Summary
Mange plantearter endrer plasseringen av kloroplaster for å optimalisere lysabsorpsjon. Denne protokollen beskriver hvordan du bruker et enkelt, hjemmebygd instrument for å undersøke kloroplastbevegelsen i Arabidopsis thaliana-blader ved hjelp av endringer i overføring av lys gjennom et blad som proxy.
Abstract
Kloroplastbevegelse i blader har vist seg å bidra til å minimere fotoinhibition og øke veksten under visse forhold. Mye kan læres om kloroplastbevegelse ved å studere kloroplastposisjonering i blader ved hjelp av for eksempel konfettisk fluorescensmikroskopi, men tilgangen til denne typen mikroskopi er begrenset. Denne protokollen beskriver en metode som bruker endringene i bladoverføring som proxy for kloroplastbevegelse. Hvis kloroplaster spres ut for å maksimere lysavskjæring, vil overføringen være lav. Hvis kloroplaster beveger seg mot de anticlinale celleveggene for å unngå lys, vil overføringen være høyere. Denne protokollen beskriver hvordan du bruker et enkelt, hjemmebygd instrument for å eksponere blader for forskjellige blålysintensiteter og kvantifisere de dynamiske endringene i bladoverføring. Denne tilnærmingen gjør det mulig for forskere å kvantitativt beskrive kloroplastbevegelse i forskjellige arter og mutanter, studere effekten av kjemikalier og miljøfaktorer på den, eller skjerme for nye mutanter, for eksempel å identifisere manglende komponenter i prosessen som fører fra lysoppfattelse til bevegelse av kloroplaster.
Introduction
Lys er avgjørende for fotosyntese, plantevekst og utvikling. Det er en av de mest dynamiske abiotiske faktorene, da lysintensiteter ikke bare endres i løpet av en sesong eller dag, men også raskt og på uforutsigbare måter, avhengig av skydekket. På bladnivå påvirkes også lysintensiteter av tettheten og naturen til den omkringliggende vegetasjonen og plantens egen baldakin. En viktig mekanisme som gjør det mulig for planter å optimalisere lysavskjæring under variable lysforhold, er kloroplastenes evne til å bevege seg som svar på blålysstimuli1,2. Under dårlige lysforhold sprer kloroplaster seg vinkelrett på lyset (langs de periklinale celleveggene) i en såkalt akkumuleringsrespons, maksimerer lysavskjæring og dermed fotosyntese. Under høye lysforhold beveger kloroplaster seg mot den anticlinale celleveggen i en såkalt unngåelsesrespons, og minimerer lysavskjæring og faren for fotoinhibition. I mange arter antar kloroplaster også en bestemt mørk posisjon, som er forskjellig fra akkumulerings- og unngåelsesposisjonene og ofte mellomledd mellom de to tre,4. Ulike studier har vist at kloroplastbevegelse ikke bare er viktig for den kortsiktige stresstoleransen til blader5,6,7, men også for vekst og reproduktiv suksess for planter, spesielt under variable lysforhold8,9.
Kloroplastbevegelse observeres lett i sanntid i visse levende prøver (f.eks. alger eller tynnbladede planter som Elodea) ved hjelp av lysmikroskopi1. Å studere kloroplastbevegelse i de fleste blader krever imidlertid en forbehandling for å indusere kloroplastbevegelse, kjemisk fiksering og fremstilling av tverrsnitt før du ser på prøvene under et lysmikroskop10. Med introduksjonen av konfekt lasermikroskopi ble det også mulig å avbilde 3D-arrangementet av kloroplaster i intakte eller faste blader4,11,12. Disse avbildningsteknikkene bidrar i stor grad til forståelsen av kloroplastbevegelse ved å gi viktig kvalitativ informasjon. Kvantifisering av kloroplastposisjonering (f.eks. som en prosentandel kloroplaster i periclinale eller anticlinale posisjoner i disse bildene eller prosentandelen av areal dekket av kloroplaster per total celleoverflate) er også mulig, men ganske tidkrevende, spesielt hvis det utføres i intervallene som er nødvendige for å fange raske endringer i posisjonering10,8 . Den enkleste måten å vise om mørktilpassede blader av en bestemt art eller mutanter er i stand til kloroplastbevegelse i unngåelsesresponsen, er ved å dekke det meste av området av et blad for å holde kloroplastene i mørket mens du utsetter en stripe av bladet for høyt lys. Etter minst 20 min med høy lyseksponering, vil kloroplastene i det eksponerte området ha beveget seg inn i unngåelsesposisjonen, og den eksponerte stripen vil være synlig lettere i fargen enn resten av bladet. Dette gjelder for vill type A. thaliana, men ikke for noen av kloroplastbevegelsens mutanter beskrevet mer detaljert senere på13. Denne metoden og modifikasjonene av den (f.eks. reversering av hvilke deler av bladet som er eksponert, skiftende lysintensiteter) er nyttige for å screene et stort antall mutanter og for å identifisere nullmutanter som mangler enten evnen til å utvise en unngåelse eller akkumuleringsrespons eller begge deler. Det gir imidlertid ikke informasjon om de dynamiske endringene i kloroplastbevegelsen.
