Summary
Præsenteret her er en protokol for den standardiserede metode til fremstilling af gnavervæv efter iskæmi-reperfusionseksperimentet og retningslinjer for etablering af belysnings- og kameraopsætninger til billedoptagelse i høj opløsning. Denne metode gælder for al eksperimentel organfotografering af små dyr.
Abstract
Makrofotografering er anvendelig til billeddannelse af forskellige vævsprøver ved høj forstørrelse for at udføre kvalitative og kvantitative analyser. Vævsforberedelse og efterfølgende billedoptagelse er trin, der udføres umiddelbart efter iskæmi-reperfusionsforsøget (IR) og skal udføres rettidigt og med passende omhu. Til evaluering af IR-induceret skade i hjertet og hjernen beskriver dette papir 2,3,5-triphenyl-2H-tetrazoliumchlorid (TTC)-baseret farvning efterfulgt af makrofotografering. Videnskabelig makrofotografering kræver kontrolleret belysning og en passende billedbehandlingsopsætning. Den standardiserede metode sikrer detaljerede digitale billeder af høj kvalitet, selvom der anvendes en kombination af et billigt opdateret digitalkamera og makroobjektiv. Korrekte teknikker og potentielle fejl i prøveforberedelse og billedoptagelse diskuteres, og der gives eksempler på indflydelsen af korrekte og forkerte opsætninger på billedkvaliteten. Der gives specifikke tip til, hvordan man undgår almindelige fejl, såsom overstaining, forkert prøveopbevaring og suboptimale lysforhold. Dette papir viser den passende metode til udskæring og farvning af rottehjerte og hjernevæv og giver retningslinjer for etablering af belysnings- og kameraopsætninger og fotograferingsteknikker til billedoptagelse i høj opløsning.
Introduction
I årtier har fotografering og analyse af hjerte- og hjernevævsprøver været en vigtig del af life science-eksperimenter. Videnskabelige og innovative fremskridt driver udviklingen af dyre mikroskoper, der er i stand til superopløsning. Fotomikrografer opnås i et velkontrolleret lysmiljø efter detaljerede instruktioner. I modsætning hertil udføres makrofotografering (ved 1: 2 eller større forstørrelse) ofte i et ukontrolleret lysmiljø ved hjælp af upassende billedopsætninger. Ofte skal teknikkerne til prøveforberedelse og kameraopsætning optimeres væsentligt. Som følge heraf er makrofotografier af begrænset kvalitet blevet bredt offentliggjort i videnskabelige tidsskrifter. Utilstrækkelig billedopløsning og kontrast begrænser mulighederne for præcis billedkvantificering i IR-undersøgelser.
Eksperimentelle procedurer for myokardie1,2 og hjerne3,4 infarkt er blevet beskrevet detaljeret. Formålet med denne undersøgelse er at give en trinvis vejledning om, hvordan man opretter et system til fotografering og standardiseret analyse af gnaverhjerte- og hjernevævsprøver efter infarktforsøg. Dette omfatter vævsskæring, farvning og makrofotografering af hjerte- og hjerneprøver. Fremstillingen af vævsprøver er en væsentlig del af forsøget, og de planimetriske billedanalyseresultater afhænger i høj grad af kvaliteten af de opnåede billeder5.
Disse metoder er især nyttige til at udføre målinger og billedplanimetrisk analyse i gnavervæv og kan være af værdi for generel videnskabelig makrofotografering. Derudover gør billedernes høje kvalitet og konsistens det muligt at udføre automatiseret analyse af digitale fotografier, hvilket hjælper med at spare tid, undgå brugerinput og minimere risikoen for fejl eller bias under billedanalyse. Dette vil resultere i generering af robuste og pålidelige data og øge oversættelsen af prækliniske opdagelser til nye antiiskæmiske behandlinger i klinikker.
Protocol
De eksperimentelle procedurer blev udført i overensstemmelse med Det Europæiske Fællesskabs retningslinjer og lokale love og politikker (direktiv 2010/63/EU), og alle procedurerne blev godkendt af Fødevare- og Veterinærvæsenet, Riga, Letland.
1. Hjertefarvning og udskæring
BEMÆRK: Teknikker beskrevet i denne protokol kan anvendes efter både Langendorff-perfuseret isoleret rotte- eller musehjerte6,7 og in vivo rottehjerte IR-skadeassays8,9,10,11. Til farvning efter et in vivo IR-skadeassay antages det, at hjertet er udskåret, monteret på en kanyle og kortvarigt perfuseret i Langendorff-perfusionstilstand.
