Summary
Hier wordt een protocol gepresenteerd voor de gestandaardiseerde methodologie van knaagdierweefselpreparatie na het ischemie-reperfusie-experiment en richtlijnen voor het instellen van verlichtings- en camera-opstellingen voor beeldacquisitie met hoge resolutie. Deze methode is toepasbaar op alle experimentele kleindierorgelfotografie.
Abstract
Macrofotografie is toepasbaar voor het afbeelden van verschillende weefselmonsters met een hoge vergroting om kwalitatieve en kwantitatieve analyses uit te voeren. Weefselvoorbereiding en daaropvolgende beeldopname zijn stappen die onmiddellijk na het ischemie-reperfusie (IR) -experiment worden uitgevoerd en moeten tijdig en met de juiste zorg worden uitgevoerd. Voor de evaluatie van IR-geïnduceerde schade in het hart en de hersenen beschrijft dit artikel 2,3,5-trifenyl-2H-tetrazoliumchloride (TTC)-gebaseerde kleuring gevolgd door macrofotografie. Wetenschappelijke macrofotografie vereist gecontroleerde belichting en een geschikte beeldvormingsopstelling. De gestandaardiseerde methodologie zorgt voor hoogwaardige, gedetailleerde digitale beelden, zelfs als een combinatie van een goedkope up-to-date digitale camera en macrolens wordt gebruikt. De juiste technieken en mogelijke fouten bij monstervoorbereiding en beeldacquisitie worden besproken en voorbeelden van de invloed van juiste en onjuiste opstellingen op de beeldkwaliteit worden gegeven. Er worden specifieke tips gegeven over het voorkomen van veelgemaakte fouten, zoals overbewaring, onjuiste opslag van monsters en suboptimale lichtomstandigheden. Dit artikel toont de juiste methodologie voor het snijden en kleuren van hart- en hersenweefsels van ratten en biedt richtlijnen voor het vaststellen van belichtings- en camera-opstellingen en fotografietechnieken voor beeldacquisitie met hoge resolutie.
Introduction
Al tientallen jaren zijn fotografie en analyse van hart- en hersenweefselmonsters een belangrijk onderdeel van biowetenschappelijke experimenten. De vooruitgang van wetenschap en innovatie stimuleert de ontwikkeling van dure microscopen die in staat zijn tot superresolutie. Fotomicrografen worden verkregen in een goed gecontroleerde lichtomgeving volgens gedetailleerde instructies. Macrofotografie (bij een vergroting van 1:2 of meer) wordt daarentegen vaak uitgevoerd in een ongecontroleerde lichtomgeving met behulp van onjuiste beeldinstellingen. Vaak moeten de technieken van monstervoorbereiding en camera-instelling aanzienlijk worden geoptimaliseerd. Als gevolg hiervan zijn macrofoto's van beperkte kwaliteit op grote schaal gepubliceerd in wetenschappelijke tijdschriften. Onvoldoende beeldresolutie en contrast beperken de mogelijkheden van nauwkeurige beeldkwantificering in IR-studies.
Experimentele procedures van myocardiale1,2 en hersen3,4 infarcten zijn in detail beschreven. Het doel van deze studie is om een stapsgewijze handleiding te bieden voor het opzetten van een systeem voor fotografie en gestandaardiseerde analyse van knaagdierhart- en hersenweefselmonsters na infarctexperimenten. Dit omvat weefselsnijden, kleuring en macrofotografie van hart- en hersenmonsters. De voorbereiding van weefselmonsters is een essentieel onderdeel van het experiment en de resultaten van de planimetrische beeldanalyse zijn sterk afhankelijk van de kwaliteit van de verkregen beelden5.
Deze methoden zijn met name nuttig voor het uitvoeren van metingen en beeldplanimetrische analyse in knaagdierweefsels en kunnen van waarde zijn voor algemene wetenschappelijke macrofotografie. Bovendien maken de hoge kwaliteit en consistentie van afbeeldingen het mogelijk om geautomatiseerde analyse van digitale foto's uit te voeren, wat helpt om tijd te besparen, gebruikersinvoer te voorkomen en het risico op fouten of vertekening tijdens beeldanalyse te minimaliseren. Dit zal resulteren in het genereren van robuuste en betrouwbare gegevens en de vertaling van preklinische ontdekkingen naar nieuwe anti-ischemische behandelingen in klinieken vergroten.
Protocol
De experimentele procedures werden uitgevoerd in overeenstemming met de richtlijnen van de Europese Gemeenschap en lokale wetten en beleid (Richtlijn 2010/63/EU), en alle procedures werden goedgekeurd door de Voedsel- en Veterinaire Dienst, Riga, Letland.
1. Hartkleuring en snijden
OPMERKING: Technieken die in dit protocol worden beschreven, kunnen worden gebruikt na zowel Langendorff-perfused geïsoleerde ratten- of muizenhart6,7 als in vivo IR-letseltests voor rattenhart8,9,10,11. Voor kleuring na een in vivo IR-letseltest wordt aangenomen dat het hart wordt weggesneden, op een canule wordt gemonteerd en kort wordt toegediend in de Langendorff-perfusiemodus.