I motsetning tillater metoden som er beskrevet her kvantifisering av kloroplastbevegelse i intakte blader ved hjelp av endringer i lysoverføring gjennom et blad som proxy for generell kloroplastbevegelse: Under forhold når kloroplaster spres ut i mesofyllcellene i akkumuleringsresponsen, overføres mindre lys gjennom bladet enn når mange kloroplaster er i en unngåelsesrespons, plassere seg langs de anticlinale celleveggene. Derfor kan endringer i overføring brukes som proxy for den generelle kloroplastbevegelsen i blader14. Instrumentets detaljer er beskrevet andre steder (se Tilleggsfil), men i utgangspunktet bruker instrumentet blått lys for å utløse kloroplastbevegelse og måler hvor mye rødt lys som overføres gjennom det bladet med innstilte intervaller. Mer nylig har en modifikasjon av dette systemet blitt beskrevet, som bruker en modifisert 96-brønns mikroplateleser, en blå LED, en datamaskin og en temperaturkontrollert inkubator15.
Muligheten til å bruke en kombinasjon av metoder, inkludert optisk vurdering av blader for screening, etterfulgt av måling av dynamiske endringer i overføring og bruk av mikroskopi, har i stor grad bidratt til vår forståelse av både de underliggende mekanismene og den fysiologiske/økologiske betydningen av kloroplastbevegelsen. For eksempel førte det til oppdagelsen og karakteriseringen av ulike mutanter, som er svekket i spesifikke aspekter av bevegelsene deres. For eksempel mangler A. thaliana phot 1 mutanter evnen til å akkumulere sine kloroplaster i lite lys, mens phot 2 mutanter mangler evnen til å utføre en unngåelsesreaksjon. Disse fenotypene skyldes en svekkelse i to respektive blålysreseptorer16,17,18. I motsetning mangler chup1 mutanter evnen til å danne riktige aktinfilamenter rundt kloroplastene som er avgjørende for å flytte kloroplastene til ønsket posisjon i en celle11,19. I tillegg til mutantstudier har forskere vurdert effekten av ulike hemmere på kloroplastbevegelse for å belyse de mekanistiske aspektene ved prosessen. For eksempel ble kjemikalier som H2O2 og ulike antioksidanter brukt til å undersøke effekten av dette signalmolekylet på kloroplastbevegelse20. Ulike inhibitorer ble brukt til å belyse kalsiumets rolle i kloroplastbevegelsen21. I tillegg til å bidra til å avdekke mekanismene for kloroplastbevegelse, kan disse metodene brukes til å sammenligne kloroplastbevegelse i ulike arter eller mutanter dyrket under forskjellige forhold i et forsøk på å forstå den økologiske og evolusjonære konteksten av denne oppførselen. For eksempel har det vist seg at omfanget av effektene av ulike mutasjoner i kloroplastbevegelsesveien er avhengig av vekstforholdene7,9, og at soltilpassede planter ikke ser ut til å flytte kloroplastene mye. Derimot er bevegelse svært viktig for skyggeplanter10,22,23.
Dette metodepapiret, fokusert på modellanlegget A. thaliana, beskriver hvordan du bruker en overføringsenhet som er en oppdatert versjon av et tidligere utviklet instrument9. Selv om dette instrumentet ikke er kommersielt tilgjengelig, vil personer med grunnleggende forståelse av elektronikk eller hjelp av ingeniør- eller fysikkkolleger og studenter kunne bygge instrumentet ved hjelp av rimelige deler og følge de detaljerte instruksjonene (se Tilleggsfil). Åpen kildekode-plattformen som brukes til å bygge instrumentet har omfattende webstøtte og et fellesskapsforum som tilbyr hjelp hvis det skulle oppstå problemer24.
