Summary
Viele Pflanzenarten verändern die Positionierung von Chloroplasten, um die Lichtabsorption zu optimieren. Dieses Protokoll beschreibt, wie man ein einfaches, selbst gebautes Instrument verwendet, um die Chloroplastenbewegung in Arabidopsis thaliana-Blättern zu untersuchen, wobei Veränderungen in der Lichtübertragung durch ein Blatt als Proxy verwendet werden.
Abstract
Es hat sich gezeigt, dass die Chloroplastenbewegung in Blättern dazu beiträgt, die Photoinhibition zu minimieren und das Wachstum unter bestimmten Bedingungen zu erhöhen. Viel über die Chloroplastenbewegung kann gelernt werden, indem man die Chloroplastenpositionierung in Blättern mit z.B. konfokaler Fluoreszenzmikroskopie untersucht, aber der Zugang zu dieser Art von Mikroskopie ist begrenzt. Dieses Protokoll beschreibt eine Methode, die die Änderungen der Blattübertragung als Proxy für die Chloroplastenbewegung verwendet. Wenn Chloroplasten verteilt werden, um das Abfangen von Licht zu maximieren, ist die Übertragung gering. Wenn sich Chloroplasten in Richtung der antiklinalen Zellwände bewegen, um Licht zu vermeiden, ist die Transmission höher. Dieses Protokoll beschreibt, wie ein einfaches, selbstgebautes Instrument verwendet wird, um Blätter unterschiedlichen Blaulichtintensitäten auszusetzen und die dynamischen Änderungen der Blattübertragung zu quantifizieren. Dieser Ansatz ermöglicht es den Forschern, die Chloroplastenbewegung in verschiedenen Spezies und Mutanten quantitativ zu beschreiben, die Auswirkungen von Chemikalien und Umweltfaktoren darauf zu untersuchen oder nach neuen Mutanten zu suchen, z. B. um fehlende Komponenten in dem Prozess zu identifizieren, der von der Lichtwahrnehmung zur Bewegung von Chloroplasten führt.
Introduction
Licht ist essentiell für die Photosynthese, das Pflanzenwachstum und die Entwicklung. Es ist einer der dynamischsten abiotischen Faktoren, da sich die Lichtintensitäten nicht nur im Laufe einer Saison oder eines Tages ändern, sondern auch schnell und unvorhersehbar je nach Wolkendecke. Auf Blattebene werden die Lichtintensitäten auch durch die Dichte und Beschaffenheit der umgebenden Vegetation und des pflanzeneigenen Blätterdachs beeinflusst. Ein wichtiger Mechanismus, der es Pflanzen ermöglicht, das Abfangen von Licht unter variablen Lichtverhältnissen zu optimieren, ist die Fähigkeit von Chloroplasten, sich als Reaktion auf blaue Lichtreize zu bewegen1,2. Bei schlechten Lichtverhältnissen breiten sich Chloroplasten senkrecht zum Licht (entlang der periclinalen Zellwände) in einer sogenannten Akkumulationsreaktion aus, wodurch der Lichteinfang und damit die Photosynthese maximiert wird. Unter hohen Lichtverhältnissen bewegen sich Chloroplasten in einer sogenannten Vermeidungsreaktion auf die antiklinale Zellwand zu, wodurch das Abfangen von Licht und die Gefahr der Photoinhibition minimiert werden. Bei vielen Arten nehmen Chloroplasten auch eine spezifische dunkle Position ein, die sich von den Akkumulations- und Vermeidungspositionen unterscheidet und oft zwischen diesen beiden liegt3,4. Verschiedene Studien haben gezeigt, dass die Chloroplastenbewegung nicht nur für die kurzfristige Stresstoleranz der Blätter wichtig ist5,6,7, sondern auch für das Wachstum und den Fortpflanzungserfolg von Pflanzen, insbesondere unter variablen Lichtverhältnissen8,9.
