Summary
تقوم العديد من الأنواع النباتية بتغيير موضع البلاستيدات الخضراء لتحسين امتصاص الضوء. يصف هذا البروتوكول كيفية استخدام أداة مباشرة مبنية في المنزل للتحقيق في حركة البلاستيدات الخضراء في أوراق أرابيدوبسيس ثاليانا باستخدام التغيرات في انتقال الضوء عبر ورقة كوكيل.
Abstract
وقد ثبت أن حركة البلاستيدات الخضراء في الأوراق تساعد على تقليل تثبيط الضوء وزيادة النمو في ظل ظروف معينة. يمكن تعلم الكثير عن حركة البلاستيدات الخضراء من خلال دراسة وضع البلاستيدات الخضراء في الأوراق باستخدام المجهر الفلوري البؤري على سبيل المثال ، ولكن الوصول إلى هذا النوع من الفحص المجهري محدود. يصف هذا البروتوكول طريقة تستخدم التغيرات في انتقال الأوراق كبديل لحركة البلاستيدات الخضراء. إذا تم نشر البلاستيدات الخضراء من أجل تحقيق أقصى قدر من اعتراض الضوء ، فسيكون الإرسال منخفضا. إذا تحركت البلاستيدات الخضراء نحو جدران الخلايا المضادة للكلينا لتجنب الضوء ، فسيكون الانتقال أعلى. يصف هذا البروتوكول كيفية استخدام أداة مباشرة مبنية في المنزل لتعريض الأوراق لكثافة الضوء الأزرق المختلفة وتحديد التغيرات الديناميكية في انتقال الأوراق. يسمح هذا النهج للباحثين بوصف حركة البلاستيدات الخضراء كميا في الأنواع والطفرات المختلفة ، ودراسة آثار المواد الكيميائية والعوامل البيئية عليها ، أو فحص الطفرات الجديدة ، على سبيل المثال ، لتحديد المكونات المفقودة في العملية التي تؤدي من إدراك الضوء إلى حركة البلاستيدات الخضراء.
Introduction
الضوء ضروري لعملية التمثيل الضوئي ونمو النبات وتطوره. إنه أحد أكثر العوامل اللاأحيائية ديناميكية حيث لا تتغير شدة الضوء على مدار الموسم أو اليوم فحسب ، بل تتغير أيضا بسرعة وبطرق لا يمكن التنبؤ بها اعتمادا على الغطاء السحابي. على مستوى الأوراق ، تتأثر شدة الضوء أيضا بكثافة وطبيعة النباتات المحيطة ومظلة النبات الخاصة. إحدى الآليات المهمة التي تسمح للنباتات بتحسين اعتراض الضوء في ظل ظروف الإضاءة المتغيرة هي قدرة البلاستيدات الخضراء على التحرك استجابة لمحفزات الضوء الأزرق1,2. في ظل ظروف الإضاءة المنخفضة ، تنتشر البلاستيدات الخضراء عموديا على الضوء (على طول جدران الخلايا حول الخيطية) في ما يسمى باستجابة التراكم ، مما يزيد من اعتراض الضوء وبالتالي التمثيل الضوئي. في ظل ظروف الإضاءة العالية ، تتحرك البلاستيدات الخضراء نحو جدار الخلية المضاد للخلين في ما يسمى استجابة التجنب ، مما يقلل من اعتراض الضوء وخطر التثبيط الضوئي. في العديد من الأنواع ، تفترض البلاستيدات الخضراء أيضا وضعا مظلما محددا ، والذي يختلف عن مواقع التراكم والتجنب وغالبا ما يكون وسيطا بين هذين الاثنين3,4. أظهرت دراسات مختلفة أن حركة البلاستيدات الخضراء ليست مهمة فقط لتحمل الإجهاد على المدى القصير للأوراق5،6،7 ، ولكن أيضا لنمو النباتات ونجاحها التناسلي ، خاصة في ظل ظروف الإضاءة المتغيرة8،9.
يتم ملاحظة حركة البلاستيدات الخضراء بسهولة في الوقت الفعلي في بعض العينات الحية (على سبيل المثال ، الطحالب أو النباتات ذات الأوراق الرقيقة مثل Elodea) باستخدام المجهر الضوئي1. ومع ذلك، تتطلب دراسة حركة البلاستيدات الخضراء في معظم الأوراق معالجة مسبقة للحث على حركة البلاستيدات الخضراء، والتثبيت الكيميائي، وإعداد المقاطع العرضية قبل عرض العينات تحت المجهر الضوئي10. مع إدخال المجهر الليزري البؤري ، أصبح من الممكن أيضا تصوير الترتيب ثلاثي الأبعاد للبلاستيدات الخضراء في أوراق سليمة أو ثابتة4،11،12. تساعد تقنيات التصوير هذه بشكل كبير على فهم حركة البلاستيدات الخضراء من خلال توفير معلومات نوعية مهمة. ومن الممكن أيضا تحديد موضع البلاستيدات الخضراء كميا (كنسبة مئوية من البلاستيدات الخضراء في المواضع حول اللينة أو المضادة للكلينا في هذه الصور أو النسبة المئوية للمساحة التي تغطيها البلاستيدات الخضراء لكل سطح خلية كلية) ولكنه يستغرق وقتا طويلا، خاصة إذا تم إجراؤه على الفترات الزمنية اللازمة لالتقاط التغيرات السريعة في تحديد المواقع10,8 . إن أبسط طريقة لإظهار ما إذا كانت الأوراق المتكيفة مع الظلام من نوع معين أو الطفرات قادرة على حركة البلاستيدات الخضراء في استجابة التجنب هي تغطية معظم مساحة الورقة للحفاظ على البلاستيدات الخضراء في الظلام مع تعريض شريط من الورقة للضوء العالي. بعد ما لا يقل عن 20 دقيقة من التعرض العالي للضوء ، ستكون البلاستيدات الخضراء في المنطقة المكشوفة قد انتقلت إلى وضع التجنب ، وسيكون الشريط المكشوف أخف لونا بشكل واضح من بقية الورقة. وينطبق هذا على النوع البري A. thaliana ولكن ليس على بعض طفرات حركة البلاستيدات الخضراء الموصوفة بمزيد من التفصيل لاحقا13. هذه الطريقة والتعديلات عليها (على سبيل المثال ، عكس أجزاء الورقة المكشوفة ، وتغيير شدة الضوء) مفيدة لفحص أعداد كبيرة من المتحورات وتحديد الطفرات الخالية التي تفتقر إما إلى القدرة على إظهار استجابة تجنب أو تراكم أو كليهما. ومع ذلك ، فإنه لا يوفر معلومات حول التغيرات الديناميكية في حركة البلاستيدات الخضراء.