Protokollen fokuserer på hvordan du bruker instrumentet til å bestemme endringer i bladoverføring i et standard utforskende løp som utsetter et blad for et bredt spekter av lysforhold og fanger opp de mørke, akkumulerings- og unngåelsesreaksjonene til A. thaliana. Disse løypene kan endres avhengig av målet med eksperimentet og kan brukes med de fleste plantearter. Artikkelen gir eksempler på overføringsdata fra A. thaliana wildtype og flere mutanter og viser hvordan du analyserer dataene ytterligere.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Forbereder blader for en løpetur
- Plasser 8 A. thaliana planter i mørket over natten (> 6 h fungerer for de fleste arter) for å sikre at kloroplastene beveger seg i sin mørke posisjon. Alle replikaer starter med sammenlignbare overføringsverdier.
- Alternativt kan du plassere 8 komplette blader i en Petri-tallerken med et fuktig filterpapir nederst, lukke Petri-parabolen og pakke den med aluminiumsfolie.
2. Teste om overføringsenheten fungerer
- Koble overføringsenheten til en stabil strømkilde og trykk på strømbryteren (PÅ/AV-knappen) på enheten for å tilbakestille instrumentet (figur 1A,B).
- Koble iPad til en stabil strømkilde, trykk på Hjemskjerm-knappen for å aktivere skjermen, og skriv inn passordet for å logge på.
- Trykk på Innstillinger-ikonet , trykk på Display & Brightness-ikonet, trykk på Auto-Lock, og velg Aldri ved å trykke på dette alternativet for å sikre at skjermen forblir på permanent. Ellers vil programmet slutte å kjøre når skjermen går i dvale. Trykk på Hjem-skjermen for å gå tilbake til hovedskjermen.
- Dobbelttrykk på Hjem-skjermen-knappen for å se hvilke programmer som er åpne, og lukk dem alle ved å sveipe dem mot toppen av skjermen. Trykk på Hjem-skjermen for å gå tilbake til hovedskjermen.
- Finn LeafSensor-appen på hovedskjermen eller ved å sveipe til venstre eller høyre. Trykk på ikonet for appen for å åpne den (se Tilleggsfil). Det vises en grønn skjerm med tekst- og hvite felt for å skrive inn informasjonen.
- Kontroller at ordet Tilkoblet vises i den nedre delen av skjermen, da det indikerer at appen kommuniserer med overføringsenheten. Hvis meldingen 'Adafruit NOT Found' vises, må du kontrollere at enheten er koblet til og trykke på startknappen på enheten igjen.
- Fyll ut de fire første feltene på appsiden for å gi eksperimentet et navn, og for å sette opp betingelsene for en kort testkjøring uten blader og med bladklemmene åpne:
- Gi eksperimentet et navn (bruk 8 eller færre store bokstaver eller tall), for eksempel ved å skrive inn TEST i feltet Expt Name.
- Velg hvor mange forskjellige blålysintensiteter som skal brukes i eksperimentet, for eksempel ved å skrive inn 3 i feltet # Lysintensiteter.
- Velg blålysintensitetene for denne kjøringen (velg et heltall mellom 0 og 3000 og skill hvert tall fra det neste med et komma; se Tilleggsfil om hvordan du konverterer disse tallene til faktiske blålysintensiteter av lysdioder), for eksempel ved å skrive inn 0,100,1000 i feltet som heter Blue Intensities.
- Velg hvor lenge hver blå lysintensitet skal skinne på bladet (skill hvert tall fra det neste med et komma), for eksempel ved å skrive inn 2,2,2 i feltet kalt Blå varighet (minutter).
- Trykk Start eksperiment i den midterste delen av skjermen. I den nedre delen av skjermen vises 8 bindestreker og meldingen Starte eksperiment .
- Pass på at det ikke avgis lys fra lysdiodene de første to minuttene, deretter avgis svakt blått lys, og etter 2 minutter øker den blå lysintensiteten.
- Sørg for at intenst rødt lys avgis fra lysdiodene en gang i minuttet for målingene.
MERK: Når eksperimentet kjører, vises tallene på appsiden for hver av de åtte sensorene, og data oppdateres en gang i minuttet. Forsikre deg om at utgangsnumrene fra fotodiodene er rundt 1000-1023 (hvis rommet er mørkt). En oppdatering nederst til venstre viser hvor mange målinger som er gjort så langt, for eksempel Utført 1 av 6 målinger (én måling hvert minutt). - Når eksperimentet er fullført, ser du etter utseendet til eksperimentet som er fullført nederst til venstre på appsiden. Nå er instrumentet klart for en løpetur med blader.
- Trykk to ganger på Hjem-skjermen-knappen, sveip ut av appen og åpne den igjen. Trykk på PÅ/AV-knappen på instrumentet for å tilbakestille det.