Die Chloroplastenbewegung wird bei bestimmten lebenden Exemplaren (z. B. Algen oder dünnblättrigen Pflanzen wie Elodea) mittels Lichtmikroskopie in Echtzeit beobachtet1. Die Untersuchung der Chloroplastenbewegung in den meisten Blättern erfordert jedoch eine Vorbehandlung, um die Chloroplastenbewegung, die chemische Fixierung und die Vorbereitung von Querschnitten zu induzieren, bevor die Proben unter einem Lichtmikroskop betrachtet werden10. Mit der Einführung der konfokalen Lasermikroskopie wurde es auch möglich, die 3D-Anordnung von Chloroplasten in intakten oder festen Blättern abzubilden4,11,12. Diese bildgebenden Verfahren helfen dem Verständnis der Chloroplastenbewegung erheblich, indem sie wichtige qualitative Informationen liefern. Die Quantifizierung der Chloroplastenpositionierung (z. B. als Prozentsatz der Chloroplasten in den periclinalen oder antiklinalen Positionen in diesen Bildern oder als Prozentsatz der von Chloroplasten bedeckten Fläche pro Gesamtzelloberfläche) ist ebenfalls möglich, aber ziemlich zeitaufwendig, insbesondere wenn sie in den Intervallen durchgeführt wird, die erforderlich sind, um schnelle Positionsänderungen zu erfassen10,8 . Der einfachste Weg, um zu zeigen, ob dunkel angepasste Blätter einer bestimmten Spezies oder Mutanten in der Lage sind, Chloroplastenbewegung in die Vermeidungsreaktion zu versetzen, besteht darin, den größten Teil der Blattfläche abzudecken, um die Chloroplasten im Dunkeln zu halten, während ein Streifen des Blattes hohem Licht ausgesetzt wird. Nach mindestens 20 Minuten hoher Lichteinwirkung haben sich die Chloroplasten im exponierten Bereich in die Vermeidungsposition bewegt, und der freiliegende Streifen ist sichtbar heller als der Rest des Blattes. Dies gilt für wilden Typ A. thaliana, aber nicht für einige der Chloroplasten-Bewegungsmutanten, die später ausführlicher beschrieben werden13. Diese Methode und modifikationen davon (z. B. Umkehrung der exponierten Teile des Blattes, Änderung der Lichtintensitäten) sind nützlich, um eine große Anzahl von Mutanten zu screenen und Nullmutanten zu identifizieren, denen entweder die Fähigkeit fehlt, eine Vermeidungs- oder Akkumulationsreaktion oder beides zu zeigen. Es liefert jedoch keine Informationen über die dynamischen Veränderungen in der Chloroplastenbewegung.
Im Gegensatz dazu ermöglicht die hier beschriebene Methode die Quantifizierung der Chloroplastenbewegung in intakten Blättern unter Verwendung von Änderungen der Lichtdurchlässigkeit durch ein Blatt als Proxy für die gesamte Chloroplastenbewegung: Unter Bedingungen, unter denen Chloroplasten in der Akkumulationsreaktion in den Mesophyllzellen ausgebreitet werden, wird weniger Licht durch das Blatt übertragen, als wenn viele Chloroplasten in einer Vermeidungsreaktion sind. positionieren sich entlang der antiklinalen Zellwände. Daher können Änderungen in der Übertragung als Proxy für die gesamte Chloroplastenbewegung in Blättern verwendet werden14. Die Details des Instruments sind an anderer Stelle beschrieben (siehe Ergänzende Datei), aber im Grunde verwendet das Instrument blaues Licht, um die Chloroplastenbewegung auszulösen und misst, wie viel rotes Licht in festgelegten Intervallen durch dieses Blatt übertragen wird. In jüngerer Zeit wurde eine Modifikation dieses Systems beschrieben, das einen modifizierten 96-Well-Mikroplattenleser, eine blaue LED, einen Computer und einen temperaturgesteuerten Inkubator15 verwendet.
Die Möglichkeit, eine Kombination von Methoden zu verwenden, einschließlich der optischen Beurteilung von Blättern für das Screening, gefolgt von der Messung dynamischer Transmissionsänderungen und der Verwendung von Mikroskopie, hat unser Verständnis sowohl der zugrunde liegenden Mechanismen als auch der physiologischen / ökologischen Bedeutung der Chloroplastenbewegung erheblich erleichtert. Zum Beispiel führte es zur Entdeckung und Charakterisierung verschiedener Mutanten, die in bestimmten Aspekten ihrer Bewegungen beeinträchtigt sind. Zum Beispiel fehlt A. thaliana phot 1 Mutanten die Fähigkeit, ihre Chloroplasten bei schwachem Licht anzusammeln, während Phot 2 Mutanten nicht in der Lage sind, eine Vermeidungsreaktion durchzuführen. Diese Phänotypen sind auf eine Beeinträchtigung von zwei jeweiligen Blaulichtrezeptoren zurückzuführen16,17,18. Im Gegensatz dazu fehlt den Chup1-Mutanten die Fähigkeit, geeignete Aktinfilamente um die Chloroplasten herum zu bilden, die unerlässlich sind, um die Chloroplasten in die gewünschte Position innerhalb einer Zelle zu bringen11,19. Zusätzlich zu Mutantenstudien haben Forscher die Auswirkungen verschiedener Inhibitoren auf die Chloroplastenbewegung bewertet, um die mechanistischen Aspekte des Prozesses aufzuklären. Zum Beispiel wurden Chemikalien wie H2O2 und verschiedene Antioxidantien verwendet, um die Auswirkungen dieses Signalmoleküls auf die Chloroplastenbewegung zu untersuchen20. Verschiedene Inhibitoren wurden verwendet, um die Rolle von Calcium bei der Chloroplastenbewegung aufzuklären21. Diese Methoden helfen nicht nur, die Mechanismen der Chloroplastenbewegung aufzudecken, sondern können auch verwendet werden, um die Chloroplastenbewegung in verschiedenen Arten oder Mutanten, die unter verschiedenen Bedingungen angebaut werden, zu vergleichen, um den ökologischen und evolutionären Kontext dieses Verhaltens zu verstehen. So hat sich beispielsweise gezeigt, dass das Ausmaß der Auswirkungen verschiedener Mutationen im Chloroplasten-Bewegungsweg von den Wachstumsbedingungen abhängt7,9 und dass sonnenangepasste Pflanzen ihre Chloroplasten nicht viel zu bewegen scheinen. Im Gegensatz dazu ist Bewegung bei Schattenpflanzen sehr wichtig10,22,23.