- Fjern hjertekronylen fra sprøjten fyldt med Krebs-Henseleit-opløsning, og tilslut den til en sprøjte fyldt med en varm (37 °C) opløsning af 0,1 % methylenblåt i Krebs-Henseleit-opløsning. Brug en 5 ml sprøjte til rottehjerter og en 1-2 ml sprøjte til musehjerter.
BEMÆRK: Et alternativ er at fylde det tryk- eller flowstyrede (f.eks. Langendorff) apparat med en blå farvestofholdig opløsning. Under løsrivelses- og monteringsproceduren er det vigtigt ikke at efterlade luftbobler i kanylen og ikke løsne suturen, der anvendes til koronararterie-reokklusion. - Yderligere perfuser rottehjerter med 4 ml methylenblå opløsning med en hastighed på ~4 ml/min og perfuser musehjerter med 1 ml methylenblå opløsning med en hastighed på ~0,5-1 ml/min.
BEMÆRK: Baseret på erfaring er begge teknikker sikre og giver tilstrækkelig farvning; Brug af en trykstyret pumpe / hydrostatisk tryksystem er imidlertid en mere tidskrævende, men sikrere mulighed mod overbevarelse for nybegyndere. - Frakobl kanylen fra sprøjten og fjern hjertet fra kanylen.
- Fjern overskydende methylenblåt ved blid rullning af hjertet på silkepapir. Løsn ligaturen omkring koronararterien ved at åbne den hæmostatiske tang og fjerne plastslangen fra den kirurgiske sutur først efter fjernelse af overskydende methylenblåt.
BEMÆRK: På dette stadium er det muligt at placere musehjertet i en lille plastikpose eller et 5 ml centrifugemikrorør i fryseren (-20 °C) i op til 5-10 minutter. Maksimal frysetid bør bestemmes eksperimentelt i hvert laboratorium. Kortvarig frysning af et musehjerte kan hjælpe en nybegynder eksperimentator skære det i 1 mm tykke skiver. Frysning af rottehjerter anbefales ikke. Overfrysning i mere end 10 minutter ved -20 °C skal undgås. - Anbring det farvede rottehjerte i en matrix i rustfrit stål (se materialetabellen) til hjerteskæring (figur 1A). Skær derefter hjertets ventrikler i 2 mm tykke skiver (sigt efter 6-7 skiver af et voksen rottehjerte). For musehjerter skal du skære hjertets ventrikler i 1,5 mm tykke skiver (sigt efter mindst 4 skiver af et voksent musehjerte).
BEMÆRK: Der skal anvendes slicing matrix-kompatible barberblade. Generelt kan kompatible enkeltkantede barberblade (f.eks. Tykkelse på op til 0,01 tommer (0,254 mm)) bruges til at skære rottehjerter. Dobbeltkantede barberblade bruges generelt til musehjerter og er normalt op til 0,004 tommer (0,1 mm) i tykkelse.
Figur 1: Matricer til rottehjerte og hjerneskæring. (A) Rottehjerte, (B) rottehjerne. Klik her for at se en større version af denne figur.
- Efter skæring overføres skiverne til et 15 ml plastrør. Tilsæt 5 ml 1% triphenyltetrazoliumchlorid (TTC) opløst i fosfatbufret saltvand (PBS) til røret med hjerteskiverne, og inkuber i 10 minutter i et vandbad ved 37 °C.
- Efter inkubation i TTC-opløsning vaskes hjerteskiverne mindst 2-3 gange med PBS og forberedes til billedoptagelse.
2. Hjernefarvning og udskæring
- Efter det midterste cerebrale arterieokklusionseksperiment3,12 skal du fjerne hjernen, herunder hjernestammen, fra kraniet og vaske den i iskold PBS.
- Vælg den korrekte størrelse af hjernens matrix i rustfrit stål (se materialetabellen) afhængigt af dyrenes vægt (figur 1B). Placer hjernen med sin ventrale side op i hjernematrixen.
BEMÆRK: Når du sidder i matrixen, skal hjernens ventrale overflade være parallel med formens øverste overflade. - Brug knive til at begrænse de frontale og kaudale dele (2 knive fra begge sider) af hjernen.
BEMÆRK: Der skal anvendes slicing matrix-kompatible barberblade. Generelt kan et kompatibelt, enkeltkantet barberblad (tykkelse på op til 0,01 tommer (0,254 mm)) bruges til rottehjerneskæring. - Sæt knivene delvist (ikke helt skære hjernen) i kanalerne mellem det første og det sidste blad. Når alle knivene er indsat og arrangeret parallelt, skal du trykke alle knivene ned med håndfladen på samme tid for at skære hjernen i 2 mm koronale skiver.
