Summary
많은 식물 종은 빛 흡수를 최적화하기 위해 엽록소의 위치를 변경합니다. 이 프로토콜은 간단한 가정용 계측기를 사용하여 아라비도시스 탈리아나 잎의 엽록소 류스트 이동을 조사하는 방법을 설명하며 잎을 통해 빛의 전달의 변화를 프록시로 사용합니다.
Abstract
잎의 엽록소운동은 특정 조건하에서 광억제를 최소화하고 성장을 증가시키는 데 도움이 되는 것으로 나타났습니다. 엽록체 운동에 대해 많은 것을 배울 수 있는 것은 예를 들어, 공초점 형광 현미경 검사를 사용하여 잎에서 엽록소포스트 포지셔닝을 연구하되, 이러한 유형의 현미경 검사에 대한 접근이 제한적이다. 이 프로토콜은 엽록체 이동의 프록시로 잎 전송의 변화를 사용하는 방법을 설명합니다. 경차단을 최대화하기 위해 엽록소가 확산되면 전송이 낮습니다. 엽록체가 빛을 피하기 위해 항클린 세포벽을 향해 움직이면 전염이 더 높아집니다. 이 프로토콜은 잎을 다른 청색 광 강도에 노출시키고 잎 전송의 동적 변화를 정량화하기 위해 집에서 만든 간단한 계측기를 사용하는 방법을 설명합니다. 이 접근은 연구원이 다른 종 및 돌연변이에 있는 엽록소염 운동을 정량적으로 기술하고, 그것에 화학물질 및 환경 요인의 효력을 연구하거나, 예를 들면, 새로운 돌연변이에 대한 스크린, 엽록류의 운동에 빛 지각에서 이끌어 내는 프로세스에 있는 누락된 분대를 확인하기 위하여 허용합니다.
Introduction
빛은 광합성, 식물 성장 및 개발에 필수적입니다. 그것은 빛 강도뿐만 아니라 계절이나 하루의 과정을 통해 변경으로 가장 역동적 인 abiotic 요인 중 하나입니다, 뿐만 아니라 신속하고 예측할 수없는 방법으로 구름 커버에 따라. 잎 수준에서, 빛 강도는 또한 주변 식물과 식물의 자신의 캐노피의 밀도와 자연에 의해 영향을받습니다. 식물이 가변 조명 조건에서 빛 차단을 최적화할 수 있는 한 가지 중요한 메커니즘은 청색광 자극1,2에 대응하여 엽록소가 이동하는 기능입니다. 저조도 조건에서 엽록소는 빛 차단을 극대화하고 광합성을 극대화하기 위해 소위 축적 반응에서 빛(periclinal 세포벽을 따라)에 수직으로 퍼져 나아집니다. 높은 조명 조건에서 엽록소는 소위 회피 반응에서 항클럼세포 벽을 향해 이동하여 광 차단및 광억제의 위험을 최소화합니다. 많은 종에서 엽록소는 또한 축적 및 회피 위치와 종종 그 두 3,4 사이의 중개와 구별되는 특정 어두운 위치를 가정합니다. 다양한 연구는 엽록소 운동이 잎의 단기 스트레스 허용 오차뿐만 아니라, 특히 가변 광 조건하에서 식물의 성장과 생식 성공에 중요하다는 것을 입증했습니다8,9.
엽록체 운동은 가벼운 현미경1을 사용하여 특정 살아있는 표본(예를 들어, 조류 또는 엘로데아와 같은 얇은 잎이 많은 식물)에서 실시간으로 쉽게 관찰됩니다. 그러나 대부분의 잎에서 엽록체 운동을 연구하려면 경현미경10하에서 시료를 보기 전에 엽록체 이동, 화학적 고정 및 단면 의 준비를 유도하기 위한 전치료가 필요합니다. 공초점 레이저 현미경 검사법의 도입으로, 또한 그대로 또는 고정 된 잎4,11,12에서 엽록소의 3D 배열을 이미지할 수 있게되었다. 이러한 이미징 기술은 중요한 질적 정보를 제공함으로써 엽록소 운동의 이해를 크게 돕습니다. 엽록소 위치(예를 들어, 이러한 이미지의 백리클 또는 항클린 위치에서 엽록체의 백분율 또는 총 셀 표면당 엽록래가 적용되는 영역의 백분율)을 정량화하는 것도 가능하지만, 특히 위치 10,8의 급격한 변화를 포착하는 데 필요한 간격으로 실시되는 경우 매우 시간이 많이 소요됩니다. . 특정 종이나 돌연변이의 어두운 적응된 잎이 회피 반응으로 엽록체 운동을 할 수 있는지 여부를 보여주는 가장 간단한 방법은 잎의 스트립을 높은 빛에 노출시키면서 어둠 속에서 엽록을 유지하기 위해 잎의 대부분의 영역을 덮는 것입니다. 최소 20분 동안 높은 광노출 후 노출된 부위의 엽록소가 회피 위치로 이동하게 되며, 노출된 스트립은 잎의 나머지 부분보다 눈에 띄게 밝은 색상으로 움직입니다. 이것은 야생 유형 A. 탈리아나에 대 한 사실 하지만 엽록체 운동 돌연변이의 일부에 대 한 나중에 더 자세히 설명 13. 이 방법 및 수정(예: 리프의 어떤 부분이 노출되는 반전, 빛의 강도 변화)은 많은 수의 돌연변이를 선별하고 회피 또는 축적 응답 또는 둘 다를 나타낼 능력이 부족한 null 돌연변이를 식별하는 데 유용합니다. 그러나 엽록류 운동의 동적 변화에 대한 정보는 제공하지 않습니다.
