Summary
Muchas especies de plantas cambian el posicionamiento de los cloroplastos para optimizar la absorción de la luz. Este protocolo describe cómo usar un instrumento sencillo y casero para investigar el movimiento del cloroplasto en las hojas de Arabidopsis thaliana utilizando cambios en la transmisión de luz a través de una hoja como proxy.
Abstract
Se ha demostrado que el movimiento del cloroplasto en las hojas ayuda a minimizar la fotoinhibición y aumentar el crecimiento bajo ciertas condiciones. Se puede aprender mucho sobre el movimiento del cloroplasto estudiando el posicionamiento del cloroplasto en las hojas utilizando, por ejemplo, microscopía de fluorescencia confocal, pero el acceso a este tipo de microscopía es limitado. Este protocolo describe un método que utiliza los cambios en la transmisión de las hojas como un proxy para el movimiento del cloroplasto. Si los cloroplastos se extienden para maximizar la intercepción de la luz, la transmisión será baja. Si los cloroplastos se mueven hacia las paredes celulares anticlinales para evitar la luz, la transmisión será mayor. Este protocolo describe cómo usar un instrumento sencillo y casero para exponer las hojas a diferentes intensidades de luz azul y cuantificar los cambios dinámicos en la transmisión de las hojas. Este enfoque permite a los investigadores describir cuantitativamente el movimiento del cloroplasto en diferentes especies y mutantes, estudiar los efectos de los productos químicos y los factores ambientales en él, o detectar nuevos mutantes, por ejemplo, para identificar los componentes faltantes en el proceso que conduce desde la percepción de la luz hasta el movimiento de los cloroplastos.
Introduction
La luz es esencial para la fotosíntesis, el crecimiento y el desarrollo de las plantas. Es uno de los factores abióticos más dinámicos, ya que las intensidades de luz no solo cambian en el transcurso de una estación o día, sino también de manera rápida e impredecible dependiendo de la cubierta de nubes. A nivel de la hoja, las intensidades de luz también están influenciadas por la densidad y la naturaleza de la vegetación circundante y el propio dosel de la planta. Un mecanismo importante que permite a las plantas optimizar la intercepción de la luz en condiciones de luz variables es la capacidad de los cloroplastos para moverse en respuesta a los estímulos de la luz azul1,2. En condiciones de poca luz, los cloroplastos se extienden perpendicularmente a la luz (a lo largo de las paredes celulares periclinales) en una llamada respuesta de acumulación, maximizando la intercepción de la luz y, por lo tanto, la fotosíntesis. En condiciones de alta luz, los cloroplastos se mueven hacia la pared celular anticlinal en una llamada respuesta de evitación, minimizando la intercepción de la luz y el peligro de fotoinhibición. En muchas especies, los cloroplastos también asumen una posición oscura específica, que es distinta de las posiciones de acumulación y evitación y a menudo intermediaria entre esas dos3,4. Diversos estudios han demostrado que el movimiento del cloroplasto no solo es importante para la tolerancia al estrés a corto plazo de las hojas5,6,7, sino también para el crecimiento y éxito reproductivo de las plantas, especialmente en condiciones de luz variable8,9.
El movimiento del cloroplasto se observa fácilmente en tiempo real en ciertos especímenes vivos (por ejemplo, algas o plantas de hojas delgadas como Elodea) utilizando microscopía de luz1. Sin embargo, el estudio del movimiento del cloroplasto en la mayoría de las hojas requiere un pretratamiento para inducir el movimiento del cloroplasto, la fijación química y la preparación de secciones transversales antes de ver las muestras bajo un microscopio de luz10. Con la introducción de la microscopía láser confocal, también fue posible obtener imágenes de la disposición 3D de cloroplastos en hojas intactas o fijas4,11,12. Estas técnicas de imagen ayudan en gran medida a la comprensión del movimiento del cloroplasto al proporcionar información cualitativa importante. Cuantificar el posicionamiento del cloroplasto (por ejemplo, como porcentaje de cloroplastos en las posiciones periclinal o anticlinal en estas imágenes o el porcentaje de área cubierta por cloroplastos por superficie celular total) también es posible pero requiere bastante tiempo, especialmente si se realiza a los intervalos necesarios para capturar cambios rápidos en el posicionamiento10,8 . La forma más sencilla de mostrar si las hojas adaptadas a la oscuridad de una determinada especie o mutantes son capaces de mover el cloroplasto en la respuesta de evitación es cubriendo la mayor parte del área de una hoja para mantener los cloroplastos en la oscuridad mientras se expone una tira de la hoja a la luz alta. Después de un mínimo de 20 minutos de alta exposición a la luz, los cloroplastos en el área expuesta se habrán movido a la posición de evitación, y la tira expuesta será visiblemente más clara en color que el resto de la hoja. Esto es cierto para el tipo salvaje A. thaliana, pero no para algunos de los mutantes del movimiento del cloroplasto descritos con más detalle más adelante13. Este método y sus modificaciones (por ejemplo, invertir qué partes de la hoja están expuestas, cambiar las intensidades de la luz) son útiles para detectar un gran número de mutantes e identificar mutantes nulos que carecen de la capacidad de exhibir una respuesta de evitación o acumulación o ambas. Sin embargo, no proporciona información sobre los cambios dinámicos en el movimiento del cloroplasto.
