Summary
Molte specie vegetali cambiano il posizionamento dei cloroplasti per ottimizzare l'assorbimento della luce. Questo protocollo descrive come utilizzare uno strumento semplice e costruito in casa per studiare il movimento del cloroplasto nelle foglie di Arabidopsis thaliana utilizzando i cambiamenti nella trasmissione della luce attraverso una foglia come proxy.
Abstract
Il movimento del cloroplasto nelle foglie ha dimostrato di aiutare a ridurre al minimo la fotoinibizione e aumentare la crescita in determinate condizioni. Si può imparare molto sul movimento dei cloroplasti studiando il posizionamento del cloroplasto nelle foglie usando ad esempio la microscopia a fluorescenza confocale, ma l'accesso a questo tipo di microscopia è limitato. Questo protocollo descrive un metodo che utilizza i cambiamenti nella trasmissione fogliare come proxy per il movimento del cloroplasto. Se i cloroplasti sono sparsi per massimizzare l'intercettazione della luce, la trasmissione sarà bassa. Se i cloroplasti si muovono verso le pareti cellulari anticlinali per evitare la luce, la trasmissione sarà più alta. Questo protocollo descrive come utilizzare uno strumento semplice e costruito in casa per esporre le foglie a diverse intensità di luce blu e quantificare i cambiamenti dinamici nella trasmissione delle foglie. Questo approccio consente ai ricercatori di descrivere quantitativamente il movimento dei cloroplasti in diverse specie e mutanti, studiare gli effetti delle sostanze chimiche e dei fattori ambientali su di esso o lo screening di nuovi mutanti, ad esempio per identificare i componenti mancanti nel processo che porta dalla percezione della luce al movimento dei cloroplasti.
Introduction
La luce è essenziale per la fotosintesi, la crescita delle piante e lo sviluppo. È uno dei fattori abiotici più dinamici in quanto le intensità della luce non solo cambiano nel corso di una stagione o di un giorno, ma anche rapidamente e in modi imprevedibili a seconda della copertura nuvolosa. A livello fogliare, le intensità luminose sono influenzate anche dalla densità e dalla natura della vegetazione circostante e dalla chioma della pianta. Un meccanismo importante che consente alle piante di ottimizzare l'intercettazione della luce in condizioni di luce variabile è la capacità dei cloroplasti di muoversi in risposta agli stimoli della luce blu1,2. In condizioni di scarsa illuminazione, i cloroplasti si diffondono perpendicolarmente alla luce (lungo le pareti cellulari periclinali) in una cosiddetta risposta di accumulo, massimizzando l'intercettazione della luce e quindi la fotosintesi. In condizioni di luce intensa, i cloroplasti si muovono verso la parete cellulare anticlinale in una cosiddetta risposta di evitamento, riducendo al minimo l'intercettazione della luce e il pericolo di fotoinibizione. In molte specie, i cloroplasti assumono anche una specifica posizione scura, che è distinta dalle posizioni di accumulo ed evitamento e spesso intermedia tra queste due3,4. Vari studi hanno dimostrato che il movimento dei cloroplasti non è importante solo per la tolleranza allo stress a breve termine delle foglie5,6,7, ma anche per la crescita e il successo riproduttivo delle piante, specialmente in condizioni di luce variabile8,9.
Il movimento del cloroplasto è facilmente osservabile in tempo reale in alcuni esemplari vivi (ad esempio, alghe o piante a foglia sottile come Elodea) utilizzando la microscopia ottica1. Lo studio del movimento del cloroplasto nella maggior parte delle foglie, tuttavia, richiede un pretrattamento per indurre il movimento del cloroplasto, la fissazione chimica e la preparazione delle sezioni trasversali prima di visualizzare i campioni al microscopio ottico10. Con l'introduzione della microscopia laser confocale, è diventato anche possibile visualizzare la disposizione 3D dei cloroplasti in foglie intatte o fisse4,11,12. Queste tecniche di imaging aiutano notevolmente la comprensione del movimento del cloroplasto fornendo importanti informazioni qualitative. Quantificare il posizionamento dei cloroplasti (ad esempio, come percentuale di cloroplasti nelle posizioni periclinali o anticlinali in queste immagini o la percentuale di area coperta da cloroplasti per superficie cellulare totale) è anche possibile ma richiede molto tempo, soprattutto se condotto agli intervalli necessari per catturare rapidi cambiamenti di posizionamento10,8 . Il modo più semplice per mostrare se le foglie scure adattate di una certa specie o mutanti sono in grado di muoversi con il cloroplasto nella risposta di evitamento è coprendo la maggior parte dell'area di una foglia per mantenere i cloroplasti al buio mentre espongono una striscia della foglia alla luce alta. Dopo un minimo di 20 minuti di esposizione alla luce elevata, i cloroplasti nell'area esposta si saranno spostati nella posizione di evitamento e la striscia esposta sarà visibilmente di colore più chiaro rispetto al resto della foglia. Questo è vero per il tipo selvatico A. thaliana ma non per alcuni dei mutanti del movimento dei cloroplasti descritti più dettagliatamente più avanti13. Questo metodo e le sue modifiche (ad esempio, invertire le parti della foglia esposte, cambiare l'intensità della luce) sono utili per lo screening di un gran numero di mutanti e per identificare mutanti nulli che non hanno la capacità di esibire una risposta di evitamento o accumulo o entrambi. Tuttavia, non fornisce informazioni sui cambiamenti dinamici nel movimento del cloroplasto.
