Summary
Многие виды растений изменяют позиционирование хлоропластов для оптимизации поглощения света. Этот протокол описывает, как использовать простой, самодельный инструмент для исследования движения хлоропласта в листьях Arabidopsis thaliana , используя изменения в пропускании света через лист в качестве прокси.
Abstract
Было показано, что движение хлоропластов в листьях помогает свести к минимуму фотоингибирование и увеличить рост при определенных условиях. Многое можно узнать о движении хлоропластов, изучая позиционирование хлоропласта в листьях с помощью, например, конфокальной флуоресцентной микроскопии, но доступ к этому типу микроскопии ограничен. Этот протокол описывает метод, который использует изменения в листовой передаче в качестве прокси для движения хлоропласта. Если хлоропласты распределяются с целью максимального перехвата света, передача будет низкой. Если хлоропласты движутся к антиклинальным клеточным стенкам, чтобы избежать света, передача будет выше. Этот протокол описывает, как использовать простой, самодельный прибор для воздействия на листья различной интенсивности синего света и количественной оценки динамических изменений в передаче листьев. Этот подход позволяет исследователям количественно описывать движение хлоропластов у различных видов и мутантов, изучать влияние химических веществ и факторов окружающей среды на него или проверять наличие новых мутантов, например, выявлять недостающие компоненты в процессе, который приводит от восприятия света к движению хлоропластов.
Introduction
Свет необходим для фотосинтеза, роста и развития растений. Это один из наиболее динамичных абиотических факторов, поскольку интенсивность света не только меняется в течение сезона или дня, но и быстро и непредсказуемо в зависимости от облачного покрова. На уровне листьев интенсивность света также зависит от плотности и характера окружающей растительности и собственного полога растения. Одним из важных механизмов, который позволяет растениям оптимизировать перехват света в условиях переменного освещения, является способность хлоропластов двигаться в ответ на стимулы синего света1,2. В условиях низкой освещенности хлоропласты распространяются перпендикулярно свету (вдоль периклинальных клеточных стенок) в так называемой реакции накопления, максимизируя перехват света и, следовательно, фотосинтез. В условиях высокой освещенности хлоропласты движутся к антиклинальной клеточной стенке в так называемой реакции избегания, сводя к минимуму перехват света и опасность фотоингибирования. У многих видов хлоропласты также принимают специфическое темное положение, которое отличается от позиций накопления и избегания и часто является промежуточным между этими двумя3,4. Различные исследования показали, что движение хлоропластов важно не только для кратковременной стрессоустойчивости листьев5,6,7, но и для роста и репродуктивной успешности растений, особенно в условиях переменного освещения8,9.
Движение хлоропласта легко наблюдается в режиме реального времени у некоторых живых образцов (например, водорослей или тонколистных растений, таких как элодея) с помощью световой микроскопии1. Однако изучение движения хлоропластов в большинстве листьев требует предварительной обработки, чтобы вызвать движение хлоропласта, химическую фиксацию и подготовку поперечных сечений перед просмотром образцов под световым микроскопом10. С введением конфокальной лазерной микроскопии также стало возможным получать изображения 3D-расположения хлоропластов в неповрежденных или неподвижных листьях4,11,12. Эти методы визуализации значительно помогают понять движение хлоропласта, предоставляя важную качественную информацию. Количественная оценка позиционирования хлоропластов (например, в процентах от хлоропластов в периклинальном или антиклинальном положении на этих изображениях или в процентном отношении площади, покрытой хлоропластами, на общую поверхность клетки) также возможна, но довольно трудоемка, особенно если она проводится с интервалами, необходимыми для фиксации быстрых изменений в позиционировании10,8 . Самый простой способ показать, способны ли адаптированные к темноте листья определенного вида или мутантов перемещать хлоропласт в реакцию избегания, - это покрыть большую часть площади листа, чтобы держать хлоропласты в темноте, подвергая полоску листа высокому освещению. После минимум 20 минут воздействия высокого освещения хлоропласты в открытой области переместятся в положение избегания, и открытая полоса будет заметно светлее по цвету, чем остальная часть листа. Это верно для дикого типа A. thaliana, но не для некоторых мутантов движения хлоропластов, описанных более подробно позже13. Этот метод и его модификации (например, изменение того, какие части листа подвергаются воздействию, изменение интенсивности света) полезны для скрининга большого количества мутантов и выявления нулевых мутантов, которые не имеют способности проявлять реакцию избегания или накопления, либо и то, и другое. Однако он не дает информации о динамических изменениях в движении хлоропластов.
