Summary
Presentert her er en protokoll for standardisert metodikk for gnagervevspreparat etter iskemi-reperfusjonseksperimentet og retningslinjer for etablering av belysning og kameraoppsett for høyoppløselig bildeanskaffelse. Denne metoden gjelder for all eksperimentell smådyrorganfotografering.
Abstract
Makrofotografering gjelder for avbildning av ulike vevsprøver ved høy forstørrelse for å utføre kvalitative og kvantitative analyser. Vevsforberedelse og påfølgende bildeopptak utføres umiddelbart etter iskemi-reperfusjonseksperimentet (IR) og må utføres i tide og med passende forsiktighet. For evaluering av IR-indusert skade i hjerte og hjerne, beskriver dette dokumentet 2,3,5-triphenyl-2H-tetrazoliumklorid (TTC)-basert farging etterfulgt av makrofotografering. Vitenskapelig makrofotografering krever kontrollert belysning og et passende bildeoppsett. Den standardiserte metodikken sikrer detaljerte digitale bilder av høy kvalitet selv om en kombinasjon av et billig, oppdatert digitalt kamera og makrolinse brukes. Riktige teknikker og potensielle feil i prøveforberedelse og bildeanskaffelse diskuteres, og eksempler på påvirkning av riktige og feil oppsett på bildekvalitet er gitt. Det gis spesifikke tips om hvordan du unngår vanlige feil, for eksempel overstaining, feil prøvelagring og suboptimale lysforhold. Dette dokumentet viser riktig metodikk for rottehjerte og hjernevevsslicing og farging og gir retningslinjer for etablering av belysnings- og kameraoppsett og fotograferingsteknikker for høyoppløselig bildeanskaffelse.
Introduction
I flere tiår har fotografering og analyse av hjerte- og hjernevevsprøver vært en viktig del av livsvitenskapelige eksperimenter. Vitenskap og innovasjonsfremgang driver utviklingen av dyre mikroskoper som er i stand til superresolution. Fotomikrografer er oppnådd i et godt kontrollert lysmiljø ved hjelp av detaljerte instruksjoner. Makrofotografering (med 1:2 eller høyere forstørrelse) utføres derimot ofte i et ukontrollert lysmiljø ved hjelp av upassende bildeoppsett. Ofte må teknikkene for prøveforberedelse og kameraoppsett optimaliseres betydelig. Som et resultat har makrofotografier av begrenset kvalitet blitt mye publisert i vitenskapelige tidsskrifter. Utilstrekkelig bildeoppløsning og kontrast begrenser mulighetene for presis bilde kvantifisering i IR-studier.
Eksperimentelle prosedyrer for hjerteinfarkt1,2 og hjerne3,4 infarkt er beskrevet i detalj. Hensikten med denne studien er å gi en trinnvis guide for hvordan du setter opp et system for fotografering og standardisert analyse av gnagerhjerte- og hjernevevsprøver etter infarkteksperimenter. Dette inkluderer vevsslicing, farging og makrofotografering av hjerte- og hjerneprøver. Utarbeidelsen av vevsprøver er en viktig del av eksperimentet, og de planimetriske bildeanalyseresultatene avhenger sterkt av kvaliteten på de oppnådde bildene5.
Disse metodene er spesielt nyttige for å utføre målinger og bildeplanimetrisk analyse i gnagervev og kan være av verdi for generell vitenskapelig makrofotografering. I tillegg gjør høy kvalitet og konsistens av bilder det mulig å utføre automatisert analyse av digitale fotografier, noe som bidrar til å spare tid, unngå brukerinndata og minimere risikoen for feil eller skjevheter under bildeanalyse. Dette vil resultere i generering av robuste og pålitelige data og øke oversettelsen av prekliniske funn til nye antiischemic behandlinger i klinikker.
Protocol
De eksperimentelle prosedyrene ble utført i samsvar med retningslinjene i Det europeiske fellesskap og lokale lover og retningslinjer (direktiv 2010/63/EU), og alle prosedyrene ble godkjent av Food and Veterinary Service, Riga, Latvia.
1. Hjertefarging og kutting
MERK: Teknikker beskrevet i denne protokollen kan brukes etter både Langendorff-perfused isolert rotte eller mus hjerte6,7 og in vivo rotte hjerte IR skadeanalyser8,9,10,11. For farging etter en in vivo IR-skadeanalyse antas det at hjertet er utskilt, montert på en kanyle og kort parfymert i Langendorff-perfusjonsmodus.
