Summary
Många växtarter ändrar placeringen av kloroplaster för att optimera ljusabsorptionen. Detta protokoll beskriver hur man använder ett enkelt, hembyggt instrument för att undersöka kloroplast rörelse i Arabidopsis thaliana blad med hjälp av förändringar i överföringen av ljus genom ett blad som en proxy.
Abstract
Kloroplast rörelse i löv har visat sig bidra till att minimera fotoinhibition och öka tillväxten under vissa förhållanden. Mycket kan läras om kloroplaströrelse genom att studera kloroplastpositionering i löv med t.ex. konfokal fluorescensmikroskopi, men tillgången till denna typ av mikroskopi är begränsad. Detta protokoll beskriver en metod som använder förändringarna i bladöverföring som en proxy för kloroplast rörelse. Om kloroplaster sprids ut för att maximera ljusavlyssningen blir transmissionen låg. Om kloroplaster rör sig mot de antiklimatiska cellväggarna för att undvika ljus, blir överföringen högre. Detta protokoll beskriver hur du använder ett enkelt, hembyggt instrument för att exponera löv för olika blå ljusintensiteter och kvantifiera de dynamiska förändringarna i bladöverföringen. Detta tillvägagångssätt gör det möjligt för forskare att kvantitativt beskriva kloroplaströrelser hos olika arter och mutanter, studera effekterna av kemikalier och miljöfaktorer på den, eller screena för nya mutanter t.ex. för att identifiera saknade komponenter i processen som leder från ljusuppfattning till rörelsen av kloroplaster.
Introduction
Ljus är viktigt för fotosyntes, växttillväxt och utveckling. Det är en av de mest dynamiska abiotiska faktorerna eftersom ljusintensiteter inte bara förändras under en säsong eller dag, utan också snabbt och på oförutsägbara sätt beroende på molntäcket. På bladnivå påverkas ljusintensiteterna också av densiteten och naturen hos den omgivande vegetationen och växtens egen baldakin. En viktig mekanism som gör det möjligt för växter att optimera ljusavlyssning under varierande ljusförhållanden är kloroplasternas förmåga att röra sig som svar på blå ljusstimuli1,2. Under svagt ljus sprids kloroplaster ut vinkelrätt mot ljuset (längs de periclinala cellväggarna) i ett så kallat ackumuleringssvar, vilket maximerar ljusavlyssning och därmed fotosyntes. Under höga ljusförhållanden rör sig kloroplaster mot den antiklina cellväggen i ett så kallat undvikande svar, vilket minimerar ljusavlyssning och risken för fotoinhibition. I många arter antar kloroplaster också en specifik mörk position, som skiljer sig från ackumulerings- och undvikande positioner och ofta mellanhand mellan dessa två3,4. Olika studier har visat att kloroplaströrelser inte bara är viktigt för den kortsiktiga stresstoleransen hos blad5,6,7, utan också för växters tillväxt och reproduktiva framgång, särskilt under varierande ljusförhållanden8,9.
Kloroplaströrelser observeras lätt i realtid i vissa levande exemplar (t.ex. alger eller tunnbladiga växter som Elodea) med hjälp av lätt mikroskopi1. Att studera kloroplaströrelser i de flesta blad kräver dock en förbehandling för att inducera kloroplaströrelse, kemisk fixering och beredning av tvärsnitt innan du tittar på proverna under ett ljusmikroskop10. Med införandet av konfokal lasermikroskopi blev det också möjligt att avbilda 3D-arrangemanget av kloroplaster i intakta eller fasta löv4,11,12. Dessa bildframställning tekniker i hög grad stödja förståelsen av kloroplast rörelse genom att tillhandahålla viktig kvalitativ information. Kvantifiering av kloroplastpositionering (t.ex. i procent av kloroplaster i periclinala eller antiklimatiska positioner i dessa bilder eller procentandelen yta som täcks av kloroplaster per total cellyta) är också möjlig men ganska tidskrävande, särskilt om den utförs med de intervall som krävs för att fånga snabba förändringar i positionering10,8 . Det enklaste sättet att visa om mörkanpassade blad av en viss art eller mutanter kan kloroplast rörelse i undvikande svar är genom att täcka det mesta av området av ett blad för att hålla kloroplasterna i mörkret samtidigt som en remsa av bladet utsätts för högt ljus. Efter minst 20 minuters hög ljusexponering kommer kloroplasterna i det exponerade området att ha flyttats till undvikande position, och den exponerade remsan kommer att vara synligt ljusare i färg än resten av bladet. Detta gäller för vilda typ A. thaliana men inte för några av kloroplast rörelsen mutanter beskrivs mer detaljerat senare på13. Denna metod och modifieringar av den (t.ex. att vända vilka delar av bladet som exponeras, ändra ljusintensiteter) är användbara för att screena ett stort antal mutanter och för att identifiera nullmutanter som saknar antingen förmågan att uppvisa ett undvikande eller ackumuleringssvar eller båda. Det ger dock inte information om de dynamiska förändringarna i kloroplaströrelsen.
