Summary
Здесь представлен протокол стандартизированной методологии подготовки тканей грызунов после эксперимента с ишемией-реперфузией и руководство по созданию освещения и настроек камер для получения изображения с высоким разрешением. Этот метод применим ко всем экспериментальным фотографиям органов мелких животных.
Abstract
Макросъемка применима для визуализации различных образцов тканей с большим увеличением для выполнения качественного и количественного анализа. Подготовка тканей и последующий захват изображения являются этапами, выполняемыми сразу после эксперимента с ишемией-реперфузией (ИК) и должны выполняться своевременно и с соответствующей осторожностью. Для оценки ИК-индуцированных повреждений в сердце и головном мозге в этой статье описывается окрашивание на основе 2,3,5-трифенил-2H-тетразолия хлорида (ТТС) с последующей макрофотографией. Научная макросъемка требует контролируемого освещения и соответствующей настройки изображения. Стандартизированная методология обеспечивает высокое качество, детализированные цифровые изображения, даже если используется комбинация недорогой современной цифровой камеры и макрообъектива. Обсуждаются правильные методы и потенциальные ошибки в подготовке образцов и получении изображения, а также приводятся примеры влияния правильных и неправильных настроек на качество изображения. Предоставляются конкретные советы о том, как избежать распространенных ошибок, таких как чрезмерное загрязнение, неправильное хранение образцов и неоптимальные условия освещения. В этой статье показана соответствующая методология нарезки и окрашивания тканей сердца и мозга крыс, а также приведены рекомендации по созданию освещения и настроек камер и методов фотографии для получения изображений с высоким разрешением.
Introduction
На протяжении десятилетий фотография и анализ образцов сердечной и мозговой тканей были важной частью экспериментов в области наук о жизни. Прогресс науки и инноваций стимулирует разработку дорогостоящих микроскопов, способных к сверхразрешению. Микрофотографии получаются в хорошо контролируемой световой среде в соответствии с подробными инструкциями. Напротив, макросъемка (при увеличении 1:2 или выше) часто выполняется в неконтролируемой световой среде с использованием неподходящих настроек изображения. Часто методы пробоподготовки и настройки камеры нуждаются в существенной оптимизации. В результате макрофотографы ограниченного качества были широко опубликованы в научных журналах. Недостаточное разрешение изображения и контрастность ограничивают возможности точной количественной оценки изображения в ИК-исследованиях.
Подробно описаны экспериментальные процедуры инфарктов миокарда1,2 и головного мозга3,4. Целью данного исследования является предоставление пошагового руководства о том, как настроить систему фотосъемки и стандартизированного анализа образцов сердца и мозговой ткани грызунов после экспериментов с инфарктом. Это включает в себя нарезку тканей, окрашивание и макрофотографию образцов сердца и мозга. Подготовка образцов тканей является неотъемлемой частью эксперимента, и результаты планиметрического анализа изображений сильно зависят от качества полученных изображений5.
Эти методы особенно полезны для выполнения измерений и планиметрического анализа изображений в тканях грызунов и могут представлять ценность для общенаучной макрофотографии. Кроме того, высокое качество и согласованность изображений позволяют выполнять автоматизированный анализ цифровых фотографий, что помогает сэкономить время, избежать пользовательского ввода и минимизировать риск ошибок или смещений при анализе изображений. Это приведет к генерации надежных и надежных данных и увеличит трансляцию доклинических открытий в новые антиишемические методы лечения в клиниках.
Protocol
Экспериментальные процедуры были выполнены в соответствии с руководящими принципами Европейского сообщества и местными законами и политикой (Директива 2010/63/ЕС), и все процедуры были одобрены Продовольственной и ветеринарной службой, Рига, Латвия.
1. Окрашивание и нарезка сердца
ПРИМЕЧАНИЕ: Методы, описанные в настоящем протоколе, могут быть использованы после анализов ИК-повреждения сердца крысы или мыши in vivo перфузированным Лангендорфом 6,7 и in vivo ИК-повреждения сердца крысы8,9,10,11. Для окрашивания после анализа in vivo IR-травмы предполагается, что сердце иссекается, устанавливается на канюлю и кратковременно перфузионируется в режиме перфузии Лангендорфа.
- Отсоедините сердечную канюлю от шприца, заполненного раствором Кребса-Хенселейта, и соедините ее со шприцем, наполненным теплым (37 °C) раствором 0,1% метиленового синего в растворе Krebs-Henseleit. Используйте шприц 5 мл для крысиных сердец и шприц 1-2 мл для мышечных сердец.