3. Sette opp blader i bladklemmene
MERK: Dette trinnet må gjøres i mørket med en grønn lyskilde (f.eks. plasser et grønt filter foran en lyspære) for å unngå å fremkalle kloroplastbevegelse. Alternativt kan du bruke veldig lavt hvitt lys og en utvidet mørk periode i bladklemmene. Husk at den ene delen av bladklemmen holder LED-lampen (større åpning), mens den andre holder fototransistoren (figur 1C).
- Hvis plantene er mørktilpasset hele, velg 8 blader brede nok til å dekke lysdiodene. Ellers fjerner du bladene fra Petri-parabolen. Forbered 8 strimler med filterpapir om lengden på en bladklips og med et hull utstanset øverst for ikke å dekke led-lampen.
- Fukt filterpapiret og plasser det på bladklemmedelen som holder LED-lampen. Gjenta dette for hver av de åtte bladklemmene.
- Plasser hvert blad på toppen av det våte filterpapiret på bladklemmen. Forsikre deg om at riktig bladside vender mot LED-lampen (vanligvis gjøres eksperimenter med den tilstøtende bladoverflaten som vender mot LED-lampen).
- Unngå å plassere midribs av bladet på toppen av lysdiodene, og for mer konsistente resultater, plasser lignende deler av hvert blad (f.eks. den bredeste delen av bladet) over LED-lampen.
- Plasser den andre bladklemmedelen med fototransistoren på toppen. Bruk et gummibånd til å holde de to bladklemmedelene sammen om nødvendig (figur 1C,D).
- Plasser hver bladklemme i "båten" og fyll reservoarene med vann ved hjelp av en pipette. Sørg for at bladet eller i det minste filterpapiret berører vannet for å unngå dehydrering av bladene under løpet (figur 1D).
4. Gjennomføre en løpetur
MERK: For en standard eksplorativ kjøring må start med 4 timers mørke (0 μmol foton m-2 s-1), etterfulgt av 7 t lavt blått lys (2 μmol foton m-2 s-1), etterfulgt av 60 min hver av 5, 10, 30, 40, 50, 60, 90, 100 μmol foton m-2 s-1 av blått lys. Dette vil få bladene til å vise sin mørke overføring, indusere kloroplastbevegelse til maksimal akkumulering og vise forskjellige grader av unngåelsesrespons.
- Konfigurer LeafSensor-appen på iPad ved hjelp av fremgangsmåten som er beskrevet nedenfor.
- Skriv inn EXPLORA1 i feltet Expt Name.
- Skriv inn 10 i feltet # Lysintensiteter.
- Skriv inn 0,1,60,160,550,750,950,1150,1350,1950 i feltet kalt Blå intensiteter.
- Skriv inn 240 420 60 60 60 60 60 60 60 60,60 i feltet blå varighet.
- Trykk Start eksperiment. Etter det første minimumet vises utdataverdiene (vanligvis mellom 990 og 820) på skjermen. Hvis verdiene er langt av, sjekk om bladene ble plassert riktig i bladklemmene.
- Når kjøringen er fullført, må du kontrollere at meldingen Eksperimentering fullført vises nederst til venstre på skjermen. Data lagres automatisk.
- Sett skjermen i oppreist stilling (ikke vannrett). To nye alternativer vises på skjermen, nemlig Lagre og Verktøy.
- Trykk Verktøy , og en liste over lagrede filer vises. Velg filen av interesse, i dette tilfellet EXPLORA1.
- Se etter Valgt uttr: EXPLORA1 under listen over filer . Trykk på E-post, skriv inn en e-postadresse, så legges datafilen automatisk ved meldingen. Trykk Send.
MERK: Hvis det er en lang forsinkelse til filene kommer, starter du appen på nytt og sender filen på nytt.
- Hvis en kjøring ble avbrutt, men data frem til dette punktet er av interesse, trykker du Lagre før du velger Verktøy. Når flere kjøringer er kjørt, rydder du opp i minneområdet: Trykk Verktøy, velg én fil om gangen, sveip mot venstre ved siden av filen, og trykk SLETT for å fjerne filen.
- Trykk Tilbake for å kjøre et annet eksperiment, eller trykk på Hjemskjerm-knappen, sveip til hovedskjermen, trykk på Innstillinger, trykk på Skjerm og lysstyrke, trykk automatisk lås og trykk på 2 minutter.
