Summary
여기에 제시된 것은 허혈 재관류 실험 후 설치류 조직 준비의 표준화 된 방법론을위한 프로토콜 및 고해상도 이미지 획득을위한 조명 및 카메라 설정을 수립하기위한 지침입니다. 이 방법은 모든 실험적인 작은 동물 장기 사진에 적용 할 수 있습니다.
Abstract
매크로 사진은 정성적 및 정량적 분석을 수행하기 위해 다양한 조직 샘플을 고배율로 이미징하는 데 적용 할 수 있습니다. 조직 준비 및 후속 이미지 캡처는 허혈 재관류 (IR) 실험 직후에 수행되는 단계이며 적시에 적절한주의를 기울여 수행되어야합니다. 심장과 뇌에서 IR-유도된 손상의 평가를 위해, 이 논문은 2,3,5-트리페닐-2H-테트라졸륨 클로라이드(TTC)-기반 염색 후 매크로 사진을 기술한다. 과학적인 매크로 촬영을 위해서는 제어된 조명과 적절한 이미징 설정이 필요합니다. 표준화 된 방법론은 저렴한 최신 디지털 카메라와 매크로 렌즈의 조합을 사용하더라도 고품질의 상세한 디지털 이미지를 보장합니다. 샘플 준비 및 이미지 획득의 적절한 기술과 잠재적 실수에 대해 논의하고 올바른 설정과 잘못된 설정이 이미지 품질에 미치는 영향에 대한 예가 제공됩니다. 과도한 염색, 부적절한 시료 보관 및 차선책의 조명 조건과 같은 일반적인 실수를 피하는 방법에 대한 구체적인 팁이 제공됩니다. 이 논문은 쥐 심장 및 뇌 조직 슬라이싱 및 염색에 대한 적절한 방법론을 보여주고 고해상도 이미지 획득을위한 조명 및 카메라 설정 및 사진 기술을 수립하기위한 지침을 제공합니다.
Introduction
수십 년 동안 심장 및 뇌 조직 표본의 사진 및 분석은 생명 과학 실험의 중요한 부분이었습니다. 과학과 혁신의 진보는 초분해능이 가능한 고가의 현미경 개발을 주도합니다. 현미경 사진은 상세한 지시에 따라 잘 조절 된 조명 환경에서 얻어집니다. 반대로 매크로 촬영(1:2 이상의 배율)은 부적절한 이미징 설정을 사용하여 제어되지 않는 조명 환경에서 자주 수행됩니다. 종종 샘플 준비 및 카메라 설정 기술을 실질적으로 최적화해야 합니다. 결과적으로 제한된 품질의 매크로 사진이 과학 저널에 널리 발표되었습니다. 불충분 한 이미지 해상도와 대비는 IR 연구에서 정확한 이미지 정량화의 가능성을 제한합니다.
심근1,2 및 뇌3,4 경색의 실험 절차가 상세히 설명되었다. 이 연구의 목적은 경색 실험 후 설치류 심장 및 뇌 조직 표본의 사진 촬영 및 표준화 된 분석을위한 시스템을 설정하는 방법에 대한 단계별 가이드를 제공하는 것입니다. 여기에는 조직 슬라이싱, 염색 및 심장 및 뇌 샘플의 매크로 사진이 포함됩니다. 조직 표본의 준비는 실험의 필수적인 부분이며, 평면 이미지 분석 결과는 획득 된 이미지의 품질에 크게 의존합니다5.
이러한 방법은 설치류 조직에서 측정 및 이미지 평면 분석을 수행하는 데 특히 유용하며 일반적인 과학 매크로 사진에 유용 할 수 있습니다. 또한 이미지의 높은 품질과 일관성을 통해 디지털 사진의 자동 분석을 수행 할 수 있으므로 시간을 절약하고 사용자 입력을 피하며 이미지 분석 중 오류 또는 편향의 위험을 최소화 할 수 있습니다. 이것은 강력하고 신뢰할 수있는 데이터의 생성을 초래하고 전임상 발견의 번역을 클리닉의 새로운 항 허혈 치료로 증가시킬 것입니다.
Protocol
실험 절차는 유럽 공동체의 지침과 현지 법률 및 정책 (지침 2010 / 63 / EU)에 따라 수행되었으며 모든 절차는 라트비아의 Riga, Food and Veterinary Service의 승인을 받았습니다.
1. 심장 염색 및 슬라이스
참고: 이 프로토콜에 기재된 기술은 Langendorff-perf-perfused 단리된 래트 또는 마우스 심장6,7 및 생체내 래트 심장 IR 손상 분석 8,9,10,11 후에 사용될 수 있다. 생체내 IR 손상 분석 후의 염색을 위해, 심장이 절제되고, 캐뉼라에 장착되고, 랑겐도르프 관류 모드에서 간략하게 관류된다고 가정한다.