- Løsne hjertekanylen fra sprøyten fylt med Krebs-Henseleit-oppløsning og koble den til en sprøyte fylt med en varm (37 °C) oppløsning på 0,1% metylenblå i Krebs-Henseleit-oppløsning. Bruk en 5 ml sprøyte til rottehjerter og en 1-2 ml sprøyte til musehjerter.
MERK: Et alternativ er å fylle det trykk- eller strømningskontrollerte (f.eks. Langendorff)-apparatet med en blå fargestoffholdig oppløsning. Under løsningen og monteringsprosedyren er det viktig å ikke forlate noen luftbobler i kanylen og ikke løsne suturen som brukes til koronararterie reoklusjon. - Ytterligere parfyme rottehjerter med 4 ml metylenblå oppløsning med en hastighet på ~ 4 ml / min og perfuse musehjerter med 1 ml metylenblå løsning med en hastighet på ~ 0,5-1 ml / min.
MERK: Basert på erfaring er begge teknikkene trygge og gir tilstrekkelig farging; Å bruke et trykkkontrollert pumpe/hydrostatisk trykksystem er imidlertid et mer tidkrevende, men tryggere alternativ mot overbelastning for nybegynnere. - Koble kanylen fra sprøyten og fjern hjertet fra kanylen.
- Fjern overflødig metylenblå ved forsiktig rulling av hjertet på vevspapir. Løsne ligaturen rundt koronararterien ved å åpne de hemostatiske tangene og fjerne plastrørene fra den kirurgiske suturen først etter å ha fjernet overflødig metylenblå.
MERK: På dette stadiet er det mulig å plassere musehjertet i en liten plastpose eller en 5 ml sentrifugemikrorør i fryseren (-20 °C) i opptil 5-10 minutter. Maksimal frysetid bør bestemmes eksperimentelt i hvert laboratorium. Kortsiktig frysing av et musehjerte kan hjelpe en nybegynner med å skjære det i 1 mm tykke skiver. Frysing av rottehjerter anbefales ikke. Overfrysing i mer enn 10 min ved -20 °C må unngås. - Plasser det fargede rottehjertet i en matrise i rustfritt stål (se materialtabellen) for hjerteslicing (figur 1A). Klipp deretter hjertets ventrikler i 2 mm tykke skiver (sikt på 6-7 skiver av et voksent rottehjerte). For musehjerter, kutt hjertets ventrikler i 1,5 mm tykke skiver (sikt på minst 4 skiver av et voksent musehjerte).
MERK: Kutting av matrisekompatible barberblader må brukes. Generelt kan kompatible barberblader med én kant (f.eks. tykkelse på opptil 0,01 tommer (0,254 mm)) brukes til kutting av rottehjerter. Dobbeltkantede barberblader brukes vanligvis til musehjerter og er vanligvis opptil 0,004 tommer (0,1 mm) i tykkelse.
Figur 1: Matriser for rottehjertet og hjerneslicing. (A) Rottehjerte, (B) rottehjerne. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
- Etter kutting, overfør skivene til et 15 ml plastrør. Tilsett 5 ml 1% triphenyltetrazoliumklorid (TTC) oppløst i fosfatbufret saltvann (PBS) til røret med hjerteskivene, og inkuber i 10 min i et vannbad ved 37 °C.
- Etter inkubasjon i TTC-oppløsning, vask hjerteskivene minst 2-3 ganger med PBS og forbered deg på bildeopptak.
2. Hjernefarging og kutting
- Etter den midterste cerebral arterie okklusjon eksperimentet3,12, fjern hjernen, inkludert hjernestammen, fra skallen, og vask den i iskald PBS.
- Velg riktig størrelse på hjernens matrise i rustfritt stål (se materialtabellen) avhengig av dyrets vekt (figur 1B). Plasser hjernen med sin ventrale side opp i hjernematrisen.
MERK: Når du sitter i matrisen, må hjernens ventrale overflate være parallell med den øverste overflaten av formen. - Bruk kniver, begrens de fremre og kaudale delene (2 kniver fra begge sider) av hjernen.
MERK: Kutting av matrisekompatible barberblader må brukes. Generelt kan et kompatibelt barberblad med én kant (tykkelse på opptil 0,01 tommer (0,254 mm)) brukes til rottehjerneslicing. - Sett bladene delvis (ikke helt kutte hjernen) inn i kanalene mellom første og siste blad. Når alle bladene er satt inn og ordnet parallelt, trykk alle bladene ned med håndflaten samtidig for å kutte hjernen i 2 mm koronalskiver.
