Summary
许多植物物种改变了叶绿体的位置，以优化光吸收。该协议描述了如何使用一种直接的自制仪器来研究 拟南芥 叶绿体运动，使用光通过叶子传输的变化作为代理。
Abstract
叶片中的叶绿体运动已被证明有助于最大限度地减少光抑制并在某些条件下增加生长。通过使用例如共聚焦荧光显微镜研究叶片中的叶绿体位置，可以学到很多关于叶绿体运动的知识，但是获得这种类型的显微镜是有限的。该协议描述了一种使用叶片传播变化作为叶绿体运动的代理的方法。如果叶绿体分散开来以最大限度地阻挡光线，则透射率将很低。如果叶绿体向背斜细胞壁移动以避开光线，则透射率会更高。该协议描述了如何使用简单的自制仪器将叶子暴露在不同的蓝光强度下，并量化叶子传输的动态变化。这种方法允许研究人员定量描述不同物种和突变体中的叶绿体运动，研究化学物质和环境因素对其的影响，或筛选新的突变体，例如，在从光感知到叶绿体运动的过程中识别缺失的成分。
Introduction
光对于光合作用、植物生长和发育至关重要。它是最具活力的非生物因素之一，因为光强度不仅在一个季节或一天的过程中发生变化，而且还会根据云层覆盖以不可预测的方式快速变化。在叶子水平上，光强度也受到周围植被的密度和性质以及植物自身树冠的影响。允许植物在可变光照条件下优化光拦截的一个重要机制是叶绿体响应蓝光刺激而移动的能力1，2。在低光照条件下，叶绿体以所谓的积累反应垂直于光（沿着下壁细胞壁）扩散，最大化光拦截，从而实现光合作用。在高光照条件下，叶绿体以所谓的回避反应向背斜细胞壁移动，最大限度地减少光拦截和光抑制的危险。在许多物种中，叶绿体也呈现出特定的黑暗位置，这与积累和回避位置不同，并且通常在这两者之间中介3，4。各种研究表明，叶绿体运动不仅对叶子的短期耐逆性很重要5，6，7，而且对植物的生长和繁殖成功也很重要，特别是在可变光照条件下8，9。
使用光学显微镜，在某些活体标本（例如，藻类或 Elodea等薄叶植物）中很容易实时观察到叶绿体运动1。然而，研究大多数叶片中的叶绿体运动需要预处理以诱导叶绿体运动，化学固定和制备横截面，然后再在光学显微镜下观察样品10。随着共聚焦激光显微镜的引入，还可以对完整或固定叶子中叶绿体的3D排列进行成像4，11，12。这些成像技术通过提供重要的定性信息，极大地帮助了对叶绿体运动的理解。量化叶绿体定位（例如，作为这些图像中叶绿体或背斜位置的百分比或叶绿体覆盖的面积的百分比）也是可能的，但非常耗时，特别是如果以捕获位置快速变化所需的间隔进行10，8.显示特定物种或突变体的黑暗适应叶子是否能够将叶绿体移动到回避反应的最简单方法是覆盖叶子的大部分区域，以使叶绿体保持在黑暗中，同时将叶子条暴露在高光下。在至少20分钟的高光照射后，暴露区域中的叶绿体将移动到回避位置，并且暴露的条带的颜色将明显比叶子的其余部分浅。对于野生拟 南芥 属是正确的，但对于稍后更详细描述的一些叶绿体运动突变体则不然13。这种方法及其修改（例如，逆转叶子的哪些部分暴露，改变光强度）对于筛选大量突变体和识别缺乏表现出回避或积累反应或两者的能力的无效突变体是有用的。然而，它没有提供有关叶绿体运动动态变化的信息。
相比之下，这里描述的方法允许使用通过叶子的光传输变化作为整体叶绿体运动的代理来量化完整叶子中的叶绿体运动：在叶绿体在积累响应中叶绿体分布在叶绿体细胞中的条件下，通过叶片的光比许多叶绿体处于回避响应时少， 沿着反斜细胞壁定位自己。因此，传播的变化可以作为叶子中整体叶绿体运动的代表14。仪器的细节在其他地方描述（见 补充文件），但基本上，仪器使用蓝光来触发叶绿体运动，并测量以设定的间隔通过该叶子传输的红光量。最近，已经描述了该系统的修改，该系统使用改进的96孔酶标仪，蓝色LED，计算机和温控培养箱15。