- Krebs-Henseleit 용액으로 채워진 주사기로부터 심장 캐뉼라를 분리하고, 이를 Krebs-Henseleit 용액 중의 0.1% 메틸렌 블루의 가온(37°C) 용액으로 채워진 주사기에 연결한다. 쥐 심장에는 5 mL 주사기를 사용하고 마우스 심장에는 1-2 mL 주사기를 사용하십시오.
참고: 대안은 압력- 또는 유동-제어된(예를 들어, Langendorff) 장치를 청색 염료 함유 용액으로 채우는 것이다. 분리 및 장착 절차 중에 캐뉼라에 기포를 남기지 말고 관상 동맥 재폐색에 사용되는 봉합사를 느슨하게하지 않는 것이 중요합니다. - 쥐 심장을 메틸렌 블루 용액 4 mL를 ~ 4 mL / min의 속도로 관류시키고 마우스 심장을 ~ 0.5-1 mL / min의 속도로 메틸렌 블루 용액 1 mL로 퍼퓨즈하십시오.
참고 : 경험에 비추어 볼 때, 두 기술 모두 안전하고 적절한 염색을 제공합니다. 그러나 압력 제어 펌프 / 정압 압력 시스템을 사용하는 것은 초보 과학자를위한 과도한 염색에 대해보다 시간이 많이 걸리지 만 더 안전한 옵션입니다. - 주사기에서 캐뉼라를 분리하고 캐뉼라에서 심장을 제거하십시오.
- 티슈 페이퍼에 심장을 부드럽게 굴려 과도한 메틸렌 블루를 제거하십시오. 지혈 포셉을 열고 과도한 메틸렌 블루를 제거한 후에 만 수술 봉합사에서 플라스틱 튜브를 제거하여 관상 동맥 주위의 합자를 느슨하게하십시오.
참고: 이 단계에서 마우스 심장을 작은 비닐 봉지 또는 5 mL 원심분리기 마이크로튜브에 냉동고(-20°C)에 넣고 최대 5-10분 동안 사용할 수 있습니다. 최대 동결 시간은 각 실험실에서 실험적으로 결정되어야합니다. 마우스 심장을 단기간 동결하면 초보 실험자가 1mm 두께의 조각으로 자르는 데 도움이 될 수 있습니다. 쥐 마음의 동결은 권장하지 않습니다. -20 °C에서 10 분 이상 과동결은 피해야합니다. - 염색된 래트 심장을 심장 슬라이싱을 위해 스테인리스강 매트릭스( 표 자료 참조)에 놓는다(도 1A). 그런 다음 심장의 심실을 2mm 두께의 조각으로 자릅니다 (성인 쥐 심장의 6-7 조각을 목표로하십시오). 마우스 심장의 경우 심장의 심실을 1.5mm 두께의 조각으로 자릅니다 (성인 마우스 심장의 최소 4 조각을 목표로하십시오).
참고: 슬라이싱 매트릭스 호환 면도날을 사용해야 합니다. 일반적으로, 호환가능한 단일 에지 면도날(예를 들어, 최대 0.01인치(0.254mm)의 두께)을 래트 하트 슬라이싱에 사용할 수 있다. 이중 가장자리 면도날은 일반적으로 마우스 심장에 사용되며 일반적으로 두께가 최대 0.004 인치 (0.1mm)입니다.
그림 1: 쥐 심장과 뇌 슬라이싱을 위한 행렬. (A) 쥐 심장, (B) 쥐 뇌. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
- 절단 후 조각을 15mL 플라스틱 튜브로 옮깁니다. 포스페이트 완충 식염수(PBS)에 용해된 1% 트리페닐테트라졸륨 클로라이드(TTC) 5 mL를 심장 절편이 있는 튜브에 첨가하고, 37°C의 수조에서 10분 동안 인큐베이션한다.
- TTC 용액에서 인큐베이션한 후, 심장 조각을 PBS로 적어도 2-3회 세척하고 이미지 캡처를 준비한다.
2. 뇌 염색 및 슬라이싱
- 중간 뇌동맥 폐색 실험3,12 후, 뇌간을 포함한 뇌를 두개골로부터 제거하고, 이를 얼음처럼 차가운 PBS로 세척한다.
- 동물의 무게에 따라 뇌 스테인리스 스틸 매트릭스의 올바른 크기를 선택하십시오 ( 자료 표 참조). 복부 쪽이있는 뇌를 뇌 매트릭스에 올려 놓으십시오.