- Maak de hartcanule los van de spuit gevuld met Krebs-Henseleit-oplossing en sluit deze aan op een spuit gevuld met een warme (37 °C) oplossing van 0,1% methyleenblauw in Krebs-Henseleit-oplossing. Gebruik een spuit van 5 ml voor rattenharten en een spuit van 1-2 ml voor muizenharten.
OPMERKING: Een alternatief is om het druk- of stroomgestuurde (bijv. Langendorff) apparaat te vullen met een blauwe kleurstofhoudende oplossing. Tijdens de loslatings- en montageprocedure is het essentieel om geen luchtbellen in de canule achter te laten en de hechting die wordt gebruikt voor coronaire reocclusie niet los te maken. - Perfuseer verder rattenharten met 4 ml methyleenblauwoplossing met een snelheid van ~ 4 ml / min en perfuseer muizenharten met 1 ml methyleenblauwoplossing met een snelheid van ~ 0,5-1 ml / min.
OPMERKING: Op basis van ervaring zijn beide technieken veilig en zorgen ze voor voldoende kleuring; het gebruik van een drukgestuurd pomp / hydrostatisch druksysteem is echter een meer tijdrovende maar veiligere optie tegen overstaining voor beginnende wetenschappers. - Koppel de canule los van de spuit en verwijder het hart van de canule.
- Verwijder overtollig methyleenblauw door het hart zachtjes op tissuepapier te rollen. Maak de ligatuur rond de kransslagader los door de hemostatische tang te openen en de plastic slang van de chirurgische hechting pas te verwijderen na het verwijderen van overtollig methyleenblauw.
OPMERKING: In dit stadium is het mogelijk om het muizenhart in een kleine plastic zak of een centrifugemicrobuis van 5 ml in de vriezer (-20 ° C) te plaatsen gedurende maximaal 5-10 minuten. De maximale vriestijd moet experimenteel in elk laboratorium worden bepaald. Kortdurend invriezen van een muizenhart kan een beginnende experimentator helpen het in plakken van 1 mm dik te snijden. Het bevriezen van rattenharten wordt niet aanbevolen. Overvriezen gedurende meer dan 10 minuten bij -20 °C moet worden vermeden. - Plaats het bevlekte rattenhart in een roestvrijstalen matrix (zie de tabel met materialen) voor het snijden van het hart (figuur 1A). Snijd vervolgens de ventrikels van het hart in plakken van 2 mm dik (richt op 6-7 plakjes van een volwassen rattenhart). Snijd voor muizenharten de ventrikels van het hart in plakken van 1,5 mm dik (streef naar ten minste 4 plakjes van een volwassen muizenhart).
OPMERKING: Er moeten snijmatrix-compatibele scheermesjes worden gebruikt. Over het algemeen kunnen compatibele scheermesjes met één rand (bijv. dikte tot 0,01 inch (0,254 mm)) worden gebruikt voor het snijden van rattenharten. Tweesnijdende scheermesjes worden over het algemeen gebruikt voor muizenharten en zijn meestal tot 0,004 inch (0,1 mm) dik.
Figuur 1: Matrices voor het rattenhart en hersensnijdingen. (A) Rattenhart, (B) rattenhersenen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
- Breng na het snijden de plakjes over in een plastic buis van 15 ml. Voeg 5 ml 1% trifenyltetrazoliumchloride (TTC) opgelost in fosfaat-gebufferde zoutoplossing (PBS) toe aan de buis met de hartplakken en incubeer gedurende 10 minuten in een waterbad bij 37 °C.
- Na incubatie in TTC-oplossing, was de hartplakken ten minste 2-3 keer met PBS en bereid je voor op het vastleggen van beelden.
2. Hersenkleuring en snijden
- Verwijder na het middelste cerebrale arterie occlusie-experiment3,12 de hersenen, inclusief de hersenstam, uit de schedel en was deze in ijskoude PBS.
- Kies de juiste grootte van de roestvrijstalen matrix in de hersenen (zie de tabel met materialen), afhankelijk van het gewicht van de dieren (figuur 1B). Plaats de hersenen met de ventrale kant naar boven in de hersenmatrix.
OPMERKING: Wanneer het ventrale oppervlak van de hersenen in de matrix zit, moet het evenwijdig zijn aan het bovenste oppervlak van de mal. - Beperk met behulp van messen de frontale en caudale delen (2 bladen aan beide zijden) van de hersenen.
OPMERKING: Er moeten snijmatrix-compatibele scheermesjes worden gebruikt. Over het algemeen kan een compatibel scheermesje met één rand (dikte tot 0,01 inch (0,254 mm)) worden gebruikt voor het snijden van de hersenen van ratten. - Plaats de messen gedeeltelijk (niet volledig snijdend in de hersenen) in de kanalen tussen de eerste en de laatste messen. Wanneer alle messen parallel zijn ingebracht en gerangschikt, drukt u alle messen tegelijkertijd met de handpalm naar beneden om de hersenen in 2 mm coronale plakjes te snijden.
