Summary
Hier wird ein Protokoll für die standardisierte Methodik der Nagetiergewebepräparation nach dem Ischämie-Reperfusionsexperiment und Richtlinien für die Einrichtung von Beleuchtungs- und Kameraeinstellungen für die hochauflösende Bildaufnahme vorgestellt. Diese Methode ist auf alle experimentellen Kleintierorganfotografien anwendbar.
Abstract
Die Makrofotografie eignet sich für die Abbildung verschiedener Gewebeproben mit hoher Vergrößerung, um qualitative und quantitative Analysen durchzuführen. Die Gewebepräparation und die anschließende Bilderfassung sind Schritte, die unmittelbar nach dem Ischämie-Reperfusions-Experiment (IR) durchgeführt werden und rechtzeitig und mit angemessener Sorgfalt durchgeführt werden müssen. Zur Bewertung von IR-induzierten Schäden im Herzen und Gehirn beschreibt dieser Beitrag die 2,3,5-Triphenyl-2H-tetrazoliumchlorid (TTC)-basierte Färbung mit anschließender Makrofotografie. Wissenschaftliche Makrofotografie erfordert eine kontrollierte Beleuchtung und einen geeigneten Bildaufbau. Die standardisierte Methodik gewährleistet qualitativ hochwertige, detaillierte digitale Bilder, auch wenn eine Kombination aus kostengünstiger aktueller Digitalkamera und Makroobjektiv verwendet wird. Richtige Techniken und mögliche Fehler bei der Probenvorbereitung und Bildaufnahme werden diskutiert und Beispiele für den Einfluss von korrekten und falschen Setups auf die Bildqualität gegeben. Es werden spezifische Tipps gegeben, wie Sie häufige Fehler wie Überfärbung, unsachgemäße Probenlagerung und suboptimale Lichtverhältnisse vermeiden können. Dieses Papier zeigt die geeignete Methodik für das Schneiden und Färben von Herz- und Hirngewebe von Ratten und enthält Richtlinien für die Einrichtung von Beleuchtungs- und Kameraeinstellungen sowie Fototechniken für die hochauflösende Bildaufnahme.
Introduction
Seit Jahrzehnten sind die Fotografie und Analyse von Herz- und Hirngewebeproben ein wichtiger Bestandteil der Life-Science-Experimente. Der Fortschritt in Wissenschaft und Innovation treibt die Entwicklung teurer Mikroskope voran, die eine hervorragende Auflösung ermöglichen. Mikroaufnahmen werden in einer gut kontrollierten Lichtumgebung nach detaillierten Anweisungen aufgenommen. Im Gegensatz dazu wird die Makrofotografie (bei einer Vergrößerung von 1: 2 oder mehr) häufig in einer unkontrollierten Lichtumgebung mit ungeeigneten Bildgebungseinstellungen durchgeführt. Oft müssen die Techniken der Probenvorbereitung und des Kameraaufbaus erheblich optimiert werden. Infolgedessen wurden Makrofotografien von begrenzter Qualität in wissenschaftlichen Zeitschriften veröffentlicht. Unzureichende Bildauflösung und Kontrast schränken die Möglichkeiten einer präzisen Bildquantifizierung in IR-Studien ein.
Experimentelle Verfahren von myokardialen1,2 und Gehirn3,4 Infarkten wurden ausführlich beschrieben. Der Zweck dieser Studie ist es, eine Schritt-für-Schritt-Anleitung zur Einrichtung eines Systems für die Fotografie und standardisierte Analyse von Nagetierherz- und Hirngewebeproben nach Infarktexperimenten bereitzustellen. Dazu gehören Gewebeschnitte, Färbungen und Makrofotografien von Herz- und Gehirnproben. Die Präparation von Gewebeproben ist ein wesentlicher Bestandteil des Experiments, und die Ergebnisse der planimetrischen Bildanalyse hängen stark von der Qualität der erhaltenen Bilder ab5.
Diese Methoden sind besonders nützlich für die Durchführung von Messungen und bildplanimetrischen Analysen in Nagetiergeweben und könnten für die allgemeine wissenschaftliche Makrofotografie von Wert sein. Darüber hinaus ermöglichen die hohe Qualität und Konsistenz der Bilder die automatisierte Analyse digitaler Fotos, was dazu beiträgt, Zeit zu sparen, Benutzereingaben zu vermeiden und das Risiko von Fehlern oder Verzerrungen bei der Bildanalyse zu minimieren. Dies wird zur Generierung robuster und zuverlässiger Daten führen und die Translation präklinischer Entdeckungen in neuartige antiischämische Behandlungen in Kliniken erhöhen.
Protocol
Die experimentellen Verfahren wurden in Übereinstimmung mit den Richtlinien der Europäischen Gemeinschaft und den lokalen Gesetzen und Politiken (Richtlinie 2010/63/EU) durchgeführt, und alle Verfahren wurden vom Lebensmittel- und Veterinärdienst, Riga, Lettland, genehmigt.
1. Herzfärben und Schneiden
HINWEIS: Die in diesem Protokoll beschriebenen Techniken können sowohl nach Langendorff-perfundierten isolierten Ratten- oder Mausherzen6,7 als auch nach in vivo Rattenherz-IR-Verletzungstests8,9,10,11 angewendet werden. Für die Färbung nach einem In-vivo-IR-Verletzungstest wird davon ausgegangen, dass das Herz herausgeschnitten, auf eine Kanüle montiert und im Langendorff-Perfusionsmodus kurz perfundiert wird.