En contraste, el método descrito aquí permite la cuantificación del movimiento del cloroplasto en hojas intactas utilizando cambios en la transmisión de luz a través de una hoja como un proxy para el movimiento general del cloroplasto: en condiciones en que los cloroplastos se extienden en las células mesófilas en la respuesta de acumulación, se transmite menos luz a través de la hoja que cuando muchos cloroplastos están en una respuesta de evitación, posicionándose a lo largo de las paredes celulares anticlinales. Por lo tanto, los cambios en la transmisión pueden ser utilizados como un proxy para el movimiento general del cloroplasto en las hojas14. Los detalles del instrumento se describen en otra parte (consulte el Archivo complementario), pero básicamente, el instrumento utiliza luz azul para activar el movimiento del cloroplasto y mide cuánta luz roja se transmite a través de esa hoja a intervalos establecidos. Más recientemente, se ha descrito una modificación de este sistema, que utiliza un lector de microplacas modificado de 96 pocillos, un LED azul, una computadora y una incubadora de temperatura controlada15.
La opción de utilizar una combinación de métodos, incluida la evaluación óptica de las hojas para el cribado, seguida de la medición de los cambios dinámicos en la transmisión y el uso de la microscopía, ha ayudado en gran medida a nuestra comprensión tanto de los mecanismos subyacentes como de la importancia fisiológica / ecológica del movimiento del cloroplasto. Por ejemplo, condujo al descubrimiento y caracterización de varios mutantes, que se ven afectados en aspectos específicos de sus movimientos. Por ejemplo, los mutantes de A. thaliana phot 1 carecen de la capacidad de acumular sus cloroplastos con poca luz, mientras que los mutantes de phot 2 carecen de la capacidad de realizar una reacción de evitación. Estos fenotipos se deben a un deterioro en dos receptores de luz azul respectivos16,17,18. Por el contrario, los mutantes chup1 carecen de la capacidad de formar filamentos de actina adecuados alrededor de los cloroplastos, que son esenciales para mover los cloroplastos a la posición deseada dentro de una célula11,19. Además de los estudios mutantes, los investigadores han evaluado los efectos de varios inhibidores en el movimiento del cloroplasto para dilucidar los aspectos mecanicistas del proceso. Por ejemplo, se utilizaron sustancias químicas como el H2O2 y varios antioxidantes para investigar los efectos de esta molécula de señalización en el movimiento del cloroplasto20. Se utilizaron diversos inhibidores para dilucidar el papel del calcio en el movimiento del cloroplasto21. Además de ayudar a descubrir los mecanismos del movimiento del cloroplasto, estos métodos se pueden utilizar para comparar el movimiento del cloroplasto en varias especies o mutantes cultivados en diferentes condiciones en un intento de comprender el contexto ecológico y evolutivo de este comportamiento. Por ejemplo, se ha demostrado que el alcance de los efectos de diversas mutaciones en la vía de movimiento del cloroplasto depende de las condiciones de crecimiento7,9, y que las plantas adaptadas al sol no parecen mover mucho sus cloroplastos. Por el contrario, el movimiento es muy importante para las plantas de sombra10,22,23.
Este documento de métodos, centrado en la planta modelo A. thaliana, describe cómo utilizar un dispositivo de transmisión que es una versión actualizada de un instrumento desarrollado previamente9. Si bien este instrumento no está disponible comercialmente, las personas con una comprensión básica de la electrónica o la ayuda de colegas y estudiantes de ingeniería o física podrán construir el instrumento utilizando piezas asequibles y siguiendo las instrucciones detalladas (consulte el Archivo complementario). La plataforma de código abierto utilizada para construir el instrumento tiene un amplio soporte web y un foro comunitario que ofrece ayuda en caso de que surjan problemas24.