ПРИМЕЧАНИЕ: Альтернативой является заполнение аппарата, контролируемого давлением или потоком (например, Langendorff), синим раствором, содержащим краситель. Во время процедуры отслоения и монтажа важно не оставлять пузырьков воздуха в канюле и не ослаблять шов, используемый для повторного прикуса коронарной артерии. - Далее перфируют сердца крыс 4 мл раствора метиленового синего со скоростью ~4 мл/мин и перфузируют сердца мышей 1 мл раствора метиленового синего со скоростью ~0,5-1 мл/мин.
ПРИМЕЧАНИЕ: Исходя из опыта, оба метода безопасны и обеспечивают адекватное окрашивание; тем не менее, использование насоса с регулируемым давлением / гидростатической системы давления является более трудоемким, но более безопасным вариантом против чрезмерного загрязнения для начинающих ученых. - Отсоедините канюлю от шприца и извлеките сердце из канюли.
- Удалите излишки метиленового синего, аккуратно раскатывая сердце на папиросной бумаге. Ослабьте лигатуру вокруг коронарной артерии, открыв гемостатические щипцы и удалив пластиковую трубку из хирургического шва только после удаления избытка метиленового синего.
ПРИМЕЧАНИЕ: На этом этапе можно поместить сердце мыши в небольшой полиэтиленовый пакет или микротрубку центрифуги объемом 5 мл в морозильную камеру (-20 °C) на срок до 5-10 мин. Максимальное время замораживания должно определяться экспериментально в каждой лаборатории. Кратковременное замораживание сердца мыши может помочь начинающему экспериментатору разрезать его на кусочки толщиной 1 мм. Замораживание крысиных сердец не рекомендуется. Следует избегать чрезмерной заморозки в течение более 10 мин при -20 °C. - Поместите окрашенное сердце крысы в матрицу из нержавеющей стали (см. Таблицу материалов) для нарезки сердца (рисунок 1А). Затем разрежьте желудочки сердца на ломтики толщиной 2 мм (цельтесь в 6-7 кусочков сердца взрослой крысы). Для мышечных сердец разрежьте желудочки сердца на кусочки толщиной 1,5 мм (стремитесь как минимум к 4 кусочкам сердца взрослой мыши).
ПРИМЕЧАНИЕ: Необходимо использовать бритвенные лезвия, совместимые с нарезкой матрицы. В общем, совместимые лезвия бритвы с одним лезвием (например, толщиной до 0,01 дюйма (0,254 мм)) могут использоваться для нарезки крысиных сердец. Лезвия бритвы с двойными краями обычно используются для сердец мышей и обычно имеют толщину до 0,004 дюйма (0,1 мм).
Рисунок 1: Матрицы для нарезки сердца и мозга крысы. (А) Сердце крысы, (Б) мозг крысы. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
- После нарезки переложите ломтики в пластиковую трубку объемом 15 мл. Добавьте 5 мл 1% трифенилтетразолия хлорида (TTC), растворенного в фосфатно-буферном физиологическом растворе (PBS), в трубку с сердечными ломтиками и инкубируйте в течение 10 мин на водяной бане при 37 °C.
- После инкубации в растворе ТТС промыть срезы сердца не менее 2-3 раз ПБС и подготовить к захвату изображения.
2. Окрашивание и нарезка мозга
- После эксперимента по окклюзии средней мозговой артерии3,12 удалите мозг, включая ствол мозга, из черепа и промыть его ледяным PBS.
- Выберите правильный размер мозговой матрицы из нержавеющей стали (см. Таблицу материалов) в зависимости от веса животных (рисунок 1В). Поместите мозг вентральной стороной вверх в мозговой матрице.
ПРИМЕЧАНИЕ: При нахождении в матрице вентральная поверхность мозга должна быть параллельна верхней поверхности формы. - Используя лезвия, ограничьте лобную и каудальную части (по 2 лезвия с обеих сторон) мозга.
ПРИМЕЧАНИЕ: Необходимо использовать бритвенные лезвия, совместимые с нарезкой матрицы. В общем, совместимое лезвие бритвы с одним лезвием (толщина до 0,01 дюйма (0,254 мм)) может быть использовано для нарезки мозга крысы. - Поместите лезвия частично (не полностью разрезая мозг) в каналы между первым и последним лезвиями. Когда все лезвия вставлены и расположены параллельно, прижмите все лезвия ладонью одновременно, чтобы разрезать мозг на корональные срезы 2 мм.