Напротив, метод, описанный здесь, позволяет количественно оценить движение хлоропластов в неповрежденных листьях, используя изменения в пропускании света через лист в качестве прокси для общего движения хлоропласта: в условиях, когда хлоропласты распространяются в клетках мезофилла в реакции накопления, через лист пропускается меньше света, чем когда многие хлоропласты находятся в реакции избегания, позиционируются вдоль антиклинальных клеточных стенок. Следовательно, изменения в передаче могут быть использованы в качестве прокси для общего движения хлоропласта в листьях14. Детали прибора описаны в другом месте (см. Дополнительный файл), но в основном прибор использует синий свет для запуска движения хлоропласта и измеряет, сколько красного света проходит через этот лист через заданные интервалы. Совсем недавно была описана модификация этой системы, в которой используется модифицированный 96-луночный считыватель микропластин, синий светодиод, компьютер и инкубатор с контролируемой температурой15.
Возможность использования комбинации методов, включая оптическую оценку листьев для скрининга с последующим измерением динамических изменений в передаче и использованием микроскопии, в значительной степени помогла нам понять как основные механизмы, так и физиологическое/экологическое значение движения хлоропластов. Например, это привело к обнаружению и характеристике различных мутантов, которые нарушены в конкретных аспектах своих движений. Например, мутантам A. thaliana phot 1 не хватает способности накапливать свои хлоропласты при слабом освещении, в то время как мутантам phot 2 не хватает способности выполнять реакцию избегания. Эти фенотипы обусловлены нарушением двух соответствующих рецепторов синего света16,17,18. Напротив, мутанты chup1 не обладают способностью образовывать правильные актиновые нити вокруг хлоропластов, которые необходимы для перемещения хлоропластов в желаемое положение внутри клетки11,19. В дополнение к мутантным исследованиям, исследователи оценили влияние различных ингибиторов на движение хлоропласта, чтобы прояснить механистические аспекты процесса. Например, химические вещества, такие как H2O2 и различные антиоксиданты, были использованы для исследования влияния этой сигнальной молекулы на движение хлоропласта20. Различные ингибиторы были использованы для выяснения роли кальция в движении хлоропластов21. В дополнение к тому, чтобы помочь раскрыть механизмы движения хлоропластов, эти методы могут быть использованы для сравнения движения хлоропластов у различных видов или мутантов, выращенных в разных условиях, в попытке понять экологический и эволюционный контекст этого поведения. Например, было показано, что степень воздействия различных мутаций в пути движения хлоропласта зависит от условий роста7,9, и что адаптированные к солнцу растения, по-видимому, не сильно перемещают свои хлоропласты. Напротив, движение очень важно для теневых растений10,22,23.
В данной методической работе, ориентированной на модель растения A. thaliana, описывается, как использовать передающее устройство, которое является обновленной версией ранее разработанного прибора9. Хотя этот инструмент не является коммерчески доступным, люди с базовым пониманием электроники или с помощью коллег и студентов по инженерии или физике смогут построить инструмент, используя доступные детали и следуя подробным инструкциям (см. Дополнительный файл). Платформа с открытым исходным кодом, используемая для создания инструмента, имеет обширную веб-поддержку и форум сообщества, который предлагает помощь в случае возникновения проблем24.
Протокол фокусируется на том, как использовать инструмент для определения изменений в передаче листьев в стандартном исследовательском прогоне, который подвергает лист широкому диапазону условий освещения и захватывает темные, аккумуляционные и избегающие реакции A. thaliana. Эти прогоны могут быть изменены в зависимости от цели эксперимента и могут быть использованы с большинством видов растений. В статье приведены примеры передачи данных дикого типа A. thaliana и нескольких мутантов и показано, как в дальнейшем анализировать данные.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Подготовка листьев к пробежке
- Поместите 8 растений A. thaliana в темноту на ночь (> 6 ч работает для большинства видов), чтобы убедиться, что хлоропласты перемещаются в темное положение. Все реплики начинаются с сопоставимых значений передачи.