참고 : 매트릭스에 앉을 때, 뇌의 복부 표면은 곰팡이의 윗면과 평행해야합니다. - 블레이드를 사용하여 뇌의 전두엽 및 꼬리 부분 (양쪽에서 2 개의 블레이드)을 제한하십시오.
참고: 슬라이싱 매트릭스 호환 면도날을 사용해야 합니다. 일반적으로 호환 가능한 단일 에지 면도날 (최대 0.01 인치 (0.254 mm)의 두께)을 쥐 두뇌 슬라이싱에 사용할 수 있습니다. - 블레이드를 부분적으로 (뇌를 완전히 자르지 않음) 첫 번째 블레이드와 마지막 블레이드 사이의 채널에 넣으십시오. 모든 블레이드를 삽입하고 병렬로 배열하면 손바닥으로 모든 블레이드를 동시에 눌러 뇌를 2mm 코로나 조각으로 자릅니다.
- 두 손가락으로 측면을 따라 블레이드를 단단히 잡고 매트릭스에서 얇게 썬 뇌와 함께 제거하십시오.
- 뇌 조각을 트레이 (70 mL, 72 x 72 mm)에 하나씩 배열하십시오. 슬라이스를 정렬할 때 각 슬라이스의 앞면 표면이 항상 위를 향하고 있는지 확인하십시오.
- PBS 중의 따뜻한 (+37°C) 1% TTC 용액을 뇌 절편에 붓고, 이를 어둠 속에서 37°C에서 8분 동안 인큐베이션한다.
참고 : 뇌 조각은 배양 중에 TTC 용액에 완전히 잠겨 있어야합니다. - 1% TTC 용액에서 인큐베이션한 후 뇌 조각을 파란색 플라스틱 트레이로 옮겨 이미지를 캡처합니다. 뇌 조각을 정면에서 꼬리 부분까지 순차적으로 배열하고 메스를 사용하여 시상면의 반구를 분리하십시오.
참고: 트레이의 표면은 빨 수 있고 무광택이어야 하며 뇌 조각과 대조되는 색상(예: 빨간색, 흰색 또는 옅은 분홍색이 아님)이어야 합니다.
3. 매크로 사진
- 염색 직후 조직 조각을 촬영한다.
참고: 심장 조각은 차가운 PBS (+4 °C에서) 또는 포르말린 용액에 최대 30 분 동안 보관할 수 있습니다. 뇌 조각은 장기간 (1-2 주) 포르말린에 저장할 수 있습니다. - 충전된 배터리, 메모리 카드 및 부착된 렌즈를 스탠드에 장착하여 원하는 카메라를 설정합니다(그림 2).
참고: 장비를 예열하기 위해 이미지 수집 최소 5-10분 전에 조명을 켜십시오. LED 조명은 마이크로 초 단위로 최대 밝기에 도달합니다.
그림 2: 매크로 촬영을 위해 설정된 카메라와 조명 카메라는 이미징 표면에 수직으로 배치되어 카메라의 초점 평면이 샘플과 평행하도록 합니다. 약어: LED = 발광 다이오드. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
- 사용 가능한 광원에 따라 적절한 화이트 밸런스 설정을 선택하거나 카메라 설명서의 지침에 따라 색온도 보정을 수행하십시오.
참고: 백색 LED 조명(색온도 6,500K)은 형광 전구에 의한 빛이 깜박이지 않도록 하기 위해 선호되는 광원입니다. - 카메라를 완전 수동 모드로 전환하고, ISO 100 및 조리개를 f/10으로 설정하고, 셔터 속도를 조정하여 최적의 이미지 노출을 제공합니다. 카메라 초점 평면이 샘플이 배치될 표면과 평행한지 확인하십시오.
참고: 히스토그램 기능은 조직 조각이 과다 노출되지 않도록 하는 데 유용합니다. - 셔터를 놓을 때 카메라가 흔들리지 않도록 유선 또는 무선 원격 트리거를 부착하거나 활성화합니다.
참고: 다른 방법은 지연된 셔터 기능을 활성화하여 트리거 버튼을 누른 후 트리거를 2초 또는 10초 동안 지연시키는 것입니다. - 심장 조각을 PBS가있는 용기에 완전히 담그십시오.
참고: 몰입된 슬라이드는 해당 위치에서 멀리 떠 다니는 경향이 있습니다. 슬라이스의 플로팅을 최소화하려면 모든 슬라이스가 들어갈 수 있는 가능한 가장 작은 트레이와 최소한의 침지 용액을 사용하여 시편이 완전히 침지되도록 하십시오. 다른 방법으로는 유리 슬라이드 사이에 슬라이스를 배치하거나 렌즈에 편광 필터를 사용하는 것이 포함됩니다. 원형 편광 필터가 렌즈에 부착되어 카메라의 라이브 뷰 디스플레이의 반사가 사라질 때까지 회전합니다. - PBS 또는 다른 액체가없는 건조한 트레이에 뇌 조각을 배열하십시오.