- Die Herzkanüle wird von der mit Krebs-Henseleit-Lösung gefüllten Spritze gelöst und an eine Spritze angeschlossen, die mit einer warmen (37 °C) Lösung aus 0,1%igem Methylenblau in Krebs-Henseleit-Lösung gefüllt ist. Verwenden Sie eine 5-ml-Spritze für Rattenherzen und eine 1-2-ml-Spritze für Mausherzen.
HINWEIS: Eine Alternative besteht darin, die druck- oder durchflussgesteuerte (z.B. Langendorff) Apparatur mit einer blauen farbstoffhaltigen Lösung zu füllen. Während des Ablöse- und Montagevorgangs ist es wichtig, keine Luftblasen in der Kanüle zu hinterlassen und die Naht, die für die Koronararterienreokklusion verwendet wird, nicht zu lösen. - Weitere Perfuse Rattenherzen mit 4 ml der Methylenblaulösung bei einer Rate von ~4 ml/min und Perfuse Mausherzen mit 1 ml Methylenblaulösung bei einer Rate von ~0,5-1 mL/min.
HINWEIS: Erfahrungsgemäß sind beide Techniken sicher und bieten eine angemessene Färbung. Die Verwendung eines druckgesteuerten Pump- / hydrostatischen Drucksystems ist jedoch eine zeitaufwendigere, aber sicherere Option gegen Überbefleckung für unerfahrene Wissenschaftler. - Trennen Sie die Kanüle von der Spritze und entfernen Sie das Herz von der Kanüle.
- Entfernen Sie überschüssiges Methylenblau, indem Sie das Herz vorsichtig auf Seidenpapier rollen. Lösen Sie die Ligatur um die Koronararterie, indem Sie die hämostatische Pinzette öffnen und den Kunststoffschlauch erst nach dem Entfernen von überschüssigem Methylenblau aus der chirurgischen Naht entfernen.
HINWEIS: In diesem Stadium ist es möglich, das Mausherz in eine kleine Plastiktüte oder ein 5 ml Zentrifugenmikroröhrchen in den Gefrierschrank (-20 °C) für bis zu 5-10 min zu legen. Die maximale Gefrierzeit sollte in jedem Labor experimentell bestimmt werden. Das kurzfristige Einfrieren eines Mausherzens kann einem unerfahrenen Experimentator helfen, es in 1 mm dicke Scheiben zu schneiden. Das Einfrieren von Rattenherzen wird nicht empfohlen. Ein Übergefrieren für mehr als 10 min bei -20 °C ist zu vermeiden. - Legen Sie das gebeizte Rattenherz in eine Edelstahlmatrix (siehe Materialtabelle) zum Schneiden des Herzens (Abbildung 1A). Dann schneiden Sie die Ventrikel des Herzens in 2 mm dicke Scheiben (zielen Sie auf 6-7 Scheiben eines erwachsenen Rattenherzens). Bei Mausherzen schneiden Sie die Herzkammern in 1,5 mm dicke Scheiben (zielen Sie auf mindestens 4 Scheiben eines erwachsenen Mausherzens ab).
HINWEIS: Es müssen Schneidematrix-kompatible Rasierklingen verwendet werden. Generell können kompatible einschneidige Rasierklingen (z.B. Dicke von bis zu 0,01 Zoll (0,254 mm)) zum Schneiden von Rattenherzen verwendet werden. Zweischneidige Rasierklingen werden im Allgemeinen für Mausherzen verwendet und sind in der Regel bis zu 0,004 Zoll (0,1 mm) dick.
Abbildung 1: Matrizen für das Schneiden von Rattenherz und Gehirn. (A) Rattenherz, (B) Rattengehirn. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
- Nach dem Schneiden die Scheiben in ein 15 ml Kunststoffröhrchen geben. 5 ml 1% Triphenyltetrazoliumchlorid (TTC), gelöst in phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS), in das Röhrchen mit den Herzscheiben geben und 10 min in einem Wasserbad bei 37 °C inkubieren.
- Nach der Inkubation in TTC-Lösung die Herzscheiben mindestens 2-3 Mal mit PBS waschen und für die Bildaufnahme vorbereiten.
2. Gehirnfärbung und Schneiden
- Nach dem Experiment zum Verschluss der mittleren Hirnarterie3,12 entfernen Sie das Gehirn, einschließlich des Hirnstamms, aus dem Schädel und waschen Sie es in eiskaltem PBS.
- Wählen Sie die richtige Größe der Edelstahlmatrix des Gehirns (siehe Materialtabelle) in Abhängigkeit vom Gewicht der Tiere (Abbildung 1B). Platzieren Sie das Gehirn mit seiner ventralen Seite nach oben in der Gehirnmatrix.
HINWEIS: Wenn die ventrale Oberfläche des Gehirns in der Matrix sitzt, muss sie parallel zur oberen Oberfläche der Form sein. - Beschränken Sie mit Klingen die frontalen und kaudalen Teile (2 Klingen von beiden Seiten) des Gehirns.
HINWEIS: Es müssen Schneidematrix-kompatible Rasierklingen verwendet werden. Im Allgemeinen kann eine kompatible, einschneidige Rasierklinge (Dicke von bis zu 0,01 Zoll (0,254 mm)) für das Schneiden von Rattengehirnen verwendet werden. - Legen Sie die Klingen teilweise (nicht vollständig das Gehirn schneidend) in die Kanäle zwischen der ersten und der letzten Klinge. Wenn alle Klingen parallel eingeführt und angeordnet sind, drücken Sie alle Klingen gleichzeitig mit der Handfläche nach unten, um das Gehirn in 2 mm koronale Scheiben zu schneiden.