- Tag godt fat i knivene langs siderne med to fingre og fjern dem sammen med den skivede hjerne fra matrixen.
- Arranger hjerneskiverne en efter en i en bakke (70 ml, 72 x 72 mm). Når du arrangerer skiverne, skal du sørge for, at den forreste overflade af hver skive altid vender op.
- Hæld varm (+37 °C) 1 % TTC-opløsning i PBS på hjerneskiverne, og inkuber dem i 8 minutter ved 37 °C i mørke.
BEMÆRK: Hjerneskiverne skal være helt nedsænket i TTC-opløsning under inkubationen. - Efter inkubation i 1% TTC-opløsning overføres hjerneskiverne til den blå plastbakke for at tage billeder. Arranger hjerneskiverne i sekventiel rækkefølge fra frontal til den kaudale del, og brug en skalpel til at adskille halvkuglerne i sagittalplanet.
BEMÆRK: Bakkens overflade skal være vaskbar, mat og af en farve, der kontrasterer hjerneskiver (dvs. ikke rød, hvid eller lyserød).
3. Makrofotografering
- Fotografer vævsskiverne umiddelbart efter farvning.
BEMÆRK: Hjerteskiver kan opbevares i kold PBS (ved +4 °C) eller formalinopløsning i op til 30 min. Hjerneskiver kan opbevares i formalin i længere tid (1-2 uger). - Indstil det valgte kamera med et opladet batteri, hukommelseskort og tilsluttet objektiv på et stativ (figur 2)
BEMÆRK: Tænd lyset mindst 5-10 min før billedoptagelse for at varme udstyret op. LED-lys når fuld lysstyrke på mikrosekunder.
Figur 2: Kamera og lys indstillet til makrofotografering. Kameraet er vinkelret på billedoverfladen for at sikre, at kameraets brændplan er parallelt med prøverne. Forkortelse: LED = lysemitterende diode. Klik her for at se en større version af denne figur.
- Afhængigt af de tilgængelige lyskilder skal du vælge de relevante hvidbalanceindstillinger eller udføre kalibrering af farvetemperatur i henhold til instruktionerne i kameramanualen.
BEMÆRK: Hvidt LED-lys (farvetemperatur 6.500 K) er den foretrukne lyskilde for at undgå lysflimmer fra lysstofrør. - Skift kameraet til helt manuel tilstand, indstil ISO 100 og blænde til f/10, og juster lukkertiden for optimal billedeksponering. Sørg for, at kameraets brændplan er parallelt med den overflade, hvor prøven skal placeres.
BEMÆRK: Histogramfunktionen er nyttig til at sikre, at vævsskiver ikke overeksponeres. - Fastgør eller aktiver en kablet eller trådløs fjernbetjening for at forhindre kamerarystelser, når lukkeren udløses.
BEMÆRK: Et alternativ er at aktivere en forsinket lukkerfunktion, som forsinker udløseren i 2 eller 10 sekunder efter at have trykket på udløserknappen. - Sænk hjerteskiverne helt ned i en beholder med PBS.
BEMÆRK: Nedsænkede dias har tendens til at flyde væk fra deres position. For at minimere skivernes flydende skal du bruge den mindst mulige bakke, som alle skiver kan passe i, og den minimale mængde nedsænkningsopløsning, hvilket sikrer, at prøven er helt nedsænket. Alternative metoder omfatter placering af skiverne mellem glasrutschebaner eller ved hjælp af et polariserende filter på linsen. Et cirkulært polariserende filter fastgøres til objektivet og roteres, indtil refleksioner i et live-view-display på kameraet forsvinder. - Arranger hjerneskiverne i en tør bakke uden PBS eller andre væsker.
BEMÆRK: Et polariserende filter er meget praktisk til at tage billeder af hjerneskiver. - Placer beholderen med skiver under kameraet med makroobjektivet, og sørg for, at alle skiver passer helt ind i synsfeltet. Sørg for, at skiverne er på samme plan, dvs. ikke buede eller rullede.
- Kontroller eksponeringen, og juster kameraindstillingerne, hvis det er nødvendigt.
BEMÆRK: Når den er indstillet, må du ikke ændre eksponeringen og andre indstillinger under hele eksperimentet. - Fang nummeret (eller anden identifikation) af prøven, og aftryk vævsskiven ved hjælp af en fjernudløser.