대조적으로, 여기서 설명된 방법은 전체 엽록체 운동을 위한 프록시로서 잎을 통한 광 전달의 변화를 사용하여 온전한 잎에서 엽록소 운동의 정량화를 허용합니다: 엽록소가 축적 반응에서 메소필 세포에 퍼지는 조건하에서, 많은 엽록세포가 회피 반응에 있을 때보다 잎을 통해 전달되는 빛이 적다. 항클inal 세포벽을 따라 자신을 배치. 따라서, 전송의 변화는 잎14에서 전체 엽록소 운동의 대리자로 사용될 수 있다. 기기의 세부 사항은 다른 곳에서 설명되어 있지만 기본적으로 계측기는 청색광을 사용하여 엽록체 이동을 트리거하고 설정된 간격으로 해당 잎을 통해 전송되는 적색 광의 양을 측정합니다. 최근에는 수정된 96웰 마이크로플레이트 판독기, 파란색 LED, 컴퓨터 및 온도 제어 인큐베이터15를 사용하는 이 시스템의 수정이 설명되었습니다.
스크리닝을 위한 잎의 광학 평가를 포함한 방법의 조합을 사용하는 옵션, 전송의 동적 변화 측정 및 현미경 검사법의 사용에 이어, 클로로플라스트 운동의 생리적/생태적 중요성에 대한 우리의 이해를 크게 지원했습니다. 예를 들어, 그것은 그들의 운동의 특정 양상에서 손상되는 각종 돌연변이의 발견 그리고 특성으로 이끌어 냈습니다. 예를 들어, A. 탈리아나 phot 1 돌연변이체는 저조도에서 엽록체를 축적할 수 있는 능력이 부족하고, phot 2 돌연변이체는 회피 반응을 수행할 수 있는 능력이 부족합니다. 이러한 표현형은 각각 2개의 청색광 수용체16,17,18의 손상 때문입니다. 대조적으로, chup1 돌연변이는 셀11,19 내의 원하는 위치로 엽록을 이동하는 데 필수적인 엽록체 주위에 적절한 액틴 필라멘트를 형성하는 능력이 부족합니다. 돌연변이 연구 이외에, 연구원은 프로세스의 기계론적 측면을 해명하기 위하여 엽록체 운동에 각종 억제제의 효력을 평가했습니다. 예를 들어, H2O2 및 각종 항산화제와 같은 화학 물질은 엽록소류 운동에 대한 이 신호 분자의 효과를 조사하기 위해 사용되었다20. 다양한 억제제는 엽록소 운동21에서 칼슘의 역할을 해명하기 위해 사용되었다. 엽록체 운동의 메커니즘을 밝히는 데 도움이 되는 것 외에도, 이러한 방법은 이러한 행동의 생태학적 및 진화적 맥락을 이해하기 위해 다양한 종 이나 돌연변이체에서 엽록체 운동을 비교하는 데 사용할 수 있습니다. 예를 들어, 엽록소 운동 경로에서 다양한 돌연변이의 영향의 정도가 성장 조건에 의존하는 것으로 나타났다7,9, 태양 적응 식물은 그들의 엽록성형을 많이 이동하지 않는 것 같다. 대조적으로, 움직임은 그늘 식물에 매우 중요하다10,22,23.
모델 플랜트 A. thaliana에 초점을 맞춘 이 메서드 종이는 이전에 개발된 계측기9의 업데이트된 버전인 전송 장치를 사용하는 방법을 설명합니다. 이 악기는 시판되지 않지만 전자 공학또는 물리학 동료와 학생들의 도움을 기본적인 이해가있는 사람들은 저렴한 부품을 사용하여 자세한 지침을 따르고 장비를 제작 할 수 있습니다 ( 보충 파일 참조). 악기를 구축하는 데 사용되는 오픈 소스 플랫폼은 광범위한 웹 지원과 문제가 발생하면 도움을 제공하는 커뮤니티 포럼이 있습니다24.
이 프로토콜은 다양한 광 조건에 잎을 노출하고 A. thaliana의 어둡고 축적 및 회피 반응을 포착하는 표준 탐색 실행에서 잎 전송의 변화를 결정하는 데 장비를 사용하는 방법에 중점을 둡니다. 이러한 실행은 실험의 목표에 따라 수정할 수 있으며 대부분의 식물 종과 함께 사용할 수 있습니다. 이 논문은 A. 탈리아나 야생형 및 여러 돌연변이의 전송 데이터의 예를 제공하고 데이터를 추가로 분석하는 방법을 보여줍니다.