- Fassen Sie die Klingen an den Seiten mit zwei Fingern fest und entfernen Sie sie zusammen mit dem geschnittenen Gehirn aus der Matrix.
- Ordnen Sie die Gehirnscheiben nacheinander in einem Fach (70 ml, 72 x 72 mm) an. Stellen Sie beim Anordnen der Scheiben sicher, dass die vordere Oberfläche jeder Scheibe immer nach oben zeigt.
- Gießen Sie warme (+37 °C) 1% ige TTC-Lösung in PBS auf die Gehirnscheiben und inkubieren Sie sie für 8 min bei 37 °C im Dunkeln.
HINWEIS: Die Gehirnscheiben müssen während der Inkubation vollständig in TTC-Lösung eingetaucht werden. - Nach der Inkubation in 1% iger TTC-Lösung die Gehirnscheiben in die blaue Kunststoffschale geben, um Bilder aufzunehmen. Ordnen Sie die Gehirnscheiben in sequenzieller Reihenfolge vom frontalen zum kaudalen Teil an und verwenden Sie ein Skalpell, um die Hemisphären in der Sagittalebene zu trennen.
HINWEIS: Die Oberfläche des Tabletts sollte waschbar, matt und von einer Farbe sein, die im Kontrast zu Gehirnscheiben steht (d. H. Nicht rot, weiß oder blassrosa).
3. Makrofotografie
- Fotografieren Sie die Gewebescheiben unmittelbar nach dem Färben.
HINWEIS: Herzscheiben können in kalter PBS- (bei +4 °C) oder Formalinlösung bis zu 30 min gelagert werden. Gehirnschnitte können in Formalin für einen längeren Zeitraum (1-2 Wochen) gelagert werden. - Richten Sie die Kamera Ihrer Wahl mit einem aufgeladenen Akku, einer Speicherkarte und einem angeschlossenen Objektiv auf einem Ständer ein (Abbildung 2)
HINWEIS: Schalten Sie das Licht mindestens 5-10 Minuten vor der Bildaufnahme ein, um das Gerät aufzuwärmen. LED-Leuchten erreichen in Mikrosekunden die volle Helligkeit.
Abbildung 2: Kamera und Leuchten für Makrofotografie eingerichtet. Die Kamera befindet sich senkrecht zur Bildoberfläche, um sicherzustellen, dass die Brennebene der Kamera parallel zu den Proben verläuft. Abkürzung: LED = Leuchtdiode. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
- Wählen Sie je nach verfügbaren Lichtquellen die entsprechenden Weißabgleichseinstellungen aus oder führen Sie eine Farbtemperaturkalibrierung gemäß den Anweisungen im Kamerahandbuch durch.
HINWEIS: Weißes LED-Licht (Farbtemperatur 6.500 K) ist die bevorzugte Lichtquelle, um Lichtflackern durch Leuchtstofflampen zu vermeiden. - Schalten Sie die Kamera in den vollständig manuellen Modus, stellen Sie ISO 100 und Blende auf f/10 ein und passen Sie die Verschlusszeit für eine optimale Bildbelichtung an. Stellen Sie sicher, dass die Brennebene der Kamera parallel zu der Oberfläche verläuft, auf der die Probe platziert wird.
HINWEIS: Die Histogrammfunktion ist nützlich, um sicherzustellen, dass Gewebeschnitte nicht überbelichtet werden. - Schließen Sie einen kabelgebundenen oder drahtlosen Fernauslöser an oder aktivieren Sie ihn, um ein Verwackeln der Kamera zu verhindern, wenn der Auslöser losgelassen wird.
HINWEIS: Eine Alternative besteht darin, eine verzögerte Verschlussfunktion zu aktivieren, die den Auslöser nach dem Drücken der Auslösetaste um 2 oder 10 s verzögert. - Tauchen Sie die Herzscheiben vollständig in einen Behälter mit PBS.
HINWEIS: Eingetauchte Folien neigen dazu, von ihrer Position wegzuschweben. Um das Schweben der Scheiben zu minimieren, verwenden Sie die kleinstmögliche Schale, in die alle Scheiben passen, und die minimale Menge an Tauchlösung, um sicherzustellen, dass die Probe vollständig eingetaucht ist. Alternative Methoden umfassen das Platzieren der Scheiben zwischen Glasobjektträgern oder die Verwendung eines Polarisationsfilters auf der Linse. Ein zirkularpolarisierender Filter wird am Objektiv befestigt und gedreht, bis Reflexionen in einer Live-View-Anzeige der Kamera verschwinden. - Ordnen Sie die Gehirnscheiben in einem trockenen Tablett ohne PBS oder andere Flüssigkeiten an.
HINWEIS: Ein Polarisationsfilter ist sehr praktisch, um Bilder von Gehirnschnitten aufzunehmen. - Platzieren Sie den Behälter mit Slices mit dem Makroobjektiv unter der Kamera und stellen Sie sicher, dass alle Slices vollständig in das Sichtfeld passen. Stellen Sie sicher, dass sich die Slices auf der gleichen Ebene befinden, d. h. nicht gekrümmt oder gewalzt sind.
- Überprüfen Sie die Belichtung und passen Sie bei Bedarf die Kameraeinstellungen an.