- Ta tak i bladene godt langs sidene med to fingre og fjern dem sammen med den skiver hjernen fra matrisen.
- Ordne hjerneskivene en etter en i en skuff (70 ml, 72 x 72 mm). Når du arrangerer skivene, må du sørge for at den fremre overflaten på hver skive alltid vender opp.
- Hell varm (+37 °C) 1% TTC-oppløsning i PBS på hjerneskivene, og inkuber dem i 8 min ved 37 °C i mørket.
MERK: Hjerneskivene må være helt nedsenket i TTC-oppløsning under inkubasjonen. - Etter inkubasjon i 1% TTC-løsning, overfør hjerneskivene til den blå plastbrettet for å fange bilder. Ordne hjerneskivene i sekvensiell rekkefølge fra frontal til kaudal del, og bruk en skalpell for å skille halvkule i sagittalplanet.
MERK: Overflaten på brettet skal kunne vaskes, matt og ha en farge som kontrasterer hjerneskiver (dvs. ikke rød, hvit eller blekrosa).
3. Makrofotografering
- Fotografi vev skiver umiddelbart etter farging.
MERK: Hjerteskiver kan oppbevares i kald PBS (ved +4 °C) eller formalinoppløsning i opptil 30 minutter. Hjerneskiver kan lagres i formalin i en lengre periode (1-2 uker). - Konfigurer det valgte kameraet med et ladet batteri, minnekort og tilkoblet objektiv på et stativ (figur 2)
MERK: Slå på lysene minst 5-10 minutter før bildeoppkjøp for å varme opp utstyret. LED-lys når full lysstyrke i mikrosekonds.
Figur 2: Kamera og lys som er konfigurert for makrofotografering. Kameraet er vinkelrett på bildeflaten for å sikre at fokusplanet til kameraet er parallelt med prøvene. Forkortelse: LED = lysdiode. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
- Avhengig av tilgjengelige lyskilder velger du de riktige innstillingene for hvitbalanse eller utfører fargetemperaturkalibrering i henhold til instruksjonene i kamerahåndboken.
MERK: Hvitt LED-lys (fargetemperatur 6500 K) er den foretrukne lyskilden for å unngå at lys flimrer av fluorescerende lyspærer. - Sett ISO 100 og blenderåpningen til f/10 i helt manuell modus, og juster lukkertiden for optimal bildeeksponering. Kontroller at kameraets fokusplan er parallelt med overflaten der prøven skal plasseres.
MERK: Histogramfunksjonen er nyttig for å sikre at vevsskiver ikke er overeksponert. - Fest eller aktiver en kablet eller trådløs fjernkontroll for å forhindre at kameraet rister når lukkeren slippes.
MERK: Et alternativ er å aktivere en forsinket lukkerfunksjon, som vil forsinke avtrekkeren i 2 eller 10 s etter å ha trykket på utløserknappen. - Senk hjerteskivene helt ned i en beholder med PBS.
MERK: Nedsenkede lysbilder har en tendens til å flyte bort fra posisjonen. For å minimere flytende skiver, bruk den minste mulige skuffen som alle skiver kan passe inn i og den minimale mengden nedsenkningsløsning, og sørg for at prøven er helt nedsenket. Alternative metoder inkluderer å plassere skivene mellom glasssklier eller bruke et polariserende filter på linsen. Et sirkulært polariserende filter er festet til objektivet og rotert til refleksjoner i en live-view-visning av kameraet forsvinner. - Ordne hjerneskivene i en tørr skuff uten PBS eller andre væsker.
MERK: Et polariserende filter er veldig praktisk å ta bilder av hjerneskiver. - Plasser beholderen med skiver under kameraet med makrolinsen, og kontroller at alle skiver passer helt inn i synsfeltet. Kontroller at skivene er på samme plan, det vil si ikke buet eller rullet.
- Kontroller eksponeringen og juster kamerainnstillingene om nødvendig.
MERK: Når du er innstilt, må du ikke endre eksponeringen og andre innstillinger under hele eksperimentet. - Registrer nummeret (eller annen identifikasjon) av prøven og bilde vevsstykket ved hjelp av en ekstern utløser.
MERK: En størrelsesmarkør, for eksempel en mm linjal, bør inkluderes i synsfeltet når absolutt kvantifisering av prøvestørrelsen er nødvendig. - Roter stykkene og ta bildene fra den andre siden.