وعلى النقيض من ذلك، تسمح الطريقة الموصوفة هنا بتحديد كمية حركة البلاستيدات الخضراء في الأوراق السليمة باستخدام التغيرات في انتقال الضوء عبر الورقة كبديل لحركة البلاستيدات الخضراء الشاملة: في ظل الظروف التي تنتشر فيها البلاستيدات الخضراء في خلايا الميزوفيل في استجابة التراكم، ينتقل ضوء أقل عبر الورقة مما هو عليه عندما تكون العديد من البلاستيدات الخضراء في استجابة تجنبية، وضع أنفسهم على طول جدران الخلايا المضادة للكلينا. وبالتالي، يمكن استخدام التغيرات في الإرسال كبديل لحركة البلاستيدات الخضراء الشاملة في الأوراق14. ويرد وصف لتفاصيل الصك في مكان آخر (انظر الملف التكميلي)، ولكن في الأساس، يستخدم الصك الضوء الأزرق لتحريك البلاستيدات الخضراء ويقيس مقدار الضوء الأحمر الذي ينتقل عبر تلك الورقة على فترات زمنية محددة. في الآونة الأخيرة ، تم وصف تعديل لهذا النظام ، والذي يستخدم قارئا صغيرا معدلا بسعة 96 بئرا ، ومصباح LED أزرق ، وجهاز كمبيوتر ، وحاضنة يتم التحكم في درجة حرارتها15.
وقد ساعد خيار استخدام مجموعة من الأساليب، بما في ذلك التقييم البصري للأوراق للفحص، يليه قياس التغيرات الديناميكية في انتقال العدوى واستخدام الفحص المجهري، إلى حد كبير على فهمنا لكل من الآليات الأساسية والأهمية الفسيولوجية/الإيكولوجية لحركة البلاستيدات الخضراء. على سبيل المثال ، أدى ذلك إلى اكتشاف وتوصيف مختلف المتحورات ، والتي تضعف في جوانب محددة من تحركاتها. على سبيل المثال ، تفتقر طفرات A. thaliana phot 1 إلى القدرة على تراكم البلاستيدات الخضراء في الإضاءة المنخفضة ، في حين تفتقر طفرات phot 2 إلى القدرة على إجراء تفاعل تجنب. ترجع هذه الأنماط الظاهرية إلى ضعف في مستقبلين للضوء الأزرق لكل منهما16،17،18. وعلى النقيض من ذلك، تفتقر طفرات chup1 إلى القدرة على تكوين خيوط الأكتين المناسبة حول البلاستيدات الخضراء الضرورية لنقل البلاستيدات الخضراء إلى الموضع المطلوب داخل الخلية11,19. بالإضافة إلى الدراسات المتحورة ، قام الباحثون بتقييم آثار المثبطات المختلفة على حركة البلاستيدات الخضراء لتوضيح الجوانب الميكانيكية للعملية. على سبيل المثال ، تم استخدام مواد كيميائية مثل H2O2 ومضادات الأكسدة المختلفة للتحقيق في آثار جزيء الإشارة هذا على حركة البلاستيدات الخضراء20. تم استخدام مثبطات مختلفة لتوضيح دور الكالسيوم في حركة البلاستيدات الخضراء21. بالإضافة إلى المساعدة في الكشف عن آليات حركة البلاستيدات الخضراء ، يمكن استخدام هذه الطرق لمقارنة حركة البلاستيدات الخضراء في مختلف الأنواع أو الطفرات المزروعة في ظروف مختلفة في محاولة لفهم السياق البيئي والتطوري لهذا السلوك. على سبيل المثال ، فقد تبين أن مدى تأثيرات الطفرات المختلفة في مسار حركة البلاستيدات الخضراء يعتمد على ظروف النمو7,9 ، وأن النباتات المتكيفة مع الشمس لا يبدو أنها تحرك البلاستيدات الخضراء الخاصة بها كثيرا. في المقابل ، الحركة مهمة جدا لنباتات الظل10،22،23.
تصف ورقة الأساليب هذه، التي تركز على المصنع النموذجي A. thaliana، كيفية استخدام جهاز إرسال وهو نسخة محدثة من أداة تم تطويرها مسبقا9. على الرغم من أن هذه الأداة غير متوفرة تجاريا ، إلا أن الأشخاص الذين لديهم فهم أساسي للإلكترونيات أو مساعدة من زملاء وطلاب الهندسة أو الفيزياء سيكونون قادرين على بناء الأداة باستخدام أجزاء بأسعار معقولة واتباع التعليمات التفصيلية (انظر الملف التكميلي). وتتمتع المنصة مفتوحة المصدر المستخدمة لبناء الأداة بدعم واسع النطاق على شبكة الإنترنت ومنتدى مجتمعي يقدم المساعدة في حالة ظهور مشاكل24.