- В качестве альтернативы поместите 8 полных листьев в чашку Петри с влажной фильтровальной бумагой внизу, закройте чашку Петри и оберните ее алюминиевой фольгой.
2. Проверка работы передающего устройства
- Подключите передающее устройство к стабильному источнику питания и нажмите выключатель питания (кнопка ON/OFF) устройства для сброса прибора (рисунок 1A,B).
- Подключите iPad к стабильному источнику питания, нажмите кнопку «На главном экране», чтобы активировать экран, и введите пароль для входа в систему.
- Нажмите значок «Настройки», нажмите значок «Дисплей и яркость », нажмите «Автоблокировка» и выберите «Никогда », нажав эту опцию, чтобы экран оставался включенным постоянно. В противном случае программа перестанет работать, когда экран перейдет в спящий режим. Нажмите кнопку «Главный экран», чтобы вернуться на главный экран.
- Дважды нажмите кнопку «На главном экране», чтобы увидеть, какие приложения открыты, и закройте их все, проведя пальцем в верхней части экрана. Нажмите кнопку «Главный экран», чтобы вернуться на главный экран.
- Найдите приложение LeafSensor на главном экране или проведя пальцем влево или вправо. Нажмите на значок приложения, чтобы открыть его (см. раздел Дополнительный файл). Появится зеленый экран с текстом и белыми полями для ввода информации.
- Убедитесь, что слово Connected отображается в нижней части экрана, поскольку оно указывает на то, что приложение взаимодействует с передающим устройством. Если появляется сообщение «Adafruit NOT Found», убедитесь, что устройство подключено к сети, и снова нажмите кнопку запуска на устройстве.
- Заполните первые 4 поля на странице приложения, чтобы назвать эксперимент и настроить условия для краткого тестового запуска без листьев и с открытыми зажимами листьев:
- Назовите эксперимент (используйте 8 или менее прописных букв или цифр), например, введя TEST в поле с именем Expt Name.
- Выберите, сколько различных интенсивностей синего света будет использоваться в эксперименте, например, набрав 3 в поле с именем # Интенсивность света.
- Выберите интенсивность синего света для этого пробега (выберите целое число от 0 до 3000 и отделите каждое число от следующего запятой; см. Дополнительный файл о том, как преобразовать эти числа в фактическую интенсивность синего света светодиодов), например, набрав 0 100 1000 в поле с именем Blue Intensities.
- Выберите продолжительность времени, в течение которого каждая интенсивность синего света будет светить на листе (отделите каждое число от следующего запятой), например, набрав 2,2,2 в поле с именем Blue Duration (минуты).
- Нажмите Запустить эксперимент в средней части экрана. В нижней части экрана появится 8 дефисов и сообщение Запуск эксперимента .
- Убедитесь, что светодиоды не излучают свет в течение первых двух минут, затем излучается слабый синий свет, и через 2 минуты интенсивность синего света увеличивается.
- Убедитесь, что интенсивный красный свет излучается от светодиодов один раз в минуту для измерений.
ПРИМЕЧАНИЕ: По мере выполнения эксперимента на странице приложения будут появляться цифры для каждого из восьми датчиков, а данные будут обновляться раз в минуту. Убедитесь, что выходные номера фотодиодов составляют около 1000-1023 (если в комнате темно). Обновление в левом нижнем углу показывает, сколько измерений было сделано до сих пор, например, Сделано 1 из 6 измерений (одно измерение каждую минуту). - По завершении эксперимента проверьте, не отображается ли эксперимент завершенный в левом нижнем углу страницы приложения. Теперь инструмент готов к запуску с листьями.
- Дважды нажмите кнопку «Главный экран», проведите пальцем от приложения и снова откройте его. Нажмите кнопку ON/OFF на приборе, чтобы сбросить его.
3. Установка листьев в зажимы для листьев
ПРИМЕЧАНИЕ: Этот шаг должен быть выполнен в темноте с источником зеленого света (например, поместить зеленый фильтр перед лампочкой), чтобы избежать индуцирования движения хлоропласта. В качестве альтернативы, используйте очень низкий белый свет и длительный темный период в зажимах листьев. Помните, что одна часть зажима листа удерживает светодиод (большее отверстие), в то время как другая удерживает фототранзистор (рисунок 1C).