BEMÆRK: En størrelsesmarkør, f.eks. en mm-lineal, bør medtages i synsfeltet, når absolut kvantificering af prøvestørrelsen er nødvendig. - Drej udsnittene, og tag deres billeder fra den anden side.
Representative Results
Figur 3A er et fotografi af en methylenblå- og TTC-farvet hjerteskive efter myokardieinfarkt, som indeholder tilstrækkelige detaljer og farveoplysninger til yderligere planimetrisk analyse af infarktstørrelse (figur 3B). Vi testede, hvordan frysning af hjertet i 24 timer påvirker hjertevævets integritet (figur 3C). Frysning i længere tid (>1 time, figur 3C) reducerer mitokondriefunktionen; således er TTC-farvning af hjertet ikke rød, men lyserød, og grænsen mellem nekrotisk og levedygtigt væv er sløret (figur 3C).
Endvidere blev to metoder sammenlignet til reduktion af refleksioner i prøverne. Nedsænkning er den mest effektive metode og producerer detaljerede billeder med god kontrast (figur 4A). Den anden metode er brugen af et polariserende filter fastgjort til linsen. Det polariserende filter er også effektivt; filteret reducerer dog billedets opløsning og mikrokontrast lidt (figur 4B). Et eksempelbillede af et hjerteudsnit uden nedsænkning eller filter (figur 4C) indeholder mange refleksioner og er ikke egnet til yderligere analyse.
Hjerneskiver er ikke nedsænket på grund af skivehåndtering (flydende) problemer. I den planimetriske analyse er det vigtigt at sammenligne den upåvirkede (sunde) side af hjernen (figur 5A) med den slagtilfælde-ramte side (figur 5B). Hjerneskiver er lettere at håndtere på en tør plade eller bakke, og et polariserende filter bruges til at fjerne refleksioner. En bakke med blå baggrund bruges til fotografering af hjerneskiver (baggrundsvalg beskrevet tidligere5).
Manuelle kameraindstillinger blev brugt til at sikre fuld kontrol over eksponering og hvidbalance. Kameraindstillingerne skal justeres før eller i begyndelsen af eksperimentet i henhold til den tilgængelige lyskilde. Dette sikrer optimal eksponering og hvidbalance af alle billeder for at muliggøre ensartet analyse (figur 6A). Kameraets automatiske indstillinger er ikke perfekte og kan resultere i forskellige kameraparametre, hvilket forårsager upassende resultater og indførelsen af billed-til-billede-variabilitet.
Figur 6 viser eksempler på overeksponerede (figur 6B) og undereksponerede billeder (figur 6C) af hjerteskiver. Der skal lægges tilstrækkelig vægt på kameraets korrekte hvidbalanceindstillinger for at matche en bestemt lyskilde, der bruges i kameralysopsætningen. Forkerte hvidbalanceindstillinger kan resultere i et skift til blå eller gul (figur 6D) og magenta eller grøn (figur 6E), der er støbt i billedet.
Figur 3: Billeder af rottehjerteskiver. (A) Frisk hjerteskive blev analyseret i ImageProPlus 6.3-software ved hjælp af farvesegmentering (B). C) TTC-farvning diskriminerer dårligt mellem levedygtigt og nekrotisk væv i den frosne hjerteskive (frosset i 24 timer). Forkortelse: TTC = 2,3,5-triphenyl-2H-tetrazoliumchlorid. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 4: Teknikker til reduktion af refleksioner. Rottehjerteudsnitsbillede taget nedsænket i PBS (A) og ved hjælp af polariserende filter (B). (C) Hjerteskive med refleksioner, når der hverken anvendes nedsænkning eller filter. Forkortelse = PBS = fosfatbufret saltvand. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 5: Billeder af rottehjerneskiver. Rottehjerne blev skåret i syv skiver og farvet med TTC efter iskæmi-reperfusion. Brug af polariserende filter resulterer i erhvervelse af refleksionsfrit billede. A) Skiver fra den ubeskadigede halvkugle (B) Skiver fra den slagramte halvkugle. Forkortelse: TTC = 2,3,5-triphenyl-2H-tetrazoliumchlorid. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 6: Rottehjerte skive billeder. Korrekt (A) og forkert (B-E) optagne hjerteudsnitsbilleder. Forkerte eksponeringsindstillinger resulterer i overeksponerede (B) og undereksponerede billeder (C). Forkerte hvidbalanceindstillinger resulterer i gul (D) eller grøn støbning i billedet (E). Klik her for at se en større version af denne figur.