참고: 편광 필터는 뇌 조각의 이미지를 캡처하는 데 매우 편리합니다. - 매크로 렌즈를 사용하여 슬라이스가 있는 컨테이너를 카메라 아래에 놓고 모든 슬라이스가 시야에 완전히 맞는지 확인합니다. 슬라이스가 동일한 평면에 있는지, 즉 구부러지거나 구르지 않았는지 확인하십시오.
- 노출을 확인하고 필요한 경우 카메라 설정을 조정합니다.
참고: 일단 설정되면 전체 실험 중에 노출 및 기타 설정을 변경하지 마십시오. - 샘플의 수(또는 다른 식별)를 캡처하고 원격 트리거를 사용하여 조직 슬라이스를 이미지화한다.
참고: mm 눈금자와 같은 크기 마커는 시편 크기의 절대 정량화가 필요한 경우 시야에 포함되어야 합니다. - 슬라이스를 회전하고 다른 쪽에서 이미지를 캡처합니다.
Representative Results
도 3A는 심근경색 후 메틸렌 블루- 및 TTC 염색된 심장 슬라이스의 사진이며, 이는 경색 크기의 추가 평탄도 분석을 위한 충분한 상세사항 및 색상 정보를 포함하고 있다(도 3B). 우리는 24 시간 동안 심장의 동결이 심장 조직의 완전성에 어떻게 영향을 미치는지 테스트했습니다 (그림 3C). 장기간 (>1 h, 도 3C) 동안 동결하면 미토콘드리아 기능이 감소합니다. 따라서, 심장의 TTC 염색은 적색이 아니라 옅은 분홍색이며, 괴사성 조직과 생존 가능한 조직 사이의 경계가 흐려진다(도 3C).
또한, 시편에서의 반사의 감소에 대해 두 가지 방법을 비교하였다. 몰입은 가장 효율적인 방법이며 콘트라스트가 좋은 상세한 이미지를 생성합니다(그림 4A). 두 번째 방법은 렌즈에 부착 된 편광 필터를 사용하는 것입니다. 편광 필터도 효과적입니다. 그러나 필터는 이미지의 해상도와 미세 대비를 약간 감소시킵니다(그림 4B). 침지 또는 필터가 없는 심장 조각의 예제 이미지(그림 4C)에는 많은 반사가 포함되어 있으며 추가 분석에는 적합하지 않습니다.
두뇌 조각은 슬라이스 관리 (부동) 문제 때문에 잠기지 않습니다. 평면 분석에서 뇌의 영향을받지 않은(건강한) 측면(그림 5A)과 뇌졸중에 감염된 쪽(그림 5B)을 비교하는 것이 중요합니다. 두뇌 조각은 마른 판이나 쟁반에서 관리하기가 더 쉽고 편광 필터를 사용하여 반사를 제거합니다. 파란색 배경의 트레이는 브레인 슬라이스 사진 촬영에 사용됩니다(이전에 설명한 배경 선택5).
수동 카메라 설정은 노출과 화이트 밸런스를 완벽하게 제어하는 데 사용되었습니다. 카메라 설정은 실험 전이나 시작 시 사용 가능한 광원에 따라 조정해야 합니다. 이를 통해 모든 이미지의 최적 노출과 화이트 밸런스를 보장하여 균일한 분석이 가능합니다(그림 6A). 카메라의 자동 설정이 완벽하지 않으며 카메라 매개 변수가 다양하여 부적절한 결과가 발생하고 이미지 대 이미지 변동성이 발생할 수 있습니다.
도 6은 심장 절편의 과다 노출(도 6B) 및 노출 부족 이미지(도 6C)의 예를 도시한다. 카메라 조명 설정에 사용되는 특정 광원과 일치하도록 카메라의 올바른 화이트 밸런스 설정에 충분한주의를 기울여야합니다. 잘못된 화이트 밸런스 설정으로 인해 이미지에 파란색 또는 노란색(그림 6D)이 바뀌고 자홍색 또는 녹색(그림 6E)이 표시될 수 있습니다.