- Pak de messen stevig vast langs de zijkanten met twee vingers en verwijder ze samen met de gesneden hersenen uit de matrix.
- Schik de hersensneden één voor één in een bakje (70 ml, 72 x 72 mm). Zorg er bij het rangschikken van de plakjes voor dat het voorste oppervlak van elke plak altijd naar boven is gericht.
- Giet warme (+37 °C) 1% TTC-oplossing in PBS op de hersenschijfjes en incubeer ze gedurende 8 minuten bij 37 °C in het donker.
OPMERKING: De hersenschijfjes moeten tijdens de incubatie volledig worden ondergedompeld in TTC-oplossing. - Breng na incubatie in 1% TTC-oplossing de hersenschijfjes over naar de blauwe plastic bak om beelden vast te leggen. Rangschik de hersenplakken in opeenvolgende volgorde van het frontale naar het caudale deel en gebruik een scalpel om de hemisferen in het sagittale vlak te scheiden.
OPMERKING: Het oppervlak van de lade moet wasbaar, mat en van een kleur zijn die contrasteert met hersenplakken (d.w.z. niet rood, wit of lichtroze).
3. Macrofotografie
- Fotografeer de plakjes van het weefsel direct na het kleuren.
OPMERKING: Hartplakken kunnen tot 30 minuten worden bewaard in koude PBS (bij +4 °C) of formaline-oplossing. Hersenplakken kunnen gedurende een langere periode (1-2 weken) in formaline worden bewaard. - Stel de camera naar keuze in met een opgeladen batterij, geheugenkaart en aangesloten lens op een standaard (afbeelding 2)
OPMERKING: Zet de lichten minstens 5-10 minuten voor het verkrijgen van afbeeldingen aan om de apparatuur op te warmen. LED-lampen bereiken de volledige helderheid in microseconden.
Figuur 2: Camera en lampen ingesteld voor macrofotografie. De camera staat loodrecht op het beeldoppervlak om ervoor te zorgen dat het brandpuntsvlak van de camera evenwijdig is aan de monsters. Afkorting: LED = light-emitting diode. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
- Afhankelijk van de beschikbare lichtbronnen selecteert u de juiste witbalansinstellingen of voert u de kleurtemperatuurkalibratie uit volgens de instructies in de handleiding van de camera.
OPMERKING: Wit LED-licht (kleurtemperatuur 6.500 K) is de voorkeurslichtbron om te voorkomen dat licht flikkert door fluorescentielampen. - Zet de camera in de volledig handmatige modus, stel de ISO 100 en het diafragma in op f/10 en pas de sluitertijd aan voor een optimale beeldbelichting. Zorg ervoor dat het brandpuntsvlak van de camera evenwijdig is aan het oppervlak waar het monster wordt geplaatst.
OPMERKING: Histogramfunctie is nuttig om ervoor te zorgen dat weefselplakken niet overbelicht zijn. - Sluit een bedrade of draadloze afstandsbedieningstrigger aan of schakel deze in om te voorkomen dat de camera trilt wanneer de sluiter wordt losgelaten.
OPMERKING: Een alternatief is om een vertraagde sluiterfunctie in te schakelen, die de trigger 2 of 10 s vertraagt na het indrukken van de triggerknop. - Dompel de hartplakken volledig onder in een container met PBS.
OPMERKING: Ondergedompelde dia's hebben de neiging om weg te zweven van hun positie. Om het drijven van de plakjes te minimaliseren, gebruikt u de kleinst mogelijke lade waarin alle plakjes passen en de minimale hoeveelheid onderdompelingsoplossing, zodat het monster volledig wordt ondergedompeld. Alternatieve methoden zijn het plaatsen van de plakjes tussen glasplaten of het gebruik van een polarisatiefilter op de lens. Een cirkelvormig polarisatiefilter wordt aan de lens bevestigd en gedraaid totdat reflecties in een live-view display van de camera verdwijnen. - Schik de hersenschijfjes in een droge bak zonder PBS of andere vloeistoffen.
OPMERKING: Een polarisatiefilter is erg handig om beelden van hersenplakken vast te leggen. - Plaats de container met plakjes onder de camera met de macrolens en zorg ervoor dat alle plakjes volledig in het gezichtsveld passen. Zorg ervoor dat de plakjes zich op hetzelfde vlak bevinden, d.w.z. niet gebogen of gerold.
- Controleer de belichting en pas indien nodig de camera-instellingen aan.
OPMERKING: Als u eenmaal bent ingesteld, mag u de belichting en andere instellingen tijdens het hele experiment niet wijzigen. - Leg het nummer (of een andere identificatie) van het monster vast en stel het weefselsegment in beeld met behulp van een externe trigger.