- Два пальца крепко обхватите лезвия по бокам и выньте их вместе с разрезанным мозгом из матрицы.
- Разложите кусочки мозга один за другим в лоток (70 мл, 72 х 72 мм). При расстановке ломтиков убедитесь, что передняя поверхность каждого среза всегда обращена вверх.
- Налейте теплый (+37 °C) 1% раствор TTC в PBS на срезы мозга и инкубируйте их в течение 8 мин при 37 °C в темноте.
ПРИМЕЧАНИЕ: Срезы мозга должны быть полностью погружены в раствор ТТС во время инкубации. - После инкубации в 1% растворе TTC переложите срезы мозга в синий пластиковый лоток для захвата изображений. Расположите срезы мозга в последовательном порядке от лобной к каудальной части и используйте скальпель для разделения полушарий в сагиттальной плоскости.
ПРИМЕЧАНИЕ: Поверхность лотка должна быть моющейся, матовой и цвета, контрастирующего с кусочками мозга (т.е. не красной, белой или бледно-розовой).
3. Макросъемка
- Сфотографируйте срезы ткани сразу после окрашивания.
ПРИМЕЧАНИЕ: Сердечные срезы можно хранить в холодном PBS (при +4 °C) или растворе формалина до 30 мин. Срезы мозга могут храниться в формалине в течение длительного периода (1-2 недели). - Настройте камеру по своему выбору с заряженной батареей, картой памяти и прикрепленным объективом на подставке (рисунок 2)
ПРИМЕЧАНИЕ: Включите свет по крайней мере за 5-10 минут до получения изображения, чтобы разогреть оборудование. Светодиодные фонари достигают полной яркости за микросекунды.
Рисунок 2: Камера и освещение, настроенные для макросъемки. Камера перпендикулярна поверхности изображения, чтобы гарантировать, что фокальная плоскость камеры параллельна образцам. Аббревиатура: LED = светодиод. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
- В зависимости от доступных источников света выберите соответствующие настройки баланса белого или выполните калибровку цветовой температуры в соответствии с инструкциями в руководстве по эксплуатации камеры.
ПРИМЕЧАНИЕ: Белый светодиодный свет (цветовая температура 6 500 К) является предпочтительным источником света, чтобы избежать мерцания света люминесцентными лампами. - Переключите камеру в полностью ручной режим, установите ISO 100 и диафрагму на f / 10 и отрегулируйте выдержку для оптимальной экспозиции изображения. Убедитесь, что фокальная плоскость камеры параллельна поверхности, на которую будет помещен образец.
ПРИМЕЧАНИЕ: Функция гистограммы полезна для обеспечения того, чтобы срезы ткани не подвергались переэкспонированию. - Подключите или включите проводной или беспроводной дистанционный триггер, чтобы предотвратить дрожание камеры при отпускании затвора.
ПРИМЕЧАНИЕ: Альтернативой является включение функции замедленного затвора, которая будет задерживать триггер на 2 или 10 с после нажатия кнопки триггера. - Полностью погрузите сердечные срезы в контейнер с PBS.
ПРИМЕЧАНИЕ: Погруженные слайды, как правило, уплывают от своего положения. Чтобы свести к минимуму плавание ломтиков, используйте наименьший возможный лоток, в который могут поместиться все ломтики, и минимальное количество погружного раствора, гарантируя, что образец полностью погружен. Альтернативные методы включают размещение срезов между стеклянными слайдами или использование поляризационного фильтра на объективе. Круговой поляризационный фильтр прикрепляется к объективу и поворачивается до тех пор, пока отражения в дисплее камеры в режиме реального времени не исчезнут. - Разложите ломтики мозга в сухом лотке без PBS или других жидкостей.
ПРИМЕЧАНИЕ: Поляризационный фильтр очень удобен для захвата изображений срезов мозга. - Поместите контейнер с ломтиками под камеру с макрообъективом и убедитесь, что все срезы полностью помещаются в поле зрения. Убедитесь, что срезы находятся на одной плоскости, т.е. не изогнуты и не свернуты.
- Проверьте экспозицию и при необходимости отрегулируйте параметры камеры.
