Summary
Présenté ici est un protocole pour la méthodologie normalisée de la préparation de tissus de rongeurs après l’expérience d’ischémie-reperfusion et des lignes directrices pour établir des configurations d’éclairage et de caméra pour l’acquisition d’images à haute résolution. Cette méthode est applicable à toutes les photographies expérimentales d’organes de petits animaux.
Abstract
La macrophotographie est applicable à l’imagerie de divers échantillons de tissus à fort grossissement afin d’effectuer des analyses qualitatives et quantitatives. La préparation des tissus et la capture d’image subséquente sont des étapes effectuées immédiatement après l’expérience d’ischémie-reperfusion (IR) et doivent être effectuées en temps opportun et avec les soins appropriés. Pour l’évaluation des dommages induits par les infrarouges dans le cœur et le cerveau, cet article décrit une coloration à base de chlorure de 2,3,5-triphényl-2H-tétrazolium (TTC) suivie d’une macrophotographie. La macrophotographie scientifique nécessite un éclairage contrôlé et une configuration d’imagerie appropriée. La méthodologie standardisée garantit des images numériques détaillées et de haute qualité, même si une combinaison d’un appareil photo numérique peu coûteux et à jour et d’un objectif macro est utilisée. Les techniques appropriées et les erreurs potentielles dans la préparation et l’acquisition d’images sont discutées, et des exemples de l’influence de configurations correctes et incorrectes sur la qualité de l’image sont fournis. Des conseils spécifiques sont fournis sur la façon d’éviter les erreurs courantes, telles que la surcharge, le stockage inapproprié des échantillons et les conditions d’éclairage sous-optimales. Cet article montre la méthodologie appropriée pour le tranchage et la coloration des tissus cardiaques et cérébraux de rats et fournit des lignes directrices pour établir des configurations d’éclairage et de caméra et des techniques de photographie pour l’acquisition d’images haute résolution.
Introduction
Pendant des décennies, la photographie et l’analyse de spécimens de tissus cardiaques et cérébraux ont été une partie importante des expériences en sciences de la vie. Les progrès de la science et de l’innovation conduisent au développement de microscopes coûteux capables de superrésolution. Les photomicrographies sont obtenues dans un environnement lumineux bien contrôlé en suivant des instructions détaillées. En revanche, la macrophotographie (à un grossissement de 1:2 ou plus) est souvent effectuée dans un environnement lumineux incontrôlé à l’aide de configurations d’imagerie inappropriées. Souvent, les techniques de préparation des échantillons et de configuration de la caméra doivent être considérablement optimisées. En conséquence, des photographies macro de qualité limitée ont été largement publiées dans des revues scientifiques. Une résolution d’image et un contraste insuffisants limitent les possibilités de quantification précise de l’image dans les études IR.
Les procédures expérimentales des infarctus du myocarde1,2 et du cerveau3,4 ont été décrites en détail. Le but de cette étude est de fournir un guide étape par étape sur la façon de mettre en place un système de photographie et d’analyse standardisée des échantillons de tissus cardiaques et cérébraux de rongeurs après des expériences d’infarctus. Cela comprend le tranchage des tissus, la coloration et la macrophotographie d’échantillons de cœur et de cerveau. La préparation d’échantillons de tissus est une partie essentielle de l’expérience, et les résultats de l’analyse d’image planimétrique dépendent fortement de la qualité des images obtenues5.
Ces méthodes sont particulièrement utiles pour effectuer des mesures et des analyses planimétriques d’images dans les tissus de rongeurs et pourraient être utiles pour la macrophotographie scientifique générale. De plus, la haute qualité et la cohérence des images permettent d’effectuer une analyse automatisée des photographies numériques, ce qui permet de gagner du temps, d’éviter les entrées de l’utilisateur et de minimiser le risque d’erreurs ou de biais lors de l’analyse d’images. Cela se traduira par la génération de données robustes et fiables et augmentera la traduction des découvertes précliniques en nouveaux traitements antiischémiques dans les cliniques.
Protocol
Les procédures expérimentales ont été effectuées conformément aux directives de la Communauté européenne et aux lois et politiques locales (directive 2010/63/UE), et toutes les procédures ont été approuvées par le Service alimentaire et vétérinaire de Riga, Lettonie.