도 3: 래트 심장 슬라이스의 이미지. (A) 신선한 심장 슬라이스는 컬러 세그멘테이션(B)을 사용하여 ImageProPlus 6.3 소프트웨어에서 분석되었다. (c) TTC 염색은 동결된 심장 슬라이스(24시간 동안 동결)에서 생존 가능한 조직과 괴사 조직을 잘 구별하지 못한다. 약어: TTC = 2,3,5-트리페닐-2H-테트라졸륨 클로라이드. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4 : 반사를 줄이기위한 기술. 쥐 심장 슬라이스 이미지를 PBS(A)에 침지하고 편광 필터(B)를 사용하여 캡처하였다. (C) 침수나 필터가 사용되지 않을 때 반사가 있는 심장 슬라이스. 약어 = PBS = 인산염 완충 식염수. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 5: 쥐 뇌 조각의 이미지. 쥐의 뇌를 일곱 조각으로 절단하고 허혈-재관류 후 TTC로 염색하였다. 편광 필터를 사용하면 반사 없는 이미지를 얻을 수 있습니다. (A) 손상되지 않은 반구로부터의 조각; (B) 뇌졸중에 영향을 받은 반구에서 조각. 약어: TTC = 2,3,5-트리페닐-2H-테트라졸륨 클로라이드. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 6: 쥐 심장 슬라이스 이미지. 올바르게 (A) 잘못 (B-E) 심장 슬라이스 이미지를 캡처했습니다. 잘못된 노출 설정은 과다 노출(B) 및 노출 부족 이미지(C)를 초래합니다. 잘못된 화이트 밸런스 설정은 이미지(E)에서 노란색(D) 또는 녹색으로 표시됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
Discussion
IR 후 심장의 준비는 혈액 심장 동맥의 재폐색과 비 위험 부위의 차별을위한 청색 염료의 관류로 시작됩니다. 메틸렌 블루 또는 에반스 블루 염료가이 목적을 위해 가장 자주 사용됩니다2. 지나치게 높은 압력은 심장 판막을 손상시킬 수 있으므로 위험 부위에 부분적으로 또는 완전히 얼룩이 생길 수 있으므로 Langendorff 장치 또는 정수압 시스템이 장착 된 주사기 또는 펌프의 단순화 된 버전과 같은 압력 제어 시스템으로 심장을 관류시키는 것이 좋습니다. 조절 된 관류는 생리적 압력을 보장하며, 염료는 일반적으로 심장의 폐색 된 영역에 들어 가지 않습니다. 흐름 속도 및 압력 제어 기술 모두 과도한 얼룩에 대한 보호 장치입니다.
실행 가능한 조직 처리에서 가장 심각한 실수 중 하나는 염색하기 전에 조직을 장시간 냉동실에 보관하는 것입니다. 동결은 주로 연구자들이 IR 실험 다음날 또는 그 이후에 심장 염색을 수행하기를 원하기 때문에 사용됩니다. 또한, 동결은 심장의 절단을 쉽게하기 위해 사용됩니다. 우리는 최대 5-10 분 동안 심장을 단기간 동결하면 심장 조직의 완전성에 부주의하게 영향을 미치고 조직 (특히 마우스 심장의 경우)을 얇은 조각으로 절단하는 것을 용이하게한다는 것을 발견했습니다. 그러나 장기간 동결하면 막이 손상되고 세포 생존력과 미토콘드리아 기능이 저하됩니다13. 결과적으로, 기능하는 미토콘드리아의 TTC 염색이 영향을 받고, 괴사성 조직과 생존 가능한 조직 사이의 경계가 제대로 묘사되지 않습니다 (흐릿함). 전반적으로, 쥐 하트의 동결은 피해야하며, 마우스 심장의 단기간의 동결 만이 더 쉬운 절단을 위해 사용될 수 있습니다.
다음 단계는 37°C14에서 1% TTC 용액으로 조직을 염색하는 것이다. 염색 용액은 미리 예열되어야하며, 특히 뇌 조각의 염색에 중요합니다. 예열 된 용액을 사용할 때, 심장 조각에 대한 최적의 염색 시간은 10 분입니다. 37°C보다 긴 인큐베이션 또는 더 높은 온도는 심장 조직의 갈색 착색을 초래한다. 표본의 적절한 염색과 일관된 적색 색 강도는 추가 이미지 분석에 중요합니다. 촬영 전 최종 단계에서, 조직 절편을 차가운 PBS 또는 유사한 완충액으로 2-3회 헹구어 TTC 및 과량의 메틸렌 블루를 용액으로부터 제거하여 사진에서 청색 캐스팅을 피한다. 심장 조각은 최상의 이미지 품질을 얻기 위해 염색 직후에 촬영해야합니다. 심장 염색은 차가운 (+4°C) PBS에서 최대 60분 동안 보관하면 좋은 품질로 남아있다. 염색 된 뇌 조각과 대동맥 조직은 일반적으로 4 % 중성 포름 알데히드 용액에 저장되며 일주일 동안 좋은 품질을 유지합니다. 포르말린(+4°C)에 뇌 조직을 밤새 보관해도 정상 조직의 색강도를 손상시키지 않으며 이미지 획득에 적합합니다. 그러나 포르말린은 심장 조각의 붓기와 얼룩을 유발합니다. 따라서 포르말린에 심장 조직을 저장하는 것은 권장되지 않습니다.