يركز البروتوكول على كيفية استخدام الأداة لتحديد التغيرات في انتقال الأوراق في تشغيل استكشافي قياسي يعرض الورقة لمجموعة واسعة من ظروف الإضاءة ويلتقط تفاعلات الظلام والتراكم والتجنب ل A. thaliana. يمكن تعديل هذه الأشواط اعتمادا على الهدف من التجربة ويمكن استخدامها مع معظم الأنواع النباتية. تقدم الورقة أمثلة على بيانات انتقال النمط البري A. thaliana والعديد من الطفرات وتوضح كيفية إجراء مزيد من التحليل للبيانات.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. إعداد الأوراق للركض
- ضع 8 نباتات A. thaliana في الظلام بين عشية وضحاها (> 6 ساعات يعمل لمعظم الأنواع) لضمان انتقال البلاستيدات الخضراء إلى وضعها المظلم. تبدأ جميع النسخ المتماثلة بقيم إرسال قابلة للمقارنة.
- بدلا من ذلك ، ضع 8 أوراق كاملة في طبق بتري مع ورقة ترشيح رطبة في الأسفل ، وأغلق طبق بتري ، ولفه بورق الألومنيوم.
2. اختبار ما إذا كان جهاز الإرسال يعمل
- قم بتوصيل جهاز الإرسال بمصدر طاقة مستقر واضغط على مفتاح الطاقة (زر تشغيل/إيقاف) الخاص بالجهاز لإعادة ضبط الجهاز (الشكل 1A، B).
- قم بتوصيل ال iPad بمصدر طاقة مستقر، واضغط على زر الشاشة الرئيسية لتنشيط الشاشة، وأدخل رمز المرور لتسجيل الدخول.
- اضغط على أيقونة الإعدادات ، واضغط على أيقونة العرض والسطوع ، واضغط على القفل التلقائي، وحدد أبدا بالضغط على هذا الخيار لضمان بقاء الشاشة قيد التشغيل بشكل دائم. وإلا سيتوقف البرنامج عن العمل عندما تذهب الشاشة إلى وضع السكون. اضغط على زر الشاشة الرئيسية للعودة إلى الشاشة الرئيسية.
- اضغط مرتين على زر الشاشة الرئيسية لمعرفة التطبيقات المفتوحة، وأغلقها جميعا عن طريق تمريرها نحو الجزء العلوي من الشاشة. اضغط على زر الشاشة الرئيسية للعودة إلى الشاشة الرئيسية.
- ابحث عن تطبيق LeafSensor على الشاشة الرئيسية أو عن طريق السحب إلى اليسار أو اليمين. اضغط على أيقونة التطبيق لفتحه (انظر الملف التكميلي). ستظهر شاشة خضراء تحتوي على حقول نصية وبيضاء لإدخال المعلومات.
- تأكد من ظهور كلمة Connected في الجزء السفلي من الشاشة لأنها تشير إلى أن التطبيق يتصل بجهاز الإرسال. إذا ظهرت الرسالة "لم يتم العثور على Adafruit" ، فتحقق من توصيل الجهاز واضغط على زر البدء على الجهاز مرة أخرى.
- املأ أول 4 حقول في صفحة التطبيق لتسمية التجربة وإعداد شروط تشغيل اختبار قصير بدون أوراق ومع فتح مقاطع الأوراق:
- قم بتسمية التجربة (استخدم 8 أحرف أو أرقام كبيرة أو أقل) على سبيل المثال، عن طريق كتابة TEST في الحقل المسمى Expt Name.
- اختر عدد شدة الضوء الأزرق المختلفة التي سيتم استخدامها في التجربة، على سبيل المثال، عن طريق كتابة 3 في الحقل المسمى # شدة الضوء.
- اختر شدة الضوء الأزرق لهذا التشغيل (اختر عددا صحيحا بين 0 و 3000 وافصل كل رقم عن الرقم التالي بفاصلة ؛ راجع الملف التكميلي حول كيفية تحويل هذه الأرقام إلى كثافات الضوء الأزرق الفعلية لمصابيح LED) على سبيل المثال ، عن طريق كتابة 0,100,1000 في الحقل المسمى Blue Intensities.
- اختر طول الوقت الذي ستلمع فيه كل شدة ضوء أزرق على الورقة (افصل كل رقم عن الرقم التالي بفاصلة) على سبيل المثال ، عن طريق كتابة 2,2,2 في الحقل المسمى Blue Duration (minutes).
- اضغط على بدء التجربة في القسم الأوسط من الشاشة. في الجزء السفلي من الشاشة ، ستظهر 8 واصلات ورسالة بدء التجربة .
- تأكد من عدم انبعاث أي ضوء من مصابيح LED خلال الدقيقتين الأوليين ، ثم يتم انبعاث ضوء أزرق ضعيف ، وبعد 2 دقيقة تزداد كثافة الضوء الأزرق.
- تأكد من انبعاث ضوء أحمر مكثف من مصابيح LED مرة واحدة في الدقيقة لإجراء القياسات.
ملاحظة: أثناء تشغيل التجربة، ستظهر الأرقام على صفحة التطبيق لكل من المستشعرات الثمانية، وسيتم تحديث البيانات مرة واحدة في الدقيقة. تأكد من أن أرقام الإخراج من الثنائيات الضوئية حوالي 1000-1023 (إذا كانت الغرفة مظلمة). يوضح تحديث في أسفل اليسار عدد القياسات التي تم إجراؤها حتى الآن ، على سبيل المثال ، تم إجراء 1 من 6 قياسات (قياس واحد كل دقيقة). - عند الانتهاء من التجربة، تحقق من مظهر التجربة التي انتهت في أسفل يمين صفحة التطبيق. الآن الأداة جاهزة للتشغيل بالأوراق.