Däremot möjliggör den metod som beskrivs här kvantifiering av kloroplaströrelser i intakta löv med hjälp av förändringar i ljusöverföringen genom ett blad som en proxy för övergripande kloroplaströrelse: under förhållanden då kloroplaster sprids ut i mesofyllcellerna i ackumuleringssvaret överförs mindre ljus genom bladet än när många kloroplaster är i undvikande svar, positionera sig längs de antiklina cellväggarna. Därför kan förändringar i överföringen användas som en proxy för den övergripande kloroplaströrelsen i löv14. Detaljerna i instrumentet beskrivs någon annanstans (se Kompletterande fil), men i princip använder instrumentet blått ljus för att utlösa kloroplaströrelse och mäter hur mycket rött ljus som överförs genom det bladet med inställda intervaller. På senare tid har en modifiering av detta system beskrivits, som använder en modifierad 96-brunns mikroplatta läsare, en blå LED, en dator och en temperaturstyrd inkubator15.
Möjligheten att använda en kombination av metoder, inklusive optisk bedömning av blad för screening, följt av mätning av dynamiska förändringar i överföring och användning av mikroskopi, har i hög grad hjälpt vår förståelse av både de underliggande mekanismerna och den fysiologiska/ekologiska betydelsen av kloroplast rörelse. Till exempel ledde det till upptäckten och karakteriseringen av olika mutanter, som är nedsatta i specifika aspekter av deras rörelser. Till exempel saknar A. thaliana phot 1 mutanter förmågan att ackumulera sina kloroplaster i svagt ljus, medan phot 2 mutanter saknar förmågan att utföra en undvikande reaktion. Dessa fenotyper beror på en försämring i två respektive blå ljusreceptorer16,17,18. Däremot saknar chup1 mutanter förmågan att bilda ordentliga aktinfilament runt kloroplasterna som är nödvändiga för att flytta kloroplasterna till önskad position inom en cell11,19. Förutom mutanta studier har forskare utvärderat effekterna av olika hämmare på kloroplaströrelsen för att belysa de mekanistiska aspekterna av processen. Till exempel användes kemikalier som H2O2 och olika antioxidanter för att undersöka effekterna av denna signalmolekyl på kloroplaströrelsen20. Olika hämmare användes för att klargöra kalciums roll i kloroplaströrelsen21. Förutom att hjälpa till att avslöja mekanismerna för kloroplaströrelse kan dessa metoder användas för att jämföra kloroplaströrelser hos olika arter eller mutanter som odlas under olika förhållanden i ett försök att förstå det ekologiska och evolutionära sammanhanget för detta beteende. Det har till exempel visat sig att omfattningen av effekterna av olika mutationer i kloroplaströrelsens rörelseväg är beroende av tillväxtförhållandena7,9, och att solanpassade växter inte verkar flytta sina kloroplaster mycket. Däremot är rörelse mycket viktigt för skuggväxter10,22,23.
Detta metodpapper, fokuserat på modellväxten A. thaliana, beskriver hur man använder en överföringsanordning som är en uppdaterad version av ett tidigare utvecklat instrument9. Även om detta instrument inte är kommersiellt tillgängligt, kommer personer med en grundläggande förståelse för elektronik eller hjälp av ingenjörs- eller fysikkollegor och studenter att kunna bygga instrumentet med prisvärda delar och följa de detaljerade instruktionerna (se Kompletterande fil). Plattformen med öppen källkod som används för att bygga instrumentet har omfattande webbstöd och ett communityforum som erbjuder hjälp om problem skulle uppstå24.