El protocolo se centra en cómo usar el instrumento para determinar los cambios en la transmisión de la hoja en una carrera exploratoria estándar que expone una hoja a una amplia gama de condiciones de luz y captura las reacciones de oscuridad, acumulación y evitación de A. thaliana. Estas tiradas se pueden modificar dependiendo del objetivo del experimento y se pueden utilizar con la mayoría de las especies de plantas. El documento proporciona ejemplos de datos de transmisión de A. thaliana wildtype y varios mutantes y muestra cómo analizar más a fondo los datos.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Preparación de hojas para una carrera
- Coloque 8 plantas de A. thaliana en la oscuridad durante la noche (> 6 h funciona para la mayoría de las especies) para asegurarse de que los cloroplastos se muevan a su posición oscura. Todas las réplicas comienzan con valores de transmisión comparables.
- Alternativamente, coloque 8 hojas completas en una placa de Petri con un papel de filtro húmedo en la parte inferior, cierre la placa de Petri y envuélvala con papel de aluminio.
2. Probar si el dispositivo de transmisión funciona
- Conecte el dispositivo de transmisión a una fuente de alimentación estable y pulse el interruptor de encendido (botón ON/OFF) del dispositivo para restablecer el instrumento (Figura 1A,B).
- Conecte el iPad a una fuente de alimentación estable, presione el botón Pantalla de inicio para activar la pantalla e ingrese el código de acceso para iniciar sesión.
- Presione el ícono Configuración , presione el ícono Pantalla y brillo , presione Bloqueo automático y seleccione Nunca presionando esta opción para asegurarse de que la pantalla permanezca encendida permanentemente. De lo contrario, el programa dejará de ejecutarse cuando la pantalla entre en reposo. Presione el botón Pantalla de inicio para volver a la pantalla principal.
- Presione dos veces el botón Pantalla de inicio para ver qué aplicaciones están abiertas y ciérrelas todas deslizándolas hacia la parte superior de la pantalla. Presione el botón Pantalla de inicio para volver a la pantalla principal.
- Busque la aplicación LeafSensor en la pantalla principal o deslizando el dedo hacia la izquierda o hacia la derecha. Pulse el icono de la app para abrirla (ver Archivo Complementario). Aparecerá una pantalla verde con texto y campos blancos para ingresar la información.
- Asegúrese de que la palabra Conectado se vea en la parte inferior de la pantalla, ya que indica que la aplicación se está comunicando con el dispositivo de transmisión. Si aparece el mensaje 'Adafruit NOT Found', verifique que el dispositivo esté enchufado y presione el botón de inicio en el dispositivo nuevamente.
- Rellene los primeros 4 campos de la página de la aplicación para nombrar el experimento y configurar las condiciones para una breve prueba sin hojas y con los clips de hojas abiertos:
- Asigne un nombre al experimento (use 8 o menos letras o números en mayúsculas), por ejemplo, escribiendo TEST en el campo llamado Expt Name.
- Elija cuántas intensidades de luz azul diferentes se utilizarán en el experimento, por ejemplo, escribiendo 3 en el campo llamado # Intensidades de luz.
- Elija las intensidades de luz azul para esta ejecución (elija un entero entre 0 y 3000 y separe cada número del siguiente con una coma; consulte Archivo complementario sobre cómo convertir estos números en intensidades de luz azul reales de LED), por ejemplo, escribiendo 0,100,1000 en el campo llamado Intensidades azules.
- Elija el período de tiempo que cada intensidad de luz azul brillará en la hoja (separe cada número del siguiente con una coma), por ejemplo, escribiendo 2,2,2 en el campo llamado Duración azul (minutos).
- Presione Iniciar experimento en la sección central de la pantalla. En la parte inferior de la pantalla aparecerán 8 guiones y el mensaje Iniciando experimento .
- Asegúrese de que no se emita luz desde los LED durante los primeros dos minutos, luego se emita luz azul débil y después de 2 minutos la intensidad de la luz azul está aumentando.
- Asegúrese de que los LED emitan luz roja intensa una vez por minuto para las mediciones.
NOTA: A medida que se ejecuta el experimento, los números aparecerán en la página de la aplicación para cada uno de los ocho sensores, y los datos se actualizarán una vez por minuto. Asegúrese de que los números de salida de los fotodiodos sean alrededor de 1000-1023 (si la habitación está oscura). Una actualización en la parte inferior izquierda muestra cuántas mediciones se realizaron hasta ahora, por ejemplo, se realizó 1 de 6 mediciones (una medición por minuto). - Cuando termine el experimento, compruebe la apariencia del experimento finalizado en la parte inferior izquierda de la página de la aplicación. Ahora el instrumento está listo para una carrera con hojas.
- Presione dos veces el botón de la pantalla de inicio, deslice el dedo hacia fuera de la aplicación y ábrala nuevamente. Pulse el botón ON/OFF del instrumento para restablecerlo.