选择使用多种方法的组合，包括对叶子进行光学评估以进行筛选，然后测量透射的动态变化和显微镜的使用，极大地帮助我们理解叶绿体运动的潜在机制和生理/生态意义。例如，它导致了各种突变体的发现和表征，这些突变体在其运动的特定方面受到损害。例如，拟南芥 Phot 1 突变体缺乏在低光照下积累叶绿体的能力，而 Phot 2 突变体缺乏执行回避反应的能力。这些表型是由于两个各自的蓝光受体受损16，17，18。相比之下，chup1突变体缺乏在叶绿体周围形成适当的肌动蛋白细丝的能力，这对于将叶绿体移动到细胞内所需的位置至关重要11，19。除了突变研究外，研究人员还评估了各种抑制剂对叶绿体运动的影响，以阐明该过程的机制方面。例如，使用H2O2和各种抗氧化剂等化学物质来研究这种信号分子对叶绿体运动的影响20。使用各种抑制剂来阐明钙在叶绿体运动中的作用21。除了帮助揭示叶绿体运动的机制外，这些方法还可用于比较在不同条件下生长的各种物种或突变体中的叶绿体运动，以试图了解这种行为的生态和进化背景。例如，已经表明叶绿体运动途径中各种突变的影响程度取决于生长条件7，9，并且适应阳光的植物似乎不会移动其叶绿体太多。相比之下，运动对于遮荫植物非常重要10，22，23。
这篇方法论文侧重于模型植物 A. thaliana，描述了如何使用传输设备，该传输设备是先前开发的仪器的更新版本9。虽然该仪器尚未上市，但对电子学有基本了解或工程或物理同事和学生帮助的人将能够使用经济实惠的部件并遵循详细说明来构建仪器（请参阅 补充文件）。用于构建仪器的开源平台具有广泛的 Web 支持和社区论坛，可在出现问题时提供帮助24。
该协议侧重于如何使用该仪器来确定标准探索性运行中叶片传播的变化，该试验将叶子暴露于各种光照条件下，并捕获 拟南芥的黑暗，积累和回避反应。这些运行可以根据实验目标进行修改，并且可以与大多数植物物种一起使用。本文提供了 拟南芥 野生型和几种突变体的传输数据示例，并展示了如何进一步分析这些数据。
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Protocol
1. 准备跑步的树叶
- 将8 个拟南芥 植物在黑暗中过夜（>6小时对大多数物种有效），以确保叶绿体移动到黑暗的位置。所有副本都以可比较的传输值开头。
- 或者，将8片完整的叶子放入培养皿中，底部有湿润的滤纸，关闭培养皿，然后用铝箔包裹。
2. 测试传输设备是否正常工作
- 将传输设备连接到稳定的电源，然后按设备的电源开关（开/关按钮）重置仪器（图1A，B）。
- 将iPad连接到稳定的电源，按主屏幕按钮激活屏幕，然后输入密码登录。
- 按 "设置" 图标，按" 显示和亮度" 图标，按 "自动锁定"，然后按此选项选择" 从不 "，以确保屏幕永久保持打开状态。否则，当屏幕进入睡眠状态时，程序将停止运行。按 主屏幕 按钮返回主屏幕。
- 双击"主屏幕"按钮以查看哪些应用程序处于打开状态，并通过向屏幕顶部滑动它们来关闭所有这些应用程序。按 主屏幕 按钮返回主屏幕。
- 在主屏幕上或通过向左或向右滑动找到 LeafSensor 应用程序。按应用的图标将其打开（请参阅 补充文件）。将出现一个带有文本和白色字段的绿色屏幕以输入信息。
- 确保在屏幕的下部看到" 已连接 "一词，因为它指示应用正在与传输设备通信。如果出现消息"找不到 Adafruit"，请检查设备是否已接通电源，然后再次按设备上的"开始"按钮。
- 填写应用页面上的前 4 个字段以命名实验，并为没有叶子且打开叶片剪辑的简短测试运行设置条件：
- 为实验命名（使用 8 个或更少的大写字母或数字），例如，在名为 Expt Name 的字段中键入 TEST。
- 选择在实验中将使用多少种不同的蓝光强度，例如，通过在名为#光强度的字段中键入3。