Dieses Methodenpapier, das sich auf die Modellpflanze A. thaliana konzentriert, beschreibt die Verwendung eines Übertragungsgeräts, das eine aktualisierte Version eines zuvor entwickelten Instruments ist9. Obwohl dieses Instrument nicht im Handel erhältlich ist, können Personen mit einem grundlegenden Verständnis der Elektronik oder der Hilfe von Ingenieur- oder Physikkollegen und Studenten das Instrument aus erschwinglichen Teilen und nach den detaillierten Anweisungen bauen (siehe Ergänzende Datei). Die Open-Source-Plattform, die zum Aufbau des Instruments verwendet wurde, verfügt über umfangreiche Webunterstützung und ein Community-Forum, das Hilfe bei Problemen bietet24.
Das Protokoll konzentriert sich darauf, wie das Instrument verwendet werden kann, um Änderungen in der Blattübertragung in einem Standard-Erkundungslauf zu bestimmen, der ein Blatt einer Vielzahl von Lichtbedingungen aussetzt und die Dunkel-, Akkumulations- und Vermeidungsreaktionen von A. thaliana erfasst. Diese Läufe können je nach Ziel des Experiments modifiziert und bei den meisten Pflanzenarten verwendet werden. Das Papier liefert Beispiele für Übertragungsdaten von A. thaliana Wildtype und mehreren Mutanten und zeigt, wie die Daten weiter analysiert werden können.
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Protocol
1. Blätter für einen Lauf vorbereiten
- Stellen Sie 8 A. thaliana-Pflanzen über Nacht in die Dunkelheit (> 6 h funktioniert für die meisten Arten), um sicherzustellen, dass sich die Chloroplasten in ihre dunkle Position bewegen. Alle Replikate beginnen mit vergleichbaren Übertragungswerten.
- Alternativ können Sie 8 komplette Blätter in eine Petrischale mit einem feuchten Filterpapier am Boden legen, die Petrischale verschließen und mit Alufolie umwickeln.
2. Testen, ob das Übertragungsgerät funktioniert
- Schließen Sie das Übertragungsgerät an eine stabile Stromquelle an, und drücken Sie den Netzschalter (ON/OFF-Taste) des Geräts, um das Gerät zurückzusetzen (Abbildung 1A,B).
- Verbinden Sie das iPad mit einer stabilen Stromquelle, drücken Sie die Home-Screen-Taste, um den Bildschirm zu aktivieren, und geben Sie den Passcode ein, um sich anzumelden.
- Drücken Sie das Symbol Einstellungen , drücken Sie das Symbol Display & Helligkeit , drücken Sie die automatische Sperre und wählen Sie Nie , indem Sie diese Option drücken, um sicherzustellen, dass der Bildschirm dauerhaft eingeschaltet bleibt. Andernfalls wird das Programm nicht mehr ausgeführt, wenn der Bildschirm in den Ruhezustand wechselt. Drücken Sie die Taste Home Screen , um zum Hauptbildschirm zurückzukehren.
- Drücken Sie zweimal auf die Schaltfläche Startbildschirm, um zu sehen, welche Anwendungen geöffnet sind, und schließen Sie alle, indem Sie sie nach oben auf dem Bildschirm wischen. Drücken Sie die Taste Home Screen , um zum Hauptbildschirm zurückzukehren.
- Suchen Sie die LeafSensor-App auf dem Hauptbildschirm oder wischen Sie nach links oder rechts. Drücken Sie auf das Symbol der App, um sie zu öffnen (siehe Ergänzende Datei). Ein grüner Bildschirm mit Text und weißen Feldern wird angezeigt, um die Informationen einzugeben.
- Stellen Sie sicher, dass das Wort Verbunden im unteren Teil des Bildschirms angezeigt wird, da es anzeigt, dass die App mit dem Übertragungsgerät kommuniziert. Wenn die Meldung "Adafruit NOT Found" angezeigt wird, überprüfen Sie, ob das Gerät angeschlossen ist, und drücken Sie erneut die Starttaste am Gerät.
- Füllen Sie die ersten 4 Felder auf der App-Seite aus, um das Experiment zu benennen und die Bedingungen für einen kurzen Testlauf ohne Blätter und mit geöffneten Blattclips einzurichten:
- Benennen Sie das Experiment (verwenden Sie 8 oder weniger Großbuchstaben oder Zahlen), z. B. indem Sie TEST in das Feld Expt Name eingeben.
- Wählen Sie aus, wie viele verschiedene blaue Lichtintensitäten im Experiment verwendet werden sollen, z. B. indem Sie 3 in das Feld # Light Intensities eingeben.
- Wählen Sie die Blaulichtintensitäten für diesen Lauf (wählen Sie eine ganze Zahl zwischen 0 und 3000 und trennen Sie jede Zahl mit einem Komma von der nächsten; siehe Ergänzende Datei , wie Sie diese Zahlen in tatsächliche Blaulichtintensitäten von LEDs umwandeln), z. B. indem Sie 0.100.1000 in das Feld Blue Intensities eingeben.