Al contrario, il metodo qui descritto consente la quantificazione del movimento del cloroplasto nelle foglie intatte utilizzando i cambiamenti nella trasmissione della luce attraverso una foglia come proxy per il movimento complessivo del cloroplasto: in condizioni in cui i cloroplasti sono sparsi nelle cellule mesofilliche nella risposta di accumulo, meno luce viene trasmessa attraverso la foglia rispetto a quando molti cloroplasti sono in una risposta di evitamento, posizionandosi lungo le pareti cellulari anticlinali. Pertanto, i cambiamenti nella trasmissione possono essere utilizzati come proxy per il movimento complessivo del cloroplasto nelle foglie14. I dettagli dello strumento sono descritti altrove (vedi file supplementare), ma fondamentalmente, lo strumento utilizza la luce blu per innescare il movimento del cloroplasto e misura quanta luce rossa viene trasmessa attraverso quella foglia a intervalli prestabiliti. Più recentemente, è stata descritta una modifica di questo sistema, che utilizza un lettore di micropiastre a 96 pozzetti modificato, un LED blu, un computer e un incubatore a temperatura controllata15.
La possibilità di utilizzare una combinazione di metodi, tra cui la valutazione ottica delle foglie per lo screening, seguita dalla misurazione dei cambiamenti dinamici nella trasmissione e dall'uso della microscopia, ha notevolmente aiutato la nostra comprensione sia dei meccanismi sottostanti che del significato fisiologico / ecologico del movimento del cloroplasto. Ad esempio, ha portato alla scoperta e alla caratterizzazione di vari mutanti, che sono compromessi in aspetti specifici dei loro movimenti. Ad esempio, i mutanti di A. thaliana phot 1 non hanno la capacità di accumulare i loro cloroplasti in condizioni di scarsa illuminazione, mentre i mutanti phot 2 non hanno la capacità di eseguire una reazione di evitamento. Questi fenotipi sono dovuti a una compromissione di due rispettivi recettori della luce blu16,17,18. Al contrario, i mutanti chup1 non hanno la capacità di formare filamenti di actina adeguati attorno ai cloroplasti che sono essenziali per spostare i cloroplasti nella posizione desiderata all'interno di una cellula11,19. Oltre agli studi sui mutanti, i ricercatori hanno valutato gli effetti di vari inibitori sul movimento del cloroplasto per chiarire gli aspetti meccanicistici del processo. Ad esempio, sostanze chimiche come H2O2 e vari antiossidanti sono stati utilizzati per studiare gli effetti di questa molecola di segnalazione sul movimento del cloroplasto20. Vari inibitori sono stati utilizzati per chiarire il ruolo del calcio nel movimento dei cloroplasti21. Oltre ad aiutare a scoprire i meccanismi del movimento dei cloroplasti, questi metodi possono essere utilizzati per confrontare il movimento del cloroplasto in varie specie o mutanti cresciuti in condizioni diverse nel tentativo di comprendere il contesto ecologico ed evolutivo di questo comportamento. Ad esempio, è stato dimostrato che l'entità degli effetti di varie mutazioni nella via di movimento del cloroplasto dipende dalle condizioni di crescita7,9 e che le piante adattate al sole non sembrano spostare molto i loro cloroplasti. Al contrario, il movimento è molto importante per le piante da ombra10,22,23.
Questo documento sui metodi, incentrato sull'impianto modello A. thaliana, descrive come utilizzare un dispositivo di trasmissione che è una versione aggiornata di uno strumento precedentemente sviluppato9. Mentre questo strumento non è disponibile in commercio, le persone con una conoscenza di base dell'elettronica o l'aiuto di colleghi e studenti di ingegneria o fisica saranno in grado di costruire lo strumento utilizzando parti a prezzi accessibili e seguendo le istruzioni dettagliate (vedi File supplementare). La piattaforma open source utilizzata per costruire lo strumento ha un ampio supporto web e un forum della comunità che offre aiuto in caso di problemi24.
