Summary
Veel plantensoorten veranderen de positionering van chloroplasten om de lichtabsorptie te optimaliseren. Dit protocol beschrijft hoe een eenvoudig, zelfgebouwd instrument kan worden gebruikt om chloroplastbeweging in Arabidopsis thaliana-bladeren te onderzoeken met behulp van veranderingen in de transmissie van licht door een blad als proxy.
Abstract
Van chloroplastbeweging in bladeren is aangetoond dat het helpt bij het minimaliseren van foto-opname en het verhogen van de groei onder bepaalde omstandigheden. Er kan veel worden geleerd over chloroplastbeweging door de chloroplastpositie in bladeren te bestuderen met behulp van bijvoorbeeld confocale fluorescentiemicroscopie, maar de toegang tot dit type microscopie is beperkt. Dit protocol beschrijft een methode die de veranderingen in bladoverdracht gebruikt als een proxy voor chloroplastbeweging. Als chloroplasten worden verspreid om de lichtonderschepping te maximaliseren, zal de transmissie laag zijn. Als chloroplasten naar de anticlinale celwanden bewegen om licht te vermijden, zal de transmissie hoger zijn. Dit protocol beschrijft hoe een eenvoudig, zelfgebouwd instrument kan worden gebruikt om bladeren bloot te stellen aan verschillende intensiteiten van blauw licht en de dynamische veranderingen in bladtransmissie te kwantificeren. Deze aanpak stelt onderzoekers in staat om chloroplastbewegingen in verschillende soorten en mutanten kwantitatief te beschrijven, de effecten van chemicaliën en omgevingsfactoren erop te bestuderen, of te screenen op nieuwe mutanten, bijvoorbeeld om ontbrekende componenten te identificeren in het proces dat leidt van lichtperceptie tot de beweging van chloroplasten.
Introduction
Licht is essentieel voor fotosynthese, plantengroei en ontwikkeling. Het is een van de meest dynamische abiotische factoren omdat lichtintensiteiten niet alleen veranderen in de loop van een seizoen of dag, maar ook snel en op onvoorspelbare manieren, afhankelijk van het wolkendek. Op bladniveau worden de lichtintensiteiten ook beïnvloed door de dichtheid en aard van de omringende vegetatie en het eigen bladerdak van de plant. Een belangrijk mechanisme dat planten in staat stelt om de lichtonderschepping onder variabele lichtomstandigheden te optimaliseren, is het vermogen van chloroplasten om te bewegen als reactie op prikkels in blauw licht1,2. Bij weinig licht verspreiden chloroplasten zich loodrecht op het licht (langs de periclinale celwanden) in een zogenaamde accumulatierespons, waardoor de lichtonderschepping en dus de fotosynthese worden gemaximaliseerd. Onder hoge lichtomstandigheden bewegen chloroplasten zich naar de anticlinale celwand in een zogenaamde vermijdingsreactie, waardoor lichtonderschepping en het gevaar van foto-inhibitie worden geminimaliseerd. Bij veel soorten nemen chloroplasten ook een specifieke donkere positie aan, die verschilt van de accumulatie- en vermijdingsposities en vaak intermediair is tussen die twee3,4. Verschillende studies hebben aangetoond dat chloroplastbeweging niet alleen belangrijk is voor de stresstolerantie op korte termijn van bladeren5,6,7, maar ook voor de groei en het voortplantingssucces van planten, vooral onder variabele lichtomstandigheden8,9.
Chloroplastbeweging wordt gemakkelijk in realtime waargenomen in bepaalde levende exemplaren (bijv. Algen of dunbladige planten zoals Elodea) met behulp van lichtmicroscopie1. Het bestuderen van chloroplastbeweging in de meeste bladeren vereist echter een voorbehandeling om chloroplastbeweging, chemische fixatie en voorbereiding van doorsneden te induceren voordat de monsters onder een lichtmicroscoop worden bekeken10. Met de introductie van confocale lasermicroscopie werd het ook mogelijk om de 3D-opstelling van chloroplasten in intacte of vaste bladeren in beeld te brengen4,11,12. Deze beeldvormingstechnieken helpen het begrip van chloroplastbewegingen enorm door belangrijke kwalitatieve informatie te verstrekken. Het kwantificeren van chloroplastpositionering (bijvoorbeeld als percentage chloroplasten in de periclinale of anticlinale posities in deze afbeeldingen of het percentage van het gebied dat door chloroplasten per totaal celoppervlak wordt bedekt) is ook mogelijk, maar vrij tijdrovend, vooral als het wordt uitgevoerd met de intervallen die nodig zijn om snelle veranderingen in positionering vast te leggen10,8 . De eenvoudigste manier om aan te tonen of donker-aangepaste bladeren van een bepaalde soort of mutanten in staat zijn tot chloroplastbeweging in de vermijdingsreactie, is door het grootste deel van het gebied van een blad te bedekken om de chloroplasten in het donker te houden terwijl een strook van het blad wordt blootgesteld aan veel licht. Na een blootstelling van minimaal 20 minuten aan hoog licht zijn de chloroplasten in het blootgestelde gebied in de vermijdingspositie verplaatst en zal de blootgestelde strip zichtbaar lichter van kleur zijn dan de rest van het blad. Dit geldt voor wild type A. thaliana, maar niet voor sommige van de chloroplastbewegingsmutanten die later in meer detail worden beschreven13. Deze methode en wijzigingen ervan (bijvoorbeeld het omkeren van welke delen van het blad worden blootgesteld, veranderende lichtintensiteiten) zijn nuttig voor het screenen van grote aantallen mutanten en om nulmutanten te identificeren die niet het vermogen hebben om een vermijdings- of accumulatierespons of beide te vertonen. Het geeft echter geen informatie over de dynamische veranderingen in chloroplastbewegingen.