다음 단계는 이미지 획득입니다. 많은 실험실에서는 평판 스캐너를 디지털 카메라 및 조명 설정을 대체할 것으로 예상되는 이미지 수집 도구로 사용합니다. 우리는 슬라이스 스캔이 충분한 이미지 해상도와 색상 분리를 제공하지 않으므로 심장 조각을 이미징하는 데 적합하지 않다고 판단했습니다. 특히, 스캐너 해상도는 마우스 심장에 충분하지 않으며 메틸렌 블루의 렌더링이 좋지 않은 것으로 나타났습니다. 대조적으로, 스캐너는 TTC 또는 다른 단일 염료로만 염색 된 뇌 조각을 이미징하기위한 사진 카메라의 대안이 될 수 있습니다. 조직 조각의 스캔을 위해, 일정한 노출 설정을 보장하는 스캐닝 소프트웨어는 필수적입니다. 전반적으로 평판 스캐너는 성능이 떨어지고 대부분의 이미징 응용 분야에서 디지털 카메라를 대체 할 수 없습니다.
표본 뒤의 배경도 중요합니다. 이상적으로, 트레이의 바닥은 염색 된 표본에 존재하지 않는 색상이어야합니다. 예를 들어, 메틸렌 블루 및 TTC(적색) 염색의 면적을 자동화 또는 반자동화 방식으로 정량화하기 위해, 백색, 적색, 청색, 황색 및 갈색 배경은 피해야 한다. 따라서, 녹색 배경이 바람직할 것이다. 그럼에도 불구하고 색상 선택은 이미지를 사후 처리하는 운영자의 선호도에 따라 다릅니다. 많은 과학자들은 흰색 배경이 이미지 후처리에서 삭제되어 완전히 흰색으로 변환 될 수 있기 때문에 흰색 배경을 선호합니다 (RGB 흰색 코드 255,255,255). 그런 다음 반자동 분석에 사용되는 선택한 색상 목록에서 완전히 흰색을 제외하고 과다 노출되지 않으면 완전히 흰색이 아닌 옅은 괴사 영역 만 계산해야합니다. 파란색과 녹색 배경은 뇌 조각과 대동맥 사진에 적합합니다.
조직 촬영을위한 최적의 이미징 도구는 호환 가능한 매크로 렌즈가있는 단일 렌즈 반사 또는 미러리스 교환 렌즈 디지털 카메라입니다. 아주 작은 물체를 캡처하려면 카메라와 현미경의 조합이 필요할 수 있습니다. 그럼에도 불구하고 매크로 렌즈는 일반적으로 마우스 심장의 상세한 이미지를 얻기에 충분한 (적어도 1 : 2) 배율을 가지고 있습니다. 많은 제조업체들이 고해상도 및 고배율 사진을 얻기 위해 저렴한 디지털 카메라와 매크로 렌즈를 제공합니다. 모든 최신 디지털 카메라는 스탠드에 장착 가능, 많은 수의 픽셀 (일반적으로 >20Mpx), 라이브 뷰, 미러 잠금, 타임랩스 기능, 원격 셔터 및 카메라 매개 변수를 수동으로 설정하는 기능을 포함하여 매크로 촬영에 필요한 특성과 기능을 갖추고 있으므로 일정한 셔터 속도, 조리개, 화이트 밸런스 및 ISO 설정을 보장합니다. 위에서 언급 한 기능과 최소 1 : 2의 렌즈 배율을 가진 컴팩트 카메라도 매크로 촬영에 사용할 수 있습니다. 렌즈 특성으로 인해 일부 소형 카메라는 물체에 근접하게 배치해야하며 실험자는 카메라 본체가 시편의 조명에 영향을 미치지 않도록해야합니다.
모든 유형의 렌즈 교환식 카메라가 있는 매크로 촬영의 경우 고배율(1:1-1:2) 매크로 렌즈가 필요합니다. 풀프레임(24mm x 36mm) 센서에서 초점 거리가 50mm ~ 100mm(120mm) mm 또는 이에 상응하는 매크로 렌즈를 사용하는 것이 좋습니다. 소형 센서 카메라는 센서 크기가 다르므로 그에 따라 배율을 다시 계산해야 합니다. 심장 조각 사진의 경우, 피사체에 대한 100mm 매크로 렌즈 전면 요소의 인체 공학적 거리는 약 150mm입니다. 이 설정을 통해 작업자는 카메라 컨트롤에 쉽게 액세스할 수 있도록 모든 장비를 테이블 위에 보관할 수 있습니다. 50mm 매크로 렌즈는 하나의 사진에서 모든 조각을 얻기 위해 더 넓은 시야각이 필요하기 때문에 뇌 조각과 같은 더 큰 물체의 사진 촬영에 고려 될 수 있습니다.