Protokollet fokuserar på hur man använder instrumentet för att bestämma förändringar i bladöverföring i en standard undersökande körning som utsätter ett blad för ett brett spektrum av ljusförhållanden och fångar de mörka, ackumulerings- och undvikande reaktionerna hos A. thaliana. Dessa körningar kan modifieras beroende på experimentets mål och kan användas med de flesta växtarter. Papperet ger exempel på överföringsdata av A. thaliana wildtype och flera mutanter och visar hur man ytterligare analyserar data.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Förbereda löv för en körning
- Placera 8 A. thalianaväxter i mörkret över natten (> 6 h fungerar för de flesta arter) för att säkerställa att kloroplasterna rör sig i sitt mörka läge. Alla repliker börjar med jämförbara överförings värden.
- Alternativt kan du placera 8 kompletta blad i en Petri-maträtt med ett fuktigt filterpapper i botten, stäng Petri-skålen och linda den med aluminiumfolie.
2. Provning om transmissionsanordningen fungerar
- Anslut överföringsanordningen till en stabil strömkälla och tryck på enhetens strömbrytare (PÅ/AV-knapp) för att återställa instrumentet (figur 1A,B).
- Anslut iPad till en stabil strömkälla, tryck på hemskärmen för att aktivera skärmen och ange lösenordet för att logga in.
- Tryck på ikonen Inställningar , tryck på ikonen Visa och ljusstyrka , tryck på Lås automatiskt och välj Aldrig genom att trycka på det här alternativet för att se till att skärmen förblir permanent. Annars slutar programmet att köras när skärmen förs i viloläge. Tryck på hemskärmen för att återgå till huvudskärmen.
- Dubbeltryck på hemskärmen för att se vilka program som är öppna och stäng dem alla genom att svepa dem mot skärmens överkant. Tryck på hemskärmen för att återgå till huvudskärmen.
- Hitta LeafSensor-appen på huvudskärmen eller genom att svepa åt vänster eller höger. Tryck på ikonen för appen för att öppna den (se Kompletterande fil). En grön skärm med text och vita fält visas för att ange informationen.
- Se till att ordet Ansluten visas i den nedre delen av skärmen eftersom det indikerar att appen kommunicerar med överföringsenheten. Om meddelandet "Adafruit NOT Found" visas kontrollerar du att enheten är ansluten och trycker på startknappen på enheten igen.
- Fyll i de första 4 fälten på appsidan för att namnge experimentet och ställa in villkoren för en kort testkörning utan löv och med bladklippen öppna:
- Namnge experimentet (använd 8 eller färre versaler eller tal) t.ex. genom att skriva TEST i fältet Expt Name.
- Välj hur många olika blå ljusintensiteter som ska användas i experimentet, t.ex. genom att skriva 3 i fältet #Ljusintensiteter.
- Välj de blå ljusintensiteterna för den här körningen (välj ett heltal mellan 0 och 3000 och separera varje nummer från nästa med ett komma; se Kompletterande fil om hur du konverterar dessa nummer till faktiska blåljusintensiteter för lysdioder) t.ex. genom att skriva 0 100 1000 i fältet Blue Intensities.
- Välj hur länge varje blå ljusintensitet ska lysa på bladet (separera varje nummer från nästa med ett kommatecken) t.ex. genom att skriva in 2,2,2 i fältet Blå varaktighet (minuter).
- Tryck på Startexperiment i mitten av skärmen. I den nedre delen av skärmen visas 8 bindestreck och meddelandet Startexperiment .
- Se till att inget ljus avges från lysdioderna under de första två minuterna, sedan avges svagt blått ljus, och efter 2 min ökar den blå ljusintensiteten.
- Se till att intensivt rött ljus avges från lysdioderna en gång i minuten för mätningarna.
När experimentet körs visas siffror på appsidan för var och en av de åtta sensorerna och data uppdateras en gång i minuten. Se till att utgångsnumren från fotodioderna är cirka 1000-1023 (om rummet är mörkt). En uppdatering längst ner till vänster visar hur många mätningar som gjorts hittills, t.ex. Gjort 1 av 6 mätningar (ett mått varje minut). - När experimentet är klart kontrollerar du om experimentet visas längst ned till vänster på appsidan. Nu är instrumentet redo för en körning med löv.
- Tryck två gånger på startskärmen, svep ut ur appen och öppna den igen. Tryck på ON/OFF-knappen på instrumentet för att återställa den.