OPMERKING: Een maatmarkering, zoals een mm-liniaal, moet in het gezichtsveld worden opgenomen wanneer absolute kwantificering van de grootte van het monster nodig is. - Draai de segmenten en leg hun afbeeldingen van de andere kant vast.
Representative Results
Figuur 3A is een foto van een met methyleenblauw en TTC gekleurd hartschijfje na een hartinfarct, die voldoende detail- en kleurinformatie bevat voor verdere planimetrische analyse van de grootte van het infarct (figuur 3B). We hebben getest hoe bevriezing van het hart gedurende 24 uur de integriteit van hartweefsels beïnvloedt (figuur 3C). Invriezen gedurende een langere periode (>1 uur, figuur 3C) vermindert de mitochondriale functie; de TTC-kleuring van het hart is dus niet rood maar lichtroze en de grens tussen necrotische en levensvatbare weefsels is vaag (figuur 3C).
Verder werden twee methoden vergeleken voor het verminderen van reflecties in de specimens. Onderdompeling is de meest efficiënte methode en produceert gedetailleerde beelden met een goed contrast (figuur 4A). De tweede methode is het gebruik van een polarisatiefilter dat aan de lens is bevestigd. Het polarisatiefilter is ook effectief; het filter vermindert echter de resolutie en het microcontrast van de afbeelding enigszins (figuur 4B). Een voorbeeldafbeelding van een hartschijfje zonder onderdompeling of filter (figuur 4C) bevat veel reflecties en is niet geschikt voor verdere analyse.
Brain slices worden niet ondergedompeld vanwege slice management (zwevende) problemen. In de planimetrische analyse is het belangrijk om de onaangetaste (gezonde) kant van de hersenen (figuur 5A) te vergelijken met de door een beroerte aangedane zijde (figuur 5B). Hersenplakken zijn gemakkelijker te beheren op een droge plaat of lade en een polarisatiefilter wordt gebruikt om reflecties te verwijderen. Een lade met blauwe achtergrond wordt gebruikt voor hersenknipfotografie (achtergrondselectie eerder beschreven5).
Handmatige camera-instellingen werden gebruikt om volledige controle over belichting en witbalans te garanderen. De camera-instellingen moeten voor of aan het begin van het experiment worden aangepast aan de beschikbare lichtbron. Dit zorgt voor een optimale belichting en witbalans van alle beelden om een uniforme analyse mogelijk te maken (figuur 6A). De automatische instellingen van de camera zijn niet perfect en kunnen resulteren in wisselende cameraparameters, wat resulteert in ongepaste resultaten en de introductie van beeld-naar-beeld variabiliteit.
Figuur 6 toont voorbeelden van overbelichte (figuur 6B) en onderbelichte beelden (figuur 6C) van hartschijfjes. Er moet voldoende aandacht worden besteed aan de juiste witbalansinstellingen van de camera om overeen te komen met een bepaalde lichtbron die wordt gebruikt in de cameralichtopstelling. Onjuiste witbalansinstellingen kunnen leiden tot een verschuiving naar blauw of geel (figuur 6D) en magenta of groen (figuur 6E) in de afbeelding.
Figuur 3: Afbeeldingen van hartplakken bij ratten. (A) Vers hartschijfje werd geanalyseerd in ImageProPlus 6.3-software met behulp van kleursegmentatie (B). (C) TTC-kleuring maakt slecht onderscheid tussen levensvatbaar en necrotisch weefsel in de bevroren hartschijf (bevroren gedurende 24 uur). Afkorting: TTC = 2,3,5-trifenyl-2H-tetrazoliumchloride. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4: Technieken voor het verminderen van reflecties. Rat hart plakbeeld opgenomen ondergedompeld in PBS (A) en met behulp van polarisatiefilter (B). (C) Hartschijf met reflecties wanneer geen onderdompeling of filter wordt gebruikt. Afkorting = PBS = fosfaat-gebufferde zoutoplossing. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 5: Afbeeldingen van rattenhersenen. Rattenhersenen werden in zeven plakjes gesneden en gekleurd met TTC na ischemie-reperfusie. Het gebruik van een polarisatiefilter resulteert in het verkrijgen van reflectievrij beeld. (A) Plakjes van de onbeschadigde halve bol ; (B) Plakjes van de door een beroerte aangetaste hemisfeer. Afkorting: TTC = 2,3,5-trifenyl-2H-tetrazoliumchloride. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 6: Rattenhart snijdt beelden. Correct (A) en onjuist (B-E) vastgelegde hartsnedebeelden. Onjuiste belichtingsinstellingen resulteren in overbelichte (B) en onderbelichte beelden (C). Onjuiste witbalansinstellingen resulteren in geel (D) of groen zweem in de afbeelding (E). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Discussion
De voorbereiding van het hart na IR begint met de reocclusie van hartslagaders in het bloed en de perfusie van blauwe kleurstof voor de discriminatie van risicogebieden van niet-risicogebieden. Methyleenblauw of Evansblauwe kleurstoffen worden het meest gebruikt voor dit doel2. Omdat een te hoge druk hartkleppen kan beschadigen en dus gedeeltelijk of volledig vlekgebieden kan veroorzaken, is het beter om het hart te doordrenken met een drukgestuurd systeem, zoals het Langendorff-apparaat of een vereenvoudigde versie van een spuit of pomp met hydrostatisch druksysteem. Gecontroleerde perfusie zorgt voor fysiologische druk en de kleurstof zal meestal niet in het afgesloten gebied van het hart komen. Zowel stromingssnelheids- als drukgestuurde technieken zijn waarborgen tegen overstaining.
