Summary
Mange plantearter ændrer placeringen af kloroplaster for at optimere lysabsorptionen. Denne protokol beskriver, hvordan man bruger et ligetil, hjemmebygget instrument til at undersøge chloroplast bevægelse i Arabidopsis thaliana blade ved hjælp af ændringer i transmissionen af lys gennem et blad som en proxy.
Abstract
Chloroplast bevægelse i blade har vist sig at hjælpe med at minimere fotoinhibition og øge væksten under visse betingelser. Meget kan læres om chloroplast bevægelse ved at studere chloroplast positionering i blade ved hjælp af f.eks konfokal fluorescens mikroskopi, men adgangen til denne type mikroskopi er begrænset. I denne protokol beskrives en metode, der bruger ændringerne i bladtransmissionen som proxy for chloroplastbevægelse. Hvis kloroplaster spredes ud for at maksimere lys aflytning, vil transmissionen være lav. Hvis kloroplaster bevæger sig mod anticlinal cellevægge for at undgå lys, vil transmissionen være højere. Denne protokol beskriver, hvordan du bruger et ligetil, hjemmebygget instrument til at udsætte blade for forskellige blå lysintensiteter og kvantificere de dynamiske ændringer i bladtransmission. Denne tilgang gør det muligt for forskere kvantitativt at beskrive chloroplastbevægelser i forskellige arter og mutanter, studere virkningerne af kemikalier og miljøfaktorer på den eller screene for nye mutanter, f.eks. for at identificere manglende komponenter i processen, der fører fra lysopfattelse til bevægelse af chloroplaster.
Introduction
Lys er afgørende for fotosyntese, plantevækst og udvikling. Det er en af de mest dynamiske abiotiske faktorer, da lysintensiteter ikke kun ændrer sig i løbet af en sæson eller dag, men også hurtigt og på uforudsigelige måder afhængigt af skydækket. På bladniveau påvirkes lysintensiteterne også af tætheden og arten af den omgivende vegetation og plantens egen baldakin. En vigtig mekanisme, der gør det muligt for planter at optimere lys aflytning under variable lysforhold er kloroplasternes evne til at bevæge sig som reaktion på blåt lys stimuli1,2. Under svagt lys spredes kloroplaster vinkelret på lyset (langs de vinkelrette cellevægge) i en såkaldt akkumuleringsrespons, hvilket maksimerer lysaflytning og dermed fotosyntese. Under høje lysforhold bevæger kloroplaster sig mod anticlinalcellevæggen i et såkaldt undgåelsesrespons, hvilket minimerer lysaflytning og faren for fotoinhibition. I mange arter antager kloroplaster også en bestemt mørk position, som adskiller sig fra akkumulerings- og undgåelsespositionerne og ofte mellemled mellem disse to3,4. Forskellige undersøgelser har vist, at chloroplast bevægelse er ikke kun vigtigt for den kortsigtede stress tolerance af blade5,6,7, men også for vækst og reproduktiv succes af planter, især under variable lysforhold8,9.
Chloroplast bevægelse er let observeret i realtid i visse levende prøver (f.eks alger eller tyndtbladede planter som Elodea) ved hjælp af lys mikroskopi1. Undersøgelse af chloroplast bevægelse i de fleste blade, dog kræver en forbehandling for at fremkalde chloroplast bevægelse, kemisk fiksering, og forberedelse af tværsnit, før du ser prøverne under et lysmikroskop10. Med indførelsen af konfokal lasermikroskopi blev det også muligt at afbilde 3D-arrangementet af kloroplaster i intakte eller faste blade4,11,12. Disse billeddannelsesteknikker hjælper i høj grad forståelsen af chloroplastbevægelser ved at give vigtige kvalitative oplysninger. Kvantificering af chloroplastpositionering (f.eks. i procent af chloroplaster i periclinale eller anticlinale positioner på disse billeder eller procentdelen af området dækket af chloroplast pr. samlet celleoverflade) er også mulig, men ganske tidskrævende, især hvis den udføres med de intervaller, der er nødvendige for at opfange hurtige ændringer i positionering10,8 . Den enkleste måde at vise, om mørktilpassede blade af en bestemt art eller mutanter er i stand til chloroplast bevægelse i undgåelse svar er ved at dække det meste af området af et blad for at holde chloroplasts i mørke og samtidig udsætte en strimmel af bladet til højt lys. Efter mindst 20 min høj lyseksponering vil kloroplasterne i det udsatte område være flyttet ind i undgåelsespositionen, og den udsatte strimmel vil være synligt lysere i farven end resten af bladet. Dette gælder for vilde type A. thaliana, men ikke for nogle af de chloroplast bevægelse mutanter beskrevet mere detaljeret senere13. Denne metode og modifikationer af det (f.eks vende, hvilke dele af bladet er udsat, skiftende lysintensiteter) er nyttige til screening af et stort antal mutanter og til at identificere null mutanter, der mangler enten evnen til at udvise en undgåelse eller akkumulering svar eller begge dele. Det giver dog ikke oplysninger om de dynamiske ændringer i chloroplast bevægelse.