HINWEIS: Ändern Sie nach dem Festlegen die Belichtung und andere Einstellungen während des gesamten Experiments nicht. - Erfassen Sie die Anzahl (oder eine andere Identifikation) der Probe und stellen Sie die Gewebescheibe mit einem Fernauslöser ab.
HINWEIS: Ein Größenmarker, z. B. ein mm-Lineal, sollte in das Sichtfeld aufgenommen werden, wenn eine absolute Quantifizierung der Probengröße erforderlich ist. - Drehen Sie die Slices und erfassen Sie ihre Bilder von der anderen Seite.
Representative Results
Abbildung 3A ist ein Foto einer mit Methylenblau und TTC gefärbten Herzscheibe nach einem Myokardinfarkt, die genügend Details und Farbinformationen für eine weitere planimetrische Analyse der Infarktgröße enthält (Abbildung 3B). Wir haben getestet, wie sich das Einfrieren des Herzens für 24 Stunden auf die Integrität des Herzgewebes auswirkt (Abbildung 3C). Einfrieren über einen längeren Zeitraum (>1 h, Abbildung 3C) reduziert die mitochondriale Funktion; So ist die TTC-Färbung des Herzens nicht rot, sondern blassrosa, und die Grenze zwischen nekrotischem und lebensfähigem Gewebe ist verschwommen (Abbildung 3C).
Weiterhin wurden zwei Methoden zur Reduzierung von Reflexionen in den Proben verglichen. Die Immersion ist die effizienteste Methode und erzeugt detaillierte Bilder mit gutem Kontrast (Abbildung 4A). Die zweite Methode ist die Verwendung eines Polarisationsfilters, der an der Linse befestigt ist. Der Polarisationsfilter ist ebenfalls wirksam; Der Filter reduziert jedoch die Auflösung und den Mikrokontrast des Bildes leicht (Abbildung 4B). Ein Beispielbild einer Herzscheibe ohne Eintauchen oder Filter (Abbildung 4C) enthält viele Reflexionen und ist nicht für weitere Analysen geeignet.
Gehirnscheiben werden aufgrund von (schwebenden) Problemen mit dem Slice-Management nicht eingetaucht. Bei der planimetrischen Analyse ist es wichtig, die nicht betroffene (gesunde) Seite des Gehirns (Abbildung 5A) mit der vom Schlaganfall betroffenen Seite (Abbildung 5B) zu vergleichen. Gehirnscheiben sind auf einer trockenen Platte oder einem Tablett leichter zu handhaben, und ein Polarisationsfilter wird verwendet, um Reflexionen zu entfernen. Ein Fach mit blauem Hintergrund wird für die Brain-Slice-Fotografie verwendet (Hintergrundauswahl zuvor beschrieben5).
Manuelle Kameraeinstellungen wurden verwendet, um die volle Kontrolle über Belichtung und Weißabgleich zu gewährleisten. Die Kameraeinstellungen sollten vor oder zu Beginn des Experiments entsprechend der verfügbaren Lichtquelle angepasst werden. Dies gewährleistet eine optimale Belichtung und einen optimalen Weißabgleich aller Bilder, um eine gleichmäßige Analyse zu ermöglichen (Abbildung 6A). Die automatischen Einstellungen der Kamera sind nicht perfekt und können zu variierenden Kameraparametern führen, was zu unangemessenen Ergebnissen und der Einführung von Bild-zu-Bild-Variabilität führt.
Abbildung 6 zeigt Beispiele für überbelichtete (Abbildung 6B) und unterbelichtete Bilder (Abbildung 6C) von Herzschnitten. Es sollte ausreichend auf die korrekten Weißabgleicheinstellungen der Kamera geachtet werden, um einer bestimmten Lichtquelle zu entsprechen, die in der Kamera-Licht-Einrichtung verwendet wird. Falsche Weißabgleicheinstellungen können zu einer Verschiebung auf Blau oder Gelb (Abbildung 6D) und Magenta oder Grün (Abbildung 6E) im Bild führen.
Abbildung 3: Bilder von Herzschnitten von Ratten. (A) Die Frischherzscheibe wurde in der ImageProPlus 6.3-Software mithilfe der Farbsegmentierung (B) analysiert. (C) TTC-Färbungen unterscheiden schlecht zwischen lebensfähigem und nekrotischem Gewebe in der gefrorenen Herzscheibe (24 h gefroren). Abkürzung: TTC = 2,3,5-triphenyl-2H-tetrazoliumchlorid. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 4: Techniken zur Reduzierung von Reflexionen. Rattenherzschnittbild, aufgenommen in PBS (A) und mit Polarisationsfilter (B). (C) Herzscheibe mit Reflexionen, wenn weder Eintauchen noch Filter verwendet werden. Abkürzung = PBS = phosphatgepufferte Kochsalzlösung. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 5: Bilder von Rattenhirnschnitten. Das Rattengehirn wurde nach der Ischämie-Reperfusion in sieben Scheiben geschnitten und mit TTC gefärbt. Die Verwendung eines Polarisationsfilters führt zur Aufnahme eines reflexionsfreien Bildes. a) Scheiben aus der unbeschädigten Hemisphäre ; (B) Schnitte aus der vom Schlaganfall betroffenen Hemisphäre. Abkürzung: TTC = 2,3,5-triphenyl-2H-tetrazoliumchlorid. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 6: Rattenherzschnittbilder. Korrekt (A) und falsch (B-E) aufgenommene Herzschnittbilder. Falsche Belichtungseinstellungen führen zu überbelichteten (B) und unterbelichteten Bildern (C). Falsche Weißabgleicheinstellungen führen zu einem gelben (D) oder grünen Ton im Bild (E). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Discussion
Die Vorbereitung des Herzens nach der IR beginnt mit der Reokklusion der Blutherzarterien und der Perfusion von blauem Farbstoff zur Unterscheidung von Risikobereichen aus Nicht-Risikobereichen. Zu diesem Zweck werden am häufigsten Methylenblau- oder Evansblaufarbstoffe verwendet2. Da ein zu hoher Druck die Herzklappen schädigen und somit gefährdete Bereiche teilweise oder vollständig verfärben kann, ist es besser, das Herz mit einem druckgesteuerten System wie dem Langendorff-Gerät oder einer vereinfachten Version einer mit einem hydrostatischen Drucksystem ausgestatteten Spritze oder Pumpe zu durchbluten. Kontrollierte Perfusion sorgt für physiologischen Druck, und der Farbstoff dringt normalerweise nicht in die verschlossene Region des Herzens ein. Sowohl Strömungsgeschwindigkeits- als auch druckgesteuerte Techniken sind Schutzmaßnahmen gegen Überfärbung.