Daarentegen maakt de hier beschreven methode de kwantificering van chloroplastbeweging in intacte bladeren mogelijk met behulp van veranderingen in lichttransmissie door een blad als een proxy voor de algehele chloroplastbeweging: onder omstandigheden waarin chloroplasten in de mesofylcellen worden verspreid in de accumulatierespons, wordt er minder licht door het blad doorgelaten dan wanneer veel chloroplasten in een vermijdingsreactie zijn, zichzelf positionerend langs de anticlinale celwanden. Daarom kunnen veranderingen in transmissie worden gebruikt als een proxy voor de algehele chloroplastbeweging in bladeren14. De details van het instrument worden elders beschreven (zie Aanvullend bestand), maar in principe gebruikt het instrument blauw licht om chloroplastbewegingen te activeren en meet het hoeveel rood licht er met bepaalde intervallen door dat blad wordt doorgelaten. Meer recent is een wijziging van dit systeem beschreven, dat gebruik maakt van een gemodificeerde 96-well microplaatlezer, een blauwe LED, een computer en een temperatuurgecontroleerde incubator15.
De optie om een combinatie van methoden te gebruiken, waaronder de optische beoordeling van bladeren voor screening, gevolgd door het meten van dynamische veranderingen in transmissie en het gebruik van microscopie, heeft ons inzicht in zowel de onderliggende mechanismen als de fysiologische / ecologische betekenis van chloroplastbeweging enorm geholpen. Het leidde bijvoorbeeld tot de ontdekking en karakterisering van verschillende mutanten, die zijn aangetast in specifieke aspecten van hun bewegingen. A. thaliana phot 1-mutanten missen bijvoorbeeld het vermogen om hun chloroplasten bij weinig licht te accumuleren, terwijl phot 2-mutanten niet het vermogen hebben om een vermijdingsreactie uit te voeren. Deze fenotypen zijn te wijten aan een aantasting van twee respectievelijke blauwlichtreceptoren16,17,18. Chup1-mutanten daarentegen missen het vermogen om de juiste actinefilamenten rond de chloroplasten te vormen die essentieel zijn om de chloroplasten in de gewenste positie in een cel te brengen11,19. Naast mutantenstudies hebben onderzoekers de effecten van verschillende remmers op chloroplastbeweging beoordeeld om de mechanistische aspecten van het proces op te helderen. Chemicaliën zoals H2O2 en verschillende antioxidanten werden bijvoorbeeld gebruikt om de effecten van dit signaalmolecuul op chloroplastbeweging20 te onderzoeken. Verschillende remmers werden gebruikt om de rol van calcium in chloroplastbewegingen op te helderen21. Naast het helpen ontdekken van de mechanismen van chloroplastbeweging, kunnen deze methoden worden gebruikt om chloroplastbewegingen te vergelijken bij verschillende soorten of mutanten die in verschillende omstandigheden zijn gekweekt in een poging om de ecologische en evolutionaire context van dit gedrag te begrijpen. Zo is aangetoond dat de omvang van de effecten van verschillende mutaties in de chloroplastbewegingsroute afhankelijk is van de groeiomstandigheden7,9, en dat zongecorrigeerde planten hun chloroplasten niet veel lijken te bewegen. Beweging is daarentegen erg belangrijk voor schaduwplanten10,22,23.
Dit methodedocument, gericht op de modelfabriek A. thaliana, beschrijft hoe een transmissieapparaat te gebruiken dat een bijgewerkte versie is van een eerder ontwikkeld instrument9. Hoewel dit instrument niet commercieel beschikbaar is, kunnen mensen met een basiskennis van elektronica of de hulp van technische of natuurkundige collega's en studenten het instrument bouwen met behulp van betaalbare onderdelen en het volgen van de gedetailleerde instructies (zie Aanvullend bestand). Het open-sourceplatform dat wordt gebruikt om het instrument te bouwen, heeft uitgebreide webondersteuning en een communityforum dat hulp biedt als zich problemen voordoen24.