I modsætning hertil giver den metode, der er beskrevet her, mulighed for kvantificering af chloroplastbevægelser i intakte blade ved hjælp af ændringer i lystransmission gennem et blad som proxy for samlet chloroplastbevægelse: under forhold, hvor kloroplaster spredes ud i mesophyllcellerne i akkumuleringsresponset, overføres der mindre lys gennem bladet, end når mange kloroplaster er i undgåelsesrespons, positionering sig langs anticlinal celle vægge. Derfor kan ændringer i transmission bruges som proxy for den samlede chloroplast bevægelse i blade14. Detaljerne i instrumentet er beskrevet andetsteds (se supplerende fil), men dybest set, instrumentet bruger blåt lys til at udløse chloroplast bevægelse og måler, hvor meget rødt lys overføres gennem dette blad med faste intervaller. For nylig er en ændring af dette system blevet beskrevet, som bruger en modificeret 96-brønd mikropladelæser, en blå LED, en computer og en temperaturstyret inkubator15.
Muligheden for at anvende en kombination af metoder, herunder optisk vurdering af blade til screening, efterfulgt af måling af dynamiske ændringer i transmission og brug af mikroskopi, har i høj grad hjulpet vores forståelse af både de underliggende mekanismer og den fysiologiske / økologiske betydning af chloroplast bevægelse. For eksempel førte det til opdagelse og karakterisering af forskellige mutanter, som er nedsat i specifikke aspekter af deres bevægelser. For eksempel mangler A. thaliana phot 1 mutanter evnen til at akkumulere deres kloroplaster i svagt lys, mens phot 2 mutanter mangler evnen til at udføre en undgåelsesreaktion. Disse fænotyper skyldes en svækkelse i to respektive blå lys receptorer16,17,18. I modsætning hertil mangler chup1 mutanter evnen til at danne ordentlige aktinstråde omkring kloroplasterne, som er afgørende for at flytte kloroplasterne i den ønskede position i en celle11,19. Ud over mutante undersøgelser har forskere vurderet forskellige hæmmeres virkninger på kloroplastbevægelser for at belyse de mekanistiske aspekter af processen. For eksempel blev kemikalier som H2O2 og forskellige antioxidanter brugt til at undersøge virkningerne af dette signalmolekyle på chloroplast bevægelse20. Forskellige hæmmere blev brugt til at belyse calciums rolle i chloroplast bevægelse21. Ud over at hjælpe med at afdække mekanismerne i chloroplast bevægelse, kan disse metoder bruges til at sammenligne chloroplast bevægelse i forskellige arter eller mutanter dyrket under forskellige forhold i et forsøg på at forstå den økologiske og evolutionære sammenhæng af denne adfærd. For eksempel har det vist sig, at omfanget af virkningerne af forskellige mutationer i chloroplast bevægelsesvejen er afhængig af vækstbetingelserne7,9, og at soltilpassede planter ikke synes at flytte deres kloroplaster meget. I modsætning hertil er bevægelse meget vigtigt for skyggeplanter10,22,23.
Denne metode papir, fokuseret på model anlægget A. thaliana, beskriver, hvordan man bruger en transmissionsanordning, som er en opdateret version af en tidligere udviklet instrument9. Mens dette instrument ikke er kommercielt tilgængeligt, vil folk med en grundlæggende forståelse af elektronik eller hjælp fra ingeniør- eller fysikkolleger og studerende være i stand til at bygge instrumentet ved hjælp af overkommelige dele og følge de detaljerede instruktioner (se supplerende fil). Open source-platformen, der bruges til at opbygge instrumentet, har omfattende websupport og et fællesskabsforum, der tilbyder hjælp, hvis der opstår problemer24.