Einer der schwerwiegendsten Fehler bei der lebensfähigen Gewebeverarbeitung besteht darin, das Gewebe vor dem Färben längere Zeit in einem Gefrierschrank aufzubewahren. Das Einfrieren wird hauptsächlich verwendet, weil Forscher am Tag nach dem IR-Experiment oder später eine Herzfärbung durchführen möchten. Darüber hinaus wird das Einfrieren verwendet, um das Schneiden des Herzens zu erleichtern. Wir fanden heraus, dass ein kurzzeitiges Einfrieren des Herzens für bis zu 5-10 Minuten die Integrität des Herzgewebes vernachlässigbar beeinträchtigt und das Schneiden des Gewebes (insbesondere bei Mausherzen) in dünne Scheiben erleichtert. Das Einfrieren über einen längeren Zeitraum schädigt jedoch die Membranen und verringert die Zelllebensfähigkeit und die mitochondriale Funktion13. Infolgedessen ist die TTC-Färbung der funktionierenden Mitochondrien betroffen, und die Grenze zwischen nekrotischem und lebensfähigem Gewebe ist schlecht abgegrenzt (verschwommen). Insgesamt sollte das Einfrieren von Rattenharts vermieden werden, und nur ein kurzfristiges Einfrieren von Mäuseherzen kann zum leichteren Schneiden verwendet werden.
Der nächste Schritt ist die Gewebefärbung in 1% iger TTC-Lösung bei 37 °C14. Die Färbelösung sollte vorgewärmt werden - besonders wichtig für die Färbung von Gehirnschnitten. Bei Verwendung der vorgewärmten Lösung beträgt die optimale Färbezeit für Herzscheiben 10 min. Eine längere Inkubation oder eine Temperatur über 37 °C führt zu einer braunen Färbung des Herzgewebes. Die richtige Färbung der Proben und die gleichbleibende Intensität der roten Farbe sind wichtig für die weitere Bildanalyse. In den letzten Schritten vor dem Fotografieren werden die Gewebescheiben 2-3 Mal mit kaltem PBS oder einem ähnlichen Puffer gespült, um TTC und überschüssiges Methylenblau aus der Lösung zu entfernen, um Blauguss auf dem Foto zu vermeiden. Herzscheiben sollten kurz nach dem Färben fotografiert werden, um die beste Bildqualität zu erhalten. Die Herzverfärbung bleibt von guter Qualität, wenn sie bis zu 60 Minuten in der kalten (+4 °C) PBS gelagert wird. Gefärbte Hirnschnitte und Aortengewebe werden normalerweise in einer 4% neutralen Formaldehydlösung gelagert und behalten eine Woche lang eine gute Qualität. Die Nachtlagerung von Hirngewebe in Formalin (+4 °C) beeinträchtigt die Farbintensität von normalem Gewebe nicht und ist für die Bildaufnahme akzeptabel. Formalin induziert jedoch Schwellungen und Färbungen von Herzschnitten. Daher wird die Lagerung von Herzgewebe in Formalin nicht empfohlen.
Der nächste Schritt ist die Bildaufnahme. Viele Labore verwenden Flachbettscanner als Bilderfassungswerkzeug, von dem erwartet wird, dass es eine Digitalkamera und ein Beleuchtungssetup ersetzt. Wir haben festgestellt, dass das Scannen von Scheiben keine ausreichende Bildauflösung und Farbtrennung bietet und daher nicht für die Abbildung von Herzschnitten geeignet ist. Insbesondere ist die Scannerauflösung für Mausherzen unzureichend, und wir haben eine schlechte Darstellung von Methylenblau festgestellt. Im Gegensatz dazu könnte ein Scanner eine Alternative zu einer Fotokamera sein, um Gehirnscheiben abzubilden, die nur mit TTC oder anderen Einzelfarbstoffen gefärbt sind. Für das Scannen von Gewebeschnitten ist eine Scan-Software unerlässlich, die konstante Belichtungseinstellungen gewährleistet. Insgesamt ist ein Flachbettscanner weniger leistungsfähig und kann eine Digitalkamera für die meisten Bildgebungsanwendungen nicht ersetzen.