Il protocollo si concentra su come utilizzare lo strumento per determinare i cambiamenti nella trasmissione fogliare in una corsa esplorativa standard che espone una foglia a una vasta gamma di condizioni di luce e cattura le reazioni scure, di accumulo ed evitamento di A. thaliana. Queste corse possono essere modificate a seconda dell'obiettivo dell'esperimento e possono essere utilizzate con la maggior parte delle specie vegetali. Il documento fornisce esempi di dati di trasmissione di A. thaliana wildtype e diversi mutanti e mostra come analizzare ulteriormente i dati.
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Protocol
1. Preparare le foglie per una corsa
- Posizionare 8 piante di A. thaliana al buio durante la notte (> 6 ore funziona per la maggior parte delle specie) per garantire che i cloroplasti si spostino nella loro posizione scura. Tutte le repliche iniziano con valori di trasmissione comparabili.
- In alternativa, posizionare 8 foglie complete in una capsula di Petri con una carta da filtro umida sul fondo, chiudere la piastra di Petri e avvolgerla con un foglio di alluminio.
2. Verifica del funzionamento del dispositivo di trasmissione
- Collegare il dispositivo di trasmissione a una fonte di alimentazione stabile e premere l'interruttore di alimentazione (pulsante ON/OFF) del dispositivo per ripristinare lo strumento (Figura 1A,B).
- Collega l'iPad a una fonte di alimentazione stabile, premi il pulsante Home Screen per attivare lo schermo e inserisci il passcode per accedere.
- Premere l'icona Impostazioni, premere l'icona Display & Brightness, premere Blocco automatico e selezionare Mai premendo questa opzione per assicurarsi che lo schermo rimanga acceso in modo permanente. Altrimenti il programma smetterà di funzionare quando lo schermo va in stop. Premere il pulsante Schermata Home per tornare alla schermata principale.
- Premi due volte il pulsante Schermata Home per vedere quali applicazioni sono aperte e chiudile tutte facendole scorrere verso la parte superiore dello schermo. Premere il pulsante Schermata Home per tornare alla schermata principale.
- Trova l'app LeafSensor nella schermata principale o scorrendo verso sinistra o destra. Premi l'icona dell'app per aprirla (vedi File supplementare). Apparirà uno schermo verde con testo e campi bianchi per inserire le informazioni.
- Assicurati che la parola Connesso sia visualizzata nella parte inferiore dello schermo in quanto indica che l'app sta comunicando con il dispositivo di trasmissione. Se viene visualizzato il messaggio "Adafruit NOT Found", verificare che il dispositivo sia collegato e premere nuovamente il pulsante di avvio sul dispositivo.
- Compila i primi 4 campi nella pagina dell'app per assegnare un nome all'esperimento e impostare le condizioni per una breve esecuzione del test senza foglie e con le clip foglia aperte:
- Assegna un nome all'esperimento (usa 8 o meno lettere maiuscole o numeri), ad esempio digitando TEST nel campo denominato Expt Name.
- Scegli quante diverse intensità di luce blu verranno utilizzate nell'esperimento, ad esempio digitando 3 nel campo denominato # Intensità di luce.
- Scegli le intensità della luce blu per questa esecuzione (scegli un numero intero compreso tra 0 e 3000 e separa ogni numero dal successivo con una virgola; vedi File supplementare su come convertire questi numeri in intensità effettive di luce blu dei LED), ad esempio digitando 0,100,1000 nel campo denominato Blue Intensities.
- Scegli il periodo di tempo in cui ogni intensità di luce blu brillerà sulla foglia (separa ogni numero dal successivo con una virgola), ad esempio digitando 2,2,2 nel campo denominato Durata blu (minuti).
- Premi Avvia esperimento nella sezione centrale dello schermo. Nella parte inferiore della schermata appariranno 8 trattini e il messaggio Avvio dell'esperimento .
- Assicurarsi che nessuna luce venga emessa dai LED per i primi due minuti, quindi viene emessa una debole luce blu e dopo 2 minuti l'intensità della luce blu aumenta.
- Assicurarsi che dai LED venga emessa una luce rossa intensa una volta al minuto per le misurazioni.
NOTA: durante l'esecuzione dell'esperimento, i numeri verranno visualizzati nella pagina dell'app per ciascuno degli otto sensori e i dati verranno aggiornati una volta al minuto. Assicurati che i numeri di uscita dai fotodiodi siano intorno a 1000-1023 (se la stanza è buia). Un aggiornamento in basso a sinistra mostra quante misurazioni sono state fatte finora, ad esempio, Fatto 1 di 6 misurazioni (una misurazione ogni minuto). - Al termine dell'esperimento, verifica l'aspetto dell'esperimento terminato nella parte inferiore sinistra della pagina dell'app. Ora lo strumento è pronto per una corsa con le foglie.
- Premi due volte il pulsante Schermata Home, scorri fuori dall'app e riaprila. Premere il pulsante ON/OFF sullo strumento per ripristinarlo.