ПРИМЕЧАНИЕ: После установки не изменяйте экспозицию и другие настройки в течение всего эксперимента. - Запишите номер (или другую идентификацию) образца и визуализируйте срез ткани с помощью удаленного триггера.
ПРИМЕЧАНИЕ: Маркер размера, такой как линейка мм, должен быть включен в поле зрения, когда необходима абсолютная количественная оценка размера образца. - Поверните фрагменты и захватите их изображения с другой стороны.
Representative Results
Фиг.3А представляет собой фотографию метиленового сине- и TTC-окрашенного среза сердца после инфаркта миокарда, которая содержит достаточно подробной и цветовой информации для дальнейшего планиметрического анализа размеров инфаркта (рисунок 3B). Мы проверили, как замораживание сердца в течение 24 ч влияет на целостность тканей сердца (рисунок 3С). Замораживание в течение длительного периода (>1 ч, рисунок 3С) снижает функцию митохондрий; таким образом, окрашивание сердца TTC не красное, а бледно-розовое, а граница между некротическими и жизнеспособными тканями размыта (рисунок 3C).
Далее сравнивались два метода уменьшения отражений в образцах. Погружение является наиболее эффективным методом и дает подробные изображения с хорошей контрастностью (рисунок 4A). Второй способ заключается в использовании поляризационного фильтра, прикрепленного к линзе. Поляризационный фильтр также эффективен; однако фильтр немного уменьшает разрешение и микроконтраст изображения (рисунок 4B). Пример изображения сердечного среза без погружения или фильтра (рисунок 4С) содержит много отражений и не подходит для дальнейшего анализа.
Срезы мозга не погружаются из-за проблем управления срезами (плавающих). В планиметрическом анализе важно сравнить незатронутую (здоровую) сторону мозга (рисунок 5А) с пораженной инсультом стороной (рисунок 5B). Срезами мозга легче управлять на сухой пластине или лотке, а для удаления отражений используется поляризационный фильтр. Лоток с синим фоном используется для фотографирования среза мозга (выбор фона описан ранее5).
Ручные настройки камеры использовались для обеспечения полного контроля экспозиции и баланса белого. Настройки камеры должны быть отрегулированы до или в начале эксперимента в соответствии с имеющимся источником света. Это обеспечивает оптимальную экспозицию и баланс белого всех изображений для обеспечения равномерного анализа (рисунок 6A). Автоматические настройки камеры не идеальны и могут привести к изменению параметров камеры, что приводит к неадекватным результатам и введению изменчивости изображения к изображению.
На рисунке 6 показаны примеры переэкспонированных (рисунок 6B) и недоэкспонированных изображений (рисунок 6C) срезов сердца. Достаточное внимание следует уделить правильным настройкам баланса белого камеры в соответствии с конкретным источником света, используемым в настройке освещения камеры. Неправильные настройки баланса белого могут привести к смещению изображения на синий или желтый (рисунок 6D) и пурпурный или зеленый (рисунок 6E).
Рисунок 3: Изображения сердечных срезов крыс. (A) Свежий срез сердца был проанализирован в программном обеспечении ImageProPlus 6.3 с использованием цветовой сегментации (B). (C) Окрашивание TTC плохо различает жизнеспособную и некротическую ткань в замороженном сердечном срезе (замороженном в течение 24 ч). Аббревиатура: TTC = 2,3,5-трифенил-2H-тетразолия хлорид. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 4: Методы уменьшения отражений. Изображение среза сердца крысы снято погруженным в PBS (A) и с использованием поляризационного фильтра (B). (C) Срез сердца с отражениями, когда не используется ни погружение, ни фильтр. Аббревиатура = PBS = фосфатно-буферный физиологический раствор. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 5: Изображения срезов мозга крысы. Мозг крысы разрезали на семь ломтиков и окрашивали ТТС после ишемии-реперфузии. Использование поляризационного фильтра приводит к получению изображения без отражения. (A) Срезы из неповрежденного полушария; (B) Срезы из полушария, пораженного инсультом. Аббревиатура: TTC = 2,3,5-трифенил-2H-тетразолия хлорид. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 6: Изображения среза сердца крысы. Правильно (A) и неправильно (B-E) захватили изображения среза сердца. Неправильные настройки экспозиции приводят к переэкспонированным (B) и недоэкспонированным изображениям (C). Неправильные настройки баланса белого приводят к желтому (D) или зеленому оттенку на изображении (E). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Discussion
Подготовка сердца после ИК начинается с повторного прикуса сердечных артерий крови и перфузии синего красителя для дискриминации зон риска из зон, не относящихся к риску. Для этой цели чаще всего используются красители метиленовый синий или синий Эванса2. Поскольку чрезмерно высокое давление может повредить сердечные клапаны и, таким образом, частично или полностью испачкать области риска, лучше перфузировать сердце с помощью системы с контролируемым давлением, такой как аппарат Лангендорфа или упрощенная версия шприца или насоса, оснащенного гидростатической системой давления. Контролируемая перфузия обеспечит физиологическое давление, и краситель обычно не попадает в закупоренную область сердца. Методы, контролируемые как скоростью потока, так и методы, контролируемые давлением, являются защитой от чрезмерного загрязнения.