3. Ställa in löv i bladklämmorna
OBS: Detta steg måste göras i mörker med en grön ljuskälla (t.ex. placera ett grönt filter framför en glödlampa) för att undvika att inducera kloroplaströrelse. Alternativt kan du använda mycket lågt vitt ljus och en längre mörk period i bladklämmorna. Kom ihåg att en del av bladklämman håller lysdioden (större öppning), medan den andra håller fototransistorn (bild 1C).
- Om plantorna är mörkanpassade hela, välj 8 blad som är tillräckligt breda för att täcka lysdioderna. Annars tar du bort bladen från Petri-skålen. Förbered 8 remsor filterpapper om längden på ett bladklämma och med ett hål utslaget upptill för att inte täcka lysdioden.
- Fukta filterpapperet och placera det på bladklämdelen som håller lysdioden. Upprepa detta för vart och ett av de åtta bladklämmorna.
- Placera varje blad ovanpå det våta filterpapperet i bladklämman. Se till att rätt bladsida är vänd mot lysdioden (vanligtvis görs experiment med den adaxiella bladytan mot lysdioden).
- Undvik att placera bladets mellanstora delar ovanpå lysdioderna och placera liknande delar av varje blad (t.ex. den bredaste delen av bladet) över lysdioden.
- Placera den andra bladklämmadelen med fototransistorn ovanpå. Använd ett gummiband för att hålla ihop de två bladklämdelarna vid behov (bild 1C,D).
- Placera varje bladklämma i sin "båt" och fyll reservoarerna med vatten med en pipett. Se till att bladet eller åtminstone filterpapperet vidrör vattnet för att undvika uttorkning av bladen under körningen (bild 1D).
4. Genomföra en körning
OBS: För en vanlig undersökande körning, börja med 4 h mörker (0 μmol foton m-2 s-1), följt av 7 h svagt blått ljus (2 μmol foton m-2 s-1), följt av 60 min vardera av 5, 10, 30, 40, 50, 60, 90, 100 μmol foton m-2 s-2 s-2 s- Detta kommer att inducera bladen att uppvisa sin mörka överföring, inducera kloroplast rörelse i den maximala ackumuleringen och visa olika grader av undvikande svar.
- Konfigurera LeafSensor-appen på iPad med hjälp av stegen nedan.
- Skriv EXPLORA1 i fältet Expt Name.
- Skriv 10 i fältet #Ljusintensiteter.
- Skriv in 0,1,60,160,550,750,950,1150,1350,1950 i fältet med namnet Blue intensities.
- Skriv 240 420,60,60,60,60,60,60,60,60 i fältet Blå varaktighet.
- Tryck på Start experiment. Efter den första minutern visas utdatavärdena (vanligtvis mellan 990 och 820) på skärmen. Om värdena är långt borta kontrollerar du om bladen har placerats korrekt i bladklämmorna.
- När körningen är klar ser du till att meddelandet Experiment färdigt visas längst ned till vänster på skärmen. Data sparas automatiskt.
- Placera skärmen i upprätt läge (inte horisontellt). Två nya alternativ visas på skärmen, nämligen Spara och verktyg.
- Tryckverktyg och en lista över sparade filer visas. Välj den intressefil som är av intresse, i det här fallet EXPLORA1.
- Under listan över filer , leta efter Selected Expt: EXPLORA1. Tryck på E-post, ange en e-postadress så bifogas datafilen automatiskt till meddelandet. Tryck på Skicka.
Om det är en lång fördröjning tills filerna anländer startar du om appen och skickar filen igen.
- Om en körning avbröts, men data fram till den punkten är av intresse, trycker du på Spara innan du väljer Verktyg. Efter flera körningar rensar du minnesutrymmet: Tryck på Verktyg, markera en fil i taget, svep åt vänster bredvid filen och tryck på Ta bort för att ta bort filen.
- Tryck på Tillbaka för att köra ett annat experiment eller om du är klar, tryck på hemskärmsknappen, svep till huvudskärmen, tryck på Inställningar, tryck på Display & Ljusstyrka, tryck på Auto-Lock och tryck på 2 minuter.
5. Dataanalys
- Ladda ner filen EXPLORA1 från e-postmeddelandet, lägg till tillägg .csv till filen, dubbelklicka på filen. Data sorteras i ett kalkylblad med data för de åtta olika sensorerna sorterade i separata kolumner. Den sista kolumnen visar den tid (i sekunder) då data samlades in. Ta bort den första raden under rubrikerna (Sensor1-8) om den innehåller meningslösa data.