3. Impostazione delle foglie nelle clip fogliari
NOTA: Questo passaggio deve essere eseguito al buio con una fonte di luce verde (ad esempio, posizionare un filtro verde davanti a una lampadina) per evitare di indurre movimenti di cloroplasto. In alternativa, utilizzare una luce bianca molto bassa e un periodo di buio prolungato nelle clip fogliari. Ricorda, una parte della clip foglia contiene il LED (apertura più grande), mentre l'altra contiene il fototransistor (Figura 1C).
- Se le piante sono intere adattate al buio, scegli 8 foglie abbastanza larghe da coprire i LED. Altrimenti, rimuovere le foglie dalla capsula di Petri. Preparare 8 strisce di carta da filtro della lunghezza di una clip a foglia e con un foro perforato nella parte superiore per non coprire il LED.
- Inumidire la carta da filtro e posizionarla sulla parte della clip a foglia che contiene il LED. Ripetete questa operazione per ciascuna delle otto clip foglia.
- Posizionare ogni foglia sulla parte superiore della carta da filtro bagnata della sua graffetta. Assicurarsi che il lato foglia corretto sia rivolto verso il LED (di solito gli esperimenti vengono eseguiti con la superficie fogliare assiale rivolta verso il LED).
- Evitare di posizionare le costole della foglia sopra i LED e, per risultati più coerenti, posizionare parti simili di ciascuna foglia (ad esempio, la sezione più ampia della foglia) sul LED.
- Posizionare l'altra parte della clip foglia con il fototransistor in cima. Utilizzare un elastico per tenere insieme le due parti della clip fogliare, se necessario (Figura 1C,D).
- Metti ogni clip foglia nella sua "barca" e riempi i serbatoi con acqua usando una pipetta. Assicurarsi che la foglia o almeno la carta da filtro tocchi l'acqua per evitare la disidratazione delle foglie durante la corsa (Figura 1D).
4. Condurre una corsa
NOTA: per una corsa esplorativa standard, iniziare con 4 ore di buio (0 μmol fotone m-2 s-1), seguito da 7 ore di bassa luce blu (2 μmol fotone m-2 s-1), seguito da 60 minuti ciascuno di 5, 10, 30, 40, 50, 60, 90, 100 μmol fotone m-2 s-1 di luce blu. Ciò indurrà le foglie a mostrare la loro trasmissione scura, indurrà il movimento del cloroplasto nel massimo accumulo e mostrerà diversi gradi di risposta di evitamento.
- Configura l'app LeafSensor su iPad seguendo i passaggi descritti di seguito.
- Digitare EXPLORA1 nel campo denominato Nome Expt.
- Digitare 10 nel campo denominato # Intensità luce.
- Digita 0,1,60,160,550,750,950,1150,1350,1950 nel campo chiamato Intensità blu.
- Digitare 240,420,60,60,60,60,60,60,60,60,60 nel campo denominato Blue Duration.
- Premere Avvia esperimento. Dopo il primo min, i valori di output (di solito tra 990 e 820) appariranno sullo schermo. Se i valori sono lontani, controlla se le foglie sono state posizionate correttamente nelle clip fogliari.
- Al termine dell'esecuzione, assicurarsi che il messaggio Esperimento completato sia visualizzato nella parte inferiore sinistra dello schermo. I dati verranno salvati automaticamente.
- Metti lo schermo in posizione verticale (non orizzontale). Sullo schermo appariranno due nuove opzioni, ovvero Salva e Utilità.
- Premere Utilità e verrà visualizzato un elenco di file salvati. Seleziona il file di interesse, in questo caso , EXPLORA1.
- Sotto l'elenco dei file , cerca Selected Expt: EXPLORA1. Premere E-mail, immettere un indirizzo e-mail e il file di dati verrà automaticamente allegato al messaggio. Premere Invia.
NOTA: se si verifica un lungo ritardo fino all'arrivo dei file, riavviare l'app e inviare nuovamente il file.
- Se un'esecuzione è stata interrotta, ma i dati fino a quel punto sono di interesse, premere Salva prima di selezionare Utilità. Dopo diverse esecuzioni, ripulire lo spazio di memoria: premere Utilità, selezionare un file alla volta, scorrere verso sinistra accanto al file e premere CANC per rimuovere il file.
- Premi Indietro per eseguire un altro esperimento o, se terminato, premi il pulsante Schermata Home, scorri fino alla schermata principale, premi Impostazioni, premi Display e luminosità, premi Blocco automatico e premi 2 minuti.
5. Analisi dei dati
- Scarica il file EXPLORA1 dall'e-mail, aggiungi l'estensione .csv al file, fai doppio clic sul file. I dati verranno ordinati in un foglio di calcolo con i dati per gli otto diversi sensori ordinati in colonne separate. L'ultima colonna mostra l'ora (in secondi) in cui i dati sono stati raccolti. Eliminare la prima riga sotto le intestazioni (Sensor1-8) se contiene dati senza senso.