Het protocol richt zich op het gebruik van het instrument om veranderingen in bladoverdracht te bepalen in een standaard verkennende run die een blad blootstelt aan een breed scala aan lichtomstandigheden en de donkere, accumulatie- en vermijdingsreacties van A. thaliana vangt. Deze runs kunnen worden aangepast afhankelijk van het doel van het experiment en kunnen bij de meeste plantensoorten worden gebruikt. Het artikel geeft voorbeelden van transmissiegegevens van A. thaliana wildtype en verschillende mutanten en laat zien hoe de gegevens verder kunnen worden geanalyseerd.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Bladeren voorbereiden voor een run
- Plaats 8 A. thaliana planten 's nachts in het donker (> 6 uur werkt voor de meeste soorten) om ervoor te zorgen dat de chloroplasten in hun donkere positie komen. Alle replica's beginnen met vergelijkbare transmissiewaarden.
- U kunt ook 8 complete bladeren in een petrischaaltje doen met een vochtig filterpapier aan de onderkant, de petrischaal sluiten en inpakken met aluminiumfolie.
2. Testen of het transmissieapparaat werkt
- Sluit het transmissieapparaat aan op een stabiele voedingsbron en druk op de aan/uit-schakelaar (AAN/UIT-knop) van het apparaat om het instrument te resetten (figuur 1A,B).
- Sluit de iPad aan op een stabiele voedingsbron, druk op de knop Home Screen om het scherm te activeren en voer de toegangscode in om in te loggen.
- Druk op het pictogram Instellingen , druk op het pictogram Beeldscherm en helderheid , druk op Automatisch vergrendelen en selecteer Nooit door op deze optie te drukken om ervoor te zorgen dat het scherm permanent ingeschakeld blijft. Anders stopt het programma met werken wanneer het scherm in de slaapstand gaat. Druk op de knop Beginscherm om terug te keren naar het hoofdscherm.
- Druk dubbel op de knop Startscherm om te zien welke toepassingen zijn geopend en sluit ze allemaal door ze naar de bovenkant van het scherm te vegen. Druk op de knop Beginscherm om terug te keren naar het hoofdscherm.
- Zoek de LeafSensor-app op het hoofdscherm of door naar links of rechts te vegen. Druk op het pictogram van de app om deze te openen (zie Aanvullend bestand). Er verschijnt een groen scherm met tekst en witte velden om de informatie in te voeren.
- Zorg ervoor dat het woord Verbonden in het onderste deel van het scherm wordt weergegeven, omdat dit aangeeft dat de app communiceert met het transmissieapparaat. Als het bericht 'Adafruit NOT Found' verschijnt, controleert u of het apparaat is aangesloten en drukt u nogmaals op de startknop op het apparaat.
- Vul de eerste 4 velden op de app-pagina in om het experiment een naam te geven en de voorwaarden in te stellen voor een korte testrun zonder bladeren en met de bladclips geopend:
- Geef het experiment een naam (gebruik 8 of minder hoofdletters of cijfers) bijvoorbeeld door TEST te typen in het veld Expt Name.
- Kies hoeveel verschillende blauwlichtintensiteiten in het experiment worden gebruikt, bijvoorbeeld door 3 in het veld met de naam # Lichtintensiteiten te typen.
- Kies de blauwlichtintensiteiten voor deze run (kies een geheel getal tussen 0 en 3000 en scheid elk getal van het volgende met een komma; zie Aanvullend bestand over het converteren van deze getallen naar werkelijke blauwlichtintensiteiten van LED's), bijvoorbeeld door 0,100,1000 te typen in het veld met de naam Blue Intensities.
- Kies de tijdsduur dat elke blauwe lichtintensiteit op het blad zal schijnen (scheid elk nummer van het volgende met een komma), bijvoorbeeld door 2,2,2 te typen in het veld met de naam Blauwe duur (minuten).
- Druk op Experiment starten in het middelste gedeelte van het scherm. In het onderste gedeelte van het scherm verschijnen 8 koppeltekens en het bericht Experiment starten .
- Zorg ervoor dat er de eerste twee minuten geen licht wordt uitgestraald door de LED's, dan wordt er zwak blauw licht uitgestraald en na 2 minuten neemt de intensiteit van het blauwe licht toe.
- Zorg ervoor dat er één keer per minuut intens rood licht wordt uitgestraald door de LED's voor de metingen.
OPMERKING: Terwijl het experiment wordt uitgevoerd, verschijnen er nummers op de app-pagina voor elk van de acht sensoren en worden de gegevens eenmaal per minuut bijgewerkt. Zorg ervoor dat de uitvoernummers van de fotodiodes rond de 1000-1023 liggen (als de kamer donker is). Een update linksonder laat zien hoeveel metingen er tot nu toe zijn gedaan, bijvoorbeeld 1 van de 6 metingen gedaan (één meting per minuut). - Wanneer het experiment is voltooid, controleert u of het experiment is voltooid linksonder op de app-pagina. Nu is het instrument klaar voor een run met bladeren.
- Druk tweemaal op de knop Startscherm, veeg uit de app en open deze opnieuw. Druk op de AAN/UIT-knop op het instrument om het te resetten.