- اضغط مرتين على زر الشاشة الرئيسية، واسحب للخارج من التطبيق وافتحه مرة أخرى. اضغط على زر ON/OFF الموجود على الجهاز لإعادة ضبطه.
3. إعداد الأوراق في مقاطع الأوراق
ملاحظة: يجب القيام بهذه الخطوة في الظلام باستخدام مصدر ضوء أخضر (على سبيل المثال ، ضع مرشحا أخضر أمام مصباح كهربائي) لتجنب تحفيز حركة البلاستيدات الخضراء. بدلا من ذلك ، استخدم ضوءا أبيض منخفضا جدا وفترة مظلمة ممتدة في مقاطع الأوراق. تذكر أن جزءا واحدا من مشبك الورقة يحمل LED (فتحة أكبر) ، بينما يحمل الآخر الترانزستور الضوئي (الشكل 1C).
- إذا كانت النباتات تتكيف مع الظلام بالكامل ، فاختر 8 أوراق واسعة بما يكفي لتغطية مصابيح LED. خلاف ذلك ، قم بإزالة الأوراق من طبق بتري. قم بإعداد 8 شرائح من ورق الترشيح حول طول مشبك الأوراق ومع ثقب مثقوب في الأعلى لعدم تغطية LED.
- بلل ورقة الترشيح وضعها على جزء مشبك الأوراق الذي يحمل مؤشر LED. كرر ذلك لكل مقطع من مقاطع الأوراق الثمانية.
- ضع كل ورقة في الجزء العلوي من ورقة الترشيح الرطبة لمشبك الورقة الخاص بها. تأكد من أن جانب الورقة الصحيح متجه نحو LED (عادة ما يتم إجراء التجارب على سطح الورقة المحوري المواجه ل LED).
- تجنب وضع الأضلاع الوسطى للورقة فوق مصابيح LED ، وللحصول على نتائج أكثر اتساقا ، ضع أجزاء مماثلة من كل ورقة (على سبيل المثال ، أوسع قسم من الورقة) فوق LED.
- ضع جزء مشبك الورقة الآخر مع الترانزستور الضوئي في الأعلى. استخدم شريطا مطاطيا لتثبيت جزأي مشبك الأوراق معا إذا لزم الأمر (الشكل 1C، D).
- ضع كل مشبك ورقة في "قاربه" واملأ الخزانات بالماء باستخدام ماصة. تأكد من أن الورقة أو على الأقل ورقة الترشيح تلمس الماء لتجنب جفاف الأوراق أثناء الجري (الشكل 1D).
4. إجراء الجري
ملاحظة: بالنسبة للتشغيل الاستكشافي القياسي، ابدأ ب 4 ساعات من الظلام (0 ميكرومول فوتون m-2 s-1)، متبوعا ب 7 ساعات من الضوء الأزرق المنخفض (2 ميكرومول فوتون m-2 s-1)، متبوعا ب 60 دقيقة لكل من 5 و 10 و 30 و 40 و 50 و 60 و 90 و 100 ميكرومول فوتون m-2 s-1 من الضوء الأزرق. سيؤدي ذلك إلى حث الأوراق على إظهار انتقالها المظلم ، وحث حركة البلاستيدات الخضراء إلى أقصى تراكم ، وإظهار درجات مختلفة من استجابة التجنب.
- قم بإعداد تطبيق LeafSensor على ال iPad باستخدام الخطوات الموضحة أدناه.
- اكتب EXPLORA1 في الحقل المسمى اسم Expt.
- اكتب 10 في الحقل المسمى # شدة الضوء.
- اكتب 0,1,60,160,550,750,950,1150,1350,1950 في الحقل المسمى الكثافات الزرقاء.
- اكتب 240,420,60,60,60,60,60,60,60,60,60 في الحقل المسمى Blue Duration.
- اضغط على بدء التجربة. بعد الدقيقة الأولى ، ستظهر قيم الإخراج (عادة بين 990 و 820) على الشاشة. إذا كانت القيم بعيدة ، فتحقق مما إذا كانت الأوراق قد وضعت بشكل صحيح في مقاطع الأوراق.
- عند الانتهاء من التشغيل، تأكد من ظهور الرسالة "انتهت التجربة" في أسفل يسار الشاشة. سيتم حفظ البيانات تلقائيا.
- ضع الشاشة في وضع مستقيم (وليس أفقيا). سيظهر خياران جديدان على الشاشة ، وهما Save و Utilities.
- اضغط على الأدوات المساعدة وستظهر قائمة بالملفات المحفوظة. حدد ملف الاهتمام، في هذه الحالة، EXPLORA1.
- أسفل قائمة الملفات ، ابحث عن Expt المحدد: EXPLORA1. اضغط على البريد الإلكتروني، وأدخل عنوان بريد إلكتروني، وسيتم إرفاق ملف البيانات تلقائيا بالرسالة. اضغط على إرسال.
ملاحظة: إذا كان هناك تأخير طويل حتى وصول الملفات، فأعد تشغيل التطبيق وأرسل الملف مرة أخرى.
- إذا تم إحباط تشغيل، ولكن البيانات حتى هذه النقطة ذات أهمية، فاضغط على حفظ قبل تحديد الأدوات المساعدة. بعد عدة عمليات تشغيل، قم بتنظيف مساحة الذاكرة: اضغط على الأدوات المساعدة، وحدد ملفا واحدا في كل مرة، واسحب لليسار بجوار الملف، ثم اضغط على Delete لإزالة الملف.
- اضغط على Back (رجوع ) لتشغيل تجربة أخرى أو في حالة الانتهاء، اضغط على زر الشاشة الرئيسية، واسحب إلى الشاشة الرئيسية، واضغط على الإعدادات، واضغط على Display & Brightness، واضغط على القفل التلقائي، ثم اضغط على 2 دقيقة.