- Ställ in ett huvuddatablad som innehåller resultaten för varje sensor i ett separat blad och som omvandlar utgångsvärdena till % överföringsvärden med hjälp av de ekvationer som erhålls från kalibreringen av varje bladklämma och sensor (se Kompletterande fil).
- Kopiera varje datauppsättning till ett separat datablad (t.ex. kolumn A innehåller tiden; kolumn C innehåller data från Sensor1).
- Ställ in kolumn B så att tiden konverteras från sekunder till minuter. Ställ in kolumn D så att den innehåller formeln för att konvertera spänning till % överföring med hjälp av ekvationen från kalibreringen.
- Ställ in ett liknande datablad för varje sensor och kom ihåg att formeln som används för att omvandla spänningseffekten till % överföringsvärden kan vara olika för varje sensor.
- Plot % överföring (T) mot tid, min (figur 2).
- Spara databladet under ett nytt namn så att huvuddatabladet kan återanvändas.
- För att ytterligare analysera data (figur 2), beräkna ackumulering av ΔT (t.ex . förändring av T vid maximal ackumulering jämfört med T vid mörker), undvikande av ΔT (t.ex. förändring av T vid maximal undvikande jämfört med T vid mörker) eller dT/dt (%/h) (t.ex. förändring i T under den snabbaste delen av ackumulerings- eller undvikandereaktionen). För mer information se 8.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
De olika delarna av transmissionsanordningen visas i figur 1. Mikrokontrollern är enhetens styrenhet och styr de ljusförhållanden som bladen, säkrade i svarta bladklämmor, upplever och lagrar ljusöverföringsdata som den tar emot (figur 1A,B). En närbild av instrumentets styrenhet visar ON/OFF-knappen, SD-kortet för datalagringskapacitet, Bluetooth-skölden (som skickar data till LeafSensor-appen) och kablarna som ansluter till lysdioderna (lysdioder) och fototransistorer. Mikrokontrollern är placerad vid instrumentets botten och endast kanterna är synliga på bilden (bild 1B). 3D-utskrivna, svarta bladklämmor håller bladen, lysdioderna och fototransistorerna på plats. Ett våtfilterpapper placeras på bladklämmorna med lysdioden så att lysdioden är fri och ett mörkanpassat blad placeras med den adaxiella bladytan vänd mot lysdioden. Schemat visar att lysdioden och fototransistorn är placerade på motsatta sidor av bladet. Lysdioden kan avge blått eller rött ljus. Det blå ljuset används för att inducera kloroplaströrelse och stängs av under en kort period varje minut under vilken det röda mätljuset lyser på bladet. Fototransistorn, placerad på motsatt sida av bladet, upptäcker hur mycket rött ljus som överförs genom bladet och skickar data till mikrokontrollern och SD-kortet (figur 1C). De två delarna av bladklämman monteras och placeras i en 3D-utskriven "båt" som är fylld med vatten och hjälper till att hålla bladet fuktigt under experimentet (figur 1D).
Figur 2 visar en typisk datauppsättning där överföringsdata % ritas upp mot tid (min). Denna speciella överföringskörning involverade 1 h mörker, följt av 3 h lågt blått ljus (2 μmol foton m-2 s-1) och 1 h vardera av mellanliggande (30 μmol foton m-2 s-1) och högblått ljus (100 μmol foton m-2 s-1) intensiteter. Data visar att överföringen i A. thaliana minskar vid låg ljus intensitet (ackumulering svar), medan en undvikande svar induceras när ljus intensitet ytterligare ökade. Detta är inte ett allt eller inget svar och graden av förändringar i förhållande till de mörka värdena beror på de exakta blå ljusintensiteterna. Dessa procentuella förändringar i överföringen (ΔT) kan beräknas med hjälp av formlerna som visas under data. Dessutom kan överföringshastigheten (dT/dt) under de första förändringarna i överföringen när ett ackumulerings- eller undvikande svar utlöses beräknas med hjälp av kurvans lutning.