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Protocol
1. 달리기를 위해 나뭇잎 준비
- 8 A. 탈리아나 식물을 밤새 어둠 속에서 놓아 (대부분의 종에 대해 6 h 가 작동 >) 엽록소가 어두운 위치로 이동하도록합니다. 모든 복제본은 비교 가능한 전송 값으로 시작합니다.
- 또는 전체 잎 8개에 촉촉한 필터 용지가 있는 페트리 접시에 넣고 페트리 접시를 닫고 알루미늄 호일로 포장하십시오.
2. 전송 장치가 작동하는지 테스트
- 전송 장치를 안정적인 전원에 연결하고 장치의 전원 스위치(ON/OFF 버튼)를 눌러 기기를 재설정합니다(그림 1A, B).
- iPad를 안정적인 전원에 연결하고 홈 화면 버튼을 눌러 화면을 활성화하고 암호를 입력하여 로그인합니다.
- 설정 아이콘을 누르고, 디스플레이 및 밝기 아이콘을 누르고, 자동 잠금을 누르고, 이 옵션을 눌러 화면이 영구적으로 유지되도록 선택합니다. 그렇지 않으면 화면이 절전 모드로 나오면 프로그램이 실행중지됩니다. 홈 화면 버튼을 눌러 메인 화면으로 돌아갑니다.
- 홈 화면 버튼을 두 번 눌러 열려 있는 응용 프로그램을 확인하고 화면 상단쪽으로 스 와이프하여 모든 응용 프로그램을 닫습니다. 홈 화면 버튼을 눌러 메인 화면으로 돌아갑니다.
- 메인 화면에서 또는 왼쪽 또는 오른쪽으로 스 와이프하여 LeafSensor 응용 프로그램을 찾을 수 있습니다. 앱의 아이콘을 눌러 엽니다( 보충 파일 참조). 텍스트와 흰색 필드가 있는 녹색 화면이 정보를 입력하는 것처럼 보입니다.
- 앱이 전송 장치와 통신하고 있음을 나타내기 때문에 Connected 라는 단어가 화면 하단에 표시되어 있는지 확인합니다. 'Adafruit NOT Found'라는 메시지가 나타나면 장치가 연결되어 있는지 확인하고 장치의 시작 버튼을 다시 누릅니다.
- 앱 페이지의 처음 4개 필드를 작성하여 실험이름을 지정하고 잎없이 잎 클립이 열리면 간단한 테스트 실행 조건을 설정합니다.
- 예를 들어 , 시험 이름을 Expt Name이라는 필드에 입력하여 실험의 이름을 8개 이하의 대문자 또는 숫자 사용 )으로 지정합니다.
- 예를 들어 # 라이트 텐스(Light Tensities)라는 필드에 3을 입력하여 실험에서 사용할 다른 청색광 강도를 선택합니다.
- 이 실행에 대한 청색 광 강도를 선택하고(0에서 3000 사이의 정수를 선택하고 각 숫자를 쉼표로 다음 번호와 분리하십시오. 이러한 숫자를 LED의 실제 청색광 강도로 변환하는 방법에 대한 보충 파일을 참조) 예를 들어 0,100,1000 을 Blue Initiess라는 필드에 입력하여.
- 각 청색광 강도가 잎에 비추는 시간을 선택합니다(쉼표로 각 숫자를 다음 숫자와 분리)(예: 블루 워밋(분)라는 필드에 2,2,2개를 입력합니다.
- 화면 의 중간 섹션에서 실험 시작 을 누릅니다. 화면 의 하부에 8 하이픈과 시작 실험 메시지가 나타납니다.
- 처음 2분 동안 LED에서 빛이 방출되지 않도록 한 다음 약한 청색광이 방출되고 2분 후에는 청색광 강도가 증가합니다.
- 측정을 위해 1분에 한 번 LED에서 강렬한 적색 표시등이 방출되는지 확인합니다.
참고: 실험이 실행 중이면 8개의 센서 각각의 앱 페이지에 숫자가 표시되고 데이터는 1분에 한 번 업데이트됩니다. 포토다이오드의 출력 번호가 약 1000-1023(방이 어두운 경우)인지 확인합니다. 왼쪽 아래의 업데이트는 6개의 측정 중 1 개(1분마다 측정)와 같은 측정 횟수를 보여줍니다. - 실험이 완료되면 앱 페이지의 왼쪽 아래에서 실험이 완료 된 모양을 확인합니다. 이제 악기는 잎으로 실행할 준비가되어 있습니다.
- 홈 화면 버튼을 두 번 누르고 앱에서 스 와이프하여 다시 엽니 다. 기기의 ON/OFF 버튼을 눌러 재설정합니다.