Protokollen fokuserer på, hvordan man bruger instrumentet til at bestemme ændringer i bladtransmission i en standard sonderende køre, der udsætter et blad til en bred vifte af lysforhold og indfanger den mørke, ophobning, og undgåelse reaktioner A. thaliana. Disse kørsler kan ændres afhængigt af eksperimentets mål og kan bruges med de fleste plantearter. Papiret giver eksempler på transmissionsdata af A. thaliana wildtype og flere mutanter og viser, hvordan man yderligere analyserer dataene.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Forberedelse blade til en løbetur
- Placer 8 A. thaliana planter i mørke natten over (> 6 h virker for de fleste arter) for at sikre, at kloroplasterne bevæger sig ind i deres mørke position. Alle replikaer starter med sammenlignelige transmissionsværdier.
- Alternativt kan du placere 8 komplette blade i en petriskål med et fugtigt filterpapir i bunden, lukke petriskålen og pakke den ind med aluminiumsfolie.
2. Test af, om transmissionsanordningen virker
- Tilslut transmissionsenheden til en stabil strømkilde, og tryk på enhedens tænd/sluk-knap (TÆND/SLUK-knap) for at nulstille instrumentet (Figur 1A,B).
- Tilslut iPad'en til en stabil strømkilde, tryk på knappen Startskærm for at aktivere skærmen, og indtast adgangskoden for at logge ind.
- Tryk på ikonet Indstillinger , tryk på ikonet Skærm og lysstyrke , tryk på Automatisk lås, og vælg Aldrig ved at trykke på denne indstilling for at sikre, at skærmen forbliver tændt permanent. Ellers stopper programmet med at køre, når skærmen går på gående. Tryk på knappen Startskærm for at vende tilbage til hovedskærmen.
- Dobbelttryk på knappen Startskærm for at se, hvilke programmer der er åbne, og luk dem alle ved at stryge dem mod toppen af skærmen. Tryk på knappen Startskærm for at vende tilbage til hovedskærmen.
- Find LeafSensor-appen på hovedskærmen eller ved at stryge til venstre eller højre. Tryk på ikonet for appen for at åbne den (se Supplerende fil). Der vises en grøn skærm med tekst og hvide felter for at indtaste oplysningerne.
- Sørg for, at ordet Tilsluttet ses i den nederste del af skærmen, da det indikerer, at appen kommunikerer med transmissionsenheden. Hvis meddelelsen 'Adafruit NOT Found' vises, skal du kontrollere, at enheden er tilsluttet, og trykke på startknappen på enheden igen.
- Udfyld de første 4 felter på appsiden for at navngive eksperimentet og for at angive betingelserne for en kort testkørsel uden blade og med bladklippene åbne:
- Navngiv eksperimentet (brug 8 eller færre store bogstaver eller tal), f.eks.
- Vælg, hvor mange forskellige blå lysintensiteter der skal bruges i eksperimentet, f.eks. ved at skrive 3 i feltet # Lysintensiteter.
- Vælg intensiteterne for blåt lys for denne kørsel (vælg et heltal mellem 0 og 3000, og adskil hvert tal fra det næste med et komma, se Supplerende fil om, hvordan du konverterer disse tal til faktiske blå lysintensiteter af LED'er), f.eks .
- Vælg den tid, hver blå lysintensitet vil skinne på bladet (adskil hvert tal fra det næste med et komma) f.eks. ved at skrive 2,2,2 i feltet Med navnet Blå varighed (minutter).
- Tryk på Start eksperiment i den midterste del af skærmen. I den nederste del af skærmen vises 8 bindestreger, og meddelelsen Starteksperiment vises.
- Sørg for, at der ikke udsendes lys fra LED'erne i de første to minutter, så udsendes svagt blåt lys, og efter 2 min øges intensiteten af blåt lys.
- Sørg for, at der udsendes intenst rødt lys fra LED'erne en gang i minuttet til målingerne.
BEMÆRK: Når eksperimentet kører, vises tal på appsiden for hver af de otte sensorer, og data opdateres en gang om minuttet. Sørg for, at outputnumrene fra fotodioderne er omkring 1000-1023 (hvis rummet er mørkt). En opdatering nederst til venstre viser, hvor mange målinger der er foretaget indtil videre, f.eks . Udført 1 af 6 målinger (en måling hvert minut). - Når eksperimentet er udført, skal du kontrollere, om eksperimentet er færdigt nederst til venstre på appsiden. Nu er instrumentet klar til en løbetur med blade.
- Tryk to gange på knappen Startskærm, stryg ud af appen, og åbn den igen. Tryk på til/FRA-knappen på instrumentet for at nulstille den.
3. Opsætning af blade i bladclipsene
BEMÆRK: Dette trin skal udføres i mørke med en grøn lyskilde (f.eks. placere et grønt filter foran en pære) for at undgå at fremkalde chloroplastbevægelse. Alternativt kan du bruge meget lavt hvidt lys og en længere mørk periode i bladclipsene. Husk, at den ene del af bladclipsen holder LED'en (større åbning), mens den anden holder fototransistoren (Figur 1C).