5. تحليل البيانات
- قم بتنزيل الملف EXPLORA1 من البريد الإلكتروني ، وأضف امتدادا .csv إلى الملف ، وانقر نقرا مزدوجا فوق الملف. سيتم فرز البيانات في جدول بيانات مع فرز بيانات المستشعرات الثمانية المختلفة في أعمدة منفصلة. يعرض العمود الأخير الوقت (بالثواني) الذي تم فيه جمع البيانات. احذف الصف الأول أسفل العناوين (Sensor1-8) إذا كان يحتوي على بيانات لا معنى لها.
- قم بإعداد ورقة بيانات رئيسية تحتوي على نتائج كل مستشعر في ورقة منفصلة وتقوم بتحويل قيم الإخراج إلى قيم إرسال ٪ باستخدام المعادلات التي تم الحصول عليها من معايرة كل مقطع ورقة ومستشعر (انظر الملف التكميلي).
- انسخ كل مجموعة بيانات إلى ورقة بيانات منفصلة (على سبيل المثال، العمود A يحتوي على الوقت؛ العمود C يحتوي على بيانات Sensor1).
- قم بإعداد العمود B بحيث يحول الوقت من ثوان إلى دقائق. قم بإعداد العمود D بحيث يحتوي على الصيغة لتحويل الجهد إلى نقل ٪ باستخدام المعادلة من المعايرة.
- قم بإعداد ورقة بيانات مماثلة لكل مستشعر وتذكر أن الصيغة المستخدمة لتحويل خرج الجهد إلى قيم نقل ٪ قد تكون مختلفة لكل مستشعر.
- انتقال النسبة المئوية للقطعة (T) مع مرور الوقت، الحد الأدنى (الشكل 2).
- احفظ ورقة البيانات تحت اسم جديد بحيث يمكن إعادة استخدام ورقة البيانات الرئيسية.
- لمزيد من التحليل للبيانات (الشكل 2)، احسب تراكم ΔT (٪) (على سبيل المثال، تغير T عند التراكم الأقصى مقارنة ب T في الظلام)، أو تجنب ΔT (٪) (على سبيل المثال، تغير T عند أقصى تجنب مقارنة ب T في الظلام)، أو dT/dt (٪/h) (على سبيل المثال، التغير في T خلال أسرع جزء من تفاعل التراكم أو التجنب). لمزيد من التفاصيل انظر 8.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
تظهر الأجزاء المختلفة من جهاز الإرسال في الشكل 1. المتحكم الدقيق هو وحدة التحكم في الجهاز ويتحكم في ظروف الإضاءة التي تمر بها الأوراق ، المؤمنة في مقاطع الأوراق السوداء ، ويخزن بيانات نقل الضوء التي تتلقاها (الشكل 1A ، B). تظهر صورة مقربة لوحدة التحكم في الجهاز زر التشغيل/الإيقاف، وبطاقة SD لقدرة تخزين البيانات، ودرع Bluetooth (الذي يرسل البيانات إلى تطبيق LeafSensor)، والكابلات التي تتصل بمصابيح LED (الثنائيات الباعثة للضوء) والترانزستورات الضوئية. يتم وضع المتحكم الدقيق في قاعدة الأداة ، ولا تظهر سوى الحواف في الصورة (الشكل 1B). 3D المطبوعة، ومشابك ورقة سوداء عقد الأوراق، ومصابيح LED، والترانزستورات الضوئية في مكانها. يتم وضع ورقة مرشح مبللة على جزء مشابك الأوراق مع LED بحيث يكون مؤشر LED دون عائق ، ويتم وضع ورقة مكيفة مع الظلام مع سطح الورقة المحورية التي تواجه LED. يوضح المخطط أن LED و phototransistor يتم وضعهما على الجانبين المعاكسين للورقة. يمكن أن ينبعث LED من الضوء الأزرق أو الأحمر. يستخدم الضوء الأزرق للحث على حركة البلاستيدات الخضراء ويتم إيقاف تشغيله لفترة وجيزة كل دقيقة يضيء خلالها ضوء القياس الأحمر على الورقة. يكتشف الترانزستور الضوئي ، الموجود على الجانب الآخر من الورقة ، مقدار الضوء الأحمر الذي ينتقل عبر الورقة ويرسل البيانات إلى المتحكم الدقيق وبطاقة SD (الشكل 1C). يتم تجميع جزأين من مشبك الأوراق ، ووضعهما في "قارب" مطبوع ثلاثي الأبعاد مملوء بالماء ويساعد على الحفاظ على رطوبة الورقة أثناء التجربة (الشكل 1D).
ويبين الشكل 2 مجموعة بيانات نموذجية يتم فيها رسم النسبة المئوية لنقل البيانات مقابل الوقت (الحد الأدنى). وتضمنت عملية الإرسال هذه 1 ساعة من الظلام، تليها 3 ساعات من الضوء الأزرق المنخفض (فوتون 2 ميكرومول m-2 s-1)، و 1 ساعة لكل من الكثافة المتوسطة (30 ميكرومول فوتون m-2 s-1) والضوء الأزرق العالي (100 ميكرومول فوتون m-2 s-1). تظهر البيانات أن انتقال العدوى في A. thaliana ينخفض عند شدة الضوء المنخفض (استجابة التراكم) ، في حين يتم تحفيز استجابة التجنب عندما تزداد شدة الضوء. هذه ليست استجابة كل شيء أو لا شيء وتعتمد درجات التغييرات بالنسبة للقيم المظلمة على كثافة الضوء الأزرق الدقيقة. ويمكن حساب هذه النسبة المئوية للتغيرات في الإرسال (ΔT) باستخدام الصيغ المبينة أدناه في البيانات. وبالإضافة إلى ذلك، يمكن حساب سرعة تغيرات الإرسال (dT/dt) أثناء التغيرات الأولية في الإرسال عند تشغيل استجابة التراكم أو التجنب باستخدام ميل المنحنى.