3. Configuración de hojas en los clips de hojas
NOTA: Este paso debe hacerse en la oscuridad con una fuente de luz verde (por ejemplo, coloque un filtro verde frente a una bombilla) para evitar inducir el movimiento del cloroplasto. Alternativamente, use luz blanca muy baja y un período oscuro prolongado en los clips de las hojas. Recuerde, una parte del clip de hoja contiene el LED (abertura más grande), mientras que la otra sostiene el fototransistor (Figura 1C).
- Si las plantas están enteras adaptadas a la oscuridad, elija 8 hojas lo suficientemente anchas como para cubrir los LED. De lo contrario, retire las hojas de la placa de Petri. Prepare 8 tiras de papel de filtro de aproximadamente la longitud de un clip de hoja y con un orificio perforado en la parte superior para no cubrir el LED.
- Humedezca el papel de filtro y colóquelo en la parte del clip de hoja que sostiene el LED. Repita esto para cada uno de los clips de ocho hojas.
- Coloque cada hoja en la parte superior del papel de filtro húmedo de su clip de hoja. Asegúrese de que el lado correcto de la hoja esté orientado hacia el LED (generalmente los experimentos se realizan con la superficie de la hoja adaxial frente al LED).
- Evite colocar las costillas medias de la hoja encima de los LED y, para obtener resultados más consistentes, coloque partes similares de cada hoja (por ejemplo, la sección más ancha de la hoja) sobre el LED.
- Coloque la otra parte del clip de hoja con el fototransistor en la parte superior. Use una banda elástica para mantener unidas las dos partes del clip de hoja si es necesario (Figura 1C, D).
- Coloque cada clip de hoja en su "bote" y llene los depósitos con agua con una pipeta. Asegúrese de que la hoja o al menos el papel de filtro toque el agua para evitar la deshidratación de las hojas durante la carrera (Figura 1D).
4. Realización de una carrera
NOTA: Para una carrera exploratoria estándar, comience con 4 h de oscuridad (0 μmol de fotón m-2 s-1), seguido de 7 h de luz azul baja (2 μmol de fotón m-2 s-1), seguido de 60 min cada uno de 5, 10, 30, 40, 50, 60, 90, 100 μmol de fotón m-2 s-1 de luz azul. Esto inducirá a las hojas a exhibir su transmisión oscura, inducirá el movimiento del cloroplasto hacia la acumulación máxima y mostrará diferentes grados de respuesta de evitación.
- Configure la aplicación LeafSensor en el iPad siguiendo los pasos que se describen a continuación.
- Escriba EXPLORA1 en el campo denominado Expt Name.
- Escriba 10 en el campo denominado # Intensidades de luz.
- Escriba 0,1,60,160,550,750,950,1150,1350,1950 en el campo llamado Intensidades azules.
- Escriba 240,420,60,60,60,60,60,60,60,60,60 en el campo denominado Duración azul.
- Presione Iniciar experimento. Después del primer minuto, los valores de salida (generalmente entre 990 y 820) aparecerán en la pantalla. Si los valores están lejos, compruebe si las hojas se colocaron correctamente en los clips de las hojas.
- Cuando finalice la ejecución, asegúrese de que el mensaje Experimento finalizado aparezca en la parte inferior izquierda de la pantalla. Los datos se guardarán automáticamente.
- Coloque la pantalla en posición vertical (no horizontal). Dos nuevas opciones aparecerán en la pantalla, a saber, Guardar y Utilidades.
- Presione Utilidades y aparecerá una lista de archivos guardados. Seleccione el archivo de interés, en este caso, EXPLORA1.
- Debajo de la lista de archivos, busque Selected Expt: EXPLORA1. Presione Correo electrónico, ingrese una dirección de correo electrónico y el archivo de datos se adjuntará automáticamente al mensaje. Pulse Enviar.
NOTA: Si hay un retraso prolongado hasta que lleguen los archivos, reinicie la aplicación y envíe el archivo nuevamente.
- Si se anuló una ejecución, pero los datos hasta ese momento son de interés, presione Guardar antes de seleccionar Utilidades. Después de varias ejecuciones, limpie el espacio de memoria: presione Utilidades, seleccione un archivo a la vez, deslice el dedo hacia la izquierda junto al archivo y presione Eliminar para eliminar el archivo.
- Presione Atrás para ejecutar otro experimento o, si ha terminado, presione el botón Pantalla de inicio, deslice el dedo a la pantalla principal, presione Configuración, presione Pantalla y brillo, presione Bloqueo automático y presione 2 minutos.
5. Análisis de datos
- Descargue el archivo EXPLORA1 desde el correo electrónico, agregue la extensión .csv al archivo, haga doble clic en el archivo. Los datos se ordenarán en una hoja de cálculo con los datos de los ocho sensores diferentes ordenados en columnas separadas. La última columna muestra el tiempo (en segundos) en el que se recopilaron los datos. Elimine la primera fila debajo de los encabezados (Sensor1-8) si contiene datos sin sentido.