- Hvis planterne er mørktilpassede hele, skal du vælge 8 blade, der er brede nok til at dække LED'erne. Ellers skal du fjerne bladene fra petriskålen. Forbered 8 strimler af filterpapir om længden af et bladclips og med et hul slået ud øverst for ikke at dække LED'en.
- Fugt filterpapiret, og læg det på den bladclipsdel, der holder LED'en. Gentag dette for hvert af de otte bladclips.
- Placer hvert blad på toppen af det våde filterpapir på dets bladclips. Sørg for, at den korrekte bladside vender mod LED'en (normalt udføres eksperimenter med adaxialbladoverfladen mod LED'en).
- Undgå at placere bladets mellemribs oven på led'erne, og placer lignende dele af hvert blad (f.eks. den bredeste del af bladet) over LED'en for at opnå mere ensartede resultater.
- Placer den anden bladklipsdel med fototransistoren øverst. Brug en elastik til at holde de to bladclipsdele sammen, hvis det er nødvendigt (Figur 1C, D).
- Placer hvert bladclips i sin 'båd' og fyld reservoirerne med vand ved hjælp af en pipette. Sørg for, at bladet eller i det mindste filterpapiret rører vandet for at undgå dehydrering af bladene under kørslen (Figur 1D).
4. Gennemførelse af en løbetur
BEMÆRK: For en standard sonderende køre, start ud med 4 timers mørke (0 μmol photon m-2 s-1), efterfulgt af 7 timers lavt blåt lys (2 μmol photon m-2 s-1), efterfulgt af 60 min hver af 5, 10, 30, 40, 50, 60, 90, 100 μmol foton m-2 s-1 af blåt lys. Dette vil få bladene til at udstille deres mørke transmission, fremkalde chloroplast bevægelse i den maksimale ophobning, og vise forskellige grader af undgåelse svar.
- Konfigurer LeafSensor-appen på iPad'en ved hjælp af nedenstående trin.
- Skriv EXPLORA1 i feltet Med navnet Udst.navn.
- Skriv 10 i feltet #Lysintensiteter.
- Skriv 0,1,60,160,550,750,950,1150,1350,1950 , i feltet Blå intensiteter.
- Skriv 240.420.60.60.60.60.60,60,60,60,60 i feltet Blå varighed.
- Tryk på Starteksperiment. Efter det første minut vises outputværdierne (normalt mellem 990 og 820) på skærmen. Hvis værdierne er langt væk, skal du kontrollere, om bladene er placeret korrekt i bladclipsene.
- Når kørslen er udført, skal du sikre dig, at meddelelsen Eksperiment færdig vises nederst til venstre på skærmen. Data gemmes automatisk.
- Sæt skærmen i opretstående stilling (ikke vandret). To nye indstillinger vises på skærmen, nemlig Gem og Utilities.
- Tryk på Hjælpeprogrammer, og der vises en liste over gemte filer. Vælg filen af interesse, i dette tilfælde EXPLORA1.
- Under listen over filer , se efter Selected Expt: EXPLORA1. Tryk på E-mail, angiv en e-mail-adresse, og datafilen vedhæftes automatisk til meddelelsen. Tryk på Send.
BEMÆRK: Hvis der er en lang forsinkelse, indtil filerne ankommer, skal du genstarte appen og sende filen igen.
- Hvis en kørsel blev afbrudt, men data indtil dette punkt er af interesse, skal du trykke på Gem , før du vælger Hjælpeprogrammer. Når du har kørt flere gange, skal du rydde op i hukommelsesområdet: Tryk på Hjælpeprogrammer, vælg én fil ad gangen, stryg til venstre ud for filen, og tryk på Slet for at fjerne filen.
- Tryk på Tilbage for at køre et andet eksperiment, eller tryk på knappen Startskærm, stryg til hovedskærmen, tryk på Indstillinger, tryk på Skærm og lysstyrke, tryk på Automatisk lås, og tryk på 2 minutter.
5. Dataanalyse
- Download filen EXPLORA1 fra e-mailen, tilføj udvidelse .csv til filen, dobbeltklik på filen. Data sorteres i et regneark med data for de otte forskellige sensorer sorteret i separate kolonner. Den sidste kolonne viser det tidspunkt (i sekunder), hvor dataene blev indsamlet. Slet den første række under overskrifterne (Sensor1-8), hvis den indeholder meningsløse data.