Одной из самых серьезных ошибок в жизнеспособной обработке тканей является хранение тканей в морозильной камере в течение длительного времени перед окрашиванием. Замораживание в основном используется, потому что исследователи хотят выполнить окрашивание сердца на следующий день после ИК-эксперимента или позже. Кроме того, замораживание используется для облегчения разрезания сердца. Мы обнаружили, что кратковременное замораживание сердца на срок до 5-10 мин незначительно влияет на целостность тканей сердца и облегчает разрезание тканей (особенно для мышечных сердец) на тонкие срезы. Однако замораживание в течение длительных периодов времени повреждает мембраны и снижает жизнеспособность клеток и функцию митохондрий13. В результате поражается окрашивание ТТС функционирующих митохондрий, а граница между некротическими и жизнеспособными тканями плохо очерчена (размыта). В целом, следует избегать замораживания крысиных хартов, и только кратковременное замораживание мышечных сердец может быть использовано для более легкой резки.
Следующим этапом является окрашивание тканей в 1% раствор TTC при 37 °C14. Окрашивающий раствор должен быть предварительно расплавленным, что особенно важно для окрашивания срезов мозга. При использовании предварительного раствора оптимальное время окрашивания сердечных ломтиков составляет 10 мин. Более длительная инкубация или температура выше 37 °C приводит к коричневой окраске тканей сердца. Правильное окрашивание образцов и постоянная интенсивность красного цвета важны для дальнейшего анализа изображения. На заключительных этапах перед фотографированием срезы ткани промывают 2-3 раза холодным PBS или аналогичным буфером для удаления TTC и избытка метиленового синего из раствора, чтобы избежать синего отливки на фотографии. Сердечные срезы должны быть сфотографированы вскоре после окрашивания, чтобы получить наилучшее качество изображения. Окрашивание сердца остается хорошего качества при хранении до 60 мин в холоде (+4 °C) PBS. Окрашенные срезы мозга и ткани аорты обычно хранятся в 4% нейтральном растворе формальдегида и сохраняют хорошее качество в течение недели. Ночное хранение тканей головного мозга в формалине (+4 °C) не ухудшает интенсивность цвета нормальной ткани и приемлемо для получения изображения. Однако формалин вызывает отек и расчесывание сердечных ломтиков. Поэтому хранение тканей сердца в формалине не рекомендуется.
Следующим шагом является получение изображения. Многие лаборатории используют планшетные сканеры в качестве инструмента сбора изображений, который, как ожидается, заменит цифровую камеру и установку освещения. Мы определили, что сканирование срезов не обеспечивает достаточного разрешения изображения и цветоделия и, следовательно, не подходит для визуализации сердечных срезов. В частности, разрешение сканера недостаточно для мышечных сердец, и мы заметили плохую визуализацию метиленового синего. Напротив, сканер может быть альтернативой фотокамере для визуализации срезов мозга, окрашенных только TTC или другими одиночными красителями. Для сканирования срезов тканей важное значение имеет программное обеспечение для сканирования, которое обеспечивает постоянные настройки экспозиции. В целом, планшетный сканер менее эффективен и не может заменить цифровую камеру для большинства приложений для обработки изображений.