- Configure una hoja de datos maestra que contendrá los resultados de cada sensor en una hoja separada y que convierte los valores de salida en valores de transmisión de % utilizando las ecuaciones obtenidas de la calibración de cada clip de hoja y sensor (consulte Archivo complementario).
- Copie cada conjunto de datos en una hoja de datos independiente (por ejemplo, la columna A contiene la hora; la columna C contiene los datos del sensor1).
- Configure la columna B para que convierta el tiempo de segundos a minutos. Configure la columna D para que contenga la fórmula para convertir el voltaje a % de transmisión utilizando la ecuación de la calibración.
- Configure una hoja de datos similar para cada sensor y recuerde que la fórmula utilizada para convertir la salida de voltaje en % los valores de transmisión pueden ser diferentes para cada sensor.
- Gráfico % transmisión (T) contra el tiempo, min (Figura 2).
- Guarde la hoja de datos con un nuevo nombre para que la hoja de datos maestra se pueda reutilizar.
- Para analizar más a fondo los datos (Figura 2), calcule la acumulación de ΔT (%) (por ejemplo, el cambio de T en la acumulación máxima en comparación con T en la oscuridad), la evitación de ΔT ( %) (por ejemplo, el cambio de T en la evitación máxima en comparación con T en la oscuridad ) o dT / dt (% / h) (por ejemplo, el cambio en T durante la parte más rápida de la reacción de acumulación o evitación). Para más detalles, véase 8.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Las diferentes partes del dispositivo de transmisión se muestran en la Figura 1. El microcontrolador es la unidad de control del dispositivo y controla las condiciones de luz que experimentan las hojas, aseguradas en clips de hojas negras, y almacena los datos de transmisión de luz que recibe (Figura 1A, B). Un primer plano de la unidad de control del instrumento muestra el botón ON/ OFF, la tarjeta SD para la capacidad de almacenamiento de datos, el escudo Bluetooth (que envía los datos a la aplicación LeafSensor ) y los cables que se conectan a los LED (diodos emisores de luz) y fototransistores. El microcontrolador se coloca en la base del instrumento, y sólo los bordes son visibles en la imagen (Figura 1B). Los clips de hojas negras impresos en 3D mantienen las hojas, los LED y los fototransistores en su lugar. Se coloca un papel de filtro húmedo en la parte de los clips de hoja con el LED de modo que el LED no esté obstruido, y se coloca una hoja adaptada a la oscuridad con la superficie de la hoja adaxial frente al LED. El esquema muestra que el LED y el fototransistor están colocados en los lados opuestos de la hoja. El LED puede emitir luz azul o roja. La luz azul se utiliza para inducir el movimiento del cloroplasto y se apaga durante un breve período cada minuto durante el cual la luz roja de medición brilla sobre la hoja. El fototransistor, colocado en el lado opuesto de la hoja, detecta cuánta luz roja se transmite a través de la hoja y envía los datos al microcontrolador y a la tarjeta SD (Figura 1C). Las dos partes del clip de la hoja se ensamblan y se colocan en un "bote" impreso en 3D que se llena de agua y ayuda a mantener la hoja húmeda durante el experimento (Figura 1D).
La figura 2 muestra un conjunto de datos típico en el que los datos de % de transmisión se trazan contra el tiempo (min). Esta carrera de transmisión en particular implicó 1 h de oscuridad, seguida de 3 h de luz azul baja (2 μmol de fotón m-2 s-1), y 1 h cada una de intensidades intermedias (30 μmol de fotón m-2 s-1) y alta luz azul (100 μmol de fotón m-2 s-1). Los datos muestran que la transmisión en A. thaliana disminuye a bajas intensidades de luz (respuesta de acumulación), mientras que una respuesta de evitación se induce cuando las intensidades de luz aumentan aún más. Esta no es una respuesta de todo o nada y los grados de cambios en relación con los valores oscuros dependen de las intensidades exactas de la luz azul. Estos cambios porcentuales en la transmisión (ΔT) se pueden calcular utilizando las fórmulas que se muestran debajo de los datos. Además, la velocidad de los cambios de transmisión (dT/dt) durante los cambios iniciales en la transmisión cuando se desencadena una respuesta de acumulación o evitación se puede calcular utilizando la pendiente de la curva.