- Konfigurer et stamdataark, der indeholder resultaterne for hver sensor i et separat ark, og som konverterer outputværdierne til % transmissionsværdier ved hjælp af de ligninger, der er opnået ved kalibrering af hvert bladklip og sensor (se supplerende fil).
- Kopier hvert datasæt til et separat dataark (f.eks. indeholder kolonne A klokkeslættet; kolonne C indeholder sensordata1).
- Konfigurer kolonne B, så den konverterer tid fra sekunder til minutter. Konfigurer kolonne D, så den indeholder formlen til at konvertere spænding til % transmission ved hjælp af ligningen fra kalibreringen.
- Opret et lignende dataark for hver sensor, og husk, at den formel, der bruges til at konvertere spændingseffekten til % transmissionsværdier, kan være forskellig for hver sensor.
- Plot % transmission (T) mod tiden, min (figur 2).
- Gem dataarket under et nyt navn, så masterdataarket kan genbruges.
- For yderligere at analysere data (figur 2) beregne ΔT (%) akkumulering (f.eks. ændring af T ved maksimal akkumulering sammenlignet med T ved mørke), undgåelse af ΔT (%) (f.eks. ændring af T ved maksimal undgåelse sammenlignet med T ved mørke) eller dT/dt (%/h) (f.eks. ændring i T under den hurtigste del af akkumulerings- eller undgåelsesreaktionen). Yderligere oplysninger findes i 8.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
De forskellige dele af transmissionsanordningen er vist i figur 1. Mikrocontrolleren er enhedens styreenhed og styrer de lysforhold, som bladene, der er fastgjort i klip i sorte blade, oplever og gemmer de lystransmissionsdata, den modtager (Figur 1A, B). Et nærbillede af objektets kontrolenhed viser TÆND/SLUK-knappen, SD-kortet til datalagringskapacitet, Bluetooth-skjoldet (som sender dataene til LeafSensor-appen ) og de kabler, der opretter forbindelse til LED'erne (Lysdioder) og fototransistorer. Mikrocontrolleren er placeret i bunden af instrumentet, og kun kanterne er synlige på billedet (Figur 1B). 3D-printede klip med sorte blade holder bladene, LED'erne og fototransistorerne på plads. Et vådt filterpapir er placeret på bladclipsdelen med LED'en, så LED'en er uhindret, og et mørk tilpasset blad er placeret med adaxialbladoverfladen mod LED'en. Skemaet viser, at LED' en og fototransistoren er placeret på de modsatte sider af bladet. LED'en kan udsende blåt eller rødt lys. Det blå lys bruges til at fremkalde kloroplastbevægelse og slukkes i en kort periode hvert minut, hvor det røde målelys skinner på bladet. Fototransistoren, der er placeret på den modsatte side af bladet, registrerer, hvor meget rødt lys der overføres gennem bladet og sender dataene til mikrocontrolleren og SD-kortet (Figur 1C). De to dele af bladclipsen samles og placeres i en 3D-printet 'båd', der er fyldt med vand og hjælper med at holde bladet fugtigt under eksperimentet (Figur 1D).
Figur 2 viser et typisk datasæt, hvor % transmissionsdata afbildes i forhold til tiden (min). Denne særlige transmissionskørsel involverede 1 h mørke, efterfulgt af 3 timers lavt blåt lys (2 μmol foton m-2 s-1) og 1 time hver af mellemliggende (30 μmol foton m-2 s-1) og højt blåt lys (100 μmol foton m-2 s-1) intensiteter. Dataene viser, at transmissionen i A. thaliana falder ved lave lysintensiteter (akkumuleringsrespons), mens en undgåelsesrespons induceres, når lysintensiteterne øges yderligere. Dette er ikke en alt eller intet reaktion, og grader af ændringer i forhold til de mørke værdier afhænger af de nøjagtige blå lys intensiteter. Disse procentvise ændringer i overførsel (ΔT) kan beregnes ved hjælp af de formler, der vises under dataene. Desuden kan hastigheden af transmissionsændringer (dT/dt) under de første ændringer i transmissionen, når der udløses en akkumulerings- eller undgåelsesrespons, beregnes ved hjælp af kurvens hældning.