Representative Results
Figur 3A er et fotografi av en metylenblå- og TTC-farget hjerteskive etter hjerteinfarkt, som inneholder nok detaljer og fargeinformasjon til videre planimetrisk analyse av infarktstørrelse (figur 3B). Vi testet hvordan frysing av hjertet i 24 timer påvirker integriteten til hjertevev (figur 3C). Frysing i en lengre periode (>1 t, figur 3C) reduserer mitokondriefunksjonen; Dermed er TTC-farging av hjertet ikke rød, men blekrosa, og grensen mellom nekrotisk og levedyktig vev er uskarpt (figur 3C).
Videre ble to metoder sammenlignet for reduksjon av refleksjoner i prøvene. Nedsenking er den mest effektive metoden og produserer detaljerte bilder med god kontrast (figur 4A). Den andre metoden er bruk av et polariserende filter festet til linsen. Polariseringsfilteret er også effektivt; Filteret reduserer imidlertid oppløsningen og mikrokontrasten til bildet litt (figur 4B). Et eksempelbilde av et hjertestykke uten nedsenking eller filter (figur 4C) inneholder mange refleksjoner og er ikke egnet for videre analyse.
Hjerneskiver er ikke nedsenket på grunn av problemer med skivehåndtering (flytende). I den planimetriske analysen er det viktig å sammenligne den upåvirkede (sunne) siden av hjernen (figur 5A) med den hjerneslagpåvirkede siden (figur 5B). Hjerneskiver er lettere å håndtere på en tørr plate eller brett, og et polariserende filter brukes til å fjerne refleksjoner. En skuff med blå bakgrunn brukes til fotografering i hjerneskiver (bakgrunnsvalg beskrevet tidligere5).
Manuelle kamerainnstillinger ble brukt for å sikre full kontroll over eksponering og hvitbalanse. Kamerainnstillingene bør justeres før eller i begynnelsen av eksperimentet i henhold til den tilgjengelige lyskilden. Dette sikrer optimal eksponering og hvitbalanse for alle bilder for å tillate ensartet analyse (figur 6A). De automatiske innstillingene til kameraet er ikke perfekte og kan resultere i forskjellige kameraparametere, noe som forårsaker upassende resultater og innføring av bilde-til-bilde-variasjon.
Figur 6 viser eksempler på overeksponerte (figur 6B) og undereksponerte bilder (figur 6C) av hjerteskiver. Det bør tas tilstrekkelig hensyn til de riktige hvitbalanseinnstillingene til kameraet for å matche en bestemt lyskilde som brukes i kameralysoppsettet. Feil innstillinger for hvitbalanse kan føre til et skift til blått eller gult (figur 6D) og magenta eller grønt (figur 6E) i bildet.
Figur 3: Bilder av rotte hjerteskiver. (A) Frisk hjerteskive ble analysert i ImageProPlus 6.3-programvare ved hjelp av fargesegmentering (B). (C) TTC-farging diskriminerer dårlig mellom levedyktig og nekrotisk vev i den frosne hjerteskiven (frosset i 24 timer). Forkortelse: TTC = 2,3,5-triphenyl-2H-tetrazoliumklorid. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 4: Teknikker for reduksjon av refleksjoner. Rottehjerteskivebilde tatt nedsenket i PBS (A) og ved hjelp av polariserende filter (B). (C) Hjerteskive med refleksjoner når verken nedsenking eller filter brukes. Forkortelse = PBS = fosfatbufret saltvann. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 5: Bilder av rottehjerneskiver. Rottehjernen ble kuttet i syv skiver og farget med TTC etter iskemi-reperfusjon. Bruk av polariserende filter resulterer i oppkjøp av refleksjonsfritt bilde. (A) Skiver fra den uskadede halvkule; (B) Skiver fra den slagpåvirkede halvkule. Forkortelse: TTC = 2,3,5-triphenyl-2H-tetrazoliumklorid. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 6: Bilder av rottehjerteskiver. Korrekt (A) og feil (B-E) tok bilder av hjertestykker. Feil eksponeringsinnstillinger resulterer i overeksponerte (B) og undereksponerte bilder (C). Feil innstillinger for hvitbalanse resulterer i gult (D) eller grønt støpt i bildet (E). Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Discussion
Forberedelse av hjertet etter IR starter med reoklusjon av blod hjertearteri og perfusjon av blått fargestoff for diskriminering av risikoutsatte områder fra ikke-risikoområder. Metylenblå eller Evans blå fargestoffer brukes oftest til dette formålet2. Ettersom et for høyt trykk kan skade hjerteklaffer og dermed delvis eller helt flekke risikoutsatte områder, er det bedre å parfyme hjertet med et trykkkontrollert system, for eksempel Langendorff-apparatet eller en forenklet versjon av en hydrostatisk trykksystemutstyrt sprøyte eller pumpe. Kontrollert perfusjon vil sikre fysiologisk trykk, og fargestoffet vil vanligvis ikke komme inn i hjertets okkluderte region. Både strømningshastighets- og trykkkontrollerte teknikker er sikkerhetstiltak mot overbelastning.