- Impostare una scheda tecnica master che conterrà i risultati per ciascun sensore in un foglio separato e che converte i valori di uscita in valori di trasmissione % utilizzando le equazioni ottenute dalla calibrazione di ciascuna clip foglia e sensore (vedere File supplementare).
- Copiare ogni set di dati in un foglio dati separato (ad esempio, la colonna A contiene l'ora; la colonna C contiene i dati di Sensor1).
- Impostare la colonna B in modo che converta il tempo da secondi a minuti. Impostare la colonna D in modo che contenga la formula per convertire la tensione in % di trasmissione utilizzando l'equazione della calibrazione.
- Impostare una scheda tecnica simile per ciascun sensore e ricordare che la formula utilizzata per convertire l'uscita di tensione in valori di trasmissione % può essere diversa per ciascun sensore.
- Traccia % di trasmissione (T) contro il tempo, min (Figura 2).
- Salvare il foglio dati con un nuovo nome in modo che il foglio dati master possa essere riutilizzato.
- Per analizzare ulteriormente i dati (Figura 2), calcolare l'accumulo di ΔT (%) (ad esempio, la variazione di T al massimo accumulo rispetto a T al buio), l'evitamento di ΔT (%) (ad esempio, il cambiamento di T al massimo evitamento rispetto a T al buio) o dT / dt (%/ h) (ad esempio, il cambiamento di T durante la parte più veloce dell'accumulo o della reazione di evitamento). Per ulteriori dettagli si veda 8.
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Representative Results
Le diverse parti del dispositivo di trasmissione sono mostrate nella Figura 1. Il microcontrollore è l'unità di controllo del dispositivo e controlla le condizioni di luce che le foglie, fissate in clip a foglia nera, stanno vivendo e memorizza i dati di trasmissione della luce che riceve (Figura 1A, B). Un primo piano dell'unità di controllo dello strumento mostra il pulsante ON / OFF, la scheda SD per la capacità di archiviazione dei dati, lo schermo Bluetooth (che invia i dati all'app LeafSensor ) e i cavi che si collegano ai LED (Light Emitting Diodes) e ai fototransistor. Il microcontrollore è posizionato alla base dello strumento e solo i bordi sono visibili nell'immagine (Figura 1B). Le clip a foglia nera stampate in 3D mantengono le foglie, i LED e i fototransistor in posizione. Una carta da filtro bagnata è posizionata sulla parte delle clip foglia con il LED in modo tale che il LED non sia ostruito e una foglia adattata al buio sia posizionata con la superficie della foglia assiale rivolta verso il LED. Lo schema mostra che il LED e il fototransistor sono posizionati sui lati opposti della foglia. Il LED può emettere luce blu o rossa. La luce blu viene utilizzata per indurre il movimento del cloroplasto e viene spenta per un breve periodo ogni minuto durante il quale la luce di misurazione rossa brilla sulla foglia. Il fototransistor, posizionato sul lato opposto della foglia, rileva quanta luce rossa viene trasmessa attraverso la foglia e invia i dati al microcontrollore e alla scheda SD (Figura 1C). Le due parti della clip fogliare sono assemblate e collocate in una "barca" stampata in 3D che viene riempita d'acqua e aiuta a mantenere la foglia umida durante l'esperimento (Figura 1D).
La Figura 2 mostra un tipico set di dati in cui la % dei dati di trasmissione viene tracciata rispetto al tempo (min). Questa particolare trasmissione ha comportato 1 ora di oscurità, seguita da 3 ore di bassa luce blu (2 μmol fotone m-2 s-1) e 1 ora ciascuna di intensità intermedie (30 μmol fotone m-2 s-1) e alte luci blu (100 μmol fotone m-2 s-1). I dati mostrano che la trasmissione in A. thaliana diminuisce a basse intensità luminose (risposta all'accumulo), mentre una risposta di evitamento è indotta quando le intensità della luce aumentano ulteriormente. Questa non è una risposta tutto o niente e i gradi di cambiamento rispetto ai valori scuri dipendono dalle esatte intensità della luce blu. Queste variazioni percentuali nella trasmissione (ΔT) possono essere calcolate utilizzando le formule mostrate sotto i dati. Inoltre, la velocità di trasmissione cambia (dT/dt) durante i cambiamenti iniziali nella trasmissione quando viene attivata una risposta di accumulo o di evitamento può essere calcolata utilizzando la pendenza della curva.