Discussion
Forberedelse af hjertet efter IR starter med reokklusion af blodhjertearterier og perfusion af blåt farvestof til diskrimination af risikoområder fra ikke-risikoområder. Methylenblå eller Evans blå farvestoffer anvendes oftest til dette formål2. Da et for højt tryk kan beskadige hjerteklapper og dermed helt eller delvis plette risikoområder, er det bedre at perfuse hjertet med et trykstyret system, såsom Langendorff-apparatet eller en forenklet version af en hydrostatisk tryksystemudstyret sprøjte eller pumpe. Kontrolleret perfusion vil sikre fysiologisk tryk, og farvestoffet vil normalt ikke komme ind i det okkluderede område af hjertet. Både flowhastigheds- og trykstyrede teknikker er beskyttelsesforanstaltninger mod overstaining.
En af de mest alvorlige fejl i levedygtig vævsbehandling er at holde væv i en fryser i længere tid før farvning. Frysning bruges hovedsageligt, fordi forskere ønsker at udføre hjertefarvning dagen efter IR-eksperimentet eller senere. Desuden bruges frysning til at gøre skæringen af hjertet lettere. Vi fandt ud af, at kortvarig frysning af hjertet i op til 5-10 minutter ubetydeligt påvirker hjertevævets integritet og letter at skære vævene (især for musehjerter) i tynde skiver. Frysning i længere perioder beskadiger imidlertid membraner og nedsætter cellelevedygtigheden og mitokondriefunktionen13. Som følge heraf påvirkes TTC-farvning af fungerende mitokondrier, og grænsen mellem nekrotisk og levedygtigt væv er dårligt afgrænset (sløret). Samlet set bør frysning af rotteharts undgås, og kun kortvarig frysning af musehjerter kan bruges til lettere skæring.
Det næste trin er vævsfarvning i 1% TTC-opløsning ved 37 °C14. Farvningsopløsningen skal være forvarmt - især vigtig for farvning af hjerneskiver. Ved brug af den forvarmede opløsning er den optimale farvningstid for hjerteskiver 10 minutter. En længere inkubation eller en temperatur højere end 37 °C resulterer i brun farve af hjertevævet. Korrekt farvning af prøver og ensartet rød farveintensitet er vigtige for yderligere billedanalyse. I de sidste trin før fotografering skylles vævsskiverne 2-3 gange med kold PBS eller en lignende buffer for at fjerne TTC og overskydende methylenblåt fra opløsningen for at undgå blåstøbning på fotografiet. Hjerteskiver skal fotograferes kort efter farvning for at opnå den bedste billedkvalitet. Hjertefarvning forbliver af god kvalitet, hvis den opbevares i op til 60 minutter i kulden (+4 °C) PBS. Farvede hjerneskiver og aortavæv opbevares normalt i en 4% neutral formaldehydopløsning og bevarer god kvalitet i en uge. Opbevaring af hjernevæv natten over i formalin (+4 °C) forringer ikke farveintensiteten af normalt væv og er acceptabelt til billedoptagelse. Formalin inducerer imidlertid hævelse og aflejring af hjerteskiver. Derfor anbefales det ikke at opbevare hjertevæv i formalin.
Det næste trin er billedoptagelse. Mange laboratorier bruger flatbed-scannere som et billedoptagelsesværktøj, der forventes at erstatte et digitalt kamera og belysningsopsætning. Vi fastslog, at scanningen af skiver ikke giver tilstrækkelig billedopløsning og farveseparation og derfor ikke er egnet til billeddannelse af hjerteskiver. Især scanneropløsningen er utilstrækkelig til musehjerter, og vi bemærkede dårlig gengivelse af methylenblåt. I modsætning hertil kan en scanner være et alternativ til et fotokamera til billeddannelse af hjerneskiver, der kun er farvet med TTC eller andre enkeltfarvestoffer. Til scanning af vævsskiver er scanningssoftware, der sikrer konstante eksponeringsindstillinger, afgørende. Samlet set er en flatbed-scanner mindre i stand til og kan ikke erstatte et digitalt kamera til de fleste billedbehandlingsapplikationer.
Baggrunden bag prøver er også vigtig. Ideelt set bør bunden af bakken være af en farve, der ikke er til stede i den farvede prøve. For eksempel bør hvid, rød, blå, gul og brun baggrund undgås for at kvantificere området med methylenblå og TTC (rød) farvning på en automatiseret eller halvautomatiseret måde. Således ville en grøn baggrund være at foretrække. Ikke desto mindre afhænger farvevalg af operatørens præferencer, som efterbehandler billedet. Mange forskere foretrækker en hvid baggrund, fordi en hvid baggrund kan slettes i billedbehandling og konverteres til helt hvid (RGB hvid kode 255,255,255). Derefter skal man udelukke helt hvid fra listen over udvalgte farver, der anvendes til halvautomatiseret analyse og kun tælle blege nekrotiske områder, som ikke er helt hvide, hvis ikke overeksponerede. Blå og grøn baggrund er velegnet til fotografering af hjerneskiver og aortas.