5. Dataanalyse
- Last ned filen EXPLORA1 fra e-posten, legg til utvidelse .csv til filen, dobbeltklikk på filen. Data sorteres i et regneark med dataene for de åtte forskjellige sensorene sortert i separate kolonner. Den siste kolonnen viser klokkeslettet (i sekunder) da dataene ble samlet inn. Slett den første raden under overskriftene (Sensor1-8) hvis den inneholder meningsløse data.
- Sett opp et hoveddataark som skal inneholde resultatene for hver sensor i et eget ark, og som konverterer utdataverdiene til % overføringsverdier ved hjelp av ligningene hentet fra kalibreringen av hvert bladklemme og hver sensor (se Tilleggsfil).
- Kopier hvert datasett til et eget dataark (f.eks. kolonne A inneholder klokkeslettet, kolonne C inneholder dataene til Sensor1).
- Sett opp kolonne B slik at den konverterer tid fra sekunder til minutter. Sett opp kolonne D slik at den inneholder formelen for å konvertere spenning til % overføring ved hjelp av ligningen fra kalibreringen.
- Sett opp et lignende dataark for hver sensor, og husk at formelen som brukes til å konvertere spenningsutgangen til % overføringsverdier, kan være forskjellig for hver sensor.
- Plott % overføring (T) mot tid, min (figur 2).
- Lagre dataarket med et nytt navn, slik at hoveddatabladet kan brukes på nytt.
- For ytterligere å analysere data (figur 2) beregner du ΔT (%) akkumulering (f.eks. endring av T ved maksimal akkumulering sammenlignet med T ved mørkets frembrudd), ΔT (%) unngåelse (f.eks. endring av T ved maksimal unngåelse sammenlignet med T ved mørke), eller dT/dt (%/h) (f.eks. endring i T under den raskeste delen av akkumulerings- eller unngåelsesreaksjonen). For ytterligere detaljer, se 8.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
De ulike delene av overføringsenheten er vist i figur 1. Mikrokontrolleren er enhetens kontrollenhet og styrer lysforholdene som bladene, sikret i svarte bladklips, opplever, og lagrer lysoverføringsdataene den mottar (figur 1A, B). Et nærbilde av instrumentets kontrollenhet viser PÅ/AV-knappen, SD-kortet for datalagringskapasitet, Bluetooth-skjoldet (som sender dataene til LeafSensor-appen ) og kablene som kobles til lysdiodene (lysdiodene) og fototransistorene. Mikrokontrolleren er plassert ved foten av instrumentet, og bare kantene er synlige på bildet (figur 1B). 3D-trykte, svarte bladklips holder bladene, lysdiodene og fototransistorene på plass. Et vått filterpapir er plassert på bladklemmedelen med LED-lampen slik at LED-lampen er uhindret, og et mørktilpasset blad er plassert med den tilstøtende bladoverflaten vendt mot LED-lampen. Skjemaet viser at LED-lampen og fototransistoren er plassert på motsatte sider av bladet. LED-lampen kan avgi blått eller rødt lys. Det blå lyset brukes til å indusere kloroplastbevegelse og slås av i en kort periode hvert minutt der det røde målelyset skinner på bladet. Fototransistoren, plassert på motsatt side av bladet, oppdager hvor mye rødt lys som overføres gjennom bladet og sender dataene til mikrokontrolleren og SD-kortet (figur 1C). De to delene av bladklemmen monteres og plasseres i en 3D-trykt "båt" som er fylt med vann og bidrar til å holde bladet fuktig under eksperimentet (figur 1D).
Figur 2 viser et typisk datasett der % overføringsdata tegnes inn mot tiden (min). Dette spesielle overføringsløpet involverte 1 t mørke, etterfulgt av 3 t lavt blått lys (2 μmol foton m-2 s-1), og 1 time hver av mellomliggende (30 μmol foton m-2 s-1) og høyt blått lys (100 μmol foton m-2 s-1) intensiteter. Dataene viser at overføringen i A. thaliana reduseres ved lavlysintensiteter (akkumuleringsrespons), mens en unngåelsesrespons induseres når lysintensitetene øker ytterligere. Dette er ikke et svar på alt eller ingenting, og gradene av endringer i forhold til de mørke verdiene avhenger av de eksakte blålysintensitetene. Disse prosentvise endringene i overføring (ΔT) kan beregnes ved hjelp av formlene som vises under dataene. I tillegg kan hastigheten på overføringsendringer (dT/dt) under de første endringene i overføringen når en akkumulerings- eller unngåelsesrespons utløses, beregnes ved hjelp av kurvens helling.