- 选择此运行的蓝光强度（选择一个介于 0 和 3000 之间的整数，并用逗号将每个数字与下一个数字分开;有关如何将这些数字转换为 LED 的实际蓝光强度的补充文件），例如，在名为"蓝色强度"的字段中键入 0，100，1000。
- 选择每个蓝光强度将照射到叶子上的时间长度（用逗号将每个数字与下一个数字分开），例如，通过在名为"蓝色持续时间（分钟）"的字段中键入2，2，2。
- 按屏幕中间部分的 "开始实验" 。在屏幕的下半部分，将出现8个连字符，并显示消息 "开始实验" 。
- 确保在前两分钟内没有从LED发出光，然后发出微弱的蓝光，并且在2分钟后蓝光强度增加。
- 确保每分钟从LED发出一次强烈的红光以进行测量。
注意：在实验运行时，八个传感器中每个传感器的数字都会显示在应用程序页面上，并且数据将每分钟更新一次。确保光电二极管的输出数字在1000-1023左右（如果房间是黑暗的）。左下角的更新显示了到目前为止完成了多少次测量，例如， 完成6次测量中的1 次（每分钟一次测量）。 - 实验完成后，请检查应用页面左下角已完成的 实验 的外观。现在，仪器已准备好用树叶运行。
- 按两次主屏幕按钮，从应用程序中轻扫，然后再次打开它。按仪器上的开/关按钮进行复位。
3. 在叶夹中设置树叶
注意：此步骤必须在黑暗中使用绿色光源（例如，在灯泡前放置绿色滤光片）完成，以避免诱导叶绿体运动。或者，在叶夹中使用非常低的白光和延长的黑暗期。请记住，叶片夹的一部分固定LED（较大的开口），而另一部分则固定光电晶体管（图1C）。
- 如果植物是整个黑暗适应的，则选择8个足够宽的叶子来覆盖LED。否则，从培养皿中取出叶子。准备8条大约叶片夹长度的滤纸条，并在顶部打孔，以免覆盖LED。
- 润湿滤纸，然后将其放在固定 LED 的叶夹部分。对八个叶片夹中的每一个重复此操作。
- 将每片叶子放在其叶夹的湿滤纸的顶部。确保正确的叶面朝向LED（通常实验是在朝向LED的轴叶表面下完成的）。
- 避免将叶片的中脉放在LED的顶部，为了获得更一致的结果，请将每个叶片的相似部分（例如，叶片的最宽部分）放在LED上。
- 将另一个叶夹部分与光电晶体管放在顶部。如果需要，使用橡皮筋将两个叶夹部件固定在一起（图1C，D）。
- 将每个叶夹放入其"船"中，并使用移液器将水充满水箱。确保叶子或至少滤纸接触水，以避免在运行过程中叶子脱水（图1D）。
4. 进行跑步
注意：对于标准的探索性运行，从4小时的黑暗开始（0μmol光子m-2 s-1），然后是7小时的低蓝光（2μmol光子m-2 s-1），然后是60分钟，每个5，10，30，40，50，60，90，100μmol光子m-2 s-1蓝光。这将诱使叶片表现出其黑暗的传播，诱导叶绿体运动进入最大积累，并表现出不同程度的回避反应。
- 使用以下步骤在iPad上设置 LeafSensor 应用程序。
- 在名为"Expt Name"的字段中键入 EXPLORA1。
- 在名为 #光强度的字段中键入 10。
- 键入 0，1，60，160，550，750，950，1150，1350，1950 到名为 蓝色强度的字段中。
- 在名为"蓝色持续时间"的字段中键入 240，420，60，60，60，60，60，60，60。
- 按 开始实验。第一分钟后，输出值（通常介于 990 和 820 之间）将显示在屏幕上。如果值相差很远，请检查叶子是否正确放入叶片剪辑中。
- 运行完成后，请确保消息" 实验已完成" 出现在屏幕的左下角。数据将自动保存。
- 将屏幕放在直立位置（而不是水平）。屏幕上将出现两个新选项，即 "保存" 和 "实用工具"。
- 按 "实用工具" ，将显示已保存文件的列表。选择感兴趣的文件，在本例中为 EXPLORA1。
- 在文件列表下方，查找 "选定的 Expt： EXPLORA1"。按 电子邮件，输入 电子邮件地址，数据文件将自动附加到邮件中。按 发送。