Vengono mostrati i valori medi di trasmissione % di wild type (WT) (Figura 3A), nonché le foglie mutanti di A. thaliana phot 1 e phot 2 (Figura 3B) durante le lunghe corse di 19 ore. Tali trasmissioni estese ed esplorative sono utili per stabilire quali intensità di luce blu utilizzare nelle corse future. Le foglie sono state esposte per la prima volta a 4 ore di oscurità e valori di trasmissione coerenti indicano che le foglie erano completamente adattate al buio, il che renderà i dati tra le repliche più coerenti. Per le successive 7 ore, le foglie sono state esposte a bassa luce blu (2 μmol fotone m-2 s-1). In WT e phot 2, la rapida diminuzione iniziale della trasmissione è seguita da una lenta diminuzione che indica che i cloroplasti si stavano muovendo nella risposta di accumulo. A seconda della specie utilizzata, potrebbero essere necessarie diverse quantità di tempo per ottenere la trasmissione più bassa possibile. In molti casi, un ricercatore può essere interessato solo a confrontare vari mutanti in un dato punto temporale, quindi l'esposizione a luce molto bassa può essere limitata a un'ora. Rispetto al WT, phot 1 mostra una ridotta risposta all'accumulo. L'esposizione prolungata alla luce blu bassa è seguita da un aumento graduale delle intensità della luce blu ogni ora (5, 10, 30, 40, 50, 60, 90, 100 μmol fotone m-2 s-1). La trasmissione % in A. thaliana WT e phot 1 aumenta con ogni aumento dell'intensità luminosa, mostrando che i cloroplasti si muovono nella risposta di evitamento, ma questo non si vede nel phot 2. I gradi di variazione della trasmissione rispetto al valore di buio (ΔT) dipendono dalle esatte intensità della luce blu e possono differire a seconda del genotipo (Figura 3C). Viene mostrato un esempio della velocità delle variazioni di trasmissione (dT/dt) durante le risposte iniziali in trasmissione quando viene attivata l'evitamento quando l'intensità del blu viene aumentata da 5 a 10 μmol di fotone m-2 s-1 (Figura 3D). La velocità è la stessa per WT e phot 1, mentre è molto lenta per i mutanti phot 2.
Figura 1: Panoramica del dispositivo di trasmissione. Immagine del dispositivo di trasmissione costruito in casa con l'unità di controllo nella scatola nera in basso a destra e le clip foglia in alto e in basso a sinistra (A). Primo piano dell'unità di controllo con il pulsante ON /OFF, la scheda SD per la capacità di archiviazione dei dati e lo schermo Bluetooth per la comunicazione wireless. I cavi collegano l'unità di controllo ai diodi emettitori di luce (LED) e ai fototransistor. Il microcontrollore è posizionato alla base dello strumento e solo i bordi sono visibili in questa immagine (B). Le clip a foglia nera stampate in 3D: a sinistra viene mostrata la parte della clip foglia che tiene il LED, a destra viene mostrata la parte della clip foglia che contiene il fototransistor. Per impostare una corsa, una carta da filtro umida (con un foro delle dimensioni del LED) viene posizionata sulla clip senza oscurare il LED. Quindi la foglia viene posizionata nella clip che copre il LED. Lo schema mostra che il LED e il fototransistor (PT) si trovano l'uno di fronte all'altro, vicino all'anta, quando le due parti di ciascuna clip foglia sono assemblate (C). Le clip fogliari sono posizionate in "barche" stampate in 3D che vengono riempite d'acqua, mantenendo le foglie e le carte da filtro idratate (D). Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: Dati di trasmissione di una tipica foglia di A. thaliana . Dati di trasmissione (T) per una foglia di A. thaliana che è stata esposta al buio per 1 ora, seguita da 3 ore di scarsa illuminazione (2 μmol fotone m-2 s-1), seguita da 1 ora ciascuno di intermedio (30 μmol fotone m-2 s-1) e alta luce blu (100 μmol fotone m-2 s-1). Basse intensità di luce hanno indotto la risposta di accumulo, mentre intensità luminose più elevate hanno indotto diversi gradi di una risposta di evitamento. I livelli T al buio fungono da linea di base (linea blu). Le variazioni percentuali di T rispetto ai livelli scuri (ΔT), ad esempio al massimo accumulo o a diversi livelli di evitamento (le differenze con T scuro sono indicate dalle frecce blu). Inoltre, la velocità con cui T cambia (dT/dt), ad esempio durante la fase iniziale della risposta di evitamento, può essere calcolata dalla pendenza di T tracciata contro il tempo (indicata dal triangolo blu). Le equazioni sono mostrate sotto il grafico. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: Movimento del cloroplasto nelle foglie wildtype e mutanti di A. thaliana . Le foglie mature adattate al buio sono state esposte al buio per 4 ore, seguite da un'esposizione di 7 ore al fotone 2 μmol m-2 s-1, seguita da un aumento graduale dell'intensità della luce blu ogni ora (5, 10, 30, 40, 50, 60, 90, 100 μmol fotone m-2 s-1). Percentuale media Di valori di trasmissione (T) (n = 20) di WT (A) e di foglie phot 1 e phot 2 (B). Variazione in % T rispetto ai valori scuri: i valori negativi indicano che le foglie hanno mostrato una risposta di accumulo, mentre i valori positivi indicano una risposta di evitamento. I numeri a destra indicano l'intensità della luce blu a cui sono stati calcolati i dati ΔT. La combinazione di colori è la stessa del resto della figura (C). I dati dT/dt sono stati calcolati in quanto le foglie hanno risposto a un aumento dell'intensità della luce blu da 5 a 10 μmol fotone m-2 s-1 e indicano la velocità con cui % T è cambiata all'ora (D). I dati per A e B sono mezzi, per C e D significa ± SD (n = 20). Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
File supplemantary. Fare clic qui per scaricare questo file.