- Если растения адаптированы к темноте целиком, соберите 8 листьев, достаточно широких, чтобы покрыть светодиоды. В противном случае удалите листья из чашки Петри. Подготовьте 8 полосок фильтровальной бумаги длиной с зажим для листьев и с отверстием, выбитым сверху, чтобы не закрывать светодиод.
- Смочите фильтровальную бумагу и поместите ее на зажимную часть листа, которая удерживает светодиод. Повторите это для каждого из восьми зажимов листьев.
- Поместите каждый лист на верхнюю часть влажной фильтровальной бумаги его зажима. Убедитесь, что правильная сторона листа обращена к светодиоду (обычно эксперименты проводятся с адаксиальной поверхностью листа, обращенной к светодиоду).
- Избегайте размещения средних ребер створки поверх светодиодов и для более стабильных результатов размещайте аналогичные части каждого листа (например, самую широкую секцию листа) над светодиодом.
- Поместите другую часть зажима листа с фототранзистором сверху. При необходимости используйте резинку, чтобы удерживать две части зажима листьев вместе (рисунок 1C,D).
- Поместите каждый зажим для листьев в свою «лодку» и наполните резервуары водой с помощью пипетки. Убедитесь, что лист или, по крайней мере, фильтровальная бумага касается воды, чтобы избежать обезвоживания листьев во время бега (рисунок 1D).
4. Проведение пробежки
ПРИМЕЧАНИЕ: Для стандартного исследовательского пробега начните с 4 ч темноты (0 мкмоль фотона m-2 s-1), затем 7 ч низкого синего света (2 мкмоль фотона m-2 s-1), затем по 60 мин каждый из 5, 10, 30, 40, 50, 60, 90, 100 мкмоль фотонов m-2 s-1 синего света. Это заставит листья проявлять свою темную передачу, индуцировать движение хлоропласта в максимальное накопление и демонстрировать различные степени реакции избегания.
- Настройте приложение LeafSensor на iPad, выполнив действия, описанные ниже.
- Введите EXPLORA1 в поле с именем Expt Name.
- Введите 10 в поле # Интенсивность света.
- Тип 0,1,60,160,550,750,950,1150,1350,1950 в поле под названием Синие интенсивности.
- Введите 240,420,60,60,60,60,60,60,60,60,60 в поле с именем Blue Duration.
- Нажмите Начать эксперимент. После первой минуты на экране появятся выходные значения (обычно между 990 и 820). Если значения далеки, проверьте, правильно ли помещены листья в зажимы листьев.
- После завершения запуска убедитесь, что в левом нижнем углу экрана появится сообщение Эксперимент завершен . Данные будут сохранены автоматически.
- Поместите экран в вертикальное положение (не горизонтальное). На экране появятся две новые опции, а именно «Сохранить» и «Утилиты».
- Нажмите Утилиты , и появится список сохраненных файлов. Выберите интересующий файл, в данном случае EXPLORA1.
- Под списком файлов найдите Selected Expt: EXPLORA1. Нажмите Email, введите адрес электронной почты, и файл данных будет автоматически прикреплен к сообщению. Нажмите кнопку Отправить.
ПРИМЕЧАНИЕ: Если есть длительная задержка до прибытия файлов, перезапустите приложение и отправьте файл снова.
- Если запуск был прерван, но данные до этого момента представляют интерес, нажмите кнопку Сохранить перед выбором Утилиты. После нескольких запусков очистите пространство памяти: нажмите утилиты, выберите один файл за раз, проведите пальцем влево рядом с файлом и нажмите клавишу DELETE , чтобы удалить файл.
- Нажмите кнопку Назад , чтобы запустить другой эксперимент, или, если он выполнен, нажмите кнопку «Главный экран», проведите пальцем к главному экрану, нажмите «Настройки», « Дисплей и яркость», нажмите «Автоблокировка» и нажмите «2 минуты».
5. Анализ данных
- Скачайте файл EXPLORA1 с электронной почты, добавьте расширение .csv к файлу, дважды щелкните по файлу. Данные будут отсортированы в электронную таблицу с данными для восьми различных датчиков, отсортированных по отдельным столбцам. В последнем столбце показано время (в секундах), в которое были собраны данные. Удалите первую строку под заголовками (Sensor1-8), если она содержит бессмысленные данные.