En av de alvorligste feilene i levedyktig vevsbehandling er å holde vev i en fryser i lengre tid før farging. Frysing brukes hovedsakelig fordi forskere ønsker å utføre hjertefarging dagen etter IR-eksperimentet eller senere. Videre brukes frysing for å gjøre kutting av hjertet enklere. Vi fant at kortsiktig frysing av hjertet i opptil 5-10 min ubetydelig påvirker integriteten til hjertevev og letter kutting av vevet (spesielt for musehjerter) i tynne skiver. Frysing i lengre perioder skader imidlertid membraner og reduserer celle levedyktighet og mitokondriefunksjon13. Som et resultat påvirkes TTC-farging av fungerende mitokondrier, og grensen mellom nekrotisk og levedyktig vev er dårlig avgrenset (uklar). Totalt sett bør frysing av rotteharter unngås, og bare kortsiktig frysing av musehjerter kan brukes til enklere kutting.
Det neste trinnet er vevsfarging i 1% TTC-oppløsning ved 37 °C14. Fargingsløsningen bør forhåndsvarmes – spesielt viktig for farging av hjerneskiver. Ved bruk av den forhåndsvarsmede oppløsningen er den optimale fargingstiden for hjerteskiver 10 min. En lengre inkubasjon eller en temperatur høyere enn 37 °C resulterer i brun fargelegging av hjertevevet. Riktig farging av prøver og konsekvent rød fargeintensitet er viktig for videre bildeanalyse. I de siste trinnene før fotografering skylles vevskivene 2-3 ganger med kald PBS eller en lignende buffer for å fjerne TTC og overflødig metylenblå fra løsningen for å unngå blå støping på fotografiet. Hjerteskiver bør fotograferes kort tid etter farging for å oppnå best mulig bildekvalitet. Hjertefarging rester av god kvalitet hvis lagret i opptil 60 min i den kalde (+4 °C) PBS. Fargede hjerneskiver og aortavev lagres vanligvis i en 4% nøytral formaldehydløsning og beholder god kvalitet i en uke. Nattlagring av hjernevev i formalin (+4 °C) svekker ikke fargeintensiteten til normalt vev og er akseptabelt for bildeanskaffelse. Formalin induserer imidlertid hevelse og destaining av hjerteskiver. Derfor anbefales ikke lagring av hjertevev i formalin.
Det neste trinnet er bildeanskaffelse. Mange laboratorier bruker planskannere som et bildeinnhentingsverktøy som forventes å erstatte et digitalt kamera og belysningsoppsett. Vi bestemte oss for at skanning av skiver ikke gir tilstrekkelig bildeoppløsning og fargeseparasjon og derfor ikke er egnet for bildebehandling av hjerteskiver. Spesielt er skanneroppløsningen utilstrekkelig for musehjerter, og vi la merke til dårlig gjengivelse av metylenblå. En skanner kan derimot være et alternativ til et fotokamera for å avbilde hjerneskiver som bare er farget med TTC eller andre enkeltfarger. For skanning av vevsskiver er skanneprogramvare som sikrer konstant eksponeringsinnstillinger viktig. Totalt sett er en planskanner mindre kapabel og kan ikke erstatte et digitalt kamera for de fleste bildebehandlingsprogrammer.
Bakgrunnen bak prøvene er også viktig. Ideelt sett bør bunnen av brettet være av en farge som ikke er tilstede i den fargede prøven. For eksempel, for å kvantifisere området metylenblå og TTC (rød) farging på en automatisert eller halvautomatisert måte, bør hvit, rød, blå, gul og brun bakgrunn unngås. Dermed vil en grønn bakgrunn være å foretrekke. Likevel avhenger fargevalg av operatørens preferanser, som etterbehandler bildet. Mange forskere foretrekker en hvit bakgrunn fordi en hvit bakgrunn kan slettes i etterbehandling av bilder og konverteres til helt hvit (RGB hvit kode 255,255,255). Deretter bør man utelukke helt hvitt fra listen over valgte farger som brukes til halvautomatisk analyse og telle bare bleke nekrotiske områder, som ikke er helt hvite hvis de ikke er overeksponert. Blå og grønn bakgrunn er egnet for fotografering av hjerneskiver og aortas.