Een van de ernstigste fouten bij levensvatbare weefselverwerking is het langdurig bewaren van weefsels in een vriezer voordat ze worden gekleurd. Bevriezing wordt vooral gebruikt omdat onderzoekers de dag na het IR-experiment of later hartkleuring willen uitvoeren. Bovendien wordt bevriezing gebruikt om het snijden van het hart gemakkelijker te maken. We ontdekten dat kortdurend bevriezen van het hart gedurende maximaal 5-10 minuten verwaarloosbaar de integriteit van hartweefsels beïnvloedt en het snijden van de weefsels (met name voor muizenharten) in dunne plakjes vergemakkelijkt. Bevriezing gedurende langere perioden beschadigt echter membranen en vermindert de levensvatbaarheid van de cel en de mitochondriale functie13. Als gevolg hiervan wordt de TTC-kleuring van functionerende mitochondriën aangetast en is de grens tussen necrotische en levensvatbare weefsels slecht afgebakend (wazig). Over het algemeen moet bevriezing van rattenharten worden vermeden en kan alleen kortdurende bevriezing van muizenharten worden gebruikt om gemakkelijker te snijden.
De volgende stap is weefselkleuring in 1% TTC-oplossing bij 37 °C14. De kleuringsoplossing moet worden voorverwarmd , vooral belangrijk voor het kleuren van hersenplakken. Bij gebruik van de voorverwarmde oplossing is de optimale kleuringstijd voor hartplakken 10 min. Een langere incubatie of een temperatuur hoger dan 37 °C resulteert in bruine kleuring van de hartweefsels. Een goede kleuring van monsters en een consistente rode kleurintensiteit zijn belangrijk voor verdere beeldanalyse. In de laatste stappen voor de fotografie worden de weefselplakken 2-3 keer gespoeld met koude PBS of een vergelijkbare buffer om TTC en overtollig methyleenblauw uit de oplossing te verwijderen om blauw gieten op de foto te voorkomen. Hartplakken moeten kort na het kleuren worden gefotografeerd om de beste beeldkwaliteit te verkrijgen. Hartkleuring blijft van goede kwaliteit bij bewaring tot 60 min in de koude (+4 °C) PBS. Gekleurde hersenplakken en aortaweefsels worden meestal opgeslagen in een 4% neutrale formaldehyde-oplossing en behouden een week lang een goede kwaliteit. Nachtelijke opslag van hersenweefsels in formaline (+4 °C) heeft geen invloed op de kleurintensiteit van normaal weefsel en is aanvaardbaar voor beeldacquisitie. Formaline induceert echter zwelling en het vasthouden van plakjes van het hart. Daarom wordt de opslag van hartweefsels in formaline niet aanbevolen.
De volgende stap is beeldacquisitie. Veel laboratoria gebruiken flatbedscanners als een hulpmiddel voor beeldacquisitie dat naar verwachting een digitale camera en verlichtingsopstelling zal vervangen. We hebben vastgesteld dat het scannen van plakjes onvoldoende beeldresolutie en kleurscheiding biedt en daarom niet geschikt is voor het in beeld brengen van hartplakken. Met name de resolutie van de scanner is onvoldoende voor muizenharten en we merkten een slechte weergave van methyleenblauw. Een scanner kan daarentegen een alternatief zijn voor een fotocamera voor het in beeld brengen van hersenplakken die alleen zijn gekleurd met TTC of andere enkelvoudige kleurstoffen. Voor het scannen van weefselplakken is scansoftware die zorgt voor constante belichtingsinstellingen essentieel. Over het algemeen is een flatbedscanner minder capabel en kan een digitale camera niet worden vervangen voor de meeste beeldtoepassingen.