고해상도로 선명한 이미지를 얻으려면 카메라를 견고한 스탠드에 장착해야 하며, 이를 조명 설정과 함께 사진 카피 스탠드라고 합니다. 스탠드와 리모트(유선 또는 무선) 트리거에 카메라를 장착하면 카메라 흔들림이 제거되고 대상과의 일정한 거리를 보장합니다. 양쪽에서 두 개의 일정한 광원이 있는 카메라 조명 설정은 피사체 평면에 대해 약 30-60° 각도로 기울어져 시편의 충분한 조명을 보장하고 동시에 반사를 방지하는 데 도움이 됩니다. 센서가 피사체 평면과 평행하도록 카메라를 정확하게 장착해야 합니다. 이미지 필드를 고르게 비추려면 두 램프 모두 동일한 방향이어야 하며 피사체와 동일한 거리에 배치해야 합니다. 피사체로부터 다양한 거리에 배치된 광원은 고르지 않은 조명을 유발합니다. 또한 깜박이는 광원은 이미지 노출의 변동의 원인입니다. 전반적으로 카메라와 광원을 정확하게 배치하여 조명이 잘 된 표본의 이미지를 정확하게 수집하는 것이 중요합니다.
조직 샘플은 이미지에서 흰 반점으로 나타나는 빛 (반짝임)을 반사합니다. 이러한 광 반사 스폿은 유용한 색상 정보를 포함하지 않으므로 이미지의 이러한 부분은 이미지의 정확한 정량 분석에 사용할 수 없습니다. 조직 슬라이스로부터의 광 반사는 다양한 방법에 의해 제거될 수 있다. 가장 효율적인 방법은 조직 샘플을 식염수 또는 PBS 용액으로 용기에 완전히 침지하는 것입니다. 유사한 접근법은 유리 플레이트 아래 (또는 사이) 조직 조각을 삽입하는 것입니다. 이 방법은 반사에 대해 효율적입니다. 그러나 이미지 해상도는 침지 된 조직의 사진보다 낮을 수 있습니다.
렌즈에 장착 된 편광 필터를 사용하여 빛의 반사를 제거 할 수도 있습니다. 원형 편광 필터는 널리 사용 가능하지만 가격에 따라 품질이 상당히 다르며 저렴한 필터는 이미지 해상도를 크게 줄일 수 있습니다. 반사광은 편광 필터의 움직이는 부분을 비스듬히 돌려 걸러낼 수 있습니다. 편광 필터의 효능은 일부 광원(예를 들어, 강한 LED 광)에 의해 영향을 받을 수 있다. 전반적으로, 여분의 액체를 제거한 후, 편광 필터는 뇌 조각에서 모든 반사를 제거 할 수 있습니다. 그러나 완충 용액에 시료를 담그는 것이 심장 조각에 대한 가장 쉽고 비용 효율적인 접근 방식입니다.
셔터 속도, 조리개, ISO 및 화이트 밸런스의 수동 설정은 이미징 프로세스를 완벽하게 제어하는 데 중요합니다. 광원의 샘플, 배경 및 특성은 자동 설정에서 카메라 노출 측광 시스템에 영향을 미칩니다. 따라서 실험 중에 여러 사진 간의 지속적인 노출과 화이트 밸런스를 유지하려면 수동 설정이 필요합니다. 매크로 사진의 경우 제안된 조리개 설정은 f/8에서 f/16 사이입니다. 조리개를 줄이면 피사계 심도가 증가하므로 물체가 단일 평면에 있지 않은 경우에 유용합니다. 그러나 회절은 작은 조리개의 경우 사진의 총 해상도를 제한합니다. 대부분의 렌즈에 대한 최적의 조리개는 일반적으로 f/10인데, 이 설정에서는 해상도 강하가 무시할 수 있고 피사계 심도가 충분하기 때문입니다. 50에서 400 사이의 ISO 값(낮을수록 좋음)은 일반적으로 이미지 아티팩트(노이즈)를 최소화하는 데 최적입니다. 셔터 속도는 기존 조명 조건에서 언급 된 조리개 및 ISO 설정을 사용하여 올바른 노출을 얻기 위해 계속 변경되어야합니다. 수동 설정은 일관된 이미지 분석을 위해 중요합니다. 표준화된 이미징은 모든 연구 전반에 걸쳐 동일한 색상 임계값 설정을 사용하도록 보장하며, 이는 세분화 분석이 필요합니다. 예를 들어, 검체 이미지의 색상, 화이트 밸런스 및 노출이 일관된 경우 파란색, 빨간색 및 흰색(+옅은 분홍색)의 미리 정의된 색상이 있는 세분화 파일을 기반으로 하는 ImagePro 소프트웨어에 의한 반자동 분석을 수년 동안 사용할 수 있습니다.