3. 잎 클립에 나뭇잎 설정
참고: 이 단계는 엽록소 의 움직임을 유도하지 않도록 녹색 광원 (예 : 전구 앞에 녹색 필터를 놓음)으로 어둠 속에서 수행해야합니다. 또는 매우 낮은 백색광과 잎 클립에서 확장된 어두운 기간을 사용하십시오. 리프 클립의 한 부분이 LED(더 큰 개구부)를 보유하고 다른 부분은 광트랜지스터(그림 1C)를 보유한다는 것을 기억하십시오.
- 식물이 전체적으로 어둡게 조정된 경우 LED를 덮을 수 있을 만큼 8개의 잎을 선택합니다. 그렇지 않으면 페트리 접시에서 잎을 제거합니다. 리프 클립의 길이에 대한 필터 용지 8 스트립을 준비하고 상단에 구멍을 뚫어 LED를 덮지 않도록 준비합니다.
- 필터 용지를 적분시키고 LED를 보유한 리프 클립 부분에 놓습니다. 8개의 리프 클립 각각에 대해 이 것을 반복합니다.
- 각 잎을 잎 클립의 젖은 필터 용지 위에 놓습니다. 올바른 리프 면이 LED를 향하고 있는지 확인합니다(일반적으로 실험은 LED를 향한 adaxial 잎 표면으로 수행됩니다).
- 리프의 미드리브를 LED 위에 올려놓지 말고 보다 일관된 결과를 얻으려면 각 리프의 유사한 부분(예: 리프의 가장 넓은 부분)을 LED 위에 배치하십시오.
- 다른 리프 클립 부분을 포토트랜지스터를 위에 놓습니다. 고무 밴드를 사용하여 필요한 경우 두 개의 리프 클립 부품을 함께 고정합니다(그림 1C,D).
- 각 잎 클립을 '보트'에 넣고 피펫을 사용하여 저수지를 물로 채웁니다. 나뭇잎이나 적어도 필터 용지가 실행에 나뭇잎의 탈수를 피하기 위해 물에 닿는지 확인하십시오 (그림 1D).
4. 달리기 실시
참고: 표준 탐사 실행의 경우, 4 h의 어둠(0 μmol photon m-2 s-1)으로 시작하여 7h의 낮은 청색광(2 μmol photon m-2 s-1), 5, 10, 30, 40, 50, 60, 90, 100 μmol photon-2-100 μmol photon m-2-2-1의 다음에 이어 60분으로 시작합니다. 이것은 잎이 그들의 어두운 전송을 전시하고, 엽록소류 운동을 최대 축적으로 유도하고, 회피 반응의 다른 정도를 보여주기 위하여 유도할 것입니다.
- 아래에 설명된 단계를 사용하여 iPad에 LeafSensor 앱을 설정합니다.
- ExPLORA1을 Expt Name이라는 필드에 입력합니다.
- #빛 강화라는 필드에 10을 입력합니다.
- 유형 0,1,60,160,550,750,950,1150,1350,1950 블루 강도라는 필드에.
- 블루 지속시간이라는 필드에 240,420,60,60,60,60,60,60,60을 입력합니다.
- 실험을 시작합니다. 첫 번째 분 이후에는 출력 값(일반적으로 990에서 820 사이)이 화면에 나타납니다. 값이 멀리 떨어져 있으면 잎이 잎 클립에 올바르게 배치되었는지 확인합니다.
- 실행이 완료되면 실험 완료 메시지가 화면 왼쪽 하단에 나타나는지 확인합니다. 데이터는 자동으로 저장됩니다.
- 화면을 수평이 아닌 똑바로 세워 놓습니다. 화면에는 저장 및 유틸리티라는 두 가지 새로운 옵션이 나타납니다.
- 유틸리티를 누르면 저장된 파일 목록이 나타납니다. 관심 있는 파일을 선택합니다.이 경우 ExPLORA1을 선택합니다.
- 파일 목록 아래에 선택한 Expt를 찾습니다: EXPLORA1. 이메일을 누르고 이메일 주소를 입력하면 데이터 파일이 메시지에 자동으로 연결됩니다. 보내기를 누릅니다.
참고: 파일이 도착할 때까지 지연이 길어지면 앱을 다시 시작하고 파일을 다시 보냅니다.
- 실행이 중단되었지만 해당 시점까지의 데이터가 관심있는 경우 유틸리티를 선택하기 전에 저장을 누릅니다. 여러 실행 후 메모리 공간을 정리: 유틸리티 를 누르고, 한 번에 하나의 파일을 선택하고, 파일 옆왼쪽으로 스 와이프하고, 파일을 제거하기 위해 삭제를 누릅니다.
- 다시 눌러 다른 실험을 실행하거나 완료되면 홈 화면 버튼을 누르고, 메인 화면으로 스 와이프하고, 설정을 누르고, 디스플레이 및 밝기를 누르고, 자동 잠금을 누르고, 2 분을 누릅니다.