De genomsnittliga överföringsvärdena % av vild typ (WT) (figur 3A), liksom phot 1 och phot 2 mutantA. thalianablad (figur 3B) under 19 h långa körningar visas. Sådana utökade, undersökande överförings körningar är användbara för att fastställa vilka blå ljusintensiteter som ska användas i framtida körningar. Bladen utsattes först för 4 h mörker, och konsekventa överföringsvärden indikerar att bladen var helt mörkanpassade, vilket kommer att göra data mellan repliker mer konsekventa. Under de följande 7 h utsattes bladen för svagt blått ljus (2 μmol foton m-2 s-1). I WT och phot 2 följs den första snabba minskningen av överföringen av en långsam minskning som indikerar att kloroplasterna rörde sig in i ackumuleringssvaret. Beroende på vilken art som används kan det ta olika lång tid att få lägsta möjliga överföring. I många fall kan en forskare bara vara intresserad av att jämföra olika mutanter vid en viss tidpunkt, så exponeringen för mycket lågt ljus kan begränsas till en timme. Jämfört med WT visar phot 1 en minskad ackumuleringsrespons. Den utökade exponeringen för svagt blått ljus följs av en stegvis ökning av blå ljusintensiteter varje timme (5, 10, 30, 40, 50, 60, 90, 100 μmol foton m-2 s-1). % överföring i A. thaliana WT och phot 1 ökar med varje ökning av ljusintensiteten, vilket visar att kloroplasterna rör sig in i undvikande svar men detta ses inte i phot 2. Graden av förändring i överföringen i förhållande till det mörka värdet (ΔT) beror på den exakta blå ljusintensiteterna och kan variera beroende på genotypen (figur 3C). Ett exempel visas på hastigheten på överföringsändringar (dT/dt) under de första svaren vid överföring när undvikande utlöses eftersom den blå intensiteten ökas från 5 till 10 μmol foton m-2 s-1 (figur 3D). Hastigheten är densamma för WT och phot 1, medan den är mycket långsam för phot 2 mutanter.
Bild 1: Översikt över överföringsanordningen. Bild på den hembyggda transmissionsenheten med styrenheten i den svarta rutan längst ned till höger och bladklämmorna upptill och nederkant till vänster (A). Närbild av styrenheten med ON/OFF-knappen, SD-kortet för datalagringskapacitet och Bluetooth-skölden för trådlös kommunikation. Kablar ansluter styrenheten till lysdioderna (LYSDIODERNA) och fototransistorerna. Mikrokontrollern är placerad vid instrumentets botten och endast kanterna är synliga i den här bilden (B). De 3D-utskrivna svarta bladklämmorna: till vänster visas bladklämmadelen som håller lysdioden, till höger visas bladklämmadelen som håller i fototransistorn. För att ställa in en körning placeras ett fuktigt filterpapper (med ett hål av led-lampans storlek) på klämman utan att dölja lysdioden. Därefter placeras bladet i klämman som täcker lysdioden. Schemat visar att lysdioden och fototransistorn (PT) ligger mittemot varandra, nära bladet, när de två delarna av varje bladklämma är monterade (C). Bladklämmorna placeras i 3D-printade "båtar" som är fyllda med vatten, vilket håller bladen och filterpapperen hydratiserade (D). Klicka här för att se en större version av den här figuren.
Figur 2: Överföringsdata för ett typiskt A. thalianablad . Överföring (T) data för ett A. thaliana blad som utsattes för mörker i 1 h, följt av 3 h svagt ljus (2 μmol foton m-2 s-1), följt av 1 h vardera av mellanliggande (30 μmol foton m-2 s-1) och högblått ljus (100 μmol foton m-2 s-1). Låg ljus intensitet induceras ackumulering svar, medan högre ljus intensitet induceras olika grader av en undvikande svar. T-nivåerna i mörker fungerar som baslinje (blå linje). De % förändringar i T relativa de mörka nivåerna (ΔT) t.ex. vid maximal ackumulering eller olika nivåer av undvikande (skillnader till mörkt T indikeras av de blå pilarna) kan beräknas. Dessutom kan den hastighet med vilken T ändras (dT/dt) t.ex. under den inledande fasen av undvikande svar beräknas från T-lutningen plottad mot tiden (indikerad av den blå triangeln). Ekvationerna visas under diagrammet. Klicka här för att se en större version av den här figuren.
Figur 3: Kloroplast rörelse i wildtype och mutantA A. thaliana blad. Mörkanpassade, mogna blad utsattes för mörker i 4 timmar, följt av en 7 h exponering för 2 μmol foton m-2 s-1, följt av en stegmässig ökning av blått ljusintensitet varje timme (5, 10, 30, 40, 50, 60, 90, 100 μmol foton m-2 s-1). Genomsnittliga % överföringsvärden (T) (n = 20) av WT (A) samt phot 1 och phot 2 blad (B). Förändring i % T i förhållande till de mörka värdena: negativa värden indikerar att bladen visade ett ackumuleringssvar, medan positiva värden indikerar ett undvikande svar. Siffrorna till höger anger den blå ljusintensiteten vid vilken ΔT-data beräknades. Färgschemat är detsamma som i resten av figuren (C). DT/dt-data beräknades som löv svarade på en ökning av blå ljusintensitet från 5 till 10 μmol foton m-2 s-1 och anger den hastighet med vilken % T ändrades per timme (D). Data för A och B är medel, för C och D betyder ± SD (n = 20). Klicka här för att se en större version av den här figuren.