- Настройте основной лист данных, который будет содержать результаты для каждого датчика на отдельном листе и который преобразует выходные значения в значения передачи % с использованием уравнений, полученных в результате калибровки каждого зажима листа и датчика (см. Дополнительный файл).
- Скопируйте каждый набор данных в отдельный технический паспорт (например, столбец A содержит время; столбец C содержит данные Sensor1).
- Настройте столбец B таким образом, чтобы он преобразовывал время из секунд в минуты. Настройте столбец D таким образом, чтобы он содержал формулу для преобразования напряжения в % передачи, используя уравнение из калибровки.
- Настройте аналогичный технический паспорт для каждого датчика и помните, что формула, используемая для преобразования выходного напряжения в % значений передачи, может отличаться для каждого датчика.
- График % пропускания (Т) по отношению ко времени, мин (рисунок 2).
- Сохраните лист данных под новым именем, чтобы его можно было использовать повторно.
- Для дальнейшего анализа данных (рисунок 2) рассчитывают накопление ΔT (например , изменение T при максимальном накоплении по сравнению с T в темноте), избегание ΔT ( например, изменение T при максимальном избегании по сравнению с T в темноте ) или dT/dt (%/h) (например, изменение T во время самой быстрой части реакции накопления или избегания). Более подробную информацию см. в пункте 8.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Различные части передающего устройства показаны на рисунке 1. Микроконтроллер является блоком управления устройства и управляет световыми условиями, которые испытывают листья, закрепленные в черных зажимах листьев, и хранит данные о светопропускании, которые он получает (рисунок 1A, B). Крупный план блока управления прибора показывает кнопку ON/OFF, SD-карту для хранения данных, экран Bluetooth (который отправляет данные в приложение LeafSensor) и кабели, которые подключаются к светодиодам (светодиодам) и фототранзисторам. Микроконтроллер расположен у основания прибора, и на рисунке видны только края (рисунок 1В). 3D-печатные черные зажимы для листьев удерживают листья, светодиоды и фототранзисторы на месте. Мокрая фильтровальная бумага позиционируется на части зажимов листьев со светодиодом таким образом, что светодиод беспрепятственно, а адаптированный к темноте лист расположен с адаксиальной поверхностью листа, обращенной к светодиоду. Схема показывает, что светодиод и фототранзистор расположены на противоположных сторонах листа. Светодиод может излучать синий или красный свет. Синий свет используется для индуцирования движения хлоропласта и отключается на короткий период каждую минуту, в течение которого красный измерительный свет светит на лист. Фототранзистор, расположенный на противоположной стороне листа, определяет, сколько красного света проходит через лист и отправляет данные на микроконтроллер и SD-карту (рисунок 1C). Две части зажима листа собираются и помещаются в 3D-печатную «лодку», которая заполнена водой и помогает сохранить лист влажным во время эксперимента (рисунок 1D).
На рисунке 2 показан типичный набор данных, в котором данные о передаче % строятся по времени (мин). Этот конкретный пробег передачи включал 1 ч темноты, за которым следовали 3 ч низкого синего света (2 мкмоль фотона m-2 s-1) и по 1 ч промежуточной (30 мкмоль фотон m-2 s-1) и высокой интенсивности синего света (100 мкмоль фотон m-2 s-1). Данные показывают, что передача у A. thaliana уменьшается при низкой интенсивности света (реакция накопления), в то время как реакция избегания индуцируется при дальнейшем увеличении интенсивности света. Это не реакция «все или ничего», и степени изменений относительно темных значений зависят от точной интенсивности синего света. Эти процентные изменения в передаче (ΔT) могут быть рассчитаны с использованием формул, приведенных ниже данных. Кроме того, скорость изменения передачи (дТ/дт) при начальных изменениях трансмиссии при срабатывании реакции накопления или избегания может быть рассчитана с использованием наклона кривой.