Gjennomsnittlig % overføringsverdier av villtype (WT) (figur 3A), samt phot 1 og phot 2 mutant A. thaliana blader (figur 3B) under 19 timers lange løp vises. Slike utvidede, utforskende overføringskjøringer er nyttige for å fastslå hvilke blålysintensiteter som skal brukes i fremtidige kjøringer. Bladene ble først utsatt for 4 timers mørke, og konsistente overføringsverdier indikerer at bladene var fullt mørktilpasset, noe som vil gjøre dataene mellom replikaer mer konsistente. I de neste 7 t ble bladene utsatt for lavt blått lys (2 μmol foton m-2 s-1). I WT og phot 2, den første raske reduksjonen i overføring etterfølges av en langsom nedgang som indikerer at kloroplastene beveget seg inn i akkumuleringsresponsen. Avhengig av arten som brukes, kan det ta forskjellige mengder tid å oppnå lavest mulig overføring. I mange tilfeller kan en forsker bare være interessert i å sammenligne ulike mutanter på et gitt tidspunkt, slik at eksponeringen for svært lite lys kan være begrenset til en time. Sammenlignet med WT viser phot 1 redusert akkumuleringsrespons. Den utvidede eksponeringen for lavt blått lys etterfølges av en trinnvis økning i blålysintensiteter hver time (5, 10, 30, 40, 50, 60, 90, 100 μmol foton m-2 s-1). % overføring i A. thaliana WT og phot 1 øker med hver økning i lysintensitet, noe som viser at kloroplastene beveger seg inn i unngåelsesresponsen, men dette er ikke sett i phot 2. Graden av endring i overføring i forhold til den mørke verdien (ΔT) avhenger av de eksakte blå lysintensitetene og kan variere avhengig av genotypen (figur 3C). Et eksempel vises om hastigheten på overføringsendringer (dT/dt) under de første svarene i overføringen når unngåelse utløses når den blå intensiteten økes fra 5 til 10 μmol foton m-2 s-1 (figur 3D). Hastigheten er den samme for WT og phot 1, mens den er veldig treg for phot 2 mutanter.
Figur 1: Oversikt over overføringsenheten. Bilde av den hjemmebygde overføringsenheten med kontrollenheten i den svarte boksen nederst til høyre og bladklemmene øverst og nederst til venstre (A). Nærbilde av kontrollenheten med PÅ/AV-knappen, SD-kortet for datalagringsfunksjonalitet og Bluetooth-skjoldet for trådløs kommunikasjon. Kabler kobler kontrollenheten til lysdioder (lysdioder) og fototransistorer. Mikrokontrolleren er plassert ved foten av instrumentet og bare kantene er synlige i dette bildet (B). De 3D-trykte svarte bladklemmene: Til venstre vises bladklemmedelen som holder LED-lampen, til høyre vises bladklemmedelen som holder fototransistoren. For å sette opp en løpetur, plasseres et fuktig filterpapir (med et hull på LED-ens størrelse) på klipsen uten å skjule LED-lampen. Deretter plasseres bladet i klipsen som dekker LED-lampen. Skjemaet viser at LED-lampen og fototransistoren (PT) er plassert overfor hverandre, nær bladet, når de to delene av hvert bladklemme er montert (C). Bladklemmer er plassert i 3D-trykte "båter" som er fylt med vann, og holder bladene og filterpapirene hydrert (D). Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Overføringsdata for et typisk A. thaliana-blad . Overføringsdata (T) for et A. thaliana blad som ble utsatt for mørke i 1 time, etterfulgt av 3 t lite lys (2 μmol foton m-2 s-1), etterfulgt av 1 t hver av mellomliggende (30 μmol foton m-2 s-1) og høyt blått lys (100 μmol foton m-2 s-1). Intensiteter i svakt lys induserte akkumuleringsresponsen, mens høyere lysintensiteter induserte forskjellige grader av en unngåelsesrespons. T-nivåene i mørket fungerer som grunnlinje (blå linje). % endringer i T relative mørke nivåer (ΔT) f.eks, ved maksimal akkumulering eller ulike nivåer av unngåelse (forskjeller til mørk T er indikert av de blå pilene) kan beregnes. I tillegg kan hastigheten som T endres med (dT/dt) f.eks. i den første fasen av unngåelsesresponsen beregnes fra skråningen av T plottet mot tiden (angitt av den blå trekanten). Ligningene vises under diagrammet. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: Kloroplastbevegelse i villtype og mutant A. thaliana blader. Mørktilpassede, modne blader ble utsatt for mørke i 4 timer, etterfulgt av en 7 timers eksponering for 2 μmol foton m-2 s-1, etterfulgt av en trinnvis klok økning i blått lysintensitet hver time (5, 10, 30, 40, 50, 60, 90, 100 μmol foton m-2 s-1). Gjennomsnittlig % Overføring (T) verdier (n = 20) av WT (A) samt phot 1 og phot 2 blader (B). Endring i % T i forhold til de mørke verdiene: Negative verdier indikerer at bladene viste en akkumuleringsrespons, mens positive verdier indikerer en unngåelsesrespons. Tallene til høyre angir den blå lysintensiteten som ΔT-dataene ble beregnet med. Fargevalget er det samme som i resten av figuren (C). dT/dt-dataene ble beregnet da bladene reagerte på en økning i blått lysintensitet fra 5 til 10 μmol foton m-2 s-1 og indikerer hastigheten som % T endret per time (D). Data for A og B er midler, for C og D betyr ± SD (n = 20). Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Smidig fil. Klikk her for å laste ned denne filen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Enheten er ekstremt enkel å bruke, men det er av avgjørende betydning å kalibrere hvert bladklemmeoppsett av overføringsenheten uavhengig av hverandre, siden plasseringen av lysdiodene og fototransistorene kan variere noe fra bladklemme til bladklips. Sørg for at lysdiodene og fototransistorene settes inn stabilt og kontroller kalibreringen på nytt hvis dataene virker av. Unngå å få vann på apparatet. Bladene i bladklemmene er plassert i "båter" fylt med vann for å unngå vannstress. Plasser disse båtene, for eksempel, i en lav rimmet plastbeholder atskilt fra kontrollenheten og IKKE slå dem over. Ikke koble fra eller bøy kabeltilkoblingene. Vær forsiktig når du setter bladene inn i bladklemmene og unngå å trekke eller bøye kablene for mye.
Det er viktig å mørktilpasse bladene lenge nok til å sikre at de opprinnelige overføringsverdiene representerer den mørke posisjonen. Kontroller at verdiene i den mørke perioden i enheten har vært stabile minst 30 minutter før du skinner blått lys på bladene. Hvis de ikke er det, tilpasser du bladene i en lengre periode før neste løp eller forlenger den mørke perioden i overføringsenheten for å overvåke hvor lang tid det tar før bladene når en jevn tilstand. Vanligvis presenteres overføringsdataene som % endring i overføring med en gitt blått lysintensitet i forhold til den mørke verdien (ΔT). Derfor er det avgjørende å oppnå de riktige grunnlinjeverdiene.
Det utforskende løpet kan brukes til alle A. thaliana mutanter (inkludert mutanter kjent for å påvirke andre aspekter av plantens fysiologi, for eksempel fotosyntese, myosin eller ukarakteriserte mutanter) eller forskjellige arter så lenge bladområdet er stort nok til å dekke LED-lampen i bladklemmen og bladene ikke er for tykke. Programmet kan enkelt tilpasses for å fylle alle behov fra en forsker, for eksempel kan blålysintensitetene endres innenfor områdene som har vist seg å fremkalle kloroplastbevegelse (reaksjonen metter rundt 100 μmol foton m-2 s-1), eksponeringstidene kan endres, antall påfølgende lysforhold kan endres. I tillegg kan blader forbehandles før de kjøres i enheten, for eksempel med hemmere av aktinpolymerisering eller signalveikomponenter, noe som er viktig for forskere som ønsker å fylle ut blankene i signalveien som regulerer kloroplastbevegelsen.
Som alle metoder har denne også sine begrensninger og ulemper. Prosedyren er avhengig av endringer i de optiske egenskapene til blader, nemlig hvor mye lys som overføres. Derfor fungerer det best med relativt tynne blader, mens tykke blader ofte ikke tillater tilstrekkelig overføring av rødt lys til å bli oppdaget utover støynivået. Det ville være mulig å endre overføringsenheten for å øke rødlysintensiteten som skinner på bladet og øke følsomheten til fototransistorene ved å endre motstandene. Siden metoden bare gir et integrert mål på bevegelsene til kloroplast i alle celler og cellelag, kan man gå glipp av noen subtile endringer, for eksempel kan kloroplaster som beveger seg i motsatte retninger føre til ingen netto endring av overføring. Spesielt når du arbeider med tidligere ukarakteriserte mutanter eller arter, er det viktig å utfylle overføringsresultatene med bilder av kloroplastposisjonering ved hjelp av mikroskopi. For eksempel ble det observert langsomme endringer i overføring som svar på endringer i blått lysintensitet i en A. thaliana mutant og kunne ha vært på grunn av en rekke årsaker. Mikroskopi viste at cellene bare hadde to kloroplaster som var mye større enn vanlige kloroplaster. Mutanten ble senere bekreftet å være kloroplastdivisjonens mutantbue6-125.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingen interessekonflikter.