3. Bladeren in de bladclips plaatsen
OPMERKING: Deze stap moet in het donker worden uitgevoerd met een groene lichtbron (plaats bijvoorbeeld een groen filter voor een gloeilamp) om te voorkomen dat chloroplastbewegingen worden veroorzaakt. U kunt ook zeer weinig wit licht en een langere donkere periode in de bladclips gebruiken. Vergeet niet dat een deel van de bladclip de LED vasthoudt (grotere opening), terwijl het andere deel de fototransistor vasthoudt (figuur 1C).
- Als de planten in hun geheel donker zijn, pluk dan 8 bladeren die breed genoeg zijn om de LED's te bedekken. Haal anders de blaadjes uit de petrischaal. Bereid 8 stroken filterpapier voor over de lengte van een bladclip en met een gat aan de bovenkant om de LED niet te bedekken.
- Bevochtig het filtreerpapier en plaats het op het bladclipgedeelte dat de LED vasthoudt. Herhaal dit voor elk van de acht bladclips.
- Plaats elk blad op de bovenkant van het natte filterpapier van de bladclip. Zorg ervoor dat de juiste bladzijde naar de LED is gericht (meestal wordt geëxperimenteerd met het adaxiale bladoppervlak dat naar de LED is gericht).
- Plaats de middenribs van het blad niet op de LED's en plaats voor consistentere resultaten vergelijkbare delen van elk blad (bijvoorbeeld het breedste deel van het blad) over de LED.
- Plaats het andere bladclipgedeelte met de fototransistor erop. Gebruik indien nodig een elastiekje om de twee bladclipdelen bij elkaar te houden (figuur 1C,D).
- Plaats elke bladclip in zijn 'boot' en vul de reservoirs met water met behulp van een pipet. Zorg ervoor dat het blad of ten minste het filtreerpapier het water raakt om uitdroging van de bladeren tijdens het hardlopen te voorkomen (figuur 1D).
4. Een run uitvoeren
OPMERKING: Voor een standaard verkennende run, begin met 4 uur duisternis (0 μmol foton m-2 s-1), gevolgd door 7 uur laag blauw licht (2 μmol foton m-2 s-1), gevolgd door 60 min elk van 5, 10, 30, 40, 50, 60, 90, 100 μmol foton m-2 s-1 blauw licht. Dit zal de bladeren ertoe aanzetten hun donkere transmissie te vertonen, chloroplastbeweging induceren in de maximale accumulatie en verschillende gradaties van vermijdingsrespons vertonen.
- Stel de LeafSensor-app in op de iPad met behulp van de onderstaande stappen.
- Typ EXPLORA1 in het veld Expt-naam.
- Typ 10 in het veld met de naam # Lichtintensiteiten.
- Typ 0,1,60,160,550,750,950,1150,1350,1950 in het veld met de naam Blue intensities.
- Typ 240,420,60,60,60,60,60,60,60,60 in het veld Met de naam Blauwe duur.
- Druk op Experiment starten. Na de eerste minuut verschijnen de uitvoerwaarden (meestal tussen 990 en 820) op het scherm. Als de waarden ver weg zijn, controleer dan of de bladeren correct in de bladclips zijn geplaatst.
- Wanneer het uitvoeren is voltooid, controleert u of het bericht Experiment voltooid linksonder in het scherm wordt weergegeven. Gegevens worden automatisch opgeslagen.
- Zet het scherm rechtop (niet horizontaal). Er verschijnen twee nieuwe opties op het scherm, namelijk Opslaan en Hulpprogramma's.
- Druk op Hulpprogramma's en er verschijnt een lijst met opgeslagen bestanden. Selecteer het gewenste bestand, in dit geval EXPLORA1.
- Zoek onder de lijst met bestanden naar Selected Expt: EXPLORA1. Druk op E-mail, voer een e-mailadres in en het gegevensbestand wordt automatisch aan het bericht toegevoegd. Druk op Verzenden.
OPMERKING: Als er een lange vertraging is totdat de bestanden aankomen, start u de app opnieuw op en verzendt u het bestand opnieuw.
- Als een uitvoering is afgebroken, maar de gegevens tot dat moment interessant zijn, drukt u op Opslaan voordat u Hulpprogramma's selecteert. Ruim na verschillende runs de geheugenruimte op: Druk op Hulpprogramma's, selecteer één bestand tegelijk, veeg naar links naast bestand en druk op Delete om het bestand te verwijderen.
- Druk op Terug om een ander experiment uit te voeren of druk, als u klaar bent, op de knop Startscherm, veeg naar het hoofdscherm, druk op Instellingen, druk op Beeldscherm en helderheid, druk op Auto-Lock en druk op 2 Minutes.
5. Data-analyse
- Download het bestand EXPLORA1 vanuit de e-mail, voeg bestandsextensie .csv toe aan het bestand, dubbelklik op het bestand. Gegevens worden gesorteerd in een spreadsheet met de gegevens voor de acht verschillende sensoren gesorteerd in afzonderlijke kolommen. De laatste kolom toont het tijdstip (in seconden) waarop de gegevens zijn verzameld. Verwijder de eerste rij onder de kopjes (Sensor1-8) als deze onzinnige gegevens bevat.
