicillin | Sigma-Aldrich | P3032-10MU | Working concentration: 100 IU/mL |
| Pepsin | Roche | 10108057001 | Working concentration: 2 mg/mL, pH 2 |
| Phosphate-buffered saline (PBS) | DNAbiotech | DB0011 | This reagent solve in less than 1 min in D.W |
| Polybrene (Transfection reagent) | Sigma-Aldrich | TR-1003-G | |
| RPMI medium | BioIdea | BI-1006-05 | |
| Sodium bicarbonate (NaHCO3) | Sigma-Aldrich | S5761-1KG | |
| Streptomycin | Sigma-Aldrich | S9137-25G | Working concentration: 100 μg/mL |
| Third-generation lentiviral plasmid (pCDH513b) | SBI System Biosciences (BioCat GmbH) | CD513B-1-SBI | Transfer vector (obtained commercially from Molecular Medicine Research Department of Iranian Academic Center for Education, Culture and Research (ACECR), Mashhad, Iran) |
| Third-generation lentiviral plasmid (pLPI and pLPII) | Invitrogen (Life Technologies) | K4975-00 | Helper vector (obtained commercially from Molecular Medicine Research Department of Iranian Academic Center for Education, Culture and Research (ACECR), Mashhad, Iran) |
| Third-generation lentiviral plasmid (pMD2G) | Addgene | Plasmid 12259 | Helper vector (obtained commercially from Molecular Medicine Research Department of Iranian Academic Center for Education, Culture and Research (ACECR), Mashhad, Iran) |
| Tris/EDTA Buffer (TE) | DNAbiotech | DB9713-100ml | |
| Trypsin | Sigma-Aldrich | T9935-50MG | 1x working solutions (pH 7.4–7.6) |
References
- Deplazes, P., et al. Global distribution of alveolar and cystic echinococcosis. Advances in Parasitology. 95, 315 (2017).
- Borhani, M., et al. Echinococcoses in Iran, Turkey, and Pakistan: Old diseases in the new millennium. Clinical Microbiology Reviews. 34 (3), 0029020 (2021).
- Eckert, J., Thompson, R. C. A.
- Romig, T., et al. Ecology and life cycle patterns of Echinococcus species. Advances in Parasitology. 95, 213 (2017).
- Craig, P. S., Hegglin, D., Lightowlers, M. W., Torgerson, P. R., Wang, Q.
- Deplazes, P., et al. Global distribution of alveolar and cystic echinococcosis. Advances in Parasitology. 95 (1), 315 (2017).
- Tsai, I. I. J., et al. The genomes of four tapeworm species reveal adaptations to parasitism. Nature. 496 (7443), 57-63 (2013).
- Koziol, U., Brehm, K. Recent advances in Echinococcus genomics and stem cell research. Veterinary Parasitology. 213 (3-4), 92-102 (2015).
- Zheng, H., et al. The genome of the hydatid tapeworm Echinococcus granulosus. Nature Genetics. 45 (10), 1168-1175 (2013).
- Pérez-Victoria, J. M., Torres, A. P. T. C., Gamarro, F., Castanys, S. ABC transporters in the protozoan parasite Leishmania. International Microbiology. 4 (3), 159-166 (2001).
- Ehrenkaufer, G. M., Singh, U. Transient and stable transfection in the protozoan parasite Entamoeba invadens. Molecular and Biochemical Parasitology. 184 (1), 59-62 (2012).
- Moguel, B., Bobes, R. J., Carrero, J. C., Laclette, J. P.
- Tang, Y., Garson, K., Li, L., Vanderhyden, B. C. Optimization of lentiviral vector production using polyethylenimine-mediated transfection. Oncology Letters. 9 (1), 55-62 (2015).
- Mann, V. H., Suttiprapa, S., Rinaldi, G., Brindley, P. J.
- Balcaitis, S., Weinstein, J. R., Li, S., Chamberlain, J. S., Möller, T.
- Sastry, L., Johnson, T., Hobson, M. J., Smucker, B., Cornetta, K. Titering lentiviral vectors: comparison of DNA, RNA and marker expression methods. Gene Therapy. 9 (17), 1155-1162 (2002).
- Bowles, J., Blair, D., McManus, D. P. Genetic variants within the genus Echinococcus identified by mitochondrial DNA sequencing. Molecular and Biochemical Parasitology. 54 (2), 165-173 (1992).
- Rostami, S., et al. High resolution melting technique for molecular epidemiological studies of cystic echinococcosis: differentiating G1, G3, and G6 genotypes of Echinococcus granulosus sensu lato. Parasitology Research. 112 (10), 3441-3447 (2013).
- Mousavi, S. M., et al. Biological and morphological consequences of dsRNA-induced suppression of tetraspanin mRNA in developmental stages of Echinococcus granulosus. Parasites and Vectors. 13 (1), 190 (2020).
- Afgar, A., et al. MiR-339 and especially miR-766 reactivate the expression of tumor suppressor genes in colorectal cancer cell lines through DNA methyltransferase 3B gene inhibition. Cancer Biology & Therapy. 17 (11), 1126-1138 (2016).
- Ricardo, R., Phelan, K. Trypsinizing and subculturing mammalian cells. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (16), e755 (2008).
- Wang, X., McManus, M.
- Li, M., Husic, N., Lin, Y., Snider, B. J. Production of lentiviral vectors for transducing cells from the central nervous system. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (63), e4031 (2012).
- Eslami, A., Lujan, J. Western blotting: sample preparation to detection. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (44), e2359 (2010).
- Dezaki, E. S., et al. Comparison of ex vivo harvested and in vitro cultured materials from Echinococcus granulosus by measuring expression levels of five genes putatively involved in the development and maturation of adult worms. Parasitology Research. 115 (11), 4405-4416 (2016).
- Mousavi, S. M., et al. Calmodulin-specific small interfering RNA induces consistent expression suppression and morphological changes in Echinococcus granulosus. Scientific Reports. 9 (1), 1-9 (2019).
- Aboobaker, A. A., Blaxter, M. L. Functional genomics for parasitic nematodes and platyhelminths. Trends in Parasitology. 20 (4), 178-184 (2004).
- Elegheert, J., et al. Lentiviral transduction of mammalian cells for fast, scalable and high-level production of soluble and membrane proteins. Nature Protocols. 13 (12), 2991 (2018).
- Mizukami, C., et al. Gene silencing in Echinococcus multilocularis protoscoleces using RNA interference. Parasitology International. 59 (4), 647-652 (2010).
- Thompson, R. C. A., Jenkins, D. J. Echinococcus as a model system: biology and epidemiology. International Journal for Parasitology. 44 (12), 865-877 (2014).
- Thompson, R. C. A. Biology and systematics of Echinococcus. Advances in Parasitology. Thompson, R. C. A., Deplazes, P., Lymbery, A. J. 95, 65-109 (2017).
- Brehm, K., Koziol, U. Echinococcus-host interactions at cellular and molecular levels. Advances in Parasitology. 95, 147-212 (2017).
- Moguel, B., et al. Transient transgenesis of the tapeworm Taenia crassiceps. SpringerPlus. 4, 496 (2015).