Se muestran los valores medios de % de transmisión de tipo salvaje (WT) (Figura 3A), así como de hojas mutantes de A. thaliana phot 1 y phot 2 (Figura 3B) durante 19 h de larga duración. Tales recorridos de transmisión exploratorios extendidos son útiles para establecer qué intensidades de luz azul usar en futuras carreras. Las hojas se expusieron por primera vez a 4 h de oscuridad, y los valores de transmisión consistentes indican que las hojas estaban completamente adaptadas a la oscuridad, lo que hará que los datos entre réplicas sean más consistentes. Durante las siguientes 7 h, las hojas fueron expuestas a luz azul baja (2 μmol de fotón m-2 s-1). En WT y phot 2, la disminución rápida inicial en la transmisión es seguida por una disminución lenta que indica que los cloroplastos se estaban moviendo hacia la respuesta de acumulación. Dependiendo de la especie utilizada, puede tomar diferentes cantidades de tiempo para obtener la transmisión más baja posible. En muchos casos, un investigador solo puede estar interesado en comparar varios mutantes en un punto de tiempo determinado, por lo que la exposición a muy poca luz puede limitarse a una hora. En comparación con WT, phot 1 muestra una respuesta de acumulación reducida. La exposición prolongada a la luz azul baja es seguida por un aumento gradual de las intensidades de luz azul cada hora (5, 10, 30, 40, 50, 60, 90, 100 μmol de fotón m-2 s-1). El % de transmisión en A. thaliana WT y phot 1 aumenta con cada aumento en la intensidad de la luz, lo que demuestra que los cloroplastos se mueven hacia la respuesta de evitación, pero esto no se ve en phot 2. Los grados de cambio en la transmisión en relación con el valor oscuro (ΔT) dependen de las intensidades exactas de la luz azul y pueden diferir según el genotipo (Figura 3C). Se muestra un ejemplo de la velocidad de los cambios de transmisión (dT/dt) durante las respuestas iniciales en la transmisión cuando se activa la evitación a medida que aumenta la intensidad azul de 5 a 10 μmol de fotón m-2 s-1 (Figura 3D). La velocidad es la misma para WT y phot 1, mientras que es muy lenta para los mutantes de phot 2.
Figura 1: Descripción general del dispositivo de transmisión. Imagen del dispositivo de transmisión construido en casa con la unidad de control en la caja negra en la parte inferior derecha y los clips de hoja en la parte superior e inferior izquierda (A). Primer plano de la unidad de control con el botón ON/OFF, la tarjeta SD para la capacidad de almacenamiento de datos y el escudo Bluetooth para la comunicación inalámbrica. Los cables conectan la unidad de control a los diodos emisores de luz (LED) y fototransistores. El microcontrolador se coloca en la base del instrumento y solo los bordes son visibles en esta imagen (B). Los clips de hoja negros impresos en 3D: a la izquierda se muestra la parte del clip de hoja que sostiene el LED, a la derecha se muestra la parte del clip de hoja que sostiene el fototransistor. Para configurar una carrera, se coloca un papel de filtro húmedo (con un orificio del tamaño del LED) en el clip sin oscurecer el LED. Luego, la hoja se coloca en el clip que cubre el LED. El esquema muestra que el LED y el fototransistor (PT) están ubicados uno frente al otro, cerca de la hoja, cuando se ensamblan las dos partes de cada clip de hoja (C). Los clips de hojas se colocan en "botes" impresos en 3D que se llenan de agua, manteniendo las hojas y los papeles de filtro hidratados (D). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Datos de transmisión de una hoja típica de A. thaliana. Datos de transmisión (T) para una hoja de A. thaliana que estuvo expuesta a la oscuridad durante 1 h, seguida de 3 h de luz baja (fotón de 2 μmol m-2 s-1), seguido de 1 h cada una de luz azul intermedia (30 μmol de fotón m-2 s-1) y alta (fotón de 100 μmol m-2 s-1). Las intensidades de luz bajas indujeron la respuesta de acumulación, mientras que las intensidades de luz más altas indujeron diferentes grados de respuesta de evitación. Los niveles T en la oscuridad sirven como línea de base (línea azul). Se puede calcular el % de cambios en T en relación con los niveles oscuros (ΔT), por ejemplo, en la acumulación máxima o en diferentes niveles de evitación (las diferencias con T oscura se indican con las flechas azules). Además, la velocidad con la que T cambia (dT/dt), por ejemplo, durante la fase inicial de la respuesta de evitación se puede calcular a partir de la pendiente de T trazada contra el tiempo (indicada por el triángulo azul). Las ecuaciones se muestran debajo del gráfico. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Movimiento del cloroplasto en hojas de A. thaliana de tipo salvaje y mutante. Las hojas maduras adaptadas a la oscuridad se expusieron a la oscuridad durante 4 h, seguidas de una exposición de 7 h a 2 μmol de fotón m-2 s-1, seguida de un aumento gradual en la intensidad de la luz azul cada hora (5, 10, 30, 40, 50, 60, 90, 100 μmol de fotón m-2 s-1). Valores medios de % transmisión (T) (n = 20) de WT (A), así como de hojas de phot 1 y phot 2 (B). Cambio en % T en relación con los valores oscuros: los valores negativos indican que las hojas mostraron una respuesta de acumulación, mientras que los valores positivos indican una respuesta de evitación. Los números de la derecha indican la intensidad de la luz azul a la que se calcularon los datos de ΔT. El esquema de color es el mismo que en el resto de la figura (C). Los datos de dT/dt se calcularon como hojas que respondieron a un aumento en la intensidad de la luz azul de 5 a 10 μmol de fotón m-2 s-1 e indican la velocidad con la que % T cambió por hora (D). Los datos para A y B son medias, para C y D significan ± SD (n = 20). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Archivo suplolentario. Haga clic aquí para descargar este archivo.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