- Stel een stamgegevensblad in dat de resultaten voor elke sensor in een afzonderlijk blad bevat en dat de uitgangswaarden omzet in % transmissiewaarden met behulp van de vergelijkingen die zijn verkregen uit de kalibratie van elke bladclip en sensor (zie Aanvullend bestand).
- Kopieer elke gegevensset naar een afzonderlijk gegevensblad (kolom A bevat bijvoorbeeld de tijd; kolom C bevat de gegevens van Sensor1).
- Stel kolom B zo in dat deze de tijd converteert van seconden naar minuten. Stel kolom D zo in dat deze de formule bevat om spanning om te zetten in % transmissie met behulp van de vergelijking uit de kalibratie.
- Stel voor elke sensor een soortgelijk gegevensblad in en onthoud dat de formule die wordt gebruikt om de spanningsuitgang om te zetten in % transmissiewaarden voor elke sensor anders kan zijn.
- Plot % transmissie (T) tegen de tijd, min (figuur 2).
- Sla het gegevensblad op onder een nieuwe naam, zodat het stamgegevensblad opnieuw kan worden gebruikt.
- Om gegevens verder te analyseren (figuur 2), berekent u ΔT (%) accumulatie (bijv. Verandering van T bij maximale accumulatie in vergelijking met T in het donker), ΔT (%) vermijding (bijv. Verandering van T bij maximale vermijding in vergelijking met T bij donkere), of dT /dt (% / h) (bijv. Verandering in T tijdens het snelste deel van de accumulatie- of vermijdingsreactie). Voor meer details zie 8.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
De verschillende onderdelen van het transmissieapparaat zijn weergegeven in figuur 1. De microcontroller is de besturingseenheid van het apparaat en regelt de lichtomstandigheden die de bladeren, beveiligd in zwarte bladclips, ervaren en slaat de lichttransmissiegegevens op die het ontvangt (figuur 1A, B). Een close-up van de besturingseenheid van het instrument toont de AAN / UIT-knop, de SD-kaart voor gegevensopslagcapaciteit, het Bluetooth-schild (dat de gegevens naar de LeafSensor-app stuurt) en de kabels die verbinding maken met de LED's (Light Emitting Diodes) en fototransistors. De microcontroller bevindt zich aan de basis van het instrument en alleen de randen zijn zichtbaar in de afbeelding (figuur 1B). 3D-geprinte, zwarte bladclips houden de bladeren, LED's en fototransistors op hun plaats. Een nat filterpapier wordt op het bladclipsgedeelte met de LED geplaatst, zodat de LED onbelemmerd is en een donker aangepast blad wordt gepositioneerd met het adaxiale bladoppervlak naar de LED gericht. Het schema laat zien dat de LED en fototransistor aan de tegenovergestelde zijden van het blad zijn geplaatst. De LED kan blauw of rood licht uitstralen. Het blauwe licht wordt gebruikt om chloroplastbewegingen op te wekken en wordt elke minuut gedurende een korte periode uitgeschakeld waarin het rode meetlicht op het blad schijnt. De fototransistor, geplaatst aan de andere kant van het blad, detecteert hoeveel rood licht door het blad wordt doorgelaten en stuurt de gegevens naar de microcontroller en SD-kaart (figuur 1C). De twee delen van de bladclip worden geassembleerd en in een 3D-geprinte 'boot' geplaatst die gevuld is met water en helpt het blad vochtig te houden tijdens het experiment (figuur 1D).
Figuur 2 toont een typische dataset waarin de % transmissiegegevens worden uitgezet tegen de tijd (min). Deze specifieke transmissierun omvatte 1 uur duisternis, gevolgd door 3 uur laag blauw licht (2 μmol foton m-2 s-1) en 1 uur elk van intermediaire (30 μmol foton m-2 s-1) en hoog blauw licht (100 μmol foton m-2 s-1) intensiteiten. De gegevens tonen aan dat de transmissie in A. thaliana afneemt bij lage lichtintensiteiten (accumulatierespons), terwijl een vermijdingsrespons wordt geïnduceerd wanneer de lichtintensiteiten verder toenemen. Dit is geen alles of niets reactie en de mate van veranderingen ten opzichte van de donkere waarden is afhankelijk van de exacte intensiteiten van het blauwe licht. Deze procentuele veranderingen in transmissie (ΔT) kunnen worden berekend met behulp van de formules die onder de gegevens worden weergegeven. Bovendien kan de snelheid van transmissieveranderingen (dT/dt) tijdens de initiële veranderingen in transmissie wanneer een accumulatie- of vermijdingsreactie wordt geactiveerd, worden berekend met behulp van de helling van de curve.