Der Hintergrund hinter den Proben ist ebenfalls wichtig. Idealerweise sollte der Boden des Tabletts eine Farbe haben, die in der gefärbten Probe nicht vorhanden ist. Um beispielsweise den Bereich der Methylenblau- und TTC-Färbung (rot) auf automatisierte oder halbautomatische Weise zu quantifizieren, sollten weiße, rote, blaue, gelbe und braune Hintergründe vermieden werden. Daher wäre ein grüner Hintergrund vorzuziehen. Dennoch hängt die Farbauswahl von den Vorlieben des Bedieners ab, der das Bild nachbearbeitet. Viele Wissenschaftler bevorzugen einen weißen Hintergrund, da ein weißer Hintergrund in der Bildnachbearbeitung gelöscht und in vollständig weiß umgewandelt werden kann (RGB-Weißcode 255.255.255). Dann sollte man vollständig Weiß aus der Liste der ausgewählten Farben ausschließen, die für die halbautomatische Analyse verwendet werden, und nur blasse nekrotische Bereiche zählen, die nicht vollständig weiß, wenn nicht überbelichtet sind. Blaue und grüne Hintergründe eignen sich für die Fotografie von Hirnschnitten und Aorten.
Das optimale Bildgebungswerkzeug für die Tissuefotografie ist eine spiegelreflexartige oder spiegellose Digitalkamera mit Wechselobjektiv und einem kompatiblen Makroobjektiv. Um sehr kleine Objekte zu erfassen, ist möglicherweise eine Kombination aus einer Kamera und einem Mikroskop erforderlich. Dennoch verfügt ein Makroobjektiv in der Regel über eine ausreichende (mindestens 1:2) Vergrößerung, um detaillierte Bilder eines Mausherzens zu erhalten. Viele Hersteller bieten erschwingliche Digitalkameras und Makroobjektive an, um hochauflösende und stark vergrößerte Fotos zu erhalten. Alle modernen Digitalkameras verfügen über Eigenschaften und Funktionen, die für die Makrofotografie erforderlich sind, einschließlich der Möglichkeit, auf einem Ständer zu montieren, einer hohen Anzahl von Pixeln (normalerweise >20 Mpx), Live-View, Spiegelverriegelung, Zeitrafferfunktionen, Fernauslöser und der Möglichkeit, Kameraparameter manuell einzustellen, wodurch eine konstante Verschlusszeit, Blende, Weißabgleich und ISO-Einstellung gewährleistet werden. Kompaktkameras mit den oben genannten Eigenschaften und einer Objektivvergrößerung von mindestens 1:2 können auch für die Makrofotografie verwendet werden. Aufgrund der Objektiveigenschaften sollten einige Kompaktkameras in unmittelbarer Nähe des Objekts platziert werden, und der Experimentator muss sicherstellen, dass das Kameragehäuse die Beleuchtung der Probe nicht beeinträchtigt.
Für Makrofotografie mit jeder Art von Wechselobjektivkamera ist ein Makroobjektiv mit hoher Vergrößerung (1:1-1:2) erforderlich. Wir empfehlen die Verwendung von Makroobjektiven mit einer Brennweite von 50 mm bis 100 (120) mm oder gleichwertig auf dem Vollformatsensor (24 mm x 36 mm). Kleinere Sensorkameras haben unterschiedliche Sensorgrößen, und die Vergrößerung sollte entsprechend neu berechnet werden. Für das Fotografieren von Herzscheiben beträgt ein ergonomischer Abstand des 100 mm Makroobjektiv-Frontelements zum Motiv ca. 150 mm. Diese Einstellung ermöglicht es dem Bediener, die gesamte Ausrüstung auf einem Tisch zu halten, mit einfachem Zugriff auf die Kamerasteuerung. Ein 50-mm-Makroobjektiv könnte für die Fotografie größerer Objekte wie Gehirnschnitte in Betracht gezogen werden, da ein breiteres Sichtfeld erforderlich ist, um alle Scheiben in einem einzigen Foto zu erhalten.
Um scharfe Bilder mit hoher Auflösung zu erhalten, sollte eine Kamera auf einem stabilen Ständer montiert werden, der zusammen mit einem Lichtaufbau als Fotokopierständer bezeichnet wird. Die Montage der Kamera auf einem Ständer und einem ferngesteuerten (kabelgebundenen oder drahtlosen) Auslöser eliminiert Verwacklungen der Kamera und sorgt für einen konstanten Abstand zum Ziel. Ein Kamerabeleuchtungsaufbau mit zwei Konstantlichtquellen von beiden Seiten, die etwa um 30-60° relativ zur Motivebene geneigt sind, sorgt für eine ausreichende Ausleuchtung der Proben und hilft, Reflexionen gleichzeitig zu vermeiden. Die Kamera sollte präzise montiert werden, damit sich der Sensor parallel zur Motivebene befindet. Um das Bildfeld gleichmäßig auszuleuchten, sollten beide Lampen gleichmäßig ausgerichtet und im gleichen Abstand zum Motiv platziert werden. Lichtquellen, die in verschiedenen Abständen vom Motiv platziert sind, verursachen eine ungleichmäßige Beleuchtung. Darüber hinaus sind blinkende Lichtquellen ein Grund für Variationen in der Bildbelichtung. Insgesamt ist es wichtig, die Kamera und die Lichtquellen genau zu platzieren, um Bilder von gut ausgeleuchteten Proben präzise aufzunehmen.