ويبين متوسط النسبة المئوية لقيم انتقال النوع البري (WT) (الشكل 3A)، وكذلك أوراق اللوت 1 و phot 2 المتحورة A. thaliana (الشكل 3B) خلال 19 ساعة على المدى الطويل. وتساعد عمليات الإرسال الاستكشافية الموسعة هذه في تحديد شدة الضوء الأزرق التي يجب استخدامها في الأشواط المستقبلية. تعرضت الأوراق لأول مرة ل 4 ساعات من الظلام ، وتشير قيم الإرسال المتسقة إلى أن الأوراق كانت متكيفة تماما مع الظلام ، مما سيجعل البيانات بين النسخ المتماثلة أكثر اتساقا. خلال ال 7 ساعات التالية ، تعرضت الأوراق لضوء أزرق منخفض (فوتون 2 ميكرومول m-2 s-1). في WT و phot 2 ، يتبع الانخفاض السريع الأولي في الإرسال انخفاض بطيء يشير إلى أن البلاستيدات الخضراء كانت تتحرك في استجابة التراكم. اعتمادا على الأنواع المستخدمة ، قد يستغرق الأمر فترات زمنية مختلفة للحصول على أقل انتقال ممكن. في كثير من الحالات ، قد يكون الباحث مهتما فقط بمقارنة الطفرات المختلفة في نقطة زمنية معينة ، لذلك قد يقتصر التعرض للضوء المنخفض جدا على ساعة. بالمقارنة مع WT ، يظهر phot 1 استجابة تراكم منخفضة. ويتبع التعرض الممتد للضوء الأزرق المنخفض زيادة تدريجية في كثافة الضوء الأزرق كل ساعة (5 ، 10 ، 30 ، 40 ، 50 ، 60 ، 90 ، 100 ميكرومول فوتون m-2 s-1). تزداد النسبة المئوية لانتقال العدوى في A. thaliana WT و phot 1 مع كل زيادة في شدة الضوء ، مما يدل على أن البلاستيدات الخضراء تنتقل إلى استجابة التجنب ولكن هذا لا يظهر في phot 2. تعتمد درجات التغير في الانتقال بالنسبة للقيمة المظلمة (ΔT) على شدة الضوء الأزرق الدقيقة وقد تختلف اعتمادا على النمط الوراثي (الشكل 3C). ويبين مثال على سرعة تغيرات الإرسال (dT/dt) أثناء الاستجابات الأولية في الإرسال عندما يحدث التجنب مع زيادة الكثافة الزرقاء من 5 إلى 10 ميكرومول فوتون m-2 s-1 (الشكل 3D). السرعة هي نفسها بالنسبة ل WT و phot 1 ، في حين أنها بطيئة جدا بالنسبة لمتحورات phot 2 .
الشكل 1: نظرة عامة على جهاز الإرسال. صورة لجهاز الإرسال المبني في المنزل مع وحدة التحكم في الصندوق الأسود في أسفل اليمين ومشابك الأوراق في الأعلى وأسفل اليسار (A). صورة مقربة لوحدة التحكم باستخدام زر التشغيل/الإيقاف، وبطاقة SD لإمكانية تخزين البيانات، ودرع Bluetooth للاتصال اللاسلكي. تقوم الكابلات بتوصيل وحدة التحكم بالثنائيات الباعثة للضوء (LEDs) والترانزستورات الضوئية. يتم وضع المتحكم الدقيق في قاعدة الجهاز ولا تظهر سوى الحواف في هذه الصورة (B). مقاطع الأوراق السوداء المطبوعة بتقنية 3D: على اليسار يظهر جزء مشبك الورقة الذي يحمل LED ، وعلى اليمين يظهر جزء مشبك الورقة الذي يحمل جهاز الترانزستور الضوئي. لإعداد تشغيل ، يتم وضع ورقة ترشيح رطبة (مع ثقب بحجم LED) على المشبك دون إخفاء مؤشر LED. ثم يتم وضع الورقة في المشبك الذي يغطي LED. يوضح المخطط أن LED و phototransistor (PT) يقعان مقابل بعضهما البعض ، بالقرب من الورقة ، عندما يتم تجميع جزأين من كل مقطع ورقة (C). يتم وضع مشابك الأوراق في "قوارب" مطبوعة 3D مليئة بالماء ، مما يحافظ على الأوراق وأوراق الترشيح رطبة (D). يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.
الشكل 2: بيانات الإرسال لورقة A. thaliana النموذجية. بيانات الإرسال (T) لورقة A. thaliana التي تعرضت للظلام لمدة 1 ساعة ، تليها 3 ساعات من الضوء المنخفض (فوتون 2 ميكرومول m-2 s-1) ، تليها 1 ساعة لكل من الفوتون المتوسط (30 ميكرومول m-2 s-1) والضوء الأزرق العالي (100 ميكرومول فوتون m-2 s-1). أدت شدة الضوء المنخفض إلى استجابة التراكم ، في حين أدت شدة الضوء الأعلى إلى درجات مختلفة من استجابة التجنب. تعمل مستويات T في الظلام كخط أساس (الخط الأزرق). يمكن حساب النسبة المئوية للتغيرات في T بالنسبة للمستويات المظلمة (ΔT) ، على سبيل المثال ، عند الحد الأقصى للتراكم أو مستويات مختلفة من التجنب (يشار إلى الاختلافات إلى T الداكنة بواسطة الأسهم الزرقاء). وبالإضافة إلى ذلك، يمكن حساب السرعة التي يتغير بها T (dT/dt)، على سبيل المثال، خلال المرحلة الأولية من استجابة التجنب من ميل T المرسومة مقابل الزمن (المشار إليها بالمثلث الأزرق). تظهر المعادلات أسفل الرسم البياني. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.