Фон за образцами также важен. В идеале дно лотка должно быть цвета, отсутствующего в окрашенном образце. Например, для количественной оценки площади окрашивания метиленовым синим и TTC (красным) автоматическим или полуавтоматизированным способом следует избегать белого, красного, синего, желтого и коричневого фонов. Таким образом, зеленый фон был бы предпочтительнее. Тем не менее, выбор цвета зависит от предпочтений оператора, который постобрабатывает изображение. Многие ученые предпочитают белый фон, потому что белый фон может быть удален при постобработке изображения и преобразован в полностью белый (белый код RGB 255,255,255). Затем следует исключить полностью белый из списка выбранных цветов, используемых для полуавтоматизированного анализа, и считать только бледные некротические участки, которые не являются полностью белыми, если не переэкспонированы. Синий и зеленый фоны подходят для фотографирования срезов мозга и аорты.
Оптимальным инструментом визуализации для тканевой фотографии является однообъективная рефлекторная или беззеркальная цифровая камера со сменным объективом с совместимым макрообъективом. Для захвата очень маленьких объектов может потребоваться сочетание камеры и микроскопа; тем не менее, макрообъектив обычно имеет достаточное (по крайней мере, 1:2) увеличение для получения подробных изображений сердца мыши. Многие производители предлагают доступные цифровые камеры и макрообъективы для получения фотографий с высоким разрешением и высоким увеличением. Все современные цифровые камеры имеют характеристики и функции, необходимые для макросъемки, включая возможность крепления на подставке, большое количество пикселей (обычно >20 Mpx), просмотр в реальном времени, блокировку зеркала, функции покадровой съемки, дистанционный затвор и возможность вручную устанавливать параметры камеры, обеспечивая тем самым постоянную выдержку, диафрагму, баланс белого и настройку ISO. Компактные камеры с вышеупомянутыми функциями и увеличением объектива не менее 1:2 также могут использоваться для макросъемки. Из-за характеристик объектива некоторые компактные камеры следует размещать в непосредственной близости от объекта, а экспериментатор должен следить за тем, чтобы корпус камеры не влиял на освещенность образца.
Для макросъемки с любым типом камеры со сменным объективом требуется макрообъектив с большим увеличением (1:1-1:2). Мы предлагаем использовать макрообъективы с фокусным расстоянием от 50 мм до 100 (120) мм или эквивалент на полнокадровом (24 мм x 36 мм) сенсоре. Меньшие сенсорные камеры имеют разные размеры датчиков, и увеличение должно быть пересчитано соответствующим образом. Для фотосъемки срезов сердца эргономичное расстояние переднего элемента макрообъектива 100 мм до объекта съемки составляет примерно 150 мм. Эта настройка позволяет операторам держать все оборудование на столе с легким доступом к элементам управления камерой. Макрообъектив диаметром 50 мм может быть рассмотрен для фотографирования более крупных объектов, таких как срезы мозга, поскольку для получения всех срезов на одной фотографии необходимо более широкое поле зрения.
Для получения четких изображений с высоким разрешением камера должна быть установлена на прочной подставке, которая вместе со световой установкой называется подставкой для копирования фотографий. Установка камеры на подставку и дистанционный (проводной или беспроводной) триггер исключает дрожание камеры и обеспечивает постоянное расстояние от цели. Система освещения камеры с двумя постоянными источниками света с обеих сторон, расположенными под углом примерно 30-60° относительно плоскости объекта, обеспечивает достаточную освещенность образцов и помогает избежать отражений одновременно. Камера должна быть установлена точно так, чтобы датчик был параллельен плоскости объекта. Чтобы равномерно осветить поле изображения, обе лампы должны быть одинаково ориентированы и размещены на одинаковом расстоянии от объекта. Источники света, размещенные на различных расстояниях от объекта, вызывают неравномерное освещение. Кроме того, мигающие источники света являются причиной различий в экспозиции изображения. В целом, важно точно разместить камеру и источники света, чтобы точно получать изображения хорошо освещенных образцов.
Образцы тканей отражают свет (блеск), который выглядит как белые пятна на изображениях. Эти светоотражающие пятна не содержат полезной цветовой информации, и соответственно, эти части изображений не могут быть использованы для точного количественного анализа изображений. Отражения света от срезов ткани могут быть удалены различными методами. Наиболее эффективным является полное погружение образцов тканей в контейнер с физиологическим раствором или раствором PBS. Аналогичным подходом является введение срезов ткани ниже (или между) стеклянными пластинами. Этот метод эффективен против отражений; однако разрешение изображения может быть ниже, чем у фотографий погруженных тканей.