Gewebeproben reflektieren Licht (Glitzern), das als weiße Flecken in den Bildern erscheint. Diese Lichtreflexionsflecken enthalten keine nützlichen Farbinformationen, und dementsprechend können diese Teile der Bilder nicht für eine genaue quantitative Analyse von Bildern verwendet werden. Lichtreflexionen von Gewebeschnitten können mit verschiedenen Methoden entfernt werden. Am effizientesten ist das vollständige Eintauchen von Gewebeproben in einen Behälter mit einer Kochsalzlösung oder PBS-Lösung. Ein ähnlicher Ansatz ist das Einführen von Gewebescheiben unter (oder zwischen) Glasplatten. Diese Methode ist effizient gegen Reflexionen; Die Bildauflösung kann jedoch niedriger sein als die von Fotos von eingetauchtem Gewebe.
Man kann auch einen Polarisationsfilter verwenden, der auf einer Linse montiert ist, um Lichtreflexionen zu eliminieren. Zirkular polarisierende Filter sind weit verbreitet, variieren aber je nach Preis erheblich in der Qualität, und billige Filter können die Bildauflösung erheblich reduzieren. Reflektiertes Licht kann abgefiltert werden, indem der bewegliche Teil des Polarisationsfilters in einem Winkel gedreht wird. Die Wirksamkeit des Polarisationsfilters kann durch einige Lichtquellen (z. B. starkes LED-Licht) beeinflusst werden. Insgesamt kann ein Polarisationsfilter nach Entfernung von zusätzlicher Flüssigkeit alle Reflexionen aus den Gehirnscheiben entfernen; Das Eintauchen in Proben in die Pufferlösung ist jedoch der einfachste und kostengünstigste Ansatz für Herzschnitte.
Manuelle Einstellungen der Verschlusszeit, Blende, ISO und des Weißabgleichs sind wichtig, um die volle Kontrolle über den Bildgebungsprozess zu behalten. Die Probe, der Hintergrund und die Eigenschaften der Lichtquelle beeinflussen das Belichtungsmesssystem der Kamera in automatischen Einstellungen. Daher sind manuelle Einstellungen erforderlich, um während des Experiments eine konstante Belichtung und einen konstanten Weißabgleich zwischen mehreren Fotos aufrechtzuerhalten. Für die Makrofotografie liegt die empfohlene Blendeneinstellung zwischen f/8 und f/16. Durch die Verringerung der Blende erhöht sich die Schärfentiefe, was hilfreich ist, wenn sich das Objekt nicht in einer einzigen Ebene befindet. Die Beugung begrenzt jedoch die Gesamtauflösung der Fotografie bei kleineren Blenden. Die optimale Blende für die meisten Objektive ist normalerweise f/10, da in dieser Einstellung der Auflösungsabfall vernachlässigbar ist und die Schärfentiefe ausreichend ist. ISO-Werte im Bereich von 50 bis 400 (niedriger ist besser) sind in der Regel optimal, um Bildartefakte (Rauschen) zu minimieren. Die Verschlusszeit muss dann geändert werden, um eine korrekte Belichtung mit den genannten Blenden- und ISO-Einstellungen bei vorhandenen Lichtverhältnissen zu erhalten. Manuelle Einstellungen sind wichtig für eine konsistente Bildanalyse. Die standardisierte Bildgebung stellt sicher, dass in jeder Studie die gleichen Farbschwellenwerteinstellungen verwendet werden, was eine Segmentierungsanalyse erfordert. Zum Beispiel kann eine halbautomatische Analyse durch die ImagePro-Software, die auf einer Segmentierungsdatei mit vordefinierten Farben Blau, Rot und Weiß (+blassrosa) basiert, im Laufe der Jahre verwendet werden, wenn Probenbilder konsistente Farben, Weißabgleich und Belichtung aufweisen.
Die Weißabgleicheinstellung sollte in Abhängigkeit von der Farbtemperatur der Lichtquelle angepasst werden, die zur Beleuchtung einer Probe verwendet wird. Der Weißabgleich kann aus den in die Kamera integrierten Voreinstellungen oder über die manuelle Kalibrierung eines grauen Ziels ausgewählt werden. Der Vorteil der Bilderfassung im RAW-Format besteht darin, dass der Weißabgleich während der Software-Nachbearbeitung des Bildes angepasst werden kann. Da RAW-Dateien viel mehr Informationen enthalten als JPEG-Dateien, bietet die Nachbearbeitung von RAW-Dateien eine hervorragende Möglichkeit, die Farbbalance und -belichtung zu korrigieren und eine bessere Bildauflösung zu erzielen. Da die meisten Kameras JPEG- und RAW-Dateien gleichzeitig aufnehmen können, empfehlen wir, die RAW-Datei zu erfassen und als Backup zu speichern.
Insgesamt beschreibt dieses Protokoll eine Methodik für das Schneiden und Färben von Herz- und Hirngewebe von Ratten und bietet Richtlinien für die Etablierung von Beleuchtungs- und Kameraeinstellungen sowie Fototechniken für die hochauflösende Bildaufnahme zur weiteren Analyse. Diese Methode ist auf alle experimentellen Kleintierorganfotografien anwendbar.
Disclosures
Die Autoren erklären, dass sie keine Interessenkonflikte haben.