Det optimale billeddannelsesværktøj til vævsfotografering er et enkeltlinserefleks eller spejlløst udskifteligt objektiv digitalkamera med et kompatibelt makroobjektiv. Optagelse af meget små objekter kan kræve en kombination af et kamera og et mikroskop; Ikke desto mindre har et makroobjektiv normalt tilstrækkelig (mindst 1: 2) forstørrelse til at opnå detaljerede billeder af et musehjerte. Mange producenter tilbyder overkommelige digitale kameraer og makrolinser for at opnå fotografier i høj opløsning og høj forstørrelse. Alle opdaterede digitale kameraer har egenskaber og funktioner, der er nødvendige for makrofotografering, herunder muligheden for at montere på et stativ, et stort antal pixels (normalt >20 Mpx), live view, spejllåsning, time-lapse-funktioner, fjernlukker og muligheden for manuelt at indstille kameraparametre, hvilket sikrer en konstant lukkertid, blænde, hvidbalance og ISO-indstilling. Kompaktkameraer med ovennævnte funktioner og objektivforstørrelse på mindst 1:2 kan også bruges til makrofotografering. På grund af objektivets egenskaber skal nogle kompaktkameraer placeres i nærheden af objektet, og eksperimentatoren skal sikre, at kamerahuset ikke påvirker belysningen af prøven.
Til makrofotografering med enhver form for udskifteligt objektivkamera kræves et makroobjektiv med høj forstørrelse (1:1-1:2). Vi foreslår, at du bruger makroobjektiver med en brændvidde fra 50 mm til 100 (120) mm eller tilsvarende på full-frame-sensoren (24 mm x 36 mm). Mindre sensorkameraer har forskellige sensorstørrelser, og forstørrelse skal genberegnes i overensstemmelse hermed. Til fotografering af hjerteskiver er en ergonomisk afstand fra 100 mm makroobjektivets frontelement til motivet ca. 150 mm. Denne indstilling giver operatørerne mulighed for at opbevare alt udstyret på et bord med nem adgang til kamerakontrollerne. Et 50 mm makroobjektiv kan overvejes til fotografering af større objekter, såsom hjerneskiver, fordi et bredere synsfelt er nødvendigt for at få alle skiver i et enkelt fotografi.
For at opnå skarpe billeder med høj opløsning skal et kamera monteres på et robust stativ, der sammen med en lysopsætning kaldes et fotografisk kopistativ. Montering af kameraet på et stativ og en fjernbetjening (kablet eller trådløs) udløser eliminerer kamerarystelser og sikrer en konstant afstand fra målet. En kamerabelysningsopsætning med to konstant lyskilder fra begge sider, vinklet ca. 30-60° i forhold til motivplanet, sikrer tilstrækkelig belysning af prøver og hjælper med at undgå refleksioner på samme tid. Kameraet skal monteres præcist, så sensoren er parallel med motivplanet. For jævnt at belyse billedfeltet skal begge lamper være lige orienteret og placeret i samme afstand fra motivet. Lyskilder placeret i forskellige afstande fra motivet forårsager ujævn belysning. Derudover er blinkende lyskilder en årsag til variationer i billedeksponeringen. Samlet set er det vigtigt at placere kameraet og lyskilderne nøjagtigt for præcist at få billeder af velbelyste prøver.
Vævsprøver reflekterer lys (glins), der fremstår som hvide pletter på billederne. Disse lysreflektionspletter indeholder ikke nyttige farveoplysninger, og derfor kan disse dele af billederne ikke bruges til nøjagtig kvantitativ analyse af billeder. Lysrefleksioner fra vævsskiver kan fjernes ved forskellige metoder. Den mest effektive er fuld nedsænkning af vævsprøver i en beholder med en saltvands- eller PBS-opløsning. En lignende fremgangsmåde er indsættelse af vævsskiver under (eller mellem) glasplader. Denne metode er effektiv mod refleksioner; Billedopløsningen kan dog være lavere end for fotografier af nedsænket væv.