De gennemsnitlige % transmissionsværdier af vildtype (WT) (figur 3A) samt phot 1 og phot 2 mutant A. thaliana blade (figur 3B) under 19 timers lange kørsler vises. Sådanne udvidede, sonderende transmissionskørsler er nyttige til at fastslå, hvilke blå lysintensiteter der skal bruges i fremtidige løb. Bladene blev først udsat for 4 timers mørke, og konsekvente transmissionsværdier indikerer, at bladene var fuldt mørke-tilpasset, hvilket vil gøre dataene mellem replikaer mere konsekvente. I de næste 7 timer blev bladene udsat for lavt blåt lys (2 μmol foton m-2 s-1). I WT og phot 2 efterfølges det første hurtige fald i transmissionen af et langsomt fald, hvilket indikerer, at chloroplasterne bevægede sig ind i akkumuleringsresponset. Afhængigt af de anvendte arter kan det tage forskellige mængder tid at opnå den lavest mulige overførsel. I mange tilfælde kan en forsker kun være interesseret i at sammenligne forskellige mutanter på et givet tidspunkt, så eksponeringen for meget svagt lys kan begrænses til en time. Sammenlignet med WT viser phot 1 et reduceret akkumuleringsrespons. Den udvidede eksponering for lavt blåt lys efterfølges af en trinvis stigning i blå lysintensiteter hver time (5, 10, 30, 40, 50, 60, 90, 100 μmol foton m-2 s-1). % transmissionen i A. thaliana WT og phot 1 øges for hver stigning i lysintensiteten, hvilket viser, at chloroplasterne bevæger sig ind i undgåelsesresponset, men dette ses ikke i phot 2. Graderne af ændring i transmissionen i forhold til den mørke værdi (ΔT) afhænger af de nøjagtige blå lysintensiteter og kan variere afhængigt af genotypen (Figur 3C). Der vises et eksempel på hastigheden af transmissionsændringer (dT/dt) under de første reaktioner i transmissionen, når undgåelse udløses, da den blå intensitet øges fra 5 til 10 μmol foton m-2 s-1 (Figur 3D). Hastigheden er den samme for WT og phot 1, mens det er meget langsomt for phot 2 mutanter.
Figur 1: Oversigt over transmissionsanordningen. Billede af den hjemmebyggede transmissionsenhed med styreenheden i den sorte boks nederst til højre og bladclips øverst og nederst til venstre (A). Nærbillede af kontrolenheden med ON/OFF-knappen, SD-kortet til datalagringskapacitet og Bluetooth-skjoldet til trådløs kommunikation. Kabler forbinder styreenheden til lysdioder (LYSDIODER) og fototransistorer. Mikrocontrolleren er placeret i bunden af instrumentet, og kun kanterne er synlige på dette billede (B). De 3D-printede sorte bladklip: Til venstre vises bladklipperdelen, der holder LED'en, til højre vises bladklipsdelen, der holder fototransistoren. For at sætte en løbetur op placeres et fugtigt filterpapir (med et hul på LED'ens størrelse) på klippet uden at tilsløre LED'en. Derefter placeres bladet i klippet, der dækker LED'en. Skemaet viser, at LED'en og fototransistoren (PT) er placeret overfor hinanden, tæt på bladet, når de to dele af hvert bladclips samles (C). Bladclips er placeret i 3D-printede 'både', der er fyldt med vand, og holder bladene og filterpapirerne hydreret (D). Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: Transmissionsdata for et typisk A. thaliana blad. Transmission (T) data for et A. thaliana blad, der blev udsat for mørke i 1 time, efterfulgt af 3 timers svagt lys (2 μmol foton m-2 s-1), efterfulgt af 1 time hver af mellemliggende (30 μmol photon m-2 s-1) og højt blåt lys (100 μmol foton m-2 s-1). Lave lysintensiteter fremkaldte akkumuleringsresponsen, mens højere lysintensiteter fremkaldte forskellige grader af en undgåelsesrespons. T-niveauerne ved mørke fungerer som baseline (blå linje). % ændringer i T relative de mørke niveauer (ΔT) f.eks ved maksimal ophobning eller forskellige niveauer af undgåelse (forskelle til mørke T er angivet af de blå pile) kan beregnes. Desuden kan den hastighed, hvormed T ændres (dT/dt), f.eks. i den indledende fase af undgåelsesresponset beregnes ud fra T-hældningen afbildet mod tiden (angivet af den blå trekant). Ligninger er vist under grafen. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: Chloroplast bevægelse i wildtype og mutant A. thaliana blade. Mørk tilpassede, modne blade blev udsat for mørke i 4 timer, efterfulgt af en 7 timers eksponering for 2 μmol foton m-2 s-1, efterfulgt af en trinvis stigning i blåt lys intensitet hver time (5, 10, 30, 40, 50, 60, 90, 100 μmol foton m-2 s-1). Gennemsnitlige % Transmission (T) værdier (n = 20) af WT (A) samt phot 1 og phot 2 blade (B). Ændring i % T i forhold til de mørke værdier: negative værdier indikerer, at bladene viste et akkumuleringsrespons, mens positive værdier indikerer et undgåelsesrespons. Tallene til højre angiver den blå lysintensitet, hvor ΔT-dataene blev beregnet. Farveskemaet er det samme som i resten af figuren (C). dT/dt-dataene blev beregnet, efterhånden som bladene reagerede på en stigning i blå lysintensiteten fra 5 til 10 μmol foton m-2 s-1 og angiver den hastighed, hvormed % T ændrede sig i timen (D). Data for A og B er midler, for C og D betyder ± SD (n = 20). Klik her for at se en større version af dette tal.