Det optimale bildeverktøyet for vevsfotografering er en enkeltlinse refleks eller speilløs utskiftbart linse digitalt kamera med en kompatibel makrolinse. Å ta opp svært små objekter kan kreve en kombinasjon av et kamera og et mikroskop; Likevel har en makrolinse vanligvis tilstrekkelig (minst 1:2) forstørrelse for å få detaljerte bilder av et musehjerte. Mange produsenter tilbyr rimelige digitale kameraer og makrolinser for å oppnå fotografier med høy oppløsning og høy forstørrelse. Alle oppdaterte digitale kameraer har egenskaper og funksjoner som er nødvendige for makrofotografering, inkludert muligheten til å montere på et stativ, et høyt antall piksler (vanligvis >20 Mpx), live view, speillåsing, tidsforløpfunksjoner, ekstern lukker og muligheten til manuelt å stille inn kameraparametere, og dermed sikre en konstant lukkertid, blenderåpning, hvitbalanse og ISO-innstilling. Kompakte kameraer med ovennevnte funksjoner og objektivforstørrelse på minst 1:2 kan også brukes til makrofotografering. På grunn av objektivegenskaper bør noen kompakte kameraer plasseres i nærheten av objektet, og eksperimentatoren må sørge for at kamerahuset ikke påvirker belysningen av prøven.
For makrofotografering med alle typer utskiftbare objektivkameraer kreves det et makroobjektiv med høy forstørrelse (1:1-1:2). Vi foreslår at du bruker makrolinser med en brennvidde fra 50 mm til 100 (120) mm eller tilsvarende på fullrammesensoren (24 mm x 36 mm). Mindre sensorkameraer har forskjellige sensorstørrelser, og forstørrelsen bør beregnes på nytt tilsvarende. For fotografering av hjerteskiver er en ergonomisk avstand på det 100 mm makrolinsefrontelementet til motivet ca. 150 mm. Denne innstillingen gjør det mulig for operatører å holde alt utstyret på et bord, med enkel tilgang til kamerakontrollene. En makrolinse på 50 mm kan vurderes for fotografering av større objekter, for eksempel hjerneskiver, fordi et bredere synsfelt er nødvendig for å få tak i alle skiver i ett enkelt fotografi.
For å få skarpe bilder med høy oppløsning, bør et kamera monteres på et solid stativ, som sammen med et lysoppsett kalles et fotokopistativ. Montering av kameraet på et stativ og en ekstern (kablet eller trådløs) utløser eliminerer kameraristing og sikrer en konstant avstand fra målet. Et kamerabelysningsoppsett med to konstantlyskilder fra begge sider, vinklet ca. 30-60° i forhold til motivplanet, sikrer tilstrekkelig belysning av prøver og bidrar til å unngå refleksjoner samtidig. Kameraet skal monteres nøyaktig slik at sensoren er parallell med motivplanet. For å jevnt belyse bildefeltet, bør begge lampene være like orientert og plassert i samme avstand fra motivet. Lyskilder plassert på ulike avstander fra motivet forårsaker ujevn belysning. I tillegg er blinkende lyskilder en årsak til variasjoner i bildeeksponering. Totalt sett er det viktig å plassere kameraet og lyskildene nøyaktig for å nøyaktig skaffe bilder av godt opplyste prøver.
Vevsprøver reflekterer lys (glins), som vises som hvite flekker på bildene. Disse lysrefleksjonspunktene inneholder ikke nyttig fargeinformasjon, og derfor kan ikke disse delene av bildene brukes til nøyaktig kvantitativ analyse av bilder. Lysrefleksjoner fra vevsskiver kan fjernes ved ulike metoder. Den mest effektive er full nedsenking av vevsprøver i en beholder med saltvann eller PBS-løsning. En lignende tilnærming er innsetting av vevsskiver under (eller mellom) glassplater. Denne metoden er effektiv mot refleksjoner; Bildeoppløsningen kan imidlertid være lavere enn fotografiene av nedsenket vev.
Man kan også bruke et polariserende filter montert på et objektiv for å eliminere lysrefleksjoner. Sirkulære polarisasjonsfiltre er allment tilgjengelige, men varierer betydelig i kvalitet avhengig av pris, og billige filtre kan redusere bildeoppløsningen betydelig. Reflektert lys kan filtreres av ved å dreie den bevegelige delen av polariseringsfilteret i en vinkel. Effekten av polariseringsfilteret kan påvirkes av enkelte lyskilder (f.eks. sterkt LED-lys). Totalt sett, etter fjerning av ekstra væske, kan et polariserende filter eliminere alle refleksjoner fra hjerneskivene; Imidlertid er prøveinnlevelse i bufferløsning den enkleste og mest kostnadseffektive tilnærmingen for hjerteskiver.