- Wählen Sie, wie lange jede blaue Lichtintensität auf das Blatt scheinen soll (trennen Sie jede Zahl von der nächsten durch ein Komma), z. B. indem Sie 2,2,2 in das Feld Blaue Dauer (Minuten) eingeben.
- Klicken Sie im mittleren Bereich des Bildschirms auf Experiment starten . Im unteren Teil des Bildschirms erscheinen 8 Bindestriche und die Meldung Experiment wird gestartet.
- Stellen Sie sicher, dass in den ersten zwei Minuten kein Licht von den LEDs emittiert wird, dann wird schwaches blaues Licht emittiert und nach 2 Minuten nimmt die blaue Lichtintensität zu.
- Stellen Sie sicher, dass für die Messungen einmal pro Minute intensives rotes Licht von den LEDs emittiert wird.
HINWEIS: Während des Experiments werden die Zahlen auf der App-Seite für jeden der acht Sensoren angezeigt, und die Daten werden einmal pro Minute aktualisiert. Stellen Sie sicher, dass die Ausgabezahlen der Fotodioden bei 1000-1023 liegen (wenn der Raum dunkel ist). Ein Update unten links zeigt, wie viele Messungen bisher durchgeführt wurden, z.B. Done 1 von 6 Messungen (eine Messung pro Minute). - Wenn der Test abgeschlossen ist, überprüfen Sie unten links auf der App-Seite nach dem Erscheinungsbild des abgeschlossenen Tests. Jetzt ist das Instrument bereit für einen Lauf mit Blättern.
- Drücken Sie zweimal die Home-Screen-Taste, wischen Sie aus der App heraus und öffnen Sie sie erneut. Drücken Sie die ON/OFF-Taste am Gerät, um es zurückzusetzen.
3. Aufstellen von Blättern in den Blattklammern
HINWEIS: Dieser Schritt muss im Dunkeln mit einer grünen Lichtquelle durchgeführt werden (z. B. einen grünen Filter vor einer Glühbirne platzieren), um eine Chloroplastenbewegung zu vermeiden. Alternativ können Sie sehr wenig weißes Licht und eine längere Dunkelperiode in den Blattclips verwenden. Denken Sie daran, dass ein Teil des Blattclips die LED (größere Öffnung) hält, während der andere Teil den Fototransistor hält (Abbildung 1C).
- Wenn die Pflanzen ganz dunkel angepasst sind, wählen Sie 8 Blätter aus, die breit genug sind, um die LEDs abzudecken. Andernfalls entfernen Sie die Blätter aus der Petrischale. Bereiten Sie 8 Streifen Filterpapier etwa die Länge eines Blattclips und mit einem oben ausgestanzten Loch vor, um die LED nicht abzudecken.
- Befeuchten Sie das Filterpapier und legen Sie es auf den Blattclipteil, der die LED hält. Wiederholen Sie dies für jeden der acht Blattclips.
- Legen Sie jedes Blatt auf die Oberseite des nassen Filterpapiers seines Blattclips. Stellen Sie sicher, dass die richtige Blattseite zur LED zeigt (normalerweise werden Experimente mit der adaxialen Blattoberfläche durchgeführt, die der LED zugewandt ist).
- Vermeiden Sie es, die Mittelribs des Blatts auf den LEDs zu platzieren, und platzieren Sie für konsistentere Ergebnisse ähnliche Teile jedes Blatts (z. B. den breitesten Abschnitt des Blatts) über der LED.
- Legen Sie den anderen Blattclipteil mit dem Fototransistor darauf. Verwenden Sie ein Gummiband, um die beiden Blattclipteile bei Bedarf zusammenzuhalten (Abbildung 1C,D).
- Legen Sie jeden Blattclip in sein "Boot" und füllen Sie die Reservoirs mit einer Pipette mit Wasser. Stellen Sie sicher, dass das Blatt oder zumindest das Filterpapier das Wasser berührt, um eine Austrocknung der Blätter während des Laufs zu vermeiden (Abbildung 1D).
4. Durchführung eines Laufs
HINWEIS: Für einen Standard-Erkundungslauf beginnen Sie mit 4 h Dunkelheit (0 μmol Photon m-2 s-1), gefolgt von 7 h niedrigem blauem Licht (2 μmol Photon m-2 s-1), gefolgt von jeweils 60 min mit 5, 10, 30, 40, 50, 60, 90, 100 μmol Photon m-2 s-1 blauem Licht. Dies wird die Blätter dazu bringen, ihre dunkle Transmission zu zeigen, chloroplastische Bewegung in die maximale Akkumulation zu induzieren und unterschiedliche Grade der Vermeidungsreaktion zu zeigen.
- Richten Sie die LeafSensor-App mit den unten beschriebenen Schritten auf dem iPad ein.
- Geben Sie EXPLORA1 in das Feld Expt Name ein.
- Geben Sie 10 in das Feld # Light Intensities ein.
- Geben Sie 0,1,60,160,550,750,950,1150,1350,1950 in das Feld Blue intensities ein.