1. Coloration et tranchage du cœur
REMARQUE: Les techniques décrites dans ce protocole peuvent être utilisées après des tests isolés de cœur de rat ou de souris perfusés par Langendorff6,7 et des tests in vivo de lésions cardiaques de rat IR8,9,10,11. Pour la coloration après un test de lésion IR in vivo, on suppose que le cœur est excisé, monté sur une canule et brièvement perfusé en mode de perfusion de Langendorff.
- Détachez la canule cardiaque de la seringue remplie de solution de Krebs-Henseleit et connectez-la à une seringue remplie d’une solution chaude (37 °C) de bleu de méthylène à 0,1 % dans une solution de Krebs-Henseleit. Utilisez une seringue de 5 mL pour les cœurs de rats et une seringue de 1 à 2 mL pour les cœurs de souris.
REMARQUE: Une alternative consiste à remplir l’appareil à pression ou à débit contrôlé (par exemple, Langendorff) avec une solution contenant du colorant bleu. Pendant la procédure de détachement et de montage, il est essentiel de ne pas laisser de bulles d’air dans la canule et de ne pas desserrer la suture utilisée pour la réocclusion de l’artère coronaire. - Perfuse également les cœurs de rats avec 4 mL de la solution de bleu de méthylène à un taux d’environ 4 mL / min et perfuser les cœurs de souris avec 1 mL de solution de bleu de méthylène à un taux d’environ 0,5-1 mL / min.
REMARQUE: D’après l’expérience, les deux techniques sont sûres et fournissent une coloration adéquate; cependant, l’utilisation d’une pompe à pression contrôlée / système de pression hydrostatique est une option plus longue mais plus sûre contre les dépassements de surface pour les scientifiques novices. - Débranchez la canule de la seringue et retirez le cœur de la canule.
- Enlever l’excès de bleu de méthylène en roulant doucement le cœur sur du papier de soie. Desserrez la ligature autour de l’artère coronaire en ouvrant la pince hémostatique et en retirant le tube en plastique de la suture chirurgicale seulement après avoir enlevé l’excès de bleu de méthylène.
REMARQUE: À ce stade, il est possible de placer le cœur de la souris dans un petit sac en plastique ou un microtube centrifuge de 5 mL au congélateur (-20 ° C) jusqu’à 5-10 min. Le temps de congélation maximal doit être déterminé expérimentalement dans chaque laboratoire. La congélation à court terme d’un cœur de souris peut aider un expérimentateur novice à le couper en tranches de 1 mm d’épaisseur. La congélation des cœurs de rat n’est pas recommandée. Le dégel de plus de 10 min à -20 °C doit être évité. - Placez le cœur de rat taché dans une matrice en acier inoxydable (voir le tableau des matériaux) pour le tranchage du cœur (Figure 1A). Ensuite, coupez les ventricules du cœur en tranches de 2 mm d’épaisseur (visez 6 à 7 tranches d’un cœur de rat adulte). Pour les cœurs de souris, coupez les ventricules du cœur en tranches de 1,5 mm d’épaisseur (visez au moins 4 tranches d’un cœur de souris adulte).
REMARQUE: Des lames de rasoir compatibles avec la matrice de tranchage doivent être utilisées. En général, des lames de rasoir à un seul tranchant compatibles (par exemple, une épaisseur allant jusqu’à 0,01 pouce (0,254 mm)) peuvent être utilisées pour trancher des cœurs de rat. Les lames de rasoir à double tranchant sont généralement utilisées pour les cœurs de souris et ont généralement jusqu’à 0,004 pouce (0,1 mm) d’épaisseur.
Figure 1 : Matrices pour le découpage du cœur et du cerveau du rat. (A) Cœur de rat, (B) cerveau de rat. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
- Après la coupe, transférer les tranches dans un tube en plastique de 15 mL. Ajouter 5 mL de chlorure de triphényltétrazolium (TTC) à 1 % dissous dans une solution saline tamponnée au phosphate (PBS) dans le tube avec les tranches de cœur, et incuber pendant 10 min au bain-marie à 37 °C.