Manuelle innstillinger for lukkertid, blenderåpning, ISO og hvitbalanse er viktige for å opprettholde full kontroll over bildebehandlingsprosessen. Prøven, bakgrunnen og egenskapene til lyskilden påvirker kameraets målesystem for eksponering i automatiske innstillinger; Derfor er manuelle innstillinger nødvendige for å opprettholde konstant eksponering og hvitbalanse mellom flere fotografier under eksperimentet. For makrofotografering er den foreslåtte blenderåpningsinnstillingen mellom f/8 og f/16. Ved å redusere blenderåpningen øker feltdybden, noe som er nyttig hvis objektet ikke er i et enkelt plan. Diffraksjon begrenser imidlertid den totale oppløsningen av fotografering ved mindre blenderåpninger. Den optimale blenderåpningen for de fleste objektiver er vanligvis f/10 fordi oppløsningsfallet i denne innstillingen er ubetydelig, og dybdeskarphet er tilstrekkelig. ISO-verdier fra 50 til 400 (lavere er bedre) er vanligvis optimale for å minimere bildeartefakter (støy). Lukkertiden gjenstår deretter å endre for å oppnå riktig eksponering ved hjelp av de nevnte blenderåpningene og ISO-innstillingene under eksisterende lysforhold. Manuelle innstillinger er viktige for konsekvent bildeanalyse. Standardisert avbildning sikrer bruk av de samme innstillingene for fargeterskeling gjennom alle studier, noe som krever segmenteringsanalyse. Halvautomatisk analyse av ImagePro-programvare basert på en segmenteringsfil med forhåndsdefinerte farger i blått, rødt og hvitt (+blekrosa) kan for eksempel brukes gjennom årene hvis prøvebilder har konsekvente farger, hvitbalanse og eksponering.
Hvitbalanseinnstillingen bør justeres avhengig av fargetemperaturen til lyskilden som brukes til å belyse en prøve. Hvitbalanse kan velges fra kameraets innebygde forhåndsinnstillinger eller ved hjelp av manuell kalibrering av et grått mål. Fordelen med bildeopptak i RAW-format er at hvitbalansen kan justeres under programvare etterbehandling av avbildningen. Siden RAW-filer inneholder mye mer informasjon enn JPEG-filer, gir RAW-fil etterbehandling en utmerket mulighet for korrigering av fargebalanse og eksponering, samt for å oppnå bedre bildeoppløsning. Fordi de fleste kameraer kan ta JPEG- og RAW-filer samtidig, foreslår vi at du tar RAW-filen og lagrer den som en sikkerhetskopi.
Samlet sett beskriver denne protokollen en metodikk for rottehjerte- og hjernevevsslicing og farging og gir retningslinjer for etablering av belysnings- og kameraoppsett og fotograferingsteknikker for høyoppløselig bildeanskaffelse for videre analyse. Denne metoden gjelder for all eksperimentell smådyrorganfotografering.
Disclosures
Forfatterne erklærer at de ikke har noen interessekonflikter.