- Geben Sie 240,420,60,60,60,60,60,60,60,60 in das Feld Blaue Dauer ein.
- Klicken Sie auf Experiment starten. Nach der ersten Minute erscheinen die Ausgabewerte (in der Regel zwischen 990 und 820) auf dem Bildschirm. Wenn die Werte weit entfernt sind, überprüfen Sie, ob die Blätter korrekt in die Blattklammern platziert wurden.
- Wenn der Lauf abgeschlossen ist, stellen Sie sicher, dass die Meldung Experiment beendet unten links auf dem Bildschirm angezeigt wird. Die Daten werden automatisch gespeichert.
- Stellen Sie den Bildschirm in die aufrechte Position (nicht horizontal). Zwei neue Optionen werden auf dem Bildschirm angezeigt, nämlich Speichern und Dienstprogramme.
- Drücken Sie Dienstprogramme und eine Liste der gespeicherten Dateien wird angezeigt. Wählen Sie die gewünschte Datei aus, in diesem Fall EXPLORA1.
- Suchen Sie unterhalb der Liste der Dateien nach Selected Expt: EXPLORA1. Drücken Sie E-Mail, geben Sie eine E-Mail-Adresse ein, und die Datendatei wird automatisch an die Nachricht angehängt. Drücken Sie Auf Senden.
HINWEIS: Wenn es eine lange Verzögerung gibt, bis die Dateien ankommen, starten Sie die App neu und senden Sie die Datei erneut.
- Wenn eine Ausführung abgebrochen wurde, aber die Daten bis zu diesem Zeitpunkt von Interesse sind, drücken Sie Speichern , bevor Sie Dienstprogramme auswählen. Bereinigen Sie nach mehreren Läufen den Speicherplatz: Drücken Sie Dienstprogramme, wählen Sie eine Datei nach der anderen aus, wischen Sie neben der Datei nach links und drücken Sie die Entf-Taste , um die Datei zu entfernen.
- Drücken Sie Zurück , um ein weiteres Experiment auszuführen, oder wenn Sie fertig sind, drücken Sie die Home-Screen-Taste, wischen Sie zum Hauptbildschirm, drücken Sie Einstellungen, drücken Sie Display & Helligkeit, drücken Sie Auto-Lock und drücken Sie 2 Minuten.
5. Datenanalyse
- Laden Sie die Datei EXPLORA1 aus der E-Mail herunter, fügen Sie der Datei die Erweiterung .csv hinzu, doppelklicken Sie auf die Datei. Die Daten werden in einer Tabelle sortiert, wobei die Daten für die acht verschiedenen Sensoren in separaten Spalten sortiert sind. Die letzte Spalte zeigt den Zeitpunkt (in Sekunden), zu dem die Daten gesammelt wurden. Löschen Sie die erste Zeile unter den Überschriften (Sensor1-8), wenn sie unsinnige Daten enthält.
- Richten Sie ein Stammdatenblatt ein, das die Ergebnisse für jeden Sensor in einem separaten Blatt enthält und die Ausgabewerte mithilfe der Gleichungen aus der Kalibrierung jedes Blattclips und Sensors in % der Übertragungswerte umwandelt (siehe Ergänzungsdatei).
- Kopieren Sie jeden Datensatz in ein separates Datenblatt (z. B. Spalte A enthält die Uhrzeit; Spalte C enthält die Daten von Sensor1).
- Richten Sie Spalte B so ein, dass die Zeit von Sekunden in Minuten umgewandelt wird. Richten Sie Spalte D so ein, dass sie die Formel zum Umwandeln der Spannung in % der Übertragung mithilfe der Gleichung aus der Kalibrierung enthält.
- Richten Sie für jeden Sensor ein ähnliches Datenblatt ein und denken Sie daran, dass die Formel, die zum Umwandeln der Ausgangsspannung in % der Übertragungswerte verwendet wird, für jeden Sensor unterschiedlich sein kann.
- Plot % Übertragung (T) gegen die Zeit, min (Abbildung 2).
- Speichern Sie das Datenblatt unter einem neuen Namen, damit das Stammdatenblatt wiederverwendet werden kann.
- Um die Daten weiter zu analysieren (Abbildung 2), berechnen Sie die ΔT(%)-Akkumulation (z. B. Änderung von T bei maximaler Akkumulation im Vergleich zu T bei Dunkelheit), ΔT (%) -Vermeidung (z. B. Änderung von T bei maximaler Vermeidung im Vergleich zu T bei Dunkelheit ) oder dT/dt (%/h) (z. B. Änderung von T während des schnellsten Teils der Akkumulations- oder Vermeidungsreaktion). Weitere Einzelheiten finden Sie unter 8.