Supplemantary File. Klicka här för att ladda ner den här filen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Enheten är extremt lätt att använda men det är av avgörande betydelse att kalibrera varje bladklämmauppsättning av överföringsenheten självständigt eftersom placeringen av lysdioder och fototransistorer kan variera något från bladklämma till bladklämma. Se till att lysdioderna och fototransistorerna sätts in stabilt och kontrollera kalibreringen igen om data verkar vara av. Undvik att få vatten på enheten. Bladen i bladklämmorna placeras i "båtar" fyllda med vatten för att undvika vattenstress. Placera dessa båtar t.ex. i en lågkantad plastbehållare separat från styrenheten och välta dem INTE. Koppla inte ur eller böj inte kabelanslutningarna. Var försiktig när du sätter in löv i bladklämmorna och undvik att dra eller böja kablarna för mycket.
Det är viktigt att mörkanpassa bladen tillräckligt länge för att säkerställa att de ursprungliga överföringsvärdena representerar den mörka positionen. Kontrollera att värdena under den mörka perioden i enheten har varit stabila minst 30 minuter innan de lyser blått ljus på bladen. Om de inte är det, mörkanpassa bladen under en längre tid före nästa körning eller förlänga den mörka perioden i transmissionsanordningen för att övervaka hur lång tid det tar för bladen att nå ett stabilt tillstånd. Vanligtvis presenteras överföringsdata som % förändring i överföringen med en given blå ljusintensitet i förhållande till det mörka värdet (ΔT). Därför är det viktigt att få rätt baslinjevärden.
Den undersökande körningen kan användas för alla A. thaliana mutanter (inklusive mutanter som är kända för att påverka andra aspekter av en växts fysiologi, t.ex. fotosyntes, myosin eller okarakteriserade mutanter) eller olika arter så länge bladområdet är tillräckligt stort för att täcka lysdioden i bladklämman och bladen inte är för tjocka. Programmet kan enkelt anpassas för att fylla en forskares behov, t.ex. de blå ljusintensiteterna kan ändras inom de intervall som har visat sig framkalla kloroplaströrelse (reaktionen mättar cirka 100 μmol foton m-2 s-1), exponeringstiderna kan ändras, antalet på varandra följande ljusförhållanden kan ändras. Dessutom kan bladen förbehandlas innan de körs i enheten, t.ex. med hämmare av aktinpolymerisering eller signalvägskomponenter, vilket är viktigt för forskare som vill fylla i ämnena i signalvägen som reglerar kloroplaströrelsen.
Liksom alla metoder har den här också sina begränsningar och nackdelar. Förfarandet bygger på förändringar i bladens optiska egenskaper, nämligen hur mycket ljus som överförs. Därför fungerar det bäst med relativt tunna löv, medan tjocka löv ofta inte tillåter tillräcklig överföring av rött ljus att detekteras utöver ljudnivån. Det skulle vara möjligt att modifiera överföringsanordningen för att öka den röda ljusintensiteten som lyser på bladet och öka ljustransistorernas känslighet genom att ändra motstånden. Eftersom metoden endast ger ett integrerat mått på kloroplastens rörelser i alla celler och celllager, kan man missa några subtila förändringar, t.ex. kloroplaster som rör sig i motsatta riktningar kan leda till ingen nettoförändring av överföringen. Speciellt när man arbetar med tidigare okarakteriserade mutanter eller arter är det viktigt att komplettera överföringsresultaten med bilder av kloroplastpositionering med mikroskopi. Till exempel observerades långsamma förändringar i överföringen som svar på förändringar i blått ljus intensitet i en A. thaliana mutant och kunde ha berott på en rad skäl. Mikroskopi visade att celler bara hade två kloroplaster som var mycket större än normala kloroplaster. Mutanten bekräftades senare vara kloroplast division mutant arc6-125.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inga intressekonflikter.