De gemiddelde % transmissiewaarden van het wilde type (WT) (figuur 3A), alsmede van phot 1 en phot 2 mutant A. thaliana bladeren (figuur 3B) gedurende 19 uur lange runs worden weergegeven. Dergelijke uitgebreide, verkennende transmissieruns zijn nuttig om vast te stellen welke blauwlichtintensiteiten in toekomstige runs moeten worden gebruikt. De bladeren werden voor het eerst blootgesteld aan 4 uur duisternis en consistente transmissiewaarden geven aan dat de bladeren volledig donker-aangepast waren, wat de gegevens tussen replica's consistenter zal maken. Gedurende de volgende 7 uur werden de bladeren blootgesteld aan weinig blauw licht (2 μmol foton m-2 s-1). In WT en phot 2 wordt de aanvankelijke snelle afname van de transmissie gevolgd door een langzame afname die aangeeft dat de chloroplasten zich in de accumulatierespons begaven. Afhankelijk van de gebruikte soort kan het verschillende hoeveelheden tijd kosten om een zo laag mogelijke overdracht te verkrijgen. In veel gevallen is een onderzoeker alleen geïnteresseerd in het vergelijken van verschillende mutanten op een bepaald tijdstip, dus de blootstelling aan zeer weinig licht kan beperkt zijn tot een uur. In vergelijking met WT vertoont phot 1 een verminderde accumulatierespons. De uitgebreide blootstelling aan weinig blauw licht wordt elk uur gevolgd door een stapsgewijze toename van de intensiteiten van blauw licht (5, 10, 30, 40, 50, 60, 90, 100 μmol foton m-2 s-1). Het % transmissie in A. thaliana WT en phot 1 neemt toe met elke toename van de lichtintensiteit, wat aantoont dat de chloroplasten in de vermijdingsrespons bewegen, maar dit wordt niet gezien bij phot 2. De mate van verandering in transmissie ten opzichte van de donkere waarde (ΔT) is afhankelijk van de exacte intensiteiten van het blauw licht en kan verschillen afhankelijk van het genotype (figuur 3C). Een voorbeeld wordt getoond van de snelheid van transmissieveranderingen (dT/dt) tijdens de initiële reacties in transmissie wanneer vermijding wordt geactiveerd als de blauwe intensiteit wordt verhoogd van 5 tot 10 μmol foton m-2 s-1 (figuur 3D). De snelheid is hetzelfde voor WT en phot 1, terwijl het erg traag is voor phot 2 mutanten.
Figuur 1: Overzicht van het transmissieapparaat. Afbeelding van het zelfgebouwde transmissieapparaat met de besturingseenheid in de zwarte doos rechtsonder en de bladclips bovenaan en linksonder (A). Close-up van de besturingseenheid met de AAN/UIT-knop, de SD-kaart voor gegevensopslag en het Bluetooth-schild voor draadloze communicatie. Kabels verbinden de besturingseenheid met de Light Emitting Diodes (LED's) en fototransistors. De microcontroller bevindt zich aan de basis van het instrument en alleen de randen zijn zichtbaar in deze afbeelding (B). De 3D-geprinte zwarte bladclips: links wordt het bladclipgedeelte met de LED weergegeven, rechts het bladclipgedeelte met de fototransistor. Om een run op te zetten, wordt een vochtig filterpapier (met een gat ter grootte van de LED) op de clip geplaatst zonder de LED te verduisteren. Vervolgens wordt het blad in de clip geplaatst die de LED bedekt. Het schema laat zien dat de LED en de fototransistor (PT) zich tegenover elkaar bevinden, dicht bij het blad, wanneer de twee delen van elke bladclip zijn geassembleerd (C). Bladclips worden geplaatst in 3D-geprinte 'boten' die gevuld zijn met water, waardoor de bladeren en het filterpapier gehydrateerd blijven (D). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Transmissiegegevens van een typisch A. thaliana blad. Transmissie (T) gegevens voor een A. thaliana blad dat werd blootgesteld aan donker gedurende 1 uur, gevolgd door 3 uur weinig licht (2 μmol foton m-2 s-1), gevolgd door 1 uur elk van intermediair (30 μmol foton m-2 s-1) en hoog blauw licht (100 μmol foton m-2 s-1). Lage lichtintensiteiten veroorzaakten de accumulatierespons, terwijl hogere lichtintensiteiten verschillende gradaties van een vermijdingsreactie veroorzaakten. De T-niveaus in het donker dienen als de basislijn (blauwe lijn). De % veranderingen in T ten opzichte van de donkere niveaus (ΔT) bijvoorbeeld bij maximale accumulatie of verschillende niveaus van vermijding (verschillen met donkere T worden aangegeven door de blauwe pijlen) kunnen worden berekend. Bovendien kan de snelheid waarmee T verandert (dT/dt) bijvoorbeeld tijdens de beginfase van de vermijdingsrespons worden berekend uit de helling van T die tegen de tijd is uitgezet (aangegeven door de blauwe driehoek). De vergelijkingen staan onder de grafiek. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: Chloroplast beweging bij wildtype en mutant A. thaliana bladeren. Donkere aangepaste, volwassen bladeren werden gedurende 4 uur blootgesteld aan donker, gevolgd door een blootstelling van 7 uur aan 2 μmol foton m-2 s-1, gevolgd door een stapsgewijze toename van de intensiteit van blauw licht elk uur (5, 10, 30, 40, 50, 60, 90, 100 μmol foton m-2 s-1). Gemiddelde % Transmissie (T) waarden (n = 20) van WT (A) en phot 1 en phot 2 bladeren (B). Verandering in % T ten opzichte van de donkere waarden: negatieve waarden geven aan dat de bladeren een accumulatierespons vertoonden, terwijl positieve waarden een vermijdingsreactie aangeven. De getallen aan de rechterkant geven de intensiteit van het blauwe licht aan waarbij de ΔT-gegevens zijn berekend. Het kleurenschema is hetzelfde als in de rest van de figuur (C). De dT/dt-gegevens werden berekend als bladeren reageerden op een toename van de intensiteit van blauw licht van 5 tot 10 μmol foton m-2 s-1 en geven de snelheid aan waarmee % T per uur veranderde (D). Gegevens voor A en B zijn gemiddelden, voor C en D betekent ± SD (n = 20). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Aanvullend dossier. Klik hier om dit bestand te downloaden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Het apparaat is uiterst eenvoudig te gebruiken, maar het is van cruciaal belang om elke bladclipopstelling van het transmissieapparaat onafhankelijk te kalibreren, omdat de positionering van de LED's en fototransistors enigszins kan variëren van bladclip tot bladclip. Zorg ervoor dat de LED's en fototransistors stabiel zijn geplaatst en controleer de kalibratie opnieuw als de gegevens niet lijken te kloppen. Voorkom dat er water op het apparaat komt. De bladeren in de bladclips worden in 'boten' gevuld met water geplaatst om waterstress te voorkomen. Plaats deze boten bijvoorbeeld in een laag omrande plastic container gescheiden van de besturingseenheid en stoot ze NIET omver. Koppel de kabelverbindingen niet los en buig ze niet. Wees voorzichtig bij het inbrengen van bladeren in de bladclips en vermijd te veel trekken of buigen van de kabels.
Het is belangrijk om de bladeren lang genoeg aan te passen om ervoor te zorgen dat de initiële transmissiewaarden de donkere positie vertegenwoordigen. Controleer of de waarden tijdens de donkere periode in het apparaat ten minste 30 minuten stabiel zijn geweest voordat u blauw licht op de bladeren schijnt. Als dat niet het geval is, pas de bladeren dan voor een langere periode aan voor de volgende run of verleng de donkere periode in het transmissieapparaat om te controleren hoe lang het duurt voordat de bladeren een stabiele toestand bereiken. Doorgaans worden de transmissiegegevens gepresenteerd als % verandering in transmissie bij een bepaalde blauwlichtintensiteit ten opzichte van de donkere waarde (ΔT). Daarom is het cruciaal om de juiste basiswaarden te verkrijgen.
De verkennende run kan worden gebruikt voor elke A. thaliana-mutant (inclusief mutanten waarvan bekend is dat ze andere aspecten van de fysiologie van een plant beïnvloeden, bijvoorbeeld fotosynthese, myosine of niet-gekarakteriseerde mutanten) of verschillende soorten, zolang het bladoppervlak groot genoeg is om de LED in de bladclip te bedekken en de bladeren niet te dik zijn. Het programma kan eenvoudig worden aangepast om aan alle behoeften van een onderzoeker te voldoen, bijvoorbeeld, de intensiteiten van het blauw licht kunnen worden gewijzigd binnen de bereiken waarvan is aangetoond dat ze chloroplastbewegingen uitlokken (de reactie verzadigt ongeveer 100 μmol foton m-2 s-1), de belichtingstijden kunnen worden gewijzigd, het aantal opeenvolgende lichtomstandigheden kan worden gewijzigd. Bovendien kunnen bladeren worden voorbehandeld voordat ze in het apparaat worden uitgevoerd, bijvoorbeeld met remmers van actinepolymerisatie of signaleringsroutecomponenten, wat belangrijk is voor onderzoekers die de lege plekken in de signaleringsroute willen invullen die de chloroplastbeweging reguleren.
Zoals elke methode heeft ook deze zijn beperkingen en nadelen. De procedure is gebaseerd op veranderingen in de optische eigenschappen van bladeren, namelijk hoeveel licht wordt doorgelaten. Daarom werkt het het beste met relatief dunne bladeren, terwijl dikke bladeren vaak niet voldoende transmissie van rood licht mogelijk maken om buiten het geluidsniveau te worden gedetecteerd. Het zou mogelijk zijn om het transmissieapparaat aan te passen om de roodlichtintensiteit die op het blad schijnt te verhogen en de gevoeligheid van de fototransistors te verhogen door de weerstanden te veranderen. Omdat de methode alleen een geïntegreerde maat biedt voor de bewegingen van chloroplast in alle cellen en cellagen, kan men enkele subtiele veranderingen missen, bijvoorbeeld chloroplasten die in tegengestelde richtingen bewegen, kunnen resulteren in geen netto verandering van transmissie. Vooral bij het werken met voorheen niet-gekarakteriseerde mutanten of soorten, is het belangrijk om de transmissieresultaten aan te vullen met afbeeldingen van chloroplastpositionering met behulp van microscopie. Langzame veranderingen in transmissie als reactie op veranderingen in blauwlichtintensiteit werden bijvoorbeeld waargenomen in een A. thaliana-mutant en kunnen te wijten zijn aan een reeks redenen. Microscopie onthulde dat cellen slechts twee chloroplasten hadden die veel groter waren dan normale chloroplasten. De mutant werd later bevestigd als de chloroplast divisie mutant arc6-125.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben geen belangenverstrengeling.