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Representative Results
Die verschiedenen Teile der Übertragungsvorrichtung sind in Abbildung 1 dargestellt. Der Mikrocontroller ist die Steuereinheit des Geräts und steuert die Lichtverhältnisse, denen die blätter, in schwarzen Blattklammern befestigt, ausgesetzt sind, und speichert die empfangenen Lichtübertragungsdaten (Abbildung 1A,B). Eine Nahaufnahme der Steuereinheit des Instruments zeigt die ON/OFF-Taste, die SD-Karte für die Datenspeicherfähigkeit, das Bluetooth-Shield (das die Daten an die LeafSensor-App sendet) und die Kabel, die mit den LEDs (Light Emitting Diodes) und Fototransistoren verbunden sind. Der Mikrocontroller befindet sich an der Basis des Instruments, und nur die Kanten sind im Bild sichtbar (Abbildung 1B). 3D-gedruckte, schwarze Blattclips halten die Blätter, LEDs und Fototransistoren an Ort und Stelle. Ein nasses Filterpapier wird auf dem Blattclipteil mit der LED so positioniert, dass die LED ungehindert ist, und ein dunkel angepasstes Blatt wird mit der adaxialen Blattoberfläche zur LED hin positioniert. Das Schema zeigt, dass die LED und der Fototransistor auf den gegenüberliegenden Seiten des Blattes positioniert sind. Die LED kann blaues oder rotes Licht aussenden. Das blaue Licht wird verwendet, um die Chloroplastenbewegung zu induzieren und wird jede Minute, in der das rote Messlicht auf das Blatt scheint, für eine kurze Zeit ausgeschaltet. Der Fototransistor, der sich auf der gegenüberliegenden Seite des Blattes befindet, erkennt, wie viel rotes Licht durch das Blatt übertragen wird, und sendet die Daten an den Mikrocontroller und die SD-Karte (Abbildung 1C). Die beiden Teile des Blattclips werden zusammengefügt und in ein 3D-gedrucktes "Boot" gelegt, das mit Wasser gefüllt ist und dazu beiträgt, das Blatt während des Experiments feucht zu halten (Abbildung 1D).
Abbildung 2 zeigt einen typischen Datensatz, in dem die prozentualen Übertragungsdaten gegen die Zeit (min) aufgetragen werden. Dieser spezielle Transmissionslauf umfasste 1 h Dunkelheit, gefolgt von 3 h niedrigem blauem Licht (2 μmol Photon m-2 s-1) und jeweils 1 h mittlerer (30 μmol Photon m-2 s-1) und hoher blauer Lichtintensität (100 μmol Photon m-2 s-1). Die Daten zeigen, dass die Transmission in A. thaliana bei geringen Lichtintensitäten abnimmt (Akkumulationsreaktion), während eine Vermeidungsreaktion induziert wird, wenn die Lichtintensitäten weiter zunehmen. Dies ist keine Alles-oder-Nichts-Antwort und der Grad der Änderungen relativ zu den Dunkelwerten hängt von den genauen Blaulichtintensitäten ab. Diese prozentualen Transmissionsänderungen (ΔT) können mit den unter den Daten dargestellten Formeln berechnet werden. Darüber hinaus kann die Geschwindigkeit der Übertragungsänderungen (dT/dt) während der anfänglichen Übertragungsänderungen, wenn eine Akkumulations- oder Vermeidungsreaktion ausgelöst wird, anhand der Steigung der Kurve berechnet werden.
Die durchschnittlichen prozentualen Transmissionswerte von Wildtyp (WT) (Abbildung 3A) sowie Phot 1 und Phot 2 mutierten A. thaliana Blättern (Abbildung 3B) während 19 h langen Läufen sind dargestellt. Solche ausgedehnten, explorativen Übertragungsläufe sind hilfreich, um festzustellen, welche Blaulichtintensitäten in zukünftigen Läufen verwendet werden sollen. Die Blätter wurden zuerst 4 Stunden Dunkelheit ausgesetzt, und konsistente Übertragungswerte deuten darauf hin, dass die Blätter vollständig dunkel angepasst waren, was die Daten zwischen den Repliken konsistenter macht. Für die nächsten 7 h wurden die Blätter schwachem blauem Licht (2 μmol Photon m-2 s-1) ausgesetzt. In WT und Phot 2 folgt auf die anfängliche schnelle Abnahme der Übertragung eine langsame Abnahme, was darauf hindeutet, dass sich die Chloroplasten in die Akkumulationsreaktion bewegten. Abhängig von der verwendeten Art kann es unterschiedlich lange dauern, bis eine möglichst geringe Übertragung erreicht ist. In vielen Fällen ist ein Forscher möglicherweise nur daran interessiert, verschiedene Mutanten zu einem bestimmten Zeitpunkt zu vergleichen, so dass die Exposition gegenüber sehr wenig Licht auf eine Stunde begrenzt sein kann. Im Vergleich zu WT zeigt Phot 1 ein reduziertes Akkumulationsverhalten. Auf die längere Exposition bei schwachem blauem Licht folgt ein schrittweiser Anstieg der Blaulichtintensitäten pro Stunde (5, 10, 30, 40, 50, 60, 90, 100 μmol Photon m-2 s-1). Die prozentuale Transmission in A. thaliana WT und Phot 1 nimmt mit jeder Zunahme der Lichtintensität zu, was zeigt, dass die Chloroplasten in die Vermeidungsreaktion übergehen, dies ist jedoch in Phot 2 nicht zu sehen. Der Grad der Änderung der Transmission relativ zum Dunkelwert (ΔT) hängt von den genauen Blaulichtintensitäten ab und kann je nach Genotyp variieren (Abbildung 3C). Ein Beispiel zeigt die Geschwindigkeit der Übertragungsänderungen (dT/dt) während der ersten Reaktionen in der Übertragung, wenn die Vermeidung ausgelöst wird, wenn die Blauintensität von 5 auf 10 μmol Photon m-2 s-1 erhöht wird (Abbildung 3D). Die Geschwindigkeit ist für WT und Phot 1 gleich, während sie für Phot 2 Mutanten sehr langsam ist.