Показаны средние % значений передачи дикого типа (WT) (рисунок 3A), а также phot 1 и phot 2 мутантных листьев A. thaliana (рисунок 3B) в течение 19 ч длинных прогонов. Такие расширенные, исследовательские прогоны передачи полезны для определения интенсивности синего света для использования в будущих пробегах. Листья сначала подвергались воздействию 4 ч темноты, и последовательные значения пропускания указывают на то, что листья были полностью адаптированы к темноте, что сделает данные между репликами более последовательными. В течение следующих 7 ч листья подвергались воздействию слабого синего света (2 мкмоль фотона m-2 s-1). В WT и phot 2 начальное быстрое снижение передачи сопровождается медленным снижением, что указывает на то, что хлоропласты двигались в реакцию накопления. В зависимости от используемого вида, для получения минимально возможной передачи может потребоваться разное количество времени. Во многих случаях исследователь может быть заинтересован только в сравнении различных мутантов в данный момент времени, поэтому воздействие очень слабого света может быть ограничено часом. По сравнению с WT, phot 1 показывает сниженную реакцию накопления. Длительное воздействие низкого синего света сопровождается постепенным увеличением интенсивности синего света каждый час (5, 10, 30, 40, 50, 60, 90, 100 мкмоль фотонов m-2 s-1). % передачи у A. thaliana WT и phot 1 увеличивается с каждым увеличением интенсивности света, показывая, что хлоропласты переходят в реакцию избегания, но это не наблюдается в phot 2. Степени изменения пропускания относительно значения темноты (ΔT) зависят от точной интенсивности синего света и могут отличаться в зависимости от генотипа (рисунок 3C). Показан пример изменения скорости передачи (дТ/дт) во время начальных реакций в трансмиссии, когда избегание срабатывает, когда интенсивность синего цвета увеличивается с 5 до 10 мкмоль фотонов m-2 s-1 (рисунок 3D). Скорость одинакова для WT и phot 1, в то время как для мутантов phot 2 она очень медленная.
Рисунок 1: Обзор передающего устройства. Изображение самодельного трансмиссионного устройства с блоком управления в черном ящике в правом нижнем углу и зажимами листьев сверху и внизу слева (A). Крупный план блока управления с кнопкой ON/OFF, SD-картой для хранения данных и экраном Bluetooth для беспроводной связи. Кабели соединяют блок управления со светодиодами (LED) и фототранзисторами. Микроконтроллер расположен в основании прибора, и на этом рисунке (B) видны только края. 3D-печатные черные зажимы для листьев: слева показана часть зажима листа, удерживающая светодиод, справа - часть зажима листа, удерживающая фототранзистор. Для настройки прогона на зажим помещается влажная фильтровальная бумага (с отверстием размером со светодиод) без заслонения светодиода. Затем лист помещается в зажим, закрывающий светодиод. Схема показывает, что светодиод и фототранзистор (PT) расположены друг напротив друга, близко к створке, когда две части каждого зажима листа собраны (C). Зажимы для листьев позиционируются в 3D-печатных «лодках», которые заполнены водой, сохраняя листья и фильтровальную бумагу гидратированными (D). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 2: Передача данных типичного листа A. thaliana . Передача (T) данных для листа A. thaliana , который подвергался воздействию темноты в течение 1 ч, за которым следовали 3 ч слабого света (2 мкмоль фотона m-2 s-1), затем по 1 ч промежуточного (30 мкмоль фотона m-2 s-1) и высокого синего света (100 мкмоль фотона m-2 s-1). Низкая интенсивность света индуцировала реакцию накопления, в то время как более высокая интенсивность света вызывала различные степени реакции избегания. Темные уровни T служат базовой линией (синяя линия). Можно рассчитать % изменений T относительно темных уровней (ΔT), например, при максимальном накоплении или различных уровнях избегания (различия с темным T обозначены синими стрелками). Кроме того, скорость, с которой изменяется T (dT/dt), например, во время начальной фазы реакции избегания, может быть рассчитана по наклону T, построенному против времени (обозначенному синим треугольником). Уравнения показаны ниже графика. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 3: Движение хлоропласта в диких и мутантных листьях A. thaliana. Адаптированные к темноте, зрелые листья подвергались воздействию темноты в течение 4 ч, за которой следовало 7-часовое воздействие фотона 2 мкмоль m-2 s-1, за которым следовало постепенное увеличение интенсивности синего света каждый час (5, 10, 30, 40, 50, 60, 90, 100 мкмоль фотонов m-2 s-1). Средние значения % передачи (T) (n = 20) WT (A), а также листьев phot 1 и phot 2 (B). Изменение % T относительно темных значений: отрицательные значения указывают на то, что листья показали реакцию накопления, в то время как положительные значения указывают на реакцию избегания. Цифры справа указывают на интенсивность синего света, при которой были рассчитаны данные ΔT. Цветовая гамма такая же, как и на остальной части рисунка (C). Данные dT/dt рассчитывались как листья реагировали на увеличение интенсивности синего света с 5 до 10 мкмоль фотонов m-2 s-1 и указывали скорость, с которой % T изменялся в час (D). Данные для A и B являются средними, для C и D означает ± SD (n = 20). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Вспомогательный файл. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Устройство чрезвычайно простое в использовании, но крайне важно откалибровать каждую настройку листового зажима передающего устройства независимо друг от друга, поскольку расположение светодиодов и фототранзисторов может незначительно варьироваться от зажима листа к зажиму листа. Убедитесь, что светодиоды и фототранзисторы вставлены стабильно и повторно проверьте калибровку, если данные кажутся выключенными. Избегайте попадания воды на устройство. Листья в зажимах для листьев помещаются в «лодки», заполненные водой, чтобы избежать водного стресса. Поместите эти лодки, например, в пластиковый контейнер с низкой ободком отдельно от блока управления и НЕ опрокидывайте их. Не отключайте и не изгибайте кабельные соединения. Будьте осторожны при вставке листьев в зажимы листьев и избегайте слишком сильного натягивания или сгибания кабелей.