Acknowledgments
Financiering werd verstrekt door een Fiske Award en een Wellesley College Faculty Award.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Aluminum foil | |||
| Dark adapted leaves | |||
| Filter paper | |||
| iPad with LeafSensor app installed (see Supplemental Info) | |||
| Pipette | Any | ||
| Petri dish | Any | ||
| Transmission device (see Supplemental info) | |||
| Water |
References
- Senn, G. Die Gestalts- und Lageveränderung der Pflanzenchromatophoren. , Wilhelm Engelmann. Leipzig, Germany. (1908).
- Zurzycki, J. The influence of chloroplast displacements on the optical properties of leaves. Acta Societatis Botanicorum Poloniae. 30, 503-527 (1961).
- Wada, M., Kagawa, T., Sato, Y.
- Wada, M.
- Kasahara, M., Kagawa, T., Oikawa, K., Suetsugu, N., Miyao, M., Wada, M. Chloroplast avoidance movement reduces photodamage in plants. Nature. 420, 829-832 (2002).
- Davis, P. A., Hangarter, R. P. Chloroplast movement provides photoprotection to plants by redistributing PSII damage within leaves. Photosynthesis Research. 112, 153-161 (2012).
- Howard, M. M., Bae, A., Königer, M. The importance of chloroplast movement, nonphotochemical quenching, and electron transport rates in light acclimation and tolerance to high light in Arabidopsis thaliana. American Journal of Botany. 106 (11), 1-10 (2019).
- Gotoh, E., et al. Chloroplast accumulation response enhances leaf photosynthesis and plant biomass production. Plant Physiology. 178, 1358-1369 (2018).
- Howard, M. M., Bae, A., Pirani, Z., Van, N., Königer, M. Impairment of chloroplast movement reduces growth and delays reproduction of Arabidopsis thaliana in natural and controlled conditions. American Journal of Botany. 107 (9), 1309-1318 (2020).
- Trojan, A., Gabryś, H. Chloroplast distribution in Arabidopsis thaliana (L.) depends on light conditions during growth. Plant Physiology. 111, 419-425 (1996).
- Oikawa, K., et al. Chloroplast unusual positioning is essential for proper chloroplast positioning. The Plant Cell. 15, 2805-2815 (2003).
- Königer, M., Bollinger, N. Chloroplast movement behavior varies widely among species and does not correlate with high light stress tolerance. Planta. 236, 411-426 (2012).
- Kagawa, T., et al. Arabidopsis NPL1: a phototropin homolog controlling the chloroplast high-light avoidance response. Science. 291, 2138-2141 (2001).
- Berg, R., et al. A simple low-cost microcontroller-based photometric instrument for monitoring chloroplast movement. Photosynthesis Research. 87, 303-311 (2006).
- Johansson, H., Zeidler, M. Automatic chloroplast movement analysis. Molecular Biology. 1398, Springer. Germany. 29-35 (2016).
- Briggs, W. R., et al.
- Jarillo, J. A., et al. Phototropin-related NPL1 controls chloroplast relocation induced by blue light. Nature. 410, 952-954 (2001).
- Sakai, T. Arabidopsis nph1 and npl1: blue light receptors that mediate both phototropism and chloroplast relocation. Proceedings of the National Academy of Sciences, USA. 98 (12), 6969-6974 (2001).
- Wada, M., Kong, S. -G.
- Wen, F., Xing, D., Zhang, L. Hydrogen peroxide is involved in high blue light-induced chloroplast avoidance movements in Arabidopsis. Journal of Experimental Botany. 59 (10), 2891-2901 (2008).
- Tlalka, M., Fricker, M. The role of calcium in blue-light dependent chloroplast movement in Lemna trisulca L. The Plant Journal. 20, 461-473 (1999).
- Königer, M., Bollinger, N. Chloroplast movement behavior varies widely among species and does not correlate with high light stress tolerance. Planta. 236, 411-426 (2012).
- Higa, T., Wada, M. Chloroplast avoidance movement is not functional in plants grown under strong sunlight. Plant, Cell and Environment. 39, 871-882 (2016).
- Arduino. Arduino.cc. , Available from: https://www.arduino.cc (2021).
- Königer, M., Delamaide, J. A., Marlow, E. D., Harris, G. C. thaliana leaves with altered chloroplast numbers and chloroplast movement exhibit impaired adjustments to both low and high light. Journal of Experimental Botany. 59, 2285-2297 (2008).