Abbildung 1: Übersicht über das Übertragungsgerät. Bild des selbstgebauten Übertragungsgeräts mit der Steuereinheit in der schwarzen Box unten rechts und den Blattklammern oben und unten links (A). Nahaufnahme des Steuergeräts mit der ON/OFF-Taste, der SD-Karte für die Datenspeicherfähigkeit und dem Bluetooth-Shield für die drahtlose Kommunikation. Kabel verbinden das Steuergerät mit den Leuchtdioden (LEDs) und Fototransistoren. Der Mikrocontroller befindet sich an der Basis des Instruments und nur die Kanten sind in diesem Bild sichtbar (B). Die 3D-gedruckten schwarzen Blattclips: Links wird der Blattclipteil mit der LED angezeigt, rechts der Blattclipteil mit dem Fototransistor. Um einen Lauf einzurichten, wird ein feuchtes Filterpapier (mit einem Loch von der Größe der LED) auf den Clip gelegt, ohne die LED zu verdecken. Dann wird das Blatt in den Clip gelegt, der die LED bedeckt. Der Schaltplan zeigt, dass sich die LED und der Fototransistor (PT) in der Nähe des Blattes gegenüberliegen, wenn die beiden Teile jedes Blattclips zusammengesetzt sind (C). Blattklammern werden in 3D-gedruckten "Booten" positioniert, die mit Wasser gefüllt sind, wobei die Blätter und die Filterpapiere hydratisiert bleiben (D). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 2: Transmissionsdaten eines typischen A. thaliana-Blattes . Transmissionsdaten (T) für ein Blatt von A. thaliana , das 1 h lang dunkel exponiert wurde, gefolgt von 3 h schwachem Licht (2 μmol Photon m-2 s-1), gefolgt von jeweils 1 h mittlerem (30 μmol Photon m-2 s-1) und hohem blauem Licht (100 μmol Photon m-2 s-1). Geringe Lichtintensitäten induzierten die Akkumulationsreaktion, während höhere Lichtintensitäten unterschiedliche Grade einer Vermeidungsreaktion induzierten. Die T-Werte bei Dunkelheit dienen als Grundlinie (blaue Linie). Die prozentualen Veränderungen in T relativ zu den Dunkelwerten (ΔT), z.B. bei maximaler Akkumulation oder unterschiedlichen Vermeidungsgraden (Unterschiede zum dunklen T werden durch die blauen Pfeile angezeigt) können berechnet werden. Darüber hinaus kann die Geschwindigkeit, mit der sich T ändert (dT/dt), z. B. während der Anfangsphase der Vermeidungsreaktion, aus der Steigung von T berechnet werden, die gegen die Zeit aufgetragen wird (angezeigt durch das blaue Dreieck). Die Gleichungen sind unterhalb der Grafik dargestellt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 3: Chloroplastenbewegung in Wildtyp- und mutierten A. thaliana-Blättern . Dunkel angepasste, reife Blätter wurden 4 h lang dunkel ausgesetzt, gefolgt von einer 7-stündigen Exposition gegenüber 2 μmol Photon m-2 s-1, gefolgt von einer schrittweisen Erhöhung der blauen Lichtintensität pro Stunde (5, 10, 30, 40, 50, 60, 90, 100 μmol Photon m-2 s-1). Durchschnittliche % Transmission (T) Werte (n = 20) von WT (A) sowie Phot 1 und Phot 2 Blättern (B). Veränderung in % T relativ zu den dunkelwerten Werten: Negative Werte zeigen an, dass die Blätter eine Akkumulationsreaktion zeigten, während positive Werte eine Vermeidungsreaktion anzeigen. Die Zahlen auf der rechten Seite geben die blaue Lichtintensität an, bei der die ΔT-Daten berechnet wurden. Das Farbschema ist das gleiche wie im Rest der Abbildung (C). Die dT/dt-Daten wurden berechnet, da die Blätter auf einen Anstieg der Blaulichtintensität von 5 auf 10 μmol Photon m-2 s-1 reagierten und die Geschwindigkeit angeben, mit der sich % T pro Stunde änderte (D). Daten für A und B sind Mittelwerte, für C und D bedeutet ± SD (n = 20). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Ergänzende Akte. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.