- Après l’incubation dans une solution de TTC, lavez les tranches de cœur au moins 2 à 3 fois avec pbS et préparez-vous à la capture d’images.
2. Coloration et tranchage du cerveau
- Après l’expérience d’occlusion de l’artère cérébrale moyenne3,12, retirez le cerveau, y compris le tronc cérébral, du crâne et lavez-le dans du PBS glacé.
- Choisissez la bonne taille de la matrice cérébrale en acier inoxydable (voir le tableau des matériaux) en fonction du poids des animaux (Figure 1B). Placez le cerveau avec son côté ventral vers le haut dans la matrice cérébrale.
REMARQUE: Lorsqu’il est assis dans la matrice, la surface ventrale du cerveau doit être parallèle à la surface supérieure du moule. - À l’aide de lames, limitez les parties frontale et caudale (2 lames des deux côtés) du cerveau.
REMARQUE: Des lames de rasoir compatibles avec la matrice de tranchage doivent être utilisées. En général, une lame de rasoir compatible à un seul tranchant (épaisseur allant jusqu’à 0,01 pouce (0,254 mm)) peut être utilisée pour le tranchage du cerveau de rat. - Placez les lames partiellement (ne coupant pas complètement le cerveau) dans les canaux entre la première et la dernière lame. Lorsque toutes les lames sont insérées et disposées en parallèle, appuyez sur toutes les lames avec la paume en même temps pour couper le cerveau en tranches coronales de 2 mm.
- Saisissez fermement les lames le long des côtés avec deux doigts et retirez-les avec le cerveau tranché de la matrice.
- Disposer les tranches de cerveau une par une dans un plateau (70 mL, 72 x 72 mm). Lors de la disposition des tranches, assurez-vous que la surface antérieure de chaque tranche est toujours tournée vers le haut.
- Versez la solution chaude (+37 °C) de TTC à 1 % dans du PBS sur les tranches de cerveau et incubez-les pendant 8 min à 37 °C dans l’obscurité.
REMARQUE: Les tranches de cerveau doivent être complètement immergées dans une solution de TTC pendant l’incubation. - Après l’incubation dans une solution de TTC à 1%, transférez les tranches de cerveau dans le plateau en plastique bleu pour capturer des images. Organisez les tranches de cerveau dans l’ordre séquentiel de la partie frontale à la partie caudale et utilisez un scalpel pour séparer les hémisphères dans le plan sagittal.
REMARQUE: La surface du plateau doit être lavable, mate et d’une couleur qui contraste avec les tranches de cerveau (c’est-à-dire pas rouge, blanc ou rose pâle).
3. Macro photographie
- Photographiez les tranches de tissu immédiatement après la coloration.
REMARQUE: Les tranches de cœur peuvent être conservées dans du PBS froid (à +4 ° C) ou une solution de formol jusqu’à 30 min. Les tranches de cerveau peuvent être stockées dans le formol pendant une période prolongée (1-2 semaines). - Configurez l’appareil photo de votre choix avec une batterie chargée, une carte mémoire et un objectif connecté sur un support (Figure 2)
REMARQUE: Allumez les lumières au moins 5 à 10 minutes avant l’acquisition de l’image pour réchauffer l’équipement. Les lumières LED atteignent leur pleine luminosité en microsecondes.
Figure 2 : Appareil photo et lumières configurés pour la photographie macro. La caméra est perpendiculaire à la surface d’imagerie pour s’assurer que le plan focal de la caméra est parallèle aux échantillons. Abréviation : LED = diode électroluminescente. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
- En fonction des sources lumineuses disponibles, sélectionnez les paramètres de balance des blancs appropriés ou effectuez l’étalonnage de la température de couleur conformément aux instructions du manuel de l’appareil photo.
REMARQUE: La lumière LED blanche (température de couleur 6 500 K) est la source de lumière préférée pour éviter le scintillement de la lumière par les ampoules fluorescentes. - Basculez l’appareil photo en mode entièrement manuel, réglez l’ISO 100 et l’ouverture sur f/10 et ajustez la vitesse d’obturation pour une exposition optimale de l’image. Assurez-vous que le plan focal de la caméra est parallèle à la