Acknowledgments
Støtten ble gitt av fiskeprisen og en Wellesley College Faculty Award.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Aluminum foil | |||
| Dark adapted leaves | |||
| Filter paper | |||
| iPad with LeafSensor app installed (see Supplemental Info) | |||
| Pipette | Any | ||
| Petri dish | Any | ||
| Transmission device (see Supplemental info) | |||
| Water |
References
- Senn, G. Die Gestalts- und Lageveränderung der Pflanzenchromatophoren. , Wilhelm Engelmann. Leipzig, Germany. (1908).
- Zurzycki, J. The influence of chloroplast displacements on the optical properties of leaves. Acta Societatis Botanicorum Poloniae. 30, 503-527 (1961).
- Wada, M., Kagawa, T., Sato, Y.
- Wada, M.
- Kasahara, M., Kagawa, T., Oikawa, K., Suetsugu, N., Miyao, M., Wada, M. Chloroplast avoidance movement reduces photodamage in plants. Nature. 420, 829-832 (2002).
- Davis, P. A., Hangarter, R. P. Chloroplast movement provides photoprotection to plants by redistributing PSII damage within leaves. Photosynthesis Research. 112, 153-161 (2012).
- Howard, M. M., Bae, A., Königer, M. The importance of chloroplast movement, nonphotochemical quenching, and electron transport rates in light acclimation and tolerance to high light in Arabidopsis thaliana. American Journal of Botany. 106 (11), 1-10 (2019).
- Gotoh, E., et al. Chloroplast accumulation response enhances leaf photosynthesis and plant biomass production. Plant Physiology. 178, 1358-1369 (2018).
- Howard, M. M., Bae, A., Pirani, Z., Van, N., Königer, M. Impairment of chloroplast movement reduces growth and delays reproduction of Arabidopsis thaliana in natural and controlled conditions. American Journal of Botany. 107 (9), 1309-1318 (2020).
- Trojan, A., Gabryś, H. Chloroplast distribution in Arabidopsis thaliana (L.) depends on light conditions during growth. Plant Physiology. 111, 419-425 (1996).
- Oikawa, K., et al. Chloroplast unusual positioning is essential for proper chloroplast positioning. The Plant Cell. 15, 2805-2815 (2003).
- Königer, M., Bollinger, N. Chloroplast movement behavior varies widely among species and does not correlate with high light stress tolerance. Planta. 236, 411-426 (2012).
- Kagawa, T., et al. Arabidopsis NPL1: a phototropin homolog controlling the chloroplast high-light avoidance response. Science. 291, 2138-2141 (2001).
- Berg, R., et al. A simple low-cost microcontroller-based photometric instrument for monitoring chloroplast movement. Photosynthesis Research. 87, 303-311 (2006).
- Johansson, H., Zeidler, M. Automatic chloroplast movement analysis. Molecular Biology. 1398, Springer. Germany. 29-35 (2016).
- Briggs, W. R., et al.
- Jarillo, J. A., et al. Phototropin-related NPL1 controls chloroplast relocation induced by blue light. Nature. 410, 952-954 (2001).
- Sakai, T. Arabidopsis nph1 and npl1: blue light receptors that mediate both phototropism and chloroplast relocation. Proceedings of the National Academy of Sciences, USA. 98 (12), 6969-6974 (2001).
- Wada, M., Kong, S. -G.
- Wen, F., Xing, D., Zhang, L. Hydrogen peroxide is involved in high blue light-induced chloroplast avoidance movements in Arabidopsis. Journal of Experimental Botany. 59 (10), 2891-2901 (2008).
- Tlalka, M., Fricker, M. The role of calcium in blue-light dependent chloroplast movement in Lemna trisulca L. The Plant Journal. 20, 461-473 (1999).
- Königer, M., Bollinger, N. Chloroplast movement behavior varies widely among species and does not correlate with high light stress tolerance. Planta. 236, 411-426 (2012).
- Higa, T., Wada, M. Chloroplast avoidance movement is not functional in plants grown under strong sunlight. Plant, Cell and Environment. 39, 871-882 (2016).
- Arduino. Arduino.cc. , Available from: https://www.arduino.cc (2021).
- Königer, M., Delamaide, J. A., Marlow, E. D., Harris, G. C. thaliana leaves with altered chloroplast numbers and chloroplast movement exhibit impaired adjustments to both low and high light. Journal of Experimental Botany. 59, 2285-2297 (2008).