الشكل 3: حركة البلاستيدات الخضراء في أوراق A. thaliana المتحورة والمتحورة. تعرضت الأوراق الناضجة والمتكيفة الداكنة للظلام لمدة 4 ساعات ، تليها التعرض لمدة 7 ساعات لفوتون 2 ميكرومول m-2 s-1 ، تليها زيادة تدريجية في شدة الضوء الأزرق كل ساعة (5 ، 10 ، 30 ، 40 ، 50 ، 60 ، 90 ، 100 ميكرومول فوتون m-2 s-1). متوسط النسبة المئوية لقيم الإرسال (T) (n = 20) من WT (A) وكذلك أوراق phot 1 و phot 2 (B). التغير في النسبة المئوية T بالنسبة للقيم المظلمة: تشير القيم السلبية إلى أن الأوراق أظهرت استجابة تراكمية ، بينما تشير القيم الإيجابية إلى استجابة تجنب. تشير الأرقام الموجودة على اليمين إلى شدة الضوء الأزرق التي تم حساب بيانات ΔT بها. نظام الألوان هو نفسه كما في بقية الشكل (C). تم حساب بيانات dT / dt حيث استجابت الأوراق لزيادة في شدة الضوء الأزرق من 5 إلى 10 ميكرومول فوتون m-2 s-1 وتشير إلى السرعة التي تغيرت بها النسبة المئوية T في الساعة (D). البيانات الخاصة ب A و B هي وسائل ، بالنسبة ل C و D تعني ± SD (n = 20). يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.
الملف التكميلي. يرجى النقر هنا لتنزيل هذا الملف.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
الجهاز سهل الاستخدام للغاية ولكن من الأهمية بمكان معايرة كل إعداد مشبك ورقة لجهاز الإرسال بشكل مستقل لأن تحديد موضع مصابيح LED والترانزستورات الضوئية قد يختلف قليلا من مشبك ورقة إلى آخر. تأكد من إدخال مصابيح LED والترانزستورات الضوئية بثبات وأعد التحقق من المعايرة إذا بدت البيانات متوقفة. تجنب إدخال الماء على الجهاز. يتم وضع الأوراق في مقاطع الأوراق في "قوارب" مليئة بالماء لتجنب الإجهاد المائي. ضع هذه القوارب على سبيل المثال في حاوية بلاستيكية منخفضة الحواف منفصلة عن وحدة التحكم ولا تضربها. لا تقم بفصل توصيلات الكبل أو ثنيها. كن حذرا عند إدخال الأوراق في مشابك الأوراق وتجنب سحب الكابلات أو ثنيها أكثر من اللازم.
من المهم تكييف الأوراق مع الظلام لفترة كافية لضمان أن قيم الإرسال الأولية تمثل الوضع المظلم. تحقق من أن القيم خلال الفترة المظلمة في الجهاز كانت مستقرة لمدة 30 دقيقة على الأقل قبل تسليط الضوء الأزرق على الأوراق. إذا لم تكن كذلك ، فقم بتكييف الأوراق لفترة أطول من الوقت قبل التشغيل التالي أو قم بتمديد الفترة المظلمة في جهاز الإرسال لمراقبة المدة التي تستغرقها الأوراق للوصول إلى حالة ثابتة. عادة ، يتم تقديم بيانات الإرسال على أنها النسبة المئوية للتغير في الإرسال عند شدة ضوء أزرق معينة بالنسبة للقيمة المظلمة (ΔT). وبالتالي فمن الأهمية بمكان الحصول على قيم خط الأساس الصحيحة.
يمكن استخدام التشغيل الاستكشافي لأي متحور A. thaliana (بما في ذلك الطفرات المعروفة بتأثيرها على جوانب أخرى من فسيولوجيا النبات مثل التمثيل الضوئي أو الميوسين أو الطفرات غير المميزة) أو الأنواع المختلفة طالما أن مساحة الورقة كبيرة بما يكفي لتغطية LED في مشبك الأوراق والأوراق ليست سميكة جدا. يمكن تكييف البرنامج بسهولة لتلبية أي احتياجات للباحث ، على سبيل المثال ، يمكن تغيير شدة الضوء الأزرق داخل النطاقات التي ثبت أنها تثير حركة البلاستيدات الخضراء (يشبع التفاعل حوالي 100 ميكرومول فوتون m-2 s-1) ، ويمكن تغيير أوقات التعرض ، ويمكن تغيير عدد ظروف الضوء المتتالية. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن معالجة الأوراق مسبقا قبل تشغيلها في الجهاز ، على سبيل المثال ، مع مثبطات بلمرة الأكتين أو مكونات مسار الإشارات ، وهو أمر مهم للباحثين الذين يرغبون في ملء الفراغات في مسار الإشارات الذي ينظم حركة البلاستيدات الخضراء.