Ook de achtergrond achter exemplaren is belangrijk. Idealiter moet de bodem van de lade van een kleur zijn die niet aanwezig is in het bevlekte exemplaar. Om bijvoorbeeld het gebied van methyleenblauw en TTC (rood) kleuring op een geautomatiseerde of semi-geautomatiseerde manier te kwantificeren, moeten witte, rode, blauwe, gele en bruine achtergronden worden vermeden. Een groene achtergrond zou dus de voorkeur hebben. Niettemin hangt de kleurkeuze af van de voorkeuren van de operator, die de afbeelding nabewerkt. Veel wetenschappers geven de voorkeur aan een witte achtergrond omdat een witte achtergrond kan worden verwijderd in beeldpostprocessing en kan worden omgezet in volledig wit (RGB-witte code 255.255.255). Vervolgens moet men volledig wit uitsluiten van de lijst met geselecteerde kleuren die worden gebruikt voor semi-geautomatiseerde analyse en alleen bleke necrotische gebieden tellen, die niet volledig wit zijn, zo niet overbelicht. Blauwe en groene achtergronden zijn geschikt voor de fotografie van hersenplakken en aorta's.
De optimale beeldvormingstool voor weefselfotografie is een spiegelreflexcamera of spiegelloze digitale camera met verwisselbare lens en een compatibele macrolens. Het vastleggen van zeer kleine objecten kan een combinatie van een camera en een microscoop vereisen; toch heeft een macrolens meestal voldoende (minimaal 1:2) vergroting om gedetailleerde beelden van een muizenhart te verkrijgen. Veel fabrikanten bieden betaalbare digitale camera's en macrolenzen om foto's met een hoge resolutie en hoge vergroting te verkrijgen. Alle up-to-date digitale camera's hebben kenmerken en functies die nodig zijn voor macrofotografie, waaronder de mogelijkheid om op een standaard te monteren, een groot aantal pixels (meestal >20 Mpx), live view, spiegelvergrendeling, time-lapse-functies, externe sluitertijd en de mogelijkheid om cameraparameters handmatig in te stellen, waardoor een constante sluitertijd, diafragma, witbalans en ISO-instelling wordt gegarandeerd. Compactcamera's met de bovengenoemde functies en lensvergroting van minimaal 1:2 kunnen ook worden gebruikt voor macrofotografie. Vanwege lenskenmerken moeten sommige compactcamera's in de buurt van het object worden geplaatst en moet de experimentator ervoor zorgen dat de camerabehuizing de verlichting van het monster niet beïnvloedt.
Voor macrofotografie met elk type camera met verwisselbare lens is een macrolens met een hoge vergroting (1:1-1:2) vereist. We raden aan om macrolenzen te gebruiken met een brandpuntsafstand variërend van 50 mm tot 100 (120) mm of gelijkwaardig op de full-frame (24 mm x 36 mm) sensor. Kleinere sensorcamera's hebben verschillende sensorformaten en de vergroting moet dienovereenkomstig opnieuw worden berekend. Voor het fotograferen van hartplakken is een ergonomische afstand van het 100 mm macrolens frontelement tot het onderwerp ongeveer 150 mm. Met deze instelling kunnen operators alle apparatuur op een tafel houden, met gemakkelijke toegang tot de camerabediening. Een 50 mm macrolens kan worden overwogen voor het fotograferen van grotere objecten, zoals hersensegmenten, omdat een breder gezichtsveld nodig is om alle segmenten in één foto te verkrijgen.
Om scherpe beelden met een hoge resolutie te verkrijgen, moet een camera op een stevige standaard worden gemonteerd, die samen met een lichtopstelling een fotografie-kopieerstandaard wordt genoemd. Montage van de camera op een standaard en een externe (bekabelde of draadloze) trigger elimineert camerabewegingen en zorgt voor een constante afstand tot het doel. Een camerabelichtingsopstelling met twee constante lichtbronnen van beide zijden, ongeveer 30-60° onder een hoek ten opzichte van het onderwerpvlak, zorgt voor voldoende verlichting van monsters en helpt tegelijkertijd reflecties te voorkomen. De camera moet precies zo worden gemonteerd dat de sensor evenwijdig is aan het onderwerpvlak. Om het beeldveld gelijkmatig te verlichten, moeten beide lampen even georiënteerd zijn en op dezelfde afstand van het onderwerp worden geplaatst. Lichtbronnen die op verschillende afstanden van het onderwerp worden geplaatst, veroorzaken een ongelijke verlichting. Bovendien zijn knipperende lichtbronnen een reden voor variaties in de beeldbelichting. Over het algemeen is het belangrijk om de camera en lichtbronnen nauwkeurig te plaatsen om nauwkeurig beelden van goed verlichte exemplaren te verkrijgen.
Weefselmonsters reflecteren licht (glinsteren), die als witte vlekken in de afbeeldingen verschijnen. Deze lichtreflectievlekken bevatten geen nuttige kleurinformatie en daarom kunnen deze delen van de afbeeldingen niet worden gebruikt voor een nauwkeurige kwantitatieve analyse van afbeeldingen. Lichtreflecties van weefselplakken kunnen op verschillende manieren worden verwijderd. De meest efficiënte is de volledige onderdompeling van weefselmonsters in een container met een zoutoplossing of PBS-oplossing. Een vergelijkbare benadering is het inbrengen van weefselplakken onder (of tussen) glasplaten. Deze methode is efficiënt tegen reflecties; de beeldresolutie kan echter lager zijn dan die van foto's van ondergedompelde weefsels.