El dispositivo es extremadamente fácil de usar, pero es de crucial importancia calibrar cada configuración de clip de hoja del dispositivo de transmisión de forma independiente, ya que el posicionamiento de los LED y fototransistores puede variar ligeramente de un clip de hoja a otro. Asegúrese de que los LED y los fototransistores se inserten de manera estable y vuelva a verificar la calibración si los datos parecen estar apagados. Evite que entre agua en el dispositivo. Las hojas en los clips de las hojas se colocan en "botes" llenos de agua para evitar el estrés hídrico. Coloque estos botes, por ejemplo, en un recipiente de plástico de borde bajo separado de la unidad de control y NO los derribe. No desenchufe ni doble las conexiones de los cables. Tenga cuidado al insertar hojas en los clips de las hojas y evite tirar o doblar demasiado los cables.
Es importante adaptar las hojas a la oscuridad el tiempo suficiente para garantizar que los valores de transmisión iniciales representen la posición oscura. Verifique que los valores durante el período oscuro en el dispositivo hayan sido estables al menos 30 minutos antes de hacer brillar la luz azul sobre las hojas. Si no lo están, adapte las hojas a la oscuridad durante un período de tiempo más largo antes de la próxima ejecución o extienda el período oscuro en el dispositivo de transmisión para controlar cuánto tiempo tardan las hojas en alcanzar un estado estacionario. Normalmente, los datos de transmisión se presentan como % de cambio en la transmisión a una intensidad de luz azul dada en relación con el valor oscuro (ΔT). Por lo tanto, es crucial obtener los valores de referencia correctos.
La ejecución exploratoria se puede usar para cualquier mutante de A. thaliana (incluidos los mutantes que se sabe que afectan otros aspectos de la fisiología de una planta, por ejemplo, fotosíntesis, miosina o mutantes no caracterizados) o diferentes especies, siempre que el área de la hoja sea lo suficientemente grande como para cubrir el LED en el clip de la hoja y las hojas no sean demasiado gruesas. El programa se puede adaptar fácilmente para satisfacer cualquier necesidad de un investigador, por ejemplo, las intensidades de luz azul se pueden cambiar dentro de los rangos que se ha demostrado que provocan el movimiento del cloroplasto (la reacción satura alrededor de 100 μmol de fotón m-2 s-1), los tiempos de exposición se pueden alterar, el número de condiciones de luz consecutivas se puede cambiar. Además, las hojas se pueden tratar previamente antes de ejecutarse en el dispositivo, por ejemplo, con inhibidores de la polimerización de actina o componentes de la vía de señalización, lo cual es importante para los investigadores que desean completar los espacios en blanco en la vía de señalización que regula el movimiento del cloroplasto.
Como todo método, este también tiene sus limitaciones e inconvenientes. El procedimiento se basa en cambios en las propiedades ópticas de las hojas, es decir, cuánta luz se transmite. Por lo tanto, funciona mejor con hojas relativamente delgadas, mientras que las hojas gruesas a menudo no permiten que se detecte suficiente transmisión de luz roja más allá del nivel de ruido. Sería posible modificar el dispositivo de transmisión para aumentar la intensidad de la luz roja que brilla sobre la hoja y aumentar la sensibilidad de los fototransistores cambiando las resistencias. Dado que el método solo proporciona una medida integrada de los movimientos del cloroplasto en todas las células y capas celulares, uno puede pasar por alto algunos cambios sutiles, por ejemplo, los cloroplastos que se mueven en direcciones opuestas pueden resultar en ningún cambio neto de transmisión. Especialmente cuando se trabaja con mutantes o especies previamente no caracterizadas, es importante complementar los resultados de transmisión con imágenes de posicionamiento de cloroplastos mediante microscopía. Por ejemplo, se observaron cambios lentos en la transmisión en respuesta a cambios en la intensidad de la luz azul en un mutante de A. thaliana y podrían haberse debido a una serie de razones. La microscopía reveló que las células solo tenían dos cloroplastos que eran mucho más grandes que los cloroplastos normales. Más tarde se confirmó que el mutante era el mutante de la división de cloroplastos arc6-125.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Los autores no tienen conflictos de intereses.