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Discussion
Il dispositivo è estremamente facile da usare, ma è di fondamentale importanza calibrare ogni set-up della clip foglia del dispositivo di trasmissione in modo indipendente poiché il posizionamento dei LED e dei fototransistor può variare leggermente da clip foglia a clip foglia. Assicurarsi che i LED e i fototransistor siano inseriti in modo stabile e ricontrollare la calibrazione se i dati sembrano spenti. Evitare di portare acqua sul dispositivo. Le foglie nelle clip fogliari vengono collocate in "barche" piene d'acqua per evitare lo stress idrico. Posiziona queste barche, ad esempio, in un contenitore di plastica a bordo basso separato dall'unità di controllo e NON rovesciarle. Non scollegare o piegare le connessioni dei cavi. Fare attenzione quando si inseriscono foglie nelle clip foglia ed evitare di tirare o piegare troppo i cavi.
È importante adattare le foglie abbastanza a lungo da garantire che i valori di trasmissione iniziali rappresentino la posizione scura. Verificare che i valori durante il periodo buio nel dispositivo siano rimasti stabili almeno 30 minuti prima di far brillare la luce blu sulle foglie. Se non lo sono, adattare le foglie per un periodo di tempo più lungo prima della corsa successiva o estendere il periodo di buio nel dispositivo di trasmissione per monitorare quanto tempo ci vuole perché le foglie raggiungano uno stato stazionario. Tipicamente, i dati di trasmissione sono presentati come variazione % della trasmissione a una data intensità di luce blu rispetto al valore di buio (ΔT). Quindi è fondamentale ottenere i valori di base corretti.
La corsa esplorativa può essere utilizzata per qualsiasi mutante di A. thaliana (compresi i mutanti noti per influenzare altri aspetti della fisiologia di una pianta, ad esempio fotosintesi, miosina o mutanti non caratterizzati) o diverse specie purché l'area fogliare sia abbastanza grande da coprire il LED nella clip fogliare e le foglie non siano troppo spesse. Il programma può essere facilmente adattato per soddisfare qualsiasi esigenza di un ricercatore, ad esempio, le intensità della luce blu possono essere modificate all'interno degli intervalli che hanno dimostrato di suscitare il movimento del cloroplasto (la reazione satura circa 100 μmol fotone m-2 s-1), i tempi di esposizione possono essere modificati, il numero di condizioni di luce consecutive può essere modificato. Inoltre, le foglie possono essere pretrattate prima di essere eseguite nel dispositivo, ad esempio con inibitori della polimerizzazione dell'actina o componenti della via di segnalazione, che è importante per i ricercatori che vogliono riempire gli spazi vuoti nella via di segnalazione che regola il movimento del cloroplasto.
Come ogni metodo, anche questo ha i suoi limiti e svantaggi. La procedura si basa sui cambiamenti nelle proprietà ottiche delle foglie, vale a dire quanta luce viene trasmessa. Pertanto, funziona meglio con foglie relativamente sottili, mentre le foglie spesse spesso non consentono di rilevare una sufficiente trasmissione di luce rossa oltre il livello di rumore. Sarebbe possibile modificare il dispositivo di trasmissione per aumentare l'intensità della luce rossa che brilla sulla foglia e aumentare la sensibilità dei fototransistor cambiando i resistori. Poiché il metodo fornisce solo una misura integrata dei movimenti del cloroplasto in tutte le cellule e gli strati cellulari, si possono perdere alcuni cambiamenti sottili, ad esempio, i cloroplasti che si muovono in direzioni opposte possono non comportare alcun cambiamento netto di trasmissione. Soprattutto quando si lavora con mutanti o specie precedentemente non caratterizzati, è importante integrare i risultati della trasmissione con immagini di posizionamento del cloroplasto utilizzando la microscopia. Ad esempio, cambiamenti lenti nella trasmissione in risposta a cambiamenti nell'intensità della luce blu sono stati osservati in un mutante di A. thaliana e potrebbero essere dovuti a una serie di motivi. La microscopia ha rivelato che le cellule avevano solo due cloroplasti che erano molto più grandi dei normali cloroplasti. Il mutante è stato successivamente confermato essere il mutante della divisione cloroplasto arc6-125.