5. 데이터 분석
- 이메일에서 파일 EXPLORA1 을 다운로드하고, 파일에 .csv 확장 .csv 추가하고, 파일을 두 번 클릭합니다. 데이터는 8개의 서로 다른 센서에 대한 데이터가 별도의 열로 정렬된 스프레드시트로 정렬됩니다. 마지막 열은 데이터가 수집된 시간(초)을 표시합니다. 무의미한 데이터가 포함된 경우 제목(Sensor1-8) 아래의 첫 번째 행을 삭제합니다.
- 별도의 시트에 각 센서의 결과를 포함하고 각 리프 클립 및 센서의 보정에서 얻은 방정식을 사용하여 출력 값을 % 전송 값으로 변환하는 마스터 데이터 시트를 설정합니다( 보충 파일 참조).
- 각 데이터 세트를 별도의 데이터 시트로 복사합니다(예: 열 A에는 시간이 포함됩니다. 열 C에는 Sensor1의 데이터가 포함되어 있음).
- 초에서 분으로 시간을 변환하도록 열 B를 설정합니다. 캘리브레이션에서 방정식을 사용하여 전압을 % 전송으로 변환하는 수식이 포함되도록 열 D를 설정합니다.
- 각 센서에 대해 유사한 데이터 시트를 설정하고 전압 출력을 % 전송 값으로 변환하는 데 사용되는 수식을 기억하십시오.
- 시간 대비 % 전송 (T)을 플롯, 최소 (그림 2).
- 마스터 데이터 시트를 다시 사용할 수 있도록 새 이름으로 데이터 시트를 저장합니다.
- 데이터(그림 2)를 추가분석하려면 ΔT(%) 축적 (예를 들어, 어두운 T에 비해 최대 축적에서 T의 변화), ΔT( 예를 들어, 어두운 T에 비해 최대 회피에서 T의 변화), 또는 dT/dt(%/h) (예를 들어, 축적 또는 회피 반응의 가장 빠른 부분 동안 T의 변화)를 계산한다. 자세한 내용은 8을 참조하십시오.
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Representative Results
전송 장치의 상이한 부분은 도 1에 도시되어 있다. 마이크로 컨트롤러는 장치의 제어 장치이며 검은 잎 클립에 고정된 잎이 발생하는 광 조건을 제어하고 수신하는 광 전송 데이터를 저장합니다(그림 1A, B). 계측기의 제어 유닛을 클로즈업하면 ON/OFF 버튼, 데이터 저장 기능을 위한 SD 카드, Bluetooth 쉴드( 데이터를 LeafSensor 앱으로 전송) 및 LED(발광 다이오드)와 광트랜지스터에 연결하는 케이블이 표시됩니다. 마이크로 컨트롤러는 계측기의 베이스에 위치하며 그림에 가장자리만 표시됩니다(그림 1B). 3D 프린팅 된 검은 잎 클립은 잎, LED 및 광트랜지스터를 제자리에 고정시합니다. 젖은 필터 용지는 LED가 방해받지 않도록 LED가 있는 리프 클립 부분에 배치되며, 어두운 적응된 잎은 LED를 향한 아다실 리프 표면으로 배치됩니다. 회로도는 LED와 광트랜지스터가 잎의 반대편에 위치한다는 것을 보여줍니다. LED는 파란색 또는 빨간색 표시등을 방출할 수 있습니다. 청색광은 엽록소 운동을 유도하는 데 사용되며, 1분마다 짧은 시간 동안 꺼져 있으며, 그 동안 빨간색 측정 광이 잎에 비추는 다. 리프의 반대편에 위치한 광트랜지스터는 잎을 통해 전송되는 적색광의 양을 감지하고 데이터를 마이크로 컨트롤러 및 SD 카드(그림 1C)로 전송합니다. 리프 클립의 두 부분이 조립되어 물로 채워진 3D 인쇄된 '보트'에 배치되어 실험 중에 잎을 촉촉하게 유지하는 데 도움이 됩니다(그림 1D).
도 2는 % 전송 데이터가 시간(분)에 대해 플롯되는 일반적인 데이터 집합을 나타낸다. 이 특별한 전송 실행은 1 h의 어둠을 포함했으며, 그 다음으로 3 h의 낮은 청색광(2 μmol 광자 m-2 s-1), 중간(30 μmol 광자 m-2 s-1) 및 높은 청색광(100 μmol photon m-2 s-1) 강도가 각각 1h로 뒤따랐다. 데이터는 A. 탈리아나의 전송이 저조도(축적 응답)에서 감소하는 반면, 광 강도가 더욱 증가할 때 회피 반응이 유도된다는 것을 보여줍니다. 이것은 전부 또는 전혀 응답이 아니며 어두운 값에 대한 변경 정도는 정확한 청색 광 강도에 따라 달라집니다. 전송(ΔT)의 이러한 백분율 변화는 데이터 아래에 표시된 수식을 사용하여 계산할 수 있습니다. 또한, 축적 또는 회피 반응이 트리거될 때 전송의 초기 변화 시 변속기(dT/dt)의 속도는 곡선의 경사를 사용하여 계산될 수 있다.