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Discussion
Das Gerät ist extrem einfach zu bedienen, aber es ist von entscheidender Bedeutung, jeden Blattclip-Aufbau des Übertragungsgeräts unabhängig voneinander zu kalibrieren, da die Positionierung der LEDs und Fototransistoren von Blattclip zu Blattclip leicht variieren kann. Stellen Sie sicher, dass die LEDs und Fototransistoren stabil eingesetzt sind, und überprüfen Sie die Kalibrierung erneut, wenn die Daten falsch erscheinen. Vermeiden Sie es, Wasser auf das Gerät zu bekommen. Die Blätter in den Blattklammern werden in mit Wasser gefüllte "Boote" gelegt, um Wasserstress zu vermeiden. Stellen Sie diese Boote z.B. in einen niedrig umrandeten Kunststoffbehälter, der von der Steuereinheit getrennt ist, und werfen Sie sie NICHT um. Ziehen Sie die Kabelverbindungen nicht ab oder biegen Sie sie nicht. Seien Sie vorsichtig beim Einsetzen von Blättern in die Blattklammern und vermeiden Sie es, die Kabel zu sehr zu ziehen oder zu biegen.
Es ist wichtig, die Blätter lange genug dunkel anzupassen, um sicherzustellen, dass die anfänglichen Transmissionswerte die dunkle Position darstellen. Überprüfen Sie, ob die Werte während der Dunkelperiode im Gerät mindestens 30 Minuten stabil waren, bevor Sie blaues Licht auf die Blätter scheinen. Wenn dies nicht der Fall ist, passen Sie die Blätter vor dem nächsten Lauf für einen längeren Zeitraum dunkel an oder verlängern Sie die Dunkelperiode im Übertragungsgerät, um zu überwachen, wie lange es dauert, bis die Blätter einen stabilen Zustand erreichen. Typischerweise werden die Übertragungsdaten als prozentuale Änderung der Transmission bei einer gegebenen Blaulichtintensität relativ zum Dunkelwert (ΔT) dargestellt. Daher ist es entscheidend, die richtigen Basiswerte zu erhalten.
Der Erkundungslauf kann für jede A. thaliana-Mutante (einschließlich Mutanten, von denen bekannt ist, dass sie andere Aspekte der Physiologie einer Pflanze beeinflussen, z. B. Photosynthese, Myosin oder uncharakterisierte Mutanten) oder verschiedene Arten verwendet werden, solange die Blattfläche groß genug ist, um die LED im Blattclip zu bedecken und die Blätter nicht zu dick sind. Das Programm kann leicht angepasst werden, um alle Bedürfnisse eines Forschers zu erfüllen, z. B. können die Blaulichtintensitäten innerhalb der Bereiche geändert werden, von denen gezeigt wurde, dass sie Chloroplastenbewegungen hervorrufen (die Reaktion sättigt um 100 μmol Photon m-2 s-1), die Belichtungszeiten können geändert werden, die Anzahl der aufeinanderfolgenden Lichtverhältnisse kann geändert werden. Darüber hinaus können Blätter vorbehandelt werden, bevor sie im Gerät z.B. mit Inhibitoren der Aktinpolymerisation oder Signalwegkomponenten betrieben werden, was für Forscher wichtig ist, die die Lücken im Signalweg füllen wollen, der die Chloroplastenbewegung reguliert.
Wie jede Methode hat auch diese ihre Grenzen und Nachteile. Das Verfahren beruht auf Veränderungen der optischen Eigenschaften von Blättern, nämlich wie viel Licht durchgelassen wird. Daher funktioniert es am besten mit relativ dünnen Blättern, während dicke Blätter oft nicht zulassen, dass eine ausreichende Übertragung von rotem Licht über den Geräuschpegel hinaus erkannt wird. Es wäre möglich, die Übertragungsvorrichtung zu modifizieren, um die auf das Blatt scheinende Rotlichtintensität zu erhöhen und die Empfindlichkeit der Fototransistoren durch Ändern der Widerstände zu erhöhen. Da die Methode nur ein integriertes Maß für die Bewegungen von Chloroplasten in allen Zellen und Zellschichten liefert, kann man einige subtile Veränderungen übersehen, z. B. können Chloroplasten, die sich in entgegengesetzte Richtungen bewegen, zu keiner Nettoänderung der Übertragung führen. Gerade bei der Arbeit mit bisher uncharakterisierten Mutanten oder Spezies ist es wichtig, die Übertragungsergebnisse mit Bildern der Chloroplastenpositionierung mittels Mikroskopie zu ergänzen. Zum Beispiel wurden langsame Änderungen der Übertragung als Reaktion auf Änderungen der Blaulichtintensität bei einer A. thaliana-Mutante beobachtet und könnten auf eine Reihe von Gründen zurückzuführen sein. Die Mikroskopie ergab, dass Zellen nur zwei Chloroplasten hatten, die viel größer waren als normale Chloroplasten. Die Mutante wurde später als die Chloroplasten-Divisionsmutante arc6-125 bestätigt.
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Disclosures
Die Autoren haben keine Interessenkonflikte.
Acknowledgments
Die Finanzierung erfolgte durch einen Fiske Award und einen Wellesley College Faculty Award.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Aluminum foil | |||
| Dark adapted leaves | |||
| Filter paper | |||
| iPad with LeafSensor app installed (see Supplemental Info) | |||
| Pipette | Any | ||
| Petri dish | Any | ||
| Transmission device (see Supplemental info) | |||
| Water |
References
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