Можно также использовать поляризационный фильтр, установленный на объективе, чтобы устранить отражения света. Циркулярные поляризационные фильтры широко доступны, но значительно различаются по качеству в зависимости от цены, а дешевые фильтры могут значительно снизить разрешение изображения. Отраженный свет можно отфильтровать, повернув движущуюся часть поляризационного фильтра под углом. На эффективность поляризационного фильтра могут влиять некоторые источники света (например, сильный светодиодный свет). В целом, после удаления лишней жидкости поляризационный фильтр может устранить все отражения от срезов мозга; однако погружение образца в буферный раствор является самым простым и экономически эффективным подходом для сердечных срезов.
Ручные настройки выдержки, диафрагмы, ISO и баланса белого важны для поддержания полного контроля над процессом обработки изображений. Образец, фон и характеристики источника света влияют на систему измерения экспозиции камеры в автоматических настройках; поэтому ручные настройки необходимы для поддержания постоянной экспозиции и баланса белого между несколькими фотографиями во время эксперимента. Для макросъемки рекомендуемая настройка диафрагмы находится между f/8 и f/16. Уменьшая диафрагму, увеличивается глубина резкости, что полезно, если объект не находится в одной плоскости. Однако дифракция ограничивает общее разрешение фотографии в случае меньших диафрагм. Оптимальная диафрагма для большинства объективов обычно составляет f/ 10, потому что в этом случае падение разрешения незначительно, а глубина резкости достаточна. Значения ISO, которые варьируются от 50 до 400 (чем ниже, тем лучше), обычно оптимальны для минимизации артефактов изображения (шума). Затем выдержка остается изменить для получения правильной экспозиции с использованием упомянутых настроек диафрагмы и ISO в существующих условиях освещения. Ручные настройки важны для согласованного анализа изображений. Стандартизированная визуализация обеспечивает использование одних и тех же настроек цветового порога во всем исследовании, что требует сегментационного анализа. Например, полуавтоматизированный анализ программным обеспечением ImagePro на основе файла сегментации с предопределенными цветами синего, красного и белого (+бледно-розовый) может использоваться в течение многих лет, если изображения образцов имеют согласованные цвета, баланс белого и экспозицию.
Настройка баланса белого должна быть отрегулирована в зависимости от цветовой температуры источника света, который используется для освещения образца. Баланс белого можно выбрать из встроенных предустановок камеры или с помощью ручной калибровки серой мишени. Преимущество захвата изображения в формате RAW заключается в том, что баланс белого можно настроить во время программной постобработки изображения. Поскольку файлы RAW содержат гораздо больше информации, чем файлы JPEG, постобработка файлов RAW предоставляет отличную возможность для коррекции цветового баланса и экспозиции, а также для получения лучшего разрешения изображения. Поскольку большинство камер могут захватывать файлы JPEG и RAW одновременно, мы рекомендуем захватить файл RAW и сохранить его в качестве резервной копии.
В целом, этот протокол описывает методологию нарезки и окрашивания тканей сердца и мозга крыс и предоставляет рекомендации по созданию освещения и настроек камер и методов фотографии для получения изображений с высоким разрешением для дальнейшего анализа. Этот метод применим ко всем экспериментальным фотографиям органов мелких животных.
Disclosures
Авторы заявляют, что у них нет конфликта интересов.