Men kan ook een polarisatiefilter gebruiken dat op een lens is gemonteerd om lichtreflecties te elimineren. Circulaire polarisatiefilters zijn overal verkrijgbaar, maar variëren aanzienlijk in kwaliteit, afhankelijk van de prijs, en goedkope filters kunnen de beeldresolutie aanzienlijk verlagen. Gereflecteerd licht kan worden weggefilterd door het bewegende deel van het polarisatiefilter onder een hoek te draaien. De werkzaamheid van het polarisatiefilter kan worden beïnvloed door sommige lichtbronnen (bijvoorbeeld sterk LED-licht). Over het algemeen kan een polarisatiefilter na verwijdering van extra vloeistof alle reflecties van de hersenplakken elimineren; monsteronderdompeling in bufferoplossing is echter de gemakkelijkste en meest kostenefficiënte aanpak voor hartplakken.
Handmatige instellingen van de sluitertijd, diafragma, ISO en witbalans zijn belangrijk om volledige controle over het beeldvormingsproces te behouden. Het monster, de achtergrond en de kenmerken van de lichtbron beïnvloeden het camerabelichtingsmetersysteem in automatische instellingen; daarom zijn handmatige instellingen nodig om een constante belichting en witbalans tussen meerdere foto's tijdens het experiment te behouden. Voor macrofotografie ligt de voorgestelde diafragma-instelling tussen f/8 en f/16. Door het diafragma te verkleinen, neemt de scherptediepte toe, wat handig is als het object zich niet in een enkel vlak bevindt. Diffractie beperkt echter de totale resolutie van fotografie in het geval van kleinere diafragma's. Het optimale diafragma voor de meeste objectieven is meestal f/10 omdat in deze instelling de resolutiedaling verwaarloosbaar is en de scherptediepte voldoende is. ISO-waarden die variëren van 50 tot 400 (lager is beter) zijn meestal optimaal om beeldartefacten (ruis) te minimaliseren. De sluitertijd moet dan nog worden gewijzigd om de juiste belichting te verkrijgen met behulp van de genoemde diafragma- en ISO-instellingen in bestaande lichtomstandigheden. Handmatige instellingen zijn belangrijk voor een consistente beeldanalyse. Gestandaardiseerde beeldvorming zorgt voor het gebruik van dezelfde kleurdrempelinstellingen in elk onderzoek, wat segmentatieanalyse vereist. Semi-geautomatiseerde analyse door ImagePro-software op basis van een segmentatiebestand met vooraf gedefinieerde kleuren blauw, rood en wit (+ lichtroze) kan bijvoorbeeld in de loop der jaren worden gebruikt als specimenafbeeldingen consistente kleuren, witbalans en belichting hebben.
De witbalansinstelling moet worden aangepast afhankelijk van de kleurtemperatuur van de lichtbron die wordt gebruikt om een monster te verlichten. Witbalans kan worden geselecteerd uit ingebouwde presets van de camera of met behulp van de handmatige kalibratie van een grijs doel. Het voordeel van het vastleggen van beelden in RAW formaat is dat de witbalans kan worden aangepast tijdens softwarematige nabewerking van het beeld. Omdat RAW-bestanden veel meer informatie bevatten dan JPEG-bestanden, biedt nabewerking van RAW-bestanden een uitstekende gelegenheid voor de correctie van kleurbalans en belichting, evenals voor het verkrijgen van een betere beeldresolutie. Omdat de meeste camera's JPEG- en RAW-bestanden tegelijkertijd kunnen vastleggen, raden we aan het RAW-bestand vast te leggen en op te slaan als back-up.
Over het algemeen beschrijft dit protocol een methodologie voor het snijden en kleuren van hart- en hersenweefsel van ratten en biedt het richtlijnen voor het vaststellen van belichtings- en camera-opstellingen en fotografietechnieken voor beeldacquisitie met hoge resolutie voor verdere analyse. Deze methode is toepasbaar op alle experimentele kleindierorgelfotografie.
Disclosures
De auteurs verklaren dat ze geen belangenconflicten hebben.