注意：如果在文件到达之前存在长时间的延迟，请重新启动应用程序并再次发送文件。
- 如果运行已中止，但到目前为止的数据值得关注，请在选择"实用工具"之前按"保存"。多次运行后，清理内存空间：按"实用工具"，一次选择一个文件，向左轻扫文件旁边的文件，然后按"删除"以删除文件。
- 按 "上一步" 运行另一个实验，或者如果完成，请按"主屏幕"按钮，轻扫到主屏幕，按 "设置"，按" 显示和亮度"，按 "自动锁定"，然后按 2 分钟。
5. 数据分析
- 从电子邮件下载文件 EXPLORA1 ，将扩展名.csv添加到文件中，双击该文件。数据将被分类到一个电子表格中，八个不同传感器的数据将分类到单独的列中。最后一列显示收集数据的时间（以秒为单位）。删除标题 （Sensor1-8） 下的第一行，如果它包含无意义的数据。
- 设置一个主数据手册，该数据手册将在单独的表格中包含每个传感器的结果，并使用从每个叶片夹和传感器的校准中获得的方程将输出值转换为%传输值（参见 补充文件）。
- 将每个数据集复制到单独的数据手册中（例如，列 A 包含时间;列 C 包含 Sensor1 的数据）。
- 设置列 B，以便它将时间从秒转换为分钟。设置列 D，使其包含使用校准方程将电压转换为 % 传输的公式。
- 为每个传感器设置一个类似的数据手册，并记住用于将电压输出转换为%传输值的公式对于每个传感器可能不同。
- 绘制传输百分比（T）随时间变化的曲线，最小值（图2）。
- 以新名称保存数据手册，以便可以重复使用主数据手册。
- 为了进一步分析数据（图2），计算 ΔT（%）积累 （例如，与黑暗时T相比，最大积累时T的变化）， ΔT（%）避免 （例如，与黑暗时T相比，最大避免时T的变化）或 dT / dt（%/ h） （例如，在积累或避免反应的最快部分期间T的变化）。有关更多详细信息，请参阅 8。
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Representative Results
传输装置的不同部分如图 1所示。微控制器是设备的控制单元，控制叶片（固定在黑叶夹中）正在经历的光照条件，并存储其接收的光传输数据（图1A，B）。仪器控制单元的特写镜头显示了ON/OFF按钮，用于数据存储功能的SD卡，蓝牙扩展板（将数据发送到 LeafSensor 应用程序）以及连接到LED（发光二极管）和光电晶体管的电缆。微控制器位于仪器的底部，在图片中只有边缘可见（图1B）。3D打印的黑叶夹将叶子，LED和光电晶体管固定到位。湿滤纸与LED一起放置在叶片夹部分，使LED畅通无阻，并且定位深色适应的叶片，轴向叶片表面朝向LED。原理图显示LED和光电晶体管位于叶片的相对两侧。LED 可以发出蓝色或红色光。蓝光用于诱导叶绿体运动，并且每分钟关闭一小段时间，在此期间，红色测量灯照射到叶子上。光电晶体管位于叶子的另一侧，检测通过叶子传输了多少红光，并将数据发送到微控制器和SD卡（图1C）。叶夹的两个部分被组装起来，并放置在一个3D打印的"船"中，该船充满水，有助于在实验过程中保持叶子湿润（图1D）。
图 2 显示了一个典型数据集，其中传输数据百分比与时间（分钟）成差绘制。这次特殊的传输运行涉及1小时的黑暗，然后是3小时的低蓝光（2μmol光子m-2 s-1），以及中间（30μmol光子m-2 s-1）和高蓝光（100μmol光子m-2 s-1）强度各1小时。数据显示，在低光强（累积响应）下，拟南芥的透射率降低，而当光强度进一步增加时，诱导避免响应。这不是全有或全无响应，相对于暗值的变化程度取决于确切的蓝光强度。这些传播百分比变化（ΔT）可以使用数据下方显示的公式进行计算。此外，当触发累积或回避响应时，传输的初始变化期间的传输速度变化（dT/dt）可以使用曲线的斜率来计算。