Важно адаптировать листья в темноте достаточно долго, чтобы гарантировать, что начальные значения пропускания представляют темное положение. Убедитесь, что значения в течение темного периода в устройстве были стабильными не менее 30 минут, прежде чем светить синим светом на листья. Если это не так, темные листья адаптируются в течение более длительного периода времени перед следующим запуском или продлевают темный период в передающем устройстве, чтобы контролировать, сколько времени требуется, чтобы листья достигли устойчивого состояния. Как правило, данные передачи представляются в виде % изменения пропускания при заданной интенсивности синего света относительно значения темного (ΔT). Поэтому крайне важно получить правильные базовые значения.
Исследовательский прогон может быть использован для любого мутанта A. thaliana (включая мутантов, которые, как известно, влияют на другие аспекты физиологии растения, например, фотосинтез, миозин или нехарактеризованные мутанты) или различных видов, если площадь листьев достаточно велика, чтобы покрыть светодиод в зажиме листа, а листья не слишком толстые. Программа может быть легко адаптирована для удовлетворения любых потребностей исследователя, например, интенсивность синего света может быть изменена в диапазонах, которые, как было показано, вызывают движение хлоропласта (реакция насыщает около 100 мкмоль фотона m-2 s-1), время экспозиции может быть изменено, количество последовательных условий освещения может быть изменено. Кроме того, листья могут быть предварительно обработаны перед запуском в устройстве, например, ингибиторами полимеризации актина или компонентами сигнального пути, что важно для исследователей, которые хотят заполнить пробелы в сигнальном пути, регулирующем движение хлоропласта.
Как и любой метод, этот тоже имеет свои ограничения и недостатки. Процедура опирается на изменения оптических свойств листьев, а именно на то, сколько света передается. Поэтому он лучше всего работает с относительно тонкими листьями, в то время как толстые листья часто не позволяют обнаружить достаточную передачу красного света за пределы уровня шума. Можно было бы модифицировать передающее устройство, чтобы увеличить интенсивность красного света, светящего на лист, и повысить чувствительность фототранзисторов путем изменения резисторов. Поскольку способ обеспечивает только интегрированную меру движений хлоропласта во всех клетках и клеточных слоях, можно пропустить некоторые тонкие изменения, например, перемещение хлоропластов в противоположных направлениях может привести к отсутствию чистого изменения передачи. Особенно при работе с ранее не охарактеризованными мутантами или видами важно дополнить результаты передачи изображениями позиционирования хлоропласта с помощью микроскопии. Например, медленные изменения в передаче в ответ на изменения интенсивности синего света наблюдались у мутанта A. thaliana и могли быть обусловлены рядом причин. Микроскопия показала, что в клетках было только два хлоропласта, которые были намного больше, чем обычные хлоропласты. Позже было подтверждено, что мутант хлоропласта является мутантом отдела хлоропластов arc6-125.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
У авторов нет конфликта интересов.