화이트 밸런스 설정은 샘플을 비추는 데 사용되는 광원의 색온도에 따라 조정해야 합니다. 화이트 밸런스는 카메라 내장 프리셋 또는 그레이 타겟의 수동 보정을 사용하여 선택할 수 있습니다. RAW 형식으로 이미지를 캡처하는 이점은 이미지의 소프트웨어 후처리 중에 화이트 밸런스를 조정할 수 있다는 것입니다. RAW 파일에는 JPEG 파일보다 훨씬 많은 정보가 포함되어 있으므로 RAW 파일 후처리는 색상 균형 및 노출을 수정하고 더 나은 이미지 해상도를 얻을 수있는 훌륭한 기회를 제공합니다. 대부분의 카메라는 JPEG 및 RAW 파일을 동시에 캡처할 수 있으므로 RAW 파일을 캡처하여 백업으로 저장하는 것이 좋습니다.
전반적으로,이 프로토콜은 쥐 심장 및 뇌 조직 슬라이싱 및 염색에 대한 방법론을 설명하고 추가 분석을 위해 고해상도 이미지 수집을위한 조명 및 카메라 설정 및 사진 기술을 수립하기위한 지침을 제공합니다. 이 방법은 모든 실험적인 작은 동물 장기 사진에 적용 할 수 있습니다.
Disclosures
저자는 이해 상충이 없다고 선언합니다.
Acknowledgments
저자는 보조금 계약 No 857394, Project FAT4BRAIN에 따라 유럽 연합의 Horizon 2020 연구 및 혁신 프로그램의 지원을 받았습니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 mL syringe | Sagimed | N/A | |
| 2,3,5-Triphenyltetrazolium chloride (TTC) | Sigma-Aldrich | 298-96-4 | |
| 5 mL syringe | Sagimed | N/A | |
| 50 mL syringe | Terumo | N/A | |
| Adult Rat Brain Slicer Matrix | Zivic Instruments | BSRAS001-1 | |
| Aortic cannula for mouse heart | ADInstruments | SP3787 | |
| Aortic cannula for rat heart | ADInstruments | SP3786 | |
| Calcium chloride dihydrate, ≥99% | Acros Organics | 207780010 | |
| Cover Glass Forceps, Angled | Fine Science Tools | 11073-10 | |
| Hemostatic forceps | Agnthos | 13008-12 | |
| Hoya 62 mm alpha Circular Polarizer Filter | Hoya | HOCPA62 | |
| Magnesium chloride hexahydrate | Penta | 16330-31000 | |
| Methylene Blue | SigmaAldrich | M9140 | |
| Mouse Heart Slicer Matrix | Zivic Instruments | HSMS005-1 | |
| Polyethylene plastic tubing | BD Intramedic | N/A | |
| Potassium chloride for biochemistry | Acros Organics | 418205000 | |
| Potassium phosphate, monobasic, ≥99% | Acros Organics | 205920025 | |
| Rat Heart Slicer Matrix | Zivic Instruments | HSRS001-1 | |
| Scissors curved with blunt ends | Agnthos | 14013-15 | |
| Scissors for cleaning heart | Agnthos | 14058-11 | |
| Single Edge Razor Blades | Zivic Instruments | BLADE012.1 | |
| Sodium bicarbonate for biochemistry, 99.5% | Acros Organics | 447100010 | |
| Sodium chloride | Fisher bioreagents | BP358-10 | |
| Sony Alpha a6000 Mirrorless Digital Camera | Sony | ILCE6000 | Can be repalaced by any up-to-date digiatal camera |
| Sony FE 90 mm F/ 2.8 Macro G OSS | Sony | SEL90M28G | Important, lens should be compatible with camera |
| Sony SF32UZ SDHC 32 GB Class 10 UHS | Sony | 2190246141 | |
| Surgical blade | Heinz Herenz Hamburg Germany | BS2982 | |
| Thermo-Shaker | BioSan | PST-60HL-4 | |
| Toothed tissue forceps | Agnthos | 11021-12 | |
| Toothed tissue forceps for cleaning heart | Agnthos | 11023-10 | |
| Weigh tray, 70 mL | Sarsted | 71,99,23,212 |
References
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