Acknowledgments
Авторы были поддержаны научно-исследовательской и инновационной программой Европейского Союза Horizon 2020 в рамках грантового соглашения No 857394, проект FAT4BRAIN.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 mL syringe | Sagimed | N/A | |
| 2,3,5-Triphenyltetrazolium chloride (TTC) | Sigma-Aldrich | 298-96-4 | |
| 5 mL syringe | Sagimed | N/A | |
| 50 mL syringe | Terumo | N/A | |
| Adult Rat Brain Slicer Matrix | Zivic Instruments | BSRAS001-1 | |
| Aortic cannula for mouse heart | ADInstruments | SP3787 | |
| Aortic cannula for rat heart | ADInstruments | SP3786 | |
| Calcium chloride dihydrate, ≥99% | Acros Organics | 207780010 | |
| Cover Glass Forceps, Angled | Fine Science Tools | 11073-10 | |
| Hemostatic forceps | Agnthos | 13008-12 | |
| Hoya 62 mm alpha Circular Polarizer Filter | Hoya | HOCPA62 | |
| Magnesium chloride hexahydrate | Penta | 16330-31000 | |
| Methylene Blue | SigmaAldrich | M9140 | |
| Mouse Heart Slicer Matrix | Zivic Instruments | HSMS005-1 | |
| Polyethylene plastic tubing | BD Intramedic | N/A | |
| Potassium chloride for biochemistry | Acros Organics | 418205000 | |
| Potassium phosphate, monobasic, ≥99% | Acros Organics | 205920025 | |
| Rat Heart Slicer Matrix | Zivic Instruments | HSRS001-1 | |
| Scissors curved with blunt ends | Agnthos | 14013-15 | |
| Scissors for cleaning heart | Agnthos | 14058-11 | |
| Single Edge Razor Blades | Zivic Instruments | BLADE012.1 | |
| Sodium bicarbonate for biochemistry, 99.5% | Acros Organics | 447100010 | |
| Sodium chloride | Fisher bioreagents | BP358-10 | |
| Sony Alpha a6000 Mirrorless Digital Camera | Sony | ILCE6000 | Can be repalaced by any up-to-date digiatal camera |
| Sony FE 90 mm F/ 2.8 Macro G OSS | Sony | SEL90M28G | Important, lens should be compatible with camera |
| Sony SF32UZ SDHC 32 GB Class 10 UHS | Sony | 2190246141 | |
| Surgical blade | Heinz Herenz Hamburg Germany | BS2982 | |
| Thermo-Shaker | BioSan | PST-60HL-4 | |
| Toothed tissue forceps | Agnthos | 11021-12 | |
| Toothed tissue forceps for cleaning heart | Agnthos | 11023-10 | |
| Weigh tray, 70 mL | Sarsted | 71,99,23,212 |
References
- Bell, R. M., Mocanu, M. M., Yellon, D. M. Retrograde heart perfusion: the Langendorff technique of isolated heart perfusion. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 50 (6), 940-950 (2011).
- Botker, H. E., et al. Practical guidelines for rigor and reproducibility in preclinical and clinical studies on cardioprotection. Basic Research in Cardiology. 113 (5), 39 (2018).
- Uluc, K., Miranpuri, A., Kujoth, G. C., Akture, E., Baskaya, M. K. Focal cerebral ischemia model by endovascular suture occlusion of the middle cerebral artery in the rat. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (48), e1978 (2011).
- Zvejniece, L., Svalbe, B., Liepinsh, E., Pulks, E., Dambrova, M. The sensorimotor and cognitive deficits in rats following 90- and 120-min transient occlusion of the middle cerebral artery. Journal of Neuroscience Methods. 208 (2), 197-204 (2012).
- Liepinsh, E., Kuka, J., Dambrova, M. Troubleshooting digital macro photography for image acquisition and the analysis of biological samples. Journal of Pharmacological and Toxicological Methods. 67 (2), 98-106 (2013).
- Kolwicz, S. C., Tian, R. Assessment of cardiac function and energetics in isolated mouse hearts using 31P NMR spectroscopy. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (42), e2069 (2010).
- Herr, D. J., Aune, S. E., Menick, D. R. Induction and assessment of ischemia-reperfusion injury in Langendorff-perfused rat hearts. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (101), e52908 (2015).
- Liepinsh, E., et al. Inhibition of L-carnitine biosynthesis and transport by methyl-gamma-butyrobetaine decreases fatty acid oxidation and protects against myocardial infarction. British Journal of Pharmacology. 172 (5), 1319-1332 (2015).
- Nakamura, K., Al-Ruzzeh, S., Ilsley, C., Yacoub, M. H., Amrani, M. Acute effect of cerivastatin on cardiac regional ischemia in a rat model mimicking off-pump coronary surgery. Journal of Cardiac Surgery. 20 (6), 507-511 (2005).
- Li, Q., Morrison, M. S., Lim, H. W. Using a cardiac anchor to refine myocardial infarction surgery in the rat. Lab Animal. 39 (10), 313-317 (2010).
- Wu, Y., Yin, X., Wijaya, C., Huang, M. H., McConnell, B. K.
- Vavers, E., et al. The neuroprotective effects of R-phenibut after focal cerebral ischemia. Pharmacological Research. 113, Pt B 796-801 (2016).
- Acin-Perez, R., et al. A novel approach to measure mitochondrial respiration in frozen biological samples. EMBO Journal. 39 (13), 104073 (2020).
- Kloner, R. A., Darsee, J. R., DeBoer, L. W., Carlson, N. Early pathologic detection of acute myocardial infarction. Archives of Pathology & Laboratory Medicine. 105 (8), 403-406 (1981).