19h 롱런 동안 야생형(WT)(도 3A)과 phot 1 및 phot 2 돌연변이 A. 탈리아나 잎(그림 3B)의 평균 전송 값이 표시됩니다. 이러한 확장된 탐색적 전송 실행은 향후 주행에서 사용할 청색광 강도를 설정하는 데 도움이 됩니다. 잎은 어둠의 4h에 처음 노출되었고, 일관된 전송 값은 잎이 완전히 어둡게 조정되었음을 나타내며 복제본 간의 데이터를 보다 일관되게 만듭니다. 다음 7h의 경우 잎은 낮은 청색광(2 μmol photon m-2 s-1)에 노출되었다. WT 및 phot 2에서는, 초기 빠른 전송 감소가 엽록소가 축적 반응으로 이동했음을 나타내는 느린 감소에 선행된다. 사용되는 종에 따라 가능한 가장 낮은 전송을 얻기 위해 다른 양의 시간이 걸릴 수 있습니다. 많은 경우에, 연구원은 주어진 된 시점에서 다양 한 돌연변이를 비교에 관심이 있을 수 있습니다., 그래서 매우 낮은 빛에 노출 시간으로 제한 될 수 있습니다. WT에 비해, phot 1은 감소된 축적 반응을 나타낸다. 낮은 청색광에 대한 확장된 노출은 매시간 청색광 강도의 단계별 증가(5, 10, 30, 40, 50, 60, 90, 100 μmol 광자 m-2 s-1)가 뒤따릅니다. A. thaliana WT 및 phot 1의 % 전송은 광 강도의 각각 증가와 함께 증가하여 엽록소가 회피 반응으로 이동하지만 이는 phot 2에서 볼 수 없다는 것을 나타낸다. 어두운 값(ΔT)에 비해 전송의 변화 정도는 정확한 청색광 강도에 따라 달라지며 유전자형(도 3C)에 따라 다를 수 있다. 청색 강도가 5에서 10 μmol 광자 m-2 s-1(도 3D)에서 증가함에 따라 회피가 트리거될 때 전송시 초기 응답 시 전송 속도 변화(dT/dt)의 속도가 도시된다. 속도는 WT와 phot 1과 동일하지만 phot 2 돌연변이체의 경우 매우 느립니다.
그림 1: 전송 장치의 개요입니다. 오른쪽 하단의 블랙박스에 제어 장치가 있는 홈 제작 전송 장치와 왼쪽 상단과 하단의 리프 클립(A)의 그림입니다. ON/OFF 버튼이 있는 제어 장치, 데이터 저장 기능을 위한 SD 카드 및 무선 통신용 Bluetooth 쉴드를 클로즈업합니다. 케이블은 제어 장치를 발광 다이오드(LED) 및 광트랜지스터에 연결합니다. 마이크로 컨트롤러는 계측기의 베이스에 위치하며 이 그림(B)에는 가장자리만 표시됩니다. 3D 프린팅 된 검은 잎 클립 : 왼쪽에 LED를 들고 있는 잎 클립 부분이 표시되고 오른쪽에 광트랜지스터를 들고 있는 리프 클립 부분이 표시됩니다. 실행을 설정하려면 LED를 가리지 않고 클립에 촉촉한 필터 용지(LED 크기의 구멍 포함)가 배치됩니다. 그런 다음 리프가 LED를 덮고 있는 클립에 배치됩니다. 회로도는 LED와 광트랜지스터(PT)가 각 리프 클립의 두 부분이 조립될 때 잎 가까이에 서로 반대편에 위치하고 있음을 보여준다(C). 잎 클립은 물로 채워진 3D 인쇄된 '보트'에 배치되어 잎과 필터 용지(D)를 수화합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: 일반적인 A. 탈리아나 리프의 전송 데이터. 1시간 동안 어둠에 노출된 A. 탈리아나 잎에 대한 전송(T) 데이터는 저조도 3시간(2μmol 광자 m-2 s-1), 중간체(30μmol 광자 m-2 s-1) 및 높은 청색광(100μmol 광자 m-2 s-1)이 그 뒤를 이었다. 저조도 강도는 축적 반응을 유도하고, 높은 광 강도는 회피 반응의 다른 정도를 유도하면서. 어두운 T 수준은 기준선(파란색 선)으로 작용합니다. T의 %변화는 어두운 수준(ΔT)을 상대한다( 예를 들어, 최대 축적 또는 회피의 다른 수준(어두운 T에 대한 차이는 파란색 화살표로 표시)를 계산할 수 있다. 또한, T가 변경되는 속도(dT/dt)는 예를 들어, 회피 응답의 초기 단계에서 시간(파란색 삼각형으로 표시)에 대해 플롯된 T의 기울기로부터 계산될 수 있다. 방정식은 그래프 아래에 표시됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3: 야생형및 돌연변이 A. 탈리아나 잎의 클로로플라스트 운동. 