Acknowledgments
Finansieringen tillhandahölls av ett Fiske Award och en Wellesley College Faculty Award.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Aluminum foil | |||
| Dark adapted leaves | |||
| Filter paper | |||
| iPad with LeafSensor app installed (see Supplemental Info) | |||
| Pipette | Any | ||
| Petri dish | Any | ||
| Transmission device (see Supplemental info) | |||
| Water |
References
- Senn, G. Die Gestalts- und Lageveränderung der Pflanzenchromatophoren. , Wilhelm Engelmann. Leipzig, Germany. (1908).
- Zurzycki, J. The influence of chloroplast displacements on the optical properties of leaves. Acta Societatis Botanicorum Poloniae. 30, 503-527 (1961).
- Wada, M., Kagawa, T., Sato, Y.
- Wada, M.
- Kasahara, M., Kagawa, T., Oikawa, K., Suetsugu, N., Miyao, M., Wada, M. Chloroplast avoidance movement reduces photodamage in plants. Nature. 420, 829-832 (2002).
- Davis, P. A., Hangarter, R. P. Chloroplast movement provides photoprotection to plants by redistributing PSII damage within leaves. Photosynthesis Research. 112, 153-161 (2012).
- Howard, M. M., Bae, A., Königer, M. The importance of chloroplast movement, nonphotochemical quenching, and electron transport rates in light acclimation and tolerance to high light in Arabidopsis thaliana. American Journal of Botany. 106 (11), 1-10 (2019).
- Gotoh, E., et al. Chloroplast accumulation response enhances leaf photosynthesis and plant biomass production. Plant Physiology. 178, 1358-1369 (2018).
- Howard, M. M., Bae, A., Pirani, Z., Van, N., Königer, M. Impairment of chloroplast movement reduces growth and delays reproduction of Arabidopsis thaliana in natural and controlled conditions. American Journal of Botany. 107 (9), 1309-1318 (2020).
- Trojan, A., Gabryś, H. Chloroplast distribution in Arabidopsis thaliana (L.) depends on light conditions during growth. Plant Physiology. 111, 419-425 (1996).
- Oikawa, K., et al. Chloroplast unusual positioning is essential for proper chloroplast positioning. The Plant Cell. 15, 2805-2815 (2003).
- Königer, M., Bollinger, N. Chloroplast movement behavior varies widely among species and does not correlate with high light stress tolerance. Planta. 236, 411-426 (2012).
- Kagawa, T., et al. Arabidopsis NPL1: a phototropin homolog controlling the chloroplast high-light avoidance response. Science. 291, 2138-2141 (2001).
- Berg, R., et al. A simple low-cost microcontroller-based photometric instrument for monitoring chloroplast movement. Photosynthesis Research. 87, 303-311 (2006).
- Johansson, H., Zeidler, M. Automatic chloroplast movement analysis. Molecular Biology. 1398, Springer. Germany. 29-35 (2016).
- Briggs, W. R., et al.
- Jarillo, J. A., et al. Phototropin-related NPL1 controls chloroplast relocation induced by blue light. Nature. 410, 952-954 (2001).
- Sakai, T. Arabidopsis nph1 and npl1: blue light receptors that mediate both phototropism and chloroplast relocation. Proceedings of the National Academy of Sciences, USA. 98 (12), 6969-6974 (2001).
- Wada, M., Kong, S. -G.
- Wen, F., Xing, D., Zhang, L. Hydrogen peroxide is involved in high blue light-induced chloroplast avoidance movements in Arabidopsis. Journal of Experimental Botany. 59 (10), 2891-2901 (2008).
- Tlalka, M., Fricker, M. The role of calcium in blue-light dependent chloroplast movement in Lemna trisulca L. The Plant Journal. 20, 461-473 (1999).
- Königer, M., Bollinger, N. Chloroplast movement behavior varies widely among species and does not correlate with high light stress tolerance. Planta. 236, 411-426 (2012).
- Higa, T., Wada, M. Chloroplast avoidance movement is not functional in plants grown under strong sunlight. Plant, Cell and Environment. 39, 871-882 (2016).
- Arduino. Arduino.cc. , Available from: https://www.arduino.cc (2021).
- Königer, M., Delamaide, J. A., Marlow, E. D., Harris, G. C. thaliana leaves with altered chloroplast numbers and chloroplast movement exhibit impaired adjustments to both low and high light. Journal of Experimental Botany. 59, 2285-2297 (2008).