Acknowledgments
Die Autoren wurden vom Forschungs- und Innovationsprogramm Horizon 2020 der Europäischen Union im Rahmen der Finanzhilfevereinbarung Nr. 857394, Projekt FAT4BRAIN, unterstützt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 mL syringe | Sagimed | N/A | |
| 2,3,5-Triphenyltetrazolium chloride (TTC) | Sigma-Aldrich | 298-96-4 | |
| 5 mL syringe | Sagimed | N/A | |
| 50 mL syringe | Terumo | N/A | |
| Adult Rat Brain Slicer Matrix | Zivic Instruments | BSRAS001-1 | |
| Aortic cannula for mouse heart | ADInstruments | SP3787 | |
| Aortic cannula for rat heart | ADInstruments | SP3786 | |
| Calcium chloride dihydrate, ≥99% | Acros Organics | 207780010 | |
| Cover Glass Forceps, Angled | Fine Science Tools | 11073-10 | |
| Hemostatic forceps | Agnthos | 13008-12 | |
| Hoya 62 mm alpha Circular Polarizer Filter | Hoya | HOCPA62 | |
| Magnesium chloride hexahydrate | Penta | 16330-31000 | |
| Methylene Blue | SigmaAldrich | M9140 | |
| Mouse Heart Slicer Matrix | Zivic Instruments | HSMS005-1 | |
| Polyethylene plastic tubing | BD Intramedic | N/A | |
| Potassium chloride for biochemistry | Acros Organics | 418205000 | |
| Potassium phosphate, monobasic, ≥99% | Acros Organics | 205920025 | |
| Rat Heart Slicer Matrix | Zivic Instruments | HSRS001-1 | |
| Scissors curved with blunt ends | Agnthos | 14013-15 | |
| Scissors for cleaning heart | Agnthos | 14058-11 | |
| Single Edge Razor Blades | Zivic Instruments | BLADE012.1 | |
| Sodium bicarbonate for biochemistry, 99.5% | Acros Organics | 447100010 | |
| Sodium chloride | Fisher bioreagents | BP358-10 | |
| Sony Alpha a6000 Mirrorless Digital Camera | Sony | ILCE6000 | Can be repalaced by any up-to-date digiatal camera |
| Sony FE 90 mm F/ 2.8 Macro G OSS | Sony | SEL90M28G | Important, lens should be compatible with camera |
| Sony SF32UZ SDHC 32 GB Class 10 UHS | Sony | 2190246141 | |
| Surgical blade | Heinz Herenz Hamburg Germany | BS2982 | |
| Thermo-Shaker | BioSan | PST-60HL-4 | |
| Toothed tissue forceps | Agnthos | 11021-12 | |
| Toothed tissue forceps for cleaning heart | Agnthos | 11023-10 | |
| Weigh tray, 70 mL | Sarsted | 71,99,23,212 |
References
- Bell, R. M., Mocanu, M. M., Yellon, D. M. Retrograde heart perfusion: the Langendorff technique of isolated heart perfusion. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 50 (6), 940-950 (2011).
- Botker, H. E., et al. Practical guidelines for rigor and reproducibility in preclinical and clinical studies on cardioprotection. Basic Research in Cardiology. 113 (5), 39 (2018).
- Uluc, K., Miranpuri, A., Kujoth, G. C., Akture, E., Baskaya, M. K. Focal cerebral ischemia model by endovascular suture occlusion of the middle cerebral artery in the rat. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (48), e1978 (2011).
- Zvejniece, L., Svalbe, B., Liepinsh, E., Pulks, E., Dambrova, M. The sensorimotor and cognitive deficits in rats following 90- and 120-min transient occlusion of the middle cerebral artery. Journal of Neuroscience Methods. 208 (2), 197-204 (2012).
- Liepinsh, E., Kuka, J., Dambrova, M. Troubleshooting digital macro photography for image acquisition and the analysis of biological samples. Journal of Pharmacological and Toxicological Methods. 67 (2), 98-106 (2013).
- Kolwicz, S. C., Tian, R. Assessment of cardiac function and energetics in isolated mouse hearts using 31P NMR spectroscopy. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (42), e2069 (2010).
- Herr, D. J., Aune, S. E., Menick, D. R. Induction and assessment of ischemia-reperfusion injury in Langendorff-perfused rat hearts. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (101), e52908 (2015).
- Liepinsh, E., et al. Inhibition of L-carnitine biosynthesis and transport by methyl-gamma-butyrobetaine decreases fatty acid oxidation and protects against myocardial infarction. British Journal of Pharmacology. 172 (5), 1319-1332 (2015).
- Nakamura, K., Al-Ruzzeh, S., Ilsley, C., Yacoub, M. H., Amrani, M. Acute effect of cerivastatin on cardiac regional ischemia in a rat model mimicking off-pump coronary surgery. Journal of Cardiac Surgery. 20 (6), 507-511 (2005).
- Li, Q., Morrison, M. S., Lim, H. W. Using a cardiac anchor to refine myocardial infarction surgery in the rat. Lab Animal. 39 (10), 313-317 (2010).
- Wu, Y., Yin, X., Wijaya, C., Huang, M. H., McConnell, B. K.
- Vavers, E., et al. The neuroprotective effects of R-phenibut after focal cerebral ischemia. Pharmacological Research. 113, Pt B 796-801 (2016).
- Acin-Perez, R., et al. A novel approach to measure mitochondrial respiration in frozen biological samples. EMBO Journal. 39 (13), 104073 (2020).
- Kloner, R. A., Darsee, J. R., DeBoer, L. W., Carlson, N. Early pathologic detection of acute myocardial infarction. Archives of Pathology & Laboratory Medicine. 105 (8), 403-406 (1981).