Man kan også bruge et polariserende filter monteret på en linse for at eliminere lysrefleksioner. Cirkulære polariserende filtre er bredt tilgængelige, men varierer betydeligt i kvalitet afhængigt af pris, og billige filtre kan reducere billedopløsningen betydeligt. Reflekteret lys kan filtreres fra ved at dreje den bevægelige del af polariseringsfilteret i en vinkel. Effekten af det polariserende filter kan blive påvirket af nogle lyskilder (f.eks. Stærkt LED-lys). Samlet set kan et polariserende filter efter fjernelse af ekstra væske eliminere alle refleksioner fra hjerneskiverne; Prøvenedsænkning i bufferopløsning er dog den nemmeste og mest omkostningseffektive tilgang til hjerteskiver.
Manuelle indstillinger af lukkertid, blænde, ISO og hvidbalance er vigtige for at bevare fuld kontrol over billedbehandlingsprocessen. Lyskildens prøve, baggrund og egenskaber påvirker kameraets eksponeringsmålingssystem i automatiske indstillinger; derfor er manuelle indstillinger nødvendige for at opretholde konstant eksponering og hvidbalance mellem flere fotografier under eksperimentet. For makrofotografering er den foreslåede blændeindstilling mellem f/8 og f/16. Ved at reducere blænden øges dybdeskafflen, hvilket er nyttigt, hvis objektet ikke er i et enkelt plan. Diffraktion begrænser dog den samlede opløsning af fotografering i tilfælde af mindre blændeåbninger. Den optimale blænde for de fleste objektiver er normalt f/10, fordi opløsningsfaldet i denne indstilling er ubetydeligt, og dybdeskarphed er tilstrækkeligt. ISO-værdier, der spænder fra 50 til 400 (lavere er bedre) er normalt optimale til at minimere billedartefakter (støj). Lukkertiden skal derefter ændres for at opnå korrekt eksponering ved hjælp af de nævnte blænde- og ISO-indstillinger under eksisterende lysforhold. Manuelle indstillinger er vigtige for ensartet billedanalyse. Standardiseret billeddannelse sikrer brugen af de samme farvetærskelindstillinger i hele enhver undersøgelse, hvilket kræver segmenteringsanalyse. For eksempel kan semiautomatiseret analyse af ImagePro-software baseret på en segmenteringsfil med foruddefinerede farver blå, rød og hvid (+lyserød) bruges gennem årene, hvis prøvebilleder har ensartede farver, hvidbalance og eksponering.
Hvidbalanceindstillingen skal justeres afhængigt af farvetemperaturen på den lyskilde, der bruges til at belyse en prøve. Hvidbalancen kan vælges blandt kameraets indbyggede forudindstillinger eller ved hjælp af manuel kalibrering af et gråt mål. Fordelen ved billedoptagelse i RAW-format er, at hvidbalancen kan justeres under software efterbehandling af billedet. Da RAW-filer indeholder meget mere information end JPEG-filer, giver RAW-filbehandling en glimrende mulighed for korrektion af farvebalance og eksponering samt for at opnå bedre billedopløsning. Da de fleste kameraer kan fange JPEG- og RAW-filer samtidigt, foreslår vi, at du fanger RAW-filen og gemmer den som en sikkerhedskopi.
Samlet set beskriver denne protokol en metode til udskæring og farvning af rottehjerte og hjernevæv og giver retningslinjer for etablering af belysnings- og kameraopsætninger og fotograferingsteknikker til billedoptagelse i høj opløsning til yderligere analyse. Denne metode gælder for al eksperimentel organfotografering af små dyr.
Disclosures
Forfatterne erklærer, at de ikke har nogen interessekonflikter.