Acknowledgments
De auteurs werden ondersteund door het Horizon 2020 onderzoeks- en innovatieprogramma van de Europese Unie onder subsidieovereenkomst nr. 857394, Project FAT4BRAIN.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 mL syringe | Sagimed | N/A | |
| 2,3,5-Triphenyltetrazolium chloride (TTC) | Sigma-Aldrich | 298-96-4 | |
| 5 mL syringe | Sagimed | N/A | |
| 50 mL syringe | Terumo | N/A | |
| Adult Rat Brain Slicer Matrix | Zivic Instruments | BSRAS001-1 | |
| Aortic cannula for mouse heart | ADInstruments | SP3787 | |
| Aortic cannula for rat heart | ADInstruments | SP3786 | |
| Calcium chloride dihydrate, ≥99% | Acros Organics | 207780010 | |
| Cover Glass Forceps, Angled | Fine Science Tools | 11073-10 | |
| Hemostatic forceps | Agnthos | 13008-12 | |
| Hoya 62 mm alpha Circular Polarizer Filter | Hoya | HOCPA62 | |
| Magnesium chloride hexahydrate | Penta | 16330-31000 | |
| Methylene Blue | SigmaAldrich | M9140 | |
| Mouse Heart Slicer Matrix | Zivic Instruments | HSMS005-1 | |
| Polyethylene plastic tubing | BD Intramedic | N/A | |
| Potassium chloride for biochemistry | Acros Organics | 418205000 | |
| Potassium phosphate, monobasic, ≥99% | Acros Organics | 205920025 | |
| Rat Heart Slicer Matrix | Zivic Instruments | HSRS001-1 | |
| Scissors curved with blunt ends | Agnthos | 14013-15 | |
| Scissors for cleaning heart | Agnthos | 14058-11 | |
| Single Edge Razor Blades | Zivic Instruments | BLADE012.1 | |
| Sodium bicarbonate for biochemistry, 99.5% | Acros Organics | 447100010 | |
| Sodium chloride | Fisher bioreagents | BP358-10 | |
| Sony Alpha a6000 Mirrorless Digital Camera | Sony | ILCE6000 | Can be repalaced by any up-to-date digiatal camera |
| Sony FE 90 mm F/ 2.8 Macro G OSS | Sony | SEL90M28G | Important, lens should be compatible with camera |
| Sony SF32UZ SDHC 32 GB Class 10 UHS | Sony | 2190246141 | |
| Surgical blade | Heinz Herenz Hamburg Germany | BS2982 | |
| Thermo-Shaker | BioSan | PST-60HL-4 | |
| Toothed tissue forceps | Agnthos | 11021-12 | |
| Toothed tissue forceps for cleaning heart | Agnthos | 11023-10 | |
| Weigh tray, 70 mL | Sarsted | 71,99,23,212 |
References
- Bell, R. M., Mocanu, M. M., Yellon, D. M. Retrograde heart perfusion: the Langendorff technique of isolated heart perfusion. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 50 (6), 940-950 (2011).
- Botker, H. E., et al. Practical guidelines for rigor and reproducibility in preclinical and clinical studies on cardioprotection. Basic Research in Cardiology. 113 (5), 39 (2018).
- Uluc, K., Miranpuri, A., Kujoth, G. C., Akture, E., Baskaya, M. K. Focal cerebral ischemia model by endovascular suture occlusion of the middle cerebral artery in the rat. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (48), e1978 (2011).
- Zvejniece, L., Svalbe, B., Liepinsh, E., Pulks, E., Dambrova, M. The sensorimotor and cognitive deficits in rats following 90- and 120-min transient occlusion of the middle cerebral artery. Journal of Neuroscience Methods. 208 (2), 197-204 (2012).
- Liepinsh, E., Kuka, J., Dambrova, M. Troubleshooting digital macro photography for image acquisition and the analysis of biological samples. Journal of Pharmacological and Toxicological Methods. 67 (2), 98-106 (2013).
- Kolwicz, S. C., Tian, R. Assessment of cardiac function and energetics in isolated mouse hearts using 31P NMR spectroscopy. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (42), e2069 (2010).
- Herr, D. J., Aune, S. E., Menick, D. R. Induction and assessment of ischemia-reperfusion injury in Langendorff-perfused rat hearts. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (101), e52908 (2015).
- Liepinsh, E., et al. Inhibition of L-carnitine biosynthesis and transport by methyl-gamma-butyrobetaine decreases fatty acid oxidation and protects against myocardial infarction. British Journal of Pharmacology. 172 (5), 1319-1332 (2015).
- Nakamura, K., Al-Ruzzeh, S., Ilsley, C., Yacoub, M. H., Amrani, M. Acute effect of cerivastatin on cardiac regional ischemia in a rat model mimicking off-pump coronary surgery. Journal of Cardiac Surgery. 20 (6), 507-511 (2005).
- Li, Q., Morrison, M. S., Lim, H. W. Using a cardiac anchor to refine myocardial infarction surgery in the rat. Lab Animal. 39 (10), 313-317 (2010).
- Wu, Y., Yin, X., Wijaya, C., Huang, M. H., McConnell, B. K.
- Vavers, E., et al. The neuroprotective effects of R-phenibut after focal cerebral ischemia. Pharmacological Research. 113, Pt B 796-801 (2016).
- Acin-Perez, R., et al. A novel approach to measure mitochondrial respiration in frozen biological samples. EMBO Journal. 39 (13), 104073 (2020).
- Kloner, R. A., Darsee, J. R., DeBoer, L. W., Carlson, N. Early pathologic detection of acute myocardial infarction. Archives of Pathology & Laboratory Medicine. 105 (8), 403-406 (1981).