Smidig fil. Klik her for at downloade denne fil.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Enheden er ekstremt nem at bruge, men det er af afgørende betydning at kalibrere hvert blad klip set-up af transmissionsenheden uafhængigt, da placeringen af lysdioder og fototransistorer kan variere lidt fra blad klip til blad klip. Sørg for, at LED'erne og fototransistorerne indsættes stabilt, og kontroller kalibreringen igen, hvis dataene ser ud til at være slået fra. Undgå at få vand på enheden. Bladene i bladclipsene placeres i 'både' fyldt med vand for at undgå vandbelastning. Placer disse både f.eks. i en lav plastbeholder med lavt kant adskilt fra styreenheden, og vælter dem IKKE. Tag ikke stikket ud eller bøj kabelforbindelserne. Vær forsigtig, når du sætter blade i bladclipsene, og undgå at trække eller bøje kablerne for meget.
Det er vigtigt at mørk-tilpasse bladene længe nok til at sikre de oprindelige transmission værdier repræsenterer den mørke position. Kontroller, at værdierne i den mørke periode i enheden har været stabile mindst 30 min, før du skinner blåt lys på bladene. Hvis de ikke er det, skal bladene formes i mørke i længere tid før næste kørsel eller forlænge den mørke periode i transmissionsenheden for at overvåge, hvor lang tid det tager for bladene at nå en stabil tilstand. Transmissionsdataene præsenteres typisk som % ændring i transmissionen ved en given blå lysintensitet i forhold til den mørke værdi (ΔT). Derfor er det afgørende at opnå de korrekte basisværdier.
Den sonderende køre kan bruges til enhver A. thaliana mutant (herunder mutanter kendt for at påvirke andre aspekter af en plantes fysiologi f.eks fotosyntese, myosin eller ukarakteriseret mutanter) eller forskellige arter, så længe bladområdet er stort nok til at dække LED i bladclips og bladene er ikke for tyk. Programmet kan nemt tilpasses til at opfylde ethvert behov hos en forsker, f.eks. kan de blå lysintensiteter ændres inden for de intervaller, der har vist sig at fremkalde chloroplastbevægelse (reaktionen mætter omkring 100 μmol foton m-2 s-1), eksponeringstiderne kan ændres, antallet af på hinanden følgende lysforhold kan ændres. Derudover kan blade forbehandles, før de køres i enheden, f.eks. med hæmmere af actin polymerisering eller signaleringsvejskomponenter, hvilket er vigtigt for forskere, der ønsker at udfylde emnerne i signalvejen, der regulerer chloroplastbevægelsen.
Som enhver metode har denne også sine begrænsninger og ulemper. Proceduren bygger på ændringer i bladenes optiske egenskaber, nemlig hvor meget lys der overføres. Derfor fungerer det bedst med relativt tynde blade, mens tykke blade ofte ikke giver mulighed for tilstrækkelig overførsel af rødt lys, der skal detekteres ud over støjniveauet. Det ville være muligt at ændre transmissionsanordningen for at øge rødlysintensiteten, der skinner på bladet, og øge fototransistorernes følsomhed ved at ændre modstanderne. Da metoden kun giver et integreret mål for kloroplasts bevægelser i alle celler og cellelag, kan man gå glip af nogle subtile ændringer, f.eks. chloroplaster, der bevæger sig i modsatte retninger, kan ikke resultere i nogen nettoændring af transmissionen. Især når man arbejder med tidligere ukaraktererede mutanter eller arter, er det vigtigt at supplere transmissionsresultaterne med billeder af chloroplastpositionering ved hjælp af mikroskopi. For eksempel blev der observeret langsomme ændringer i transmissionen som reaktion på ændringer i blåt lysintensitet i en A. thaliana mutant og kunne have været på grund af en række årsager. Mikroskopi viste, at cellerne kun havde to kloroplaster, som var meget større end normale kloroplaster. Mutanten blev senere bekræftet at være chloroplast division mutant arc6-125.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingen interessekonflikter.