Acknowledgments
Финансирование было предоставлено премией Фиске и премией факультета колледжа Уэллсли.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Aluminum foil | |||
| Dark adapted leaves | |||
| Filter paper | |||
| iPad with LeafSensor app installed (see Supplemental Info) | |||
| Pipette | Any | ||
| Petri dish | Any | ||
| Transmission device (see Supplemental info) | |||
| Water |
References
- Senn, G. Die Gestalts- und Lageveränderung der Pflanzenchromatophoren. , Wilhelm Engelmann. Leipzig, Germany. (1908).
- Zurzycki, J. The influence of chloroplast displacements on the optical properties of leaves. Acta Societatis Botanicorum Poloniae. 30, 503-527 (1961).
- Wada, M., Kagawa, T., Sato, Y.
- Wada, M.
- Kasahara, M., Kagawa, T., Oikawa, K., Suetsugu, N., Miyao, M., Wada, M. Chloroplast avoidance movement reduces photodamage in plants. Nature. 420, 829-832 (2002).
- Davis, P. A., Hangarter, R. P. Chloroplast movement provides photoprotection to plants by redistributing PSII damage within leaves. Photosynthesis Research. 112, 153-161 (2012).
- Howard, M. M., Bae, A., Königer, M. The importance of chloroplast movement, nonphotochemical quenching, and electron transport rates in light acclimation and tolerance to high light in Arabidopsis thaliana. American Journal of Botany. 106 (11), 1-10 (2019).
- Gotoh, E., et al. Chloroplast accumulation response enhances leaf photosynthesis and plant biomass production. Plant Physiology. 178, 1358-1369 (2018).
- Howard, M. M., Bae, A., Pirani, Z., Van, N., Königer, M. Impairment of chloroplast movement reduces growth and delays reproduction of Arabidopsis thaliana in natural and controlled conditions. American Journal of Botany. 107 (9), 1309-1318 (2020).
- Trojan, A., Gabryś, H. Chloroplast distribution in Arabidopsis thaliana (L.) depends on light conditions during growth. Plant Physiology. 111, 419-425 (1996).
- Oikawa, K., et al. Chloroplast unusual positioning is essential for proper chloroplast positioning. The Plant Cell. 15, 2805-2815 (2003).
- Königer, M., Bollinger, N. Chloroplast movement behavior varies widely among species and does not correlate with high light stress tolerance. Planta. 236, 411-426 (2012).
- Kagawa, T., et al. Arabidopsis NPL1: a phototropin homolog controlling the chloroplast high-light avoidance response. Science. 291, 2138-2141 (2001).
- Berg, R., et al. A simple low-cost microcontroller-based photometric instrument for monitoring chloroplast movement. Photosynthesis Research. 87, 303-311 (2006).
- Johansson, H., Zeidler, M. Automatic chloroplast movement analysis. Molecular Biology. 1398, Springer. Germany. 29-35 (2016).
- Briggs, W. R., et al.
- Jarillo, J. A., et al. Phototropin-related NPL1 controls chloroplast relocation induced by blue light. Nature. 410, 952-954 (2001).
- Sakai, T. Arabidopsis nph1 and npl1: blue light receptors that mediate both phototropism and chloroplast relocation. Proceedings of the National Academy of Sciences, USA. 98 (12), 6969-6974 (2001).
- Wada, M., Kong, S. -G.
- Wen, F., Xing, D., Zhang, L. Hydrogen peroxide is involved in high blue light-induced chloroplast avoidance movements in Arabidopsis. Journal of Experimental Botany. 59 (10), 2891-2901 (2008).
- Tlalka, M., Fricker, M. The role of calcium in blue-light dependent chloroplast movement in Lemna trisulca L. The Plant Journal. 20, 461-473 (1999).
- Königer, M., Bollinger, N. Chloroplast movement behavior varies widely among species and does not correlate with high light stress tolerance. Planta. 236, 411-426 (2012).
- Higa, T., Wada, M. Chloroplast avoidance movement is not functional in plants grown under strong sunlight. Plant, Cell and Environment. 39, 871-882 (2016).
- Arduino. Arduino.cc. , Available from: https://www.arduino.cc (2021).
- Königer, M., Delamaide, J. A., Marlow, E. D., Harris, G. C. thaliana leaves with altered chloroplast numbers and chloroplast movement exhibit impaired adjustments to both low and high light. Journal of Experimental Botany. 59, 2285-2297 (2008).