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Disclosures
Gli autori non hanno conflitti di interesse.
Acknowledgments
Il finanziamento è stato fornito da un Fiske Award e da un Wellesley College Faculty Award.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Aluminum foil | |||
| Dark adapted leaves | |||
| Filter paper | |||
| iPad with LeafSensor app installed (see Supplemental Info) | |||
| Pipette | Any | ||
| Petri dish | Any | ||
| Transmission device (see Supplemental info) | |||
| Water |
References
- Senn, G. Die Gestalts- und Lageveränderung der Pflanzenchromatophoren. , Wilhelm Engelmann. Leipzig, Germany. (1908).
- Zurzycki, J. The influence of chloroplast displacements on the optical properties of leaves. Acta Societatis Botanicorum Poloniae. 30, 503-527 (1961).
- Wada, M., Kagawa, T., Sato, Y.
- Wada, M.
- Kasahara, M., Kagawa, T., Oikawa, K., Suetsugu, N., Miyao, M., Wada, M. Chloroplast avoidance movement reduces photodamage in plants. Nature. 420, 829-832 (2002).
- Davis, P. A., Hangarter, R. P. Chloroplast movement provides photoprotection to plants by redistributing PSII damage within leaves. Photosynthesis Research. 112, 153-161 (2012).
- Howard, M. M., Bae, A., Königer, M. The importance of chloroplast movement, nonphotochemical quenching, and electron transport rates in light acclimation and tolerance to high light in Arabidopsis thaliana. American Journal of Botany. 106 (11), 1-10 (2019).
- Gotoh, E., et al. Chloroplast accumulation response enhances leaf photosynthesis and plant biomass production. Plant Physiology. 178, 1358-1369 (2018).
- Howard, M. M., Bae, A., Pirani, Z., Van, N., Königer, M. Impairment of chloroplast movement reduces growth and delays reproduction of Arabidopsis thaliana in natural and controlled conditions. American Journal of Botany. 107 (9), 1309-1318 (2020).
- Trojan, A., Gabryś, H. Chloroplast distribution in Arabidopsis thaliana (L.) depends on light conditions during growth. Plant Physiology. 111, 419-425 (1996).
- Oikawa, K., et al. Chloroplast unusual positioning is essential for proper chloroplast positioning. The Plant Cell. 15, 2805-2815 (2003).
- Königer, M., Bollinger, N. Chloroplast movement behavior varies widely among species and does not correlate with high light stress tolerance. Planta. 236, 411-426 (2012).
- Kagawa, T., et al. Arabidopsis NPL1: a phototropin homolog controlling the chloroplast high-light avoidance response. Science. 291, 2138-2141 (2001).
- Berg, R., et al. A simple low-cost microcontroller-based photometric instrument for monitoring chloroplast movement. Photosynthesis Research. 87, 303-311 (2006).
- Johansson, H., Zeidler, M. Automatic chloroplast movement analysis. Molecular Biology. 1398, Springer. Germany. 29-35 (2016).
- Briggs, W. R., et al.
- Jarillo, J. A., et al. Phototropin-related NPL1 controls chloroplast relocation induced by blue light. Nature. 410, 952-954 (2001).
- Sakai, T. Arabidopsis nph1 and npl1: blue light receptors that mediate both phototropism and chloroplast relocation. Proceedings of the National Academy of Sciences, USA. 98 (12), 6969-6974 (2001).
- Wada, M., Kong, S. -G.
- Wen, F., Xing, D., Zhang, L. Hydrogen peroxide is involved in high blue light-induced chloroplast avoidance movements in Arabidopsis. Journal of Experimental Botany. 59 (10), 2891-2901 (2008).
- Tlalka, M., Fricker, M. The role of calcium in blue-light dependent chloroplast movement in Lemna trisulca L. The Plant Journal. 20, 461-473 (1999).
- Königer, M., Bollinger, N. Chloroplast movement behavior varies widely among species and does not correlate with high light stress tolerance. Planta. 236, 411-426 (2012).
- Higa, T., Wada, M. Chloroplast avoidance movement is not functional in plants grown under strong sunlight. Plant, Cell and Environment. 39, 871-882 (2016).
- Arduino. Arduino.cc. , Available from: https://www.arduino.cc (2021).
- Königer, M., Delamaide, J. A., Marlow, E. D., Harris, G. C. thaliana leaves with altered chloroplast numbers and chloroplast movement exhibit impaired adjustments to both low and high light. Journal of Experimental Botany. 59, 2285-2297 (2008).