Acknowledgments
La financiación fue proporcionada por un Premio Fiske y un Premio de la Facultad de Wellesley College.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Aluminum foil | |||
| Dark adapted leaves | |||
| Filter paper | |||
| iPad with LeafSensor app installed (see Supplemental Info) | |||
| Pipette | Any | ||
| Petri dish | Any | ||
| Transmission device (see Supplemental info) | |||
| Water |
References
- Senn, G. Die Gestalts- und Lageveränderung der Pflanzenchromatophoren. , Wilhelm Engelmann. Leipzig, Germany. (1908).
- Zurzycki, J. The influence of chloroplast displacements on the optical properties of leaves. Acta Societatis Botanicorum Poloniae. 30, 503-527 (1961).
- Wada, M., Kagawa, T., Sato, Y.
- Wada, M.
- Kasahara, M., Kagawa, T., Oikawa, K., Suetsugu, N., Miyao, M., Wada, M. Chloroplast avoidance movement reduces photodamage in plants. Nature. 420, 829-832 (2002).
- Davis, P. A., Hangarter, R. P. Chloroplast movement provides photoprotection to plants by redistributing PSII damage within leaves. Photosynthesis Research. 112, 153-161 (2012).
- Howard, M. M., Bae, A., Königer, M. The importance of chloroplast movement, nonphotochemical quenching, and electron transport rates in light acclimation and tolerance to high light in Arabidopsis thaliana. American Journal of Botany. 106 (11), 1-10 (2019).
- Gotoh, E., et al. Chloroplast accumulation response enhances leaf photosynthesis and plant biomass production. Plant Physiology. 178, 1358-1369 (2018).
- Howard, M. M., Bae, A., Pirani, Z., Van, N., Königer, M. Impairment of chloroplast movement reduces growth and delays reproduction of Arabidopsis thaliana in natural and controlled conditions. American Journal of Botany. 107 (9), 1309-1318 (2020).
- Trojan, A., Gabryś, H. Chloroplast distribution in Arabidopsis thaliana (L.) depends on light conditions during growth. Plant Physiology. 111, 419-425 (1996).
- Oikawa, K., et al. Chloroplast unusual positioning is essential for proper chloroplast positioning. The Plant Cell. 15, 2805-2815 (2003).
- Königer, M., Bollinger, N. Chloroplast movement behavior varies widely among species and does not correlate with high light stress tolerance. Planta. 236, 411-426 (2012).
- Kagawa, T., et al. Arabidopsis NPL1: a phototropin homolog controlling the chloroplast high-light avoidance response. Science. 291, 2138-2141 (2001).
- Berg, R., et al. A simple low-cost microcontroller-based photometric instrument for monitoring chloroplast movement. Photosynthesis Research. 87, 303-311 (2006).
- Johansson, H., Zeidler, M. Automatic chloroplast movement analysis. Molecular Biology. 1398, Springer. Germany. 29-35 (2016).
- Briggs, W. R., et al.
- Jarillo, J. A., et al. Phototropin-related NPL1 controls chloroplast relocation induced by blue light. Nature. 410, 952-954 (2001).
- Sakai, T. Arabidopsis nph1 and npl1: blue light receptors that mediate both phototropism and chloroplast relocation. Proceedings of the National Academy of Sciences, USA. 98 (12), 6969-6974 (2001).
- Wada, M., Kong, S. -G.
- Wen, F., Xing, D., Zhang, L. Hydrogen peroxide is involved in high blue light-induced chloroplast avoidance movements in Arabidopsis. Journal of Experimental Botany. 59 (10), 2891-2901 (2008).
- Tlalka, M., Fricker, M. The role of calcium in blue-light dependent chloroplast movement in Lemna trisulca L. The Plant Journal. 20, 461-473 (1999).
- Königer, M., Bollinger, N. Chloroplast movement behavior varies widely among species and does not correlate with high light stress tolerance. Planta. 236, 411-426 (2012).
- Higa, T., Wada, M. Chloroplast avoidance movement is not functional in plants grown under strong sunlight. Plant, Cell and Environment. 39, 871-882 (2016).
- Arduino. Arduino.cc. , Available from: https://www.arduino.cc (2021).
- Königer, M., Delamaide, J. A., Marlow, E. D., Harris, G. C. thaliana leaves with altered chloroplast numbers and chloroplast movement exhibit impaired adjustments to both low and high light. Journal of Experimental Botany. 59, 2285-2297 (2008).