어두운 적응, 성숙한 잎은 4 시간 동안 어둠에 노출되었고, 그 다음으로 2 μmol 광자 m-2 s-1에 7 시간 노출이 있었고, 매 시간 (5, 10, 30, 40, 50, 60, 90, 100 μmol 광자 m-2 s-1)의 단계 현명한 증가가 뒤따랐습니다. WT(A)의 평균 % 전송(T) 값(n =20)과 phot 1 및 phot 2 잎(B). 어두운 값에 비해 % T의 변화: 음수 값은 나뭇잎이 누적 응답을 보였음을 나타내고 양수 값은 회피 응답을 나타냅니다. 오른쪽의 숫자는 ΔT 데이터가 계산된 청색광 강도를 나타냅니다. 색상 구성표는 그림(C)의 나머지 부분과 동일합니다. dT/dt 데이터는 잎이 5에서 10 μmol 광자 m-2 s-1의 증가에 반응하고 시간당 % T가 변경되는 속도를 나타낼 때 계산되었습니다. A및 B에 대한 데이터는 C 및 D수단이 sD(n = 20)± 의미합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
유연한 파일. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
이 장치는 매우 사용하기 쉽지만 LED 및 광트랜지스터의 위치 지정이 잎 클립에서 잎 클립에 약간 다를 수 있기 때문에 전송 장치의 각 리프 클립 설정을 독립적으로 보정하는 것이 매우 중요합니다. LED와 광트랜지스터가 안정적으로 삽입되었는지 확인하고 데이터가 꺼져 있는 경우 교정을 다시 확인합니다. 장치에 물을 가져오는 것을 피하십시오. 잎 클립의 잎은 물 스트레스를 피하기 위해 물로 가득 찬 '보트'에 배치됩니다. 예를 들어, 이 보트를 제어 장치와 분리된 낮은 테두리가 있는 플라스틱 용기에 넣고 넘어뜨리지 마십시오. 케이블 연결을 분리하거나 구부리지 마십시오. 잎 클립을 삽입할 때주의하고 케이블을 너무 많이 당기거나 구부리지 마십시오.
초기 전송 값이 어두운 위치를 나타내는지 확인하기에 충분한 길이의 잎을 어둡게 조정하는 것이 중요합니다. 장치의 어두운 기간 동안 값이 잎에 푸른 빛을 비추기 전에 적어도 30 분 동안 안정되어 있는지 확인합니다. 그렇지 않은 경우 잎을 다음 실행하기 전에 더 오랜 시간 동안 잎을 어둡게 조정하거나 전송 장치의 어두운 기간을 연장하여 잎이 정상 상태에 도달하는 데 걸리는 시간을 모니터링합니다. 전형적으로, 전송 데이터는 어두운 값(ΔT)에 상대하는 주어진 청색광 강도에서 전송의 %변화로 제시된다. 따라서 올바른 기준값을 얻는 것이 중요합니다.
탐사 실행은 임의의 A. thaliana 돌연변이(예를 들어, 광합성, 근신 또는 특징이 없는 돌연변이체등)의 다른 측면에 영향을 미치는 것으로 알려진 돌연변이체 또는 잎 부위가 잎 클립에서 LED를 커버할 만큼 충분히 크거나 잎이 너무 두껍지 않는 한 사용될 수 있다. 이 프로그램은 연구원의 요구를 채우기 위해 쉽게 적응할 수 있다 예를 들어, 청색광 강도는 엽록소류 운동을 유도하는 것으로 나타난 범위 내에서 변경될 수 있다(반응 포화 약 100 μmol 광자 m-2 s-1), 노출 시간을 변경할 수 있고, 연속광 조건의 수를 변경할 수 있다. 또한, 잎은 엽록체 운동을 조절하는 신호 경로의 공백을 채우려는 연구자에게 중요한 액틴 중합제 또는 신호 경로 구성 요소의 억제제와 함께 장치에서 실행되기 전에 전처리 될 수 있다.
모든 방법과 마찬가지로,이 방법도 한계와 단점을 가지고 있습니다. 절차는 잎의 광학 적 특성, 즉 얼마나 많은 빛이 전달되는지에 따라 변경됩니다. 따라서 비교적 얇은 잎과 가장 잘 어울리며, 두꺼운 잎은 종종 소음 수준을 넘어 적색 광의 충분한 전송을 허용하지 않습니다. 변속기를 변경하여 잎에 빛나는 적색광 강도를 높이고 광전도의 감도를 높일 수 있습니다. 이 방법은 모든 세포 및 세포 층에서 엽록소세포의 움직임을 통합측정할 뿐이므로, 예를 들어, 항방향으로 이동하는 엽록소세포는 전달의 순 변화를 초래할 수 있다. 특히 이전에 특징이 없는 돌연변이 또는 종과 함께 작업할 때, 현미경 을 사용하여 엽록소 포지셔닝의 이미지와 전송 결과를 보완하는 것이 중요합니다. 예를 들어, 청색광 강도의 변화에 대응하여 전송의 느린 변화가 A. 탈리아나 돌연변이체에서 관찰되었으며 다양한 이유로 인해 관찰되었을 수 있습니다. 현미경 검사법은 세포가 일반적인 엽록소보다 훨씬 더 큰 2개의 엽록체만 있었다는 것을 밝혔습니다. 돌연변이는 나중에 엽록소 사단 돌연변이 아크6-125로 확인되었다.