Acknowledgments
Forfatterne ble støttet av EUs forsknings- og innovasjonsprogram Horizon 2020 under tilskuddsavtale No 857394, Project FAT4BRAIN.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 mL syringe | Sagimed | N/A | |
| 2,3,5-Triphenyltetrazolium chloride (TTC) | Sigma-Aldrich | 298-96-4 | |
| 5 mL syringe | Sagimed | N/A | |
| 50 mL syringe | Terumo | N/A | |
| Adult Rat Brain Slicer Matrix | Zivic Instruments | BSRAS001-1 | |
| Aortic cannula for mouse heart | ADInstruments | SP3787 | |
| Aortic cannula for rat heart | ADInstruments | SP3786 | |
| Calcium chloride dihydrate, ≥99% | Acros Organics | 207780010 | |
| Cover Glass Forceps, Angled | Fine Science Tools | 11073-10 | |
| Hemostatic forceps | Agnthos | 13008-12 | |
| Hoya 62 mm alpha Circular Polarizer Filter | Hoya | HOCPA62 | |
| Magnesium chloride hexahydrate | Penta | 16330-31000 | |
| Methylene Blue | SigmaAldrich | M9140 | |
| Mouse Heart Slicer Matrix | Zivic Instruments | HSMS005-1 | |
| Polyethylene plastic tubing | BD Intramedic | N/A | |
| Potassium chloride for biochemistry | Acros Organics | 418205000 | |
| Potassium phosphate, monobasic, ≥99% | Acros Organics | 205920025 | |
| Rat Heart Slicer Matrix | Zivic Instruments | HSRS001-1 | |
| Scissors curved with blunt ends | Agnthos | 14013-15 | |
| Scissors for cleaning heart | Agnthos | 14058-11 | |
| Single Edge Razor Blades | Zivic Instruments | BLADE012.1 | |
| Sodium bicarbonate for biochemistry, 99.5% | Acros Organics | 447100010 | |
| Sodium chloride | Fisher bioreagents | BP358-10 | |
| Sony Alpha a6000 Mirrorless Digital Camera | Sony | ILCE6000 | Can be repalaced by any up-to-date digiatal camera |
| Sony FE 90 mm F/ 2.8 Macro G OSS | Sony | SEL90M28G | Important, lens should be compatible with camera |
| Sony SF32UZ SDHC 32 GB Class 10 UHS | Sony | 2190246141 | |
| Surgical blade | Heinz Herenz Hamburg Germany | BS2982 | |
| Thermo-Shaker | BioSan | PST-60HL-4 | |
| Toothed tissue forceps | Agnthos | 11021-12 | |
| Toothed tissue forceps for cleaning heart | Agnthos | 11023-10 | |
| Weigh tray, 70 mL | Sarsted | 71,99,23,212 |
References
- Bell, R. M., Mocanu, M. M., Yellon, D. M. Retrograde heart perfusion: the Langendorff technique of isolated heart perfusion. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 50 (6), 940-950 (2011).
- Botker, H. E., et al. Practical guidelines for rigor and reproducibility in preclinical and clinical studies on cardioprotection. Basic Research in Cardiology. 113 (5), 39 (2018).
- Uluc, K., Miranpuri, A., Kujoth, G. C., Akture, E., Baskaya, M. K. Focal cerebral ischemia model by endovascular suture occlusion of the middle cerebral artery in the rat. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (48), e1978 (2011).
- Zvejniece, L., Svalbe, B., Liepinsh, E., Pulks, E., Dambrova, M. The sensorimotor and cognitive deficits in rats following 90- and 120-min transient occlusion of the middle cerebral artery. Journal of Neuroscience Methods. 208 (2), 197-204 (2012).
- Liepinsh, E., Kuka, J., Dambrova, M. Troubleshooting digital macro photography for image acquisition and the analysis of biological samples. Journal of Pharmacological and Toxicological Methods. 67 (2), 98-106 (2013).
- Kolwicz, S. C., Tian, R. Assessment of cardiac function and energetics in isolated mouse hearts using 31P NMR spectroscopy. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (42), e2069 (2010).
- Herr, D. J., Aune, S. E., Menick, D. R. Induction and assessment of ischemia-reperfusion injury in Langendorff-perfused rat hearts. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (101), e52908 (2015).
- Liepinsh, E., et al. Inhibition of L-carnitine biosynthesis and transport by methyl-gamma-butyrobetaine decreases fatty acid oxidation and protects against myocardial infarction. British Journal of Pharmacology. 172 (5), 1319-1332 (2015).
- Nakamura, K., Al-Ruzzeh, S., Ilsley, C., Yacoub, M. H., Amrani, M. Acute effect of cerivastatin on cardiac regional ischemia in a rat model mimicking off-pump coronary surgery. Journal of Cardiac Surgery. 20 (6), 507-511 (2005).
- Li, Q., Morrison, M. S., Lim, H. W. Using a cardiac anchor to refine myocardial infarction surgery in the rat. Lab Animal. 39 (10), 313-317 (2010).
- Wu, Y., Yin, X., Wijaya, C., Huang, M. H., McConnell, B. K.
- Vavers, E., et al. The neuroprotective effects of R-phenibut after focal cerebral ischemia. Pharmacological Research. 113, Pt B 796-801 (2016).
- Acin-Perez, R., et al. A novel approach to measure mitochondrial respiration in frozen biological samples. EMBO Journal. 39 (13), 104073 (2020).
- Kloner, R. A., Darsee, J. R., DeBoer, L. W., Carlson, N. Early pathologic detection of acute myocardial infarction. Archives of Pathology & Laboratory Medicine. 105 (8), 403-406 (1981).