Acknowledgments
Forfatterne blev støttet af EU's Horizon 2020 forsknings- og innovationsprogram under tilskudsaftale nr. 857394, Projekt FAT4BRAIN.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 mL syringe | Sagimed | N/A | |
| 2,3,5-Triphenyltetrazolium chloride (TTC) | Sigma-Aldrich | 298-96-4 | |
| 5 mL syringe | Sagimed | N/A | |
| 50 mL syringe | Terumo | N/A | |
| Adult Rat Brain Slicer Matrix | Zivic Instruments | BSRAS001-1 | |
| Aortic cannula for mouse heart | ADInstruments | SP3787 | |
| Aortic cannula for rat heart | ADInstruments | SP3786 | |
| Calcium chloride dihydrate, ≥99% | Acros Organics | 207780010 | |
| Cover Glass Forceps, Angled | Fine Science Tools | 11073-10 | |
| Hemostatic forceps | Agnthos | 13008-12 | |
| Hoya 62 mm alpha Circular Polarizer Filter | Hoya | HOCPA62 | |
| Magnesium chloride hexahydrate | Penta | 16330-31000 | |
| Methylene Blue | SigmaAldrich | M9140 | |
| Mouse Heart Slicer Matrix | Zivic Instruments | HSMS005-1 | |
| Polyethylene plastic tubing | BD Intramedic | N/A | |
| Potassium chloride for biochemistry | Acros Organics | 418205000 | |
| Potassium phosphate, monobasic, ≥99% | Acros Organics | 205920025 | |
| Rat Heart Slicer Matrix | Zivic Instruments | HSRS001-1 | |
| Scissors curved with blunt ends | Agnthos | 14013-15 | |
| Scissors for cleaning heart | Agnthos | 14058-11 | |
| Single Edge Razor Blades | Zivic Instruments | BLADE012.1 | |
| Sodium bicarbonate for biochemistry, 99.5% | Acros Organics | 447100010 | |
| Sodium chloride | Fisher bioreagents | BP358-10 | |
| Sony Alpha a6000 Mirrorless Digital Camera | Sony | ILCE6000 | Can be repalaced by any up-to-date digiatal camera |
| Sony FE 90 mm F/ 2.8 Macro G OSS | Sony | SEL90M28G | Important, lens should be compatible with camera |
| Sony SF32UZ SDHC 32 GB Class 10 UHS | Sony | 2190246141 | |
| Surgical blade | Heinz Herenz Hamburg Germany | BS2982 | |
| Thermo-Shaker | BioSan | PST-60HL-4 | |
| Toothed tissue forceps | Agnthos | 11021-12 | |
| Toothed tissue forceps for cleaning heart | Agnthos | 11023-10 | |
| Weigh tray, 70 mL | Sarsted | 71,99,23,212 |
References
- Bell, R. M., Mocanu, M. M., Yellon, D. M. Retrograde heart perfusion: the Langendorff technique of isolated heart perfusion. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 50 (6), 940-950 (2011).
- Botker, H. E., et al. Practical guidelines for rigor and reproducibility in preclinical and clinical studies on cardioprotection. Basic Research in Cardiology. 113 (5), 39 (2018).
- Uluc, K., Miranpuri, A., Kujoth, G. C., Akture, E., Baskaya, M. K. Focal cerebral ischemia model by endovascular suture occlusion of the middle cerebral artery in the rat. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (48), e1978 (2011).
- Zvejniece, L., Svalbe, B., Liepinsh, E., Pulks, E., Dambrova, M. The sensorimotor and cognitive deficits in rats following 90- and 120-min transient occlusion of the middle cerebral artery. Journal of Neuroscience Methods. 208 (2), 197-204 (2012).
- Liepinsh, E., Kuka, J., Dambrova, M. Troubleshooting digital macro photography for image acquisition and the analysis of biological samples. Journal of Pharmacological and Toxicological Methods. 67 (2), 98-106 (2013).
- Kolwicz, S. C., Tian, R. Assessment of cardiac function and energetics in isolated mouse hearts using 31P NMR spectroscopy. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (42), e2069 (2010).
- Herr, D. J., Aune, S. E., Menick, D. R. Induction and assessment of ischemia-reperfusion injury in Langendorff-perfused rat hearts. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (101), e52908 (2015).
- Liepinsh, E., et al. Inhibition of L-carnitine biosynthesis and transport by methyl-gamma-butyrobetaine decreases fatty acid oxidation and protects against myocardial infarction. British Journal of Pharmacology. 172 (5), 1319-1332 (2015).
- Nakamura, K., Al-Ruzzeh, S., Ilsley, C., Yacoub, M. H., Amrani, M. Acute effect of cerivastatin on cardiac regional ischemia in a rat model mimicking off-pump coronary surgery. Journal of Cardiac Surgery. 20 (6), 507-511 (2005).
- Li, Q., Morrison, M. S., Lim, H. W. Using a cardiac anchor to refine myocardial infarction surgery in the rat. Lab Animal. 39 (10), 313-317 (2010).
- Wu, Y., Yin, X., Wijaya, C., Huang, M. H., McConnell, B. K.
- Vavers, E., et al. The neuroprotective effects of R-phenibut after focal cerebral ischemia. Pharmacological Research. 113, Pt B 796-801 (2016).
- Acin-Perez, R., et al. A novel approach to measure mitochondrial respiration in frozen biological samples. EMBO Journal. 39 (13), 104073 (2020).
- Kloner, R. A., Darsee, J. R., DeBoer, L. W., Carlson, N. Early pathologic detection of acute myocardial infarction. Archives of Pathology & Laboratory Medicine. 105 (8), 403-406 (1981).