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Disclosures
저자는 이해상충이 없습니다.
Acknowledgments
기금은 Fiske 상과 웰즐리 대학 교수상에 의해 제공되었다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Aluminum foil | |||
| Dark adapted leaves | |||
| Filter paper | |||
| iPad with LeafSensor app installed (see Supplemental Info) | |||
| Pipette | Any | ||
| Petri dish | Any | ||
| Transmission device (see Supplemental info) | |||
| Water |
References
- Senn, G. Die Gestalts- und Lageveränderung der Pflanzenchromatophoren. , Wilhelm Engelmann. Leipzig, Germany. (1908).
- Zurzycki, J. The influence of chloroplast displacements on the optical properties of leaves. Acta Societatis Botanicorum Poloniae. 30, 503-527 (1961).
- Wada, M., Kagawa, T., Sato, Y.
- Wada, M.
- Kasahara, M., Kagawa, T., Oikawa, K., Suetsugu, N., Miyao, M., Wada, M. Chloroplast avoidance movement reduces photodamage in plants. Nature. 420, 829-832 (2002).
- Davis, P. A., Hangarter, R. P. Chloroplast movement provides photoprotection to plants by redistributing PSII damage within leaves. Photosynthesis Research. 112, 153-161 (2012).
- Howard, M. M., Bae, A., Königer, M. The importance of chloroplast movement, nonphotochemical quenching, and electron transport rates in light acclimation and tolerance to high light in Arabidopsis thaliana. American Journal of Botany. 106 (11), 1-10 (2019).
- Gotoh, E., et al. Chloroplast accumulation response enhances leaf photosynthesis and plant biomass production. Plant Physiology. 178, 1358-1369 (2018).
- Howard, M. M., Bae, A., Pirani, Z., Van, N., Königer, M. Impairment of chloroplast movement reduces growth and delays reproduction of Arabidopsis thaliana in natural and controlled conditions. American Journal of Botany. 107 (9), 1309-1318 (2020).
- Trojan, A., Gabryś, H. Chloroplast distribution in Arabidopsis thaliana (L.) depends on light conditions during growth. Plant Physiology. 111, 419-425 (1996).
- Oikawa, K., et al. Chloroplast unusual positioning is essential for proper chloroplast positioning. The Plant Cell. 15, 2805-2815 (2003).
- Königer, M., Bollinger, N. Chloroplast movement behavior varies widely among species and does not correlate with high light stress tolerance. Planta. 236, 411-426 (2012).
- Kagawa, T., et al. Arabidopsis NPL1: a phototropin homolog controlling the chloroplast high-light avoidance response. Science. 291, 2138-2141 (2001).
- Berg, R., et al. A simple low-cost microcontroller-based photometric instrument for monitoring chloroplast movement. Photosynthesis Research. 87, 303-311 (2006).
- Johansson, H., Zeidler, M. Automatic chloroplast movement analysis. Molecular Biology. 1398, Springer. Germany. 29-35 (2016).
- Briggs, W. R., et al.
- Jarillo, J. A., et al. Phototropin-related NPL1 controls chloroplast relocation induced by blue light. Nature. 410, 952-954 (2001).
- Sakai, T. Arabidopsis nph1 and npl1: blue light receptors that mediate both phototropism and chloroplast relocation. Proceedings of the National Academy of Sciences, USA. 98 (12), 6969-6974 (2001).
- Wada, M., Kong, S. -G.
- Wen, F., Xing, D., Zhang, L. Hydrogen peroxide is involved in high blue light-induced chloroplast avoidance movements in Arabidopsis. Journal of Experimental Botany. 59 (10), 2891-2901 (2008).
- Tlalka, M., Fricker, M. The role of calcium in blue-light dependent chloroplast movement in Lemna trisulca L. The Plant Journal. 20, 461-473 (1999).
- Königer, M., Bollinger, N. Chloroplast movement behavior varies widely among species and does not correlate with high light stress tolerance. Planta. 236, 411-426 (2012).
- Higa, T., Wada, M. Chloroplast avoidance movement is not functional in plants grown under strong sunlight. Plant, Cell and Environment. 39, 871-882 (2016).
- Arduino. Arduino.cc. , Available from: https://www.arduino.cc (2021).
- Königer, M., Delamaide, J. A., Marlow, E. D., Harris, G. C. thaliana leaves with altered chloroplast numbers and chloroplast movement exhibit impaired adjustments to both low and high light. Journal of Experimental Botany. 59, 2285-2297 (2008).