显示了野生型（WT）（图3A）以及19小时长跑期间 phot 1 和 phot 2 突变 A. thaliana 叶的平均传播百分比值（图3B）。这种扩展的探索性传输运行有助于确定在将来的运行中使用哪些蓝光强度。叶子首先暴露在4 h的黑暗中，一致的传输值表明叶子是完全黑暗适应的，这将使副本之间的数据更加一致。在接下来的7小时内，叶子暴露在低蓝光下（2μmol光子m-2 s-1）。在WT和 phot 2中，传播的初始快速减少随后缓慢减少，这表明叶绿体正在进入积累响应。根据所使用的物种，可能需要不同的时间才能获得尽可能低的传播。在许多情况下，研究人员可能只对比较给定时间点的各种突变体感兴趣，因此暴露在非常低的光线下可能仅限于一个小时。与WT相比， phot 1 显示出减少的累积反应。长时间暴露在低蓝光之后，每小时逐渐增加蓝光强度（5，10，30，40，50，60，90，100μmol光子m-2 s-1）。拟 南芥 WT和 phot 1 中的传播百分比随着光强度的每次增加而增加，表明叶绿体进入回避反应，但这在 phot 2中没有看到。相对于暗值（ΔT）的传播变化程度取决于确切的蓝光强度，并且可能因基因型而异（图3C）。例如，当蓝色强度从5μmol光子m-2 s-1增加到10μmol光子m-2 s-1 时，当避免被触发时，传输的初始响应期间传输速度变化的速度（ dT / dt）（图3D）。WT和 phot 1的速度是相同的，而 phot 2 突变体的速度非常慢。
图 1：传输设备概述。 自制变速器装置的图片，右下角的黑匣子中的控制单元，顶部和左下角的叶夹（A）。带有开/关按钮的控制单元特写，用于数据存储功能的SD卡和用于无线通信的蓝牙扩展板。电缆将控制单元连接到发光二极管（LED）和光电晶体管。微控制器位于仪器的底部，在此图（B）中仅可见边缘。3D打印的黑叶夹：左侧显示持有LED的叶夹部分，右侧显示持有光电晶体管的叶夹部分。为了设置运行，将潮湿的滤纸（带有LED大小的孔）放置在夹子上，而不会遮挡LED。然后将叶子放置在覆盖LED的夹子中。原理图显示，当每个叶片夹的两个部分组装在一起时，LED和光电晶体管（PT）彼此相对，靠近叶片（C）。叶夹被放置在充满水的3D打印"船"中，保持叶子和滤纸水合（D）。 请点击此处查看此图的放大版本。
图2：典型拟南芥叶片的传输数据。暴露于黑暗1小时的拟南芥叶的透射（T）数据，然后是3小时的低光（2μmol光子m-2 s-1），然后是中间（30μmol光子m-2 s-1）和高蓝光（100μmol光子m-2 s-1）各1小时。低光强度诱导累积反应，而较高的光强度诱导不同程度的回避反应。深色处的 T 水平用作基线（蓝线）。可以计算T相对于暗水平（ΔT）的百分比变化，例如，在最大积累或不同的回避水平（与暗T的差异由蓝色箭头表示）时。此外，T变化的速度（dT/dt），例如，在回避响应的初始阶段，可以从T相对于时间绘制的斜率（由蓝色三角形表示）计算。方程式显示在图表下方。请点击此处查看此图的放大版本。
图3：野生型和突变的拟南芥叶片中的叶绿体运动。适应黑暗的成熟叶子暴露在黑暗中4小时，然后暴露于2μmol光子m-2 s-17小时，然后每小时逐步增加蓝光强度（5，10，30，40，50，60，90，100μmol光子m-2 s-1）。WT （A） 以及 phot 1 和 phot 2 叶子 （B） 的平均传播百分比 （T） 值 （n = 20）。%T 相对于暗值的变化：负值表示叶子显示累积响应，而正值表示回避响应。右边的数字表示计算ΔT数据的蓝光强度。配色方案与图 （C） 的其余部分相同。dT/dt数据计算为叶子对蓝光强度从5到10μmol光子m-2 s-1的增加做出反应，并指示%T每小时变化的速度（D）。A 和 B 的数据均值，C 和 D 的数据均值± SD （n = 20）。请点击此处查看此图的放大版本。