مثل كل طريقة ، هذه الطريقة أيضا لها حدودها وعيوبها. يعتمد الإجراء على التغييرات في الخصائص البصرية للأوراق ، أي مقدار الضوء الذي ينتقل. لذلك ، فإنه يعمل بشكل أفضل مع الأوراق الرقيقة نسبيا ، في حين أن الأوراق السميكة غالبا ما لا تسمح باكتشاف انتقال كاف للضوء الأحمر يتجاوز مستوى الضوضاء. سيكون من الممكن تعديل جهاز الإرسال لزيادة شدة الضوء الأحمر الساطع على الورقة وزيادة حساسية الترانزستورات الضوئية عن طريق تغيير المقاومات. وبما أن هذه الطريقة لا توفر سوى مقياس متكامل لحركات البلاستيدات الخضراء في جميع الخلايا وطبقات الخلايا، فقد يفوت المرء بعض التغييرات الطفيفة، على سبيل المثال، البلاستيدات الخضراء التي تتحرك في اتجاهين متعاكسين قد لا تؤدي إلى أي تغيير صاف في الإرسال. خاصة عند العمل مع الطفرات أو الأنواع غير المميزة سابقا ، من المهم استكمال نتائج الإرسال بصور لتحديد مواقع البلاستيدات الخضراء باستخدام الفحص المجهري. فعلى سبيل المثال، لوحظت تغيرات بطيئة في انتقال العدوى استجابة للتغيرات في شدة الضوء الأزرق في متحور من فصيلة A. thaliana ويمكن أن تكون ناجمة عن مجموعة من الأسباب. كشف الفحص المجهري أن الخلايا تحتوي على اثنين فقط من البلاستيدات الخضراء التي كانت أكبر بكثير من البلاستيدات الخضراء العادية. تم تأكيد المتحور لاحقا على أنه متحور انقسام البلاستيدات الخضراء arc6-125.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
وليس لدى صاحبي البلاغ أي تضارب في المصالح.
Acknowledgments
تم توفير التمويل من خلال جائزة Fiske وجائزة Wellesley College College College.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Aluminum foil | |||
| Dark adapted leaves | |||
| Filter paper | |||
| iPad with LeafSensor app installed (see Supplemental Info) | |||
| Pipette | Any | ||
| Petri dish | Any | ||
| Transmission device (see Supplemental info) | |||
| Water |
References
- Senn, G. Die Gestalts- und Lageveränderung der Pflanzenchromatophoren. , Wilhelm Engelmann. Leipzig, Germany. (1908).
- Zurzycki, J. The influence of chloroplast displacements on the optical properties of leaves. Acta Societatis Botanicorum Poloniae. 30, 503-527 (1961).
- Wada, M., Kagawa, T., Sato, Y.
- Wada, M.
- Kasahara, M., Kagawa, T., Oikawa, K., Suetsugu, N., Miyao, M., Wada, M. Chloroplast avoidance movement reduces photodamage in plants. Nature. 420, 829-832 (2002).
- Davis, P. A., Hangarter, R. P. Chloroplast movement provides photoprotection to plants by redistributing PSII damage within leaves. Photosynthesis Research. 112, 153-161 (2012).
- Howard, M. M., Bae, A., Königer, M. The importance of chloroplast movement, nonphotochemical quenching, and electron transport rates in light acclimation and tolerance to high light in Arabidopsis thaliana. American Journal of Botany. 106 (11), 1-10 (2019).
- Gotoh, E., et al. Chloroplast accumulation response enhances leaf photosynthesis and plant biomass production. Plant Physiology. 178, 1358-1369 (2018).
- Howard, M. M., Bae, A., Pirani, Z., Van, N., Königer, M. Impairment of chloroplast movement reduces growth and delays reproduction of Arabidopsis thaliana in natural and controlled conditions. American Journal of Botany. 107 (9), 1309-1318 (2020).
- Trojan, A., Gabryś, H. Chloroplast distribution in Arabidopsis thaliana (L.) depends on light conditions during growth. Plant Physiology. 111, 419-425 (1996).
- Oikawa, K., et al. Chloroplast unusual positioning is essential for proper chloroplast positioning. The Plant Cell. 15, 2805-2815 (2003).
- Königer, M., Bollinger, N. Chloroplast movement behavior varies widely among species and does not correlate with high light stress tolerance. Planta. 236, 411-426 (2012).
- Kagawa, T., et al. Arabidopsis NPL1: a phototropin homolog controlling the chloroplast high-light avoidance response. Science. 291, 2138-2141 (2001).
- Berg, R., et al. A simple low-cost microcontroller-based photometric instrument for monitoring chloroplast movement. Photosynthesis Research. 87, 303-311 (2006).
- Johansson, H., Zeidler, M. Automatic chloroplast movement analysis. Molecular Biology. 1398, Springer. Germany. 29-35 (2016).
- Briggs, W. R., et al.
- Jarillo, J. A., et al. Phototropin-related NPL1 controls chloroplast relocation induced by blue light. Nature. 410, 952-954 (2001).
- Sakai, T. Arabidopsis nph1 and npl1: blue light receptors that mediate both phototropism and chloroplast relocation. Proceedings of the National Academy of Sciences, USA. 98 (12), 6969-6974 (2001).
- Wada, M., Kong, S. -G.
- Wen, F., Xing, D., Zhang, L. Hydrogen peroxide is involved in high blue light-induced chloroplast avoidance movements in Arabidopsis. Journal of Experimental Botany. 59 (10), 2891-2901 (2008).
- Tlalka, M., Fricker, M. The role of calcium in blue-light dependent chloroplast movement in Lemna trisulca L. The Plant Journal. 20, 461-473 (1999).
- Königer, M., Bollinger, N. Chloroplast movement behavior varies widely among species and does not correlate with high light stress tolerance. Planta. 236, 411-426 (2012).
- Higa, T., Wada, M. Chloroplast avoidance movement is not functional in plants grown under strong sunlight. Plant, Cell and Environment. 39, 871-882 (2016).
- Arduino. Arduino.cc. , Available from: https://www.arduino.cc (2021).
- Königer, M., Delamaide, J. A., Marlow, E. D., Harris, G. C. thaliana leaves with altered chloroplast numbers and chloroplast movement exhibit impaired adjustments to both low and high light. Journal of Experimental Botany. 59, 2285-2297 (2008).