Acknowledgments
Finansieringen blev ydet af en Fiske Award og en Wellesley College Faculty Award.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Aluminum foil | |||
| Dark adapted leaves | |||
| Filter paper | |||
| iPad with LeafSensor app installed (see Supplemental Info) | |||
| Pipette | Any | ||
| Petri dish | Any | ||
| Transmission device (see Supplemental info) | |||
| Water |
References
- Senn, G. Die Gestalts- und Lageveränderung der Pflanzenchromatophoren. , Wilhelm Engelmann. Leipzig, Germany. (1908).
- Zurzycki, J. The influence of chloroplast displacements on the optical properties of leaves. Acta Societatis Botanicorum Poloniae. 30, 503-527 (1961).
- Wada, M., Kagawa, T., Sato, Y.
- Wada, M.
- Kasahara, M., Kagawa, T., Oikawa, K., Suetsugu, N., Miyao, M., Wada, M. Chloroplast avoidance movement reduces photodamage in plants. Nature. 420, 829-832 (2002).
- Davis, P. A., Hangarter, R. P. Chloroplast movement provides photoprotection to plants by redistributing PSII damage within leaves. Photosynthesis Research. 112, 153-161 (2012).
- Howard, M. M., Bae, A., Königer, M. The importance of chloroplast movement, nonphotochemical quenching, and electron transport rates in light acclimation and tolerance to high light in Arabidopsis thaliana. American Journal of Botany. 106 (11), 1-10 (2019).
- Gotoh, E., et al. Chloroplast accumulation response enhances leaf photosynthesis and plant biomass production. Plant Physiology. 178, 1358-1369 (2018).
- Howard, M. M., Bae, A., Pirani, Z., Van, N., Königer, M. Impairment of chloroplast movement reduces growth and delays reproduction of Arabidopsis thaliana in natural and controlled conditions. American Journal of Botany. 107 (9), 1309-1318 (2020).
- Trojan, A., Gabryś, H. Chloroplast distribution in Arabidopsis thaliana (L.) depends on light conditions during growth. Plant Physiology. 111, 419-425 (1996).
- Oikawa, K., et al. Chloroplast unusual positioning is essential for proper chloroplast positioning. The Plant Cell. 15, 2805-2815 (2003).
- Königer, M., Bollinger, N. Chloroplast movement behavior varies widely among species and does not correlate with high light stress tolerance. Planta. 236, 411-426 (2012).
- Kagawa, T., et al. Arabidopsis NPL1: a phototropin homolog controlling the chloroplast high-light avoidance response. Science. 291, 2138-2141 (2001).
- Berg, R., et al. A simple low-cost microcontroller-based photometric instrument for monitoring chloroplast movement. Photosynthesis Research. 87, 303-311 (2006).
- Johansson, H., Zeidler, M. Automatic chloroplast movement analysis. Molecular Biology. 1398, Springer. Germany. 29-35 (2016).
- Briggs, W. R., et al.
- Jarillo, J. A., et al. Phototropin-related NPL1 controls chloroplast relocation induced by blue light. Nature. 410, 952-954 (2001).
- Sakai, T. Arabidopsis nph1 and npl1: blue light receptors that mediate both phototropism and chloroplast relocation. Proceedings of the National Academy of Sciences, USA. 98 (12), 6969-6974 (2001).
- Wada, M., Kong, S. -G.
- Wen, F., Xing, D., Zhang, L. Hydrogen peroxide is involved in high blue light-induced chloroplast avoidance movements in Arabidopsis. Journal of Experimental Botany. 59 (10), 2891-2901 (2008).
- Tlalka, M., Fricker, M. The role of calcium in blue-light dependent chloroplast movement in Lemna trisulca L. The Plant Journal. 20, 461-473 (1999).
- Königer, M., Bollinger, N. Chloroplast movement behavior varies widely among species and does not correlate with high light stress tolerance. Planta. 236, 411-426 (2012).
- Higa, T., Wada, M. Chloroplast avoidance movement is not functional in plants grown under strong sunlight. Plant, Cell and Environment. 39, 871-882 (2016).
- Arduino. Arduino.cc. , Available from: https://www.arduino.cc (2021).
- Königer, M., Delamaide, J. A., Marlow, E. D., Harris, G. C. thaliana leaves with altered chloroplast numbers and chloroplast movement exhibit impaired adjustments to both low and high light. Journal of Experimental Botany. 59, 2285-2297 (2008).