补充文件。请点击此处下载此文件。
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Discussion
该器件非常易于使用，但独立校准传输器件的每个叶片夹设置至关重要，因为LED和光电晶体管的位置可能因叶片夹而异。确保LED和光电晶体管插入稳定，如果数据似乎关闭，请重新检查校准。避免将水沾到设备上。叶夹中的叶子被放入装满水的"船"中，以避免水压力。例如，将这些船放入与控制单元分开的低框塑料容器中，不要将它们撞倒。请勿拔下或弯曲电缆连接。将树叶插入叶夹时要小心，避免过度拉动或弯曲电缆。
重要的是要使叶子变暗足够长，以确保初始透射值代表黑暗位置。检查设备黑暗期间的值是否稳定至少30分钟，然后将蓝光照射到叶子上。如果不是，请在下次运行之前对叶子进行更长时间的黑暗适应，或者延长传输设备中的黑暗期，以监测叶子达到稳定状态需要多长时间。通常，传输数据显示为在给定蓝光强度下相对于暗值（ΔT）的传输百分比变化。因此，获得正确的基线值至关重要。
探索性运行可用于任何拟南芥突变体（包括已知影响植物生理学其他方面的突变体，例如光合作用，肌球蛋白或未表征的突变体）或不同的物种，只要叶面积足够大，可以覆盖叶夹中的LED并且叶子不太厚。该程序可以很容易地适应满足研究人员的任何需求，例如，蓝光强度可以在已被证明引起叶绿体运动的范围内改变（反应饱和在100μmol光子m-2 s-1左右），曝光时间可以改变，连续光条件的数量可以改变。此外，叶子可以在设备中运行之前进行预处理，例如，使用肌动蛋白聚合抑制剂或信号通路组分，这对于想要填补调节叶绿体运动的信号通路中的空白的研究人员来说非常重要。
像每种方法一样，这种方法也有其局限性和缺点。该过程依赖于叶子光学特性的变化，即透射的光量。因此，它对相对较薄的叶子效果最好，而厚厚的叶子通常不允许在噪声水平之外检测到足够的红光透射。可以修改传输装置以增加照射到叶子上的红光强度，并通过改变电阻器来增加光电晶体管的灵敏度。由于该方法仅提供叶绿体在所有细胞和细胞层中运动的综合测量，因此可能会错过一些细微的变化，例如，叶绿体向相反方向移动可能导致没有传播的净变化。特别是在处理以前未表征的突变体或物种时，使用显微镜的叶绿体定位图像补充透射结果非常重要。例如，在拟南芥突变体中观察到响应蓝光强度变化的缓慢传播变化，可能是由于一系列原因。显微镜显示，细胞只有两个叶绿体，比正常叶绿体大得多。该突变体后来被证实是叶绿体分裂突变体arc6-125。
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Disclosures
作者没有利益冲突。
Acknowledgments
资金由Fiske奖和韦尔斯利学院教师奖提供。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Aluminum foil | |||
| Dark adapted leaves | |||
| Filter paper | |||
| iPad with LeafSensor app installed (see Supplemental Info) | |||
| Pipette | Any | ||
| Petri dish | Any | ||
| Transmission device (see Supplemental info) | |||
| Water |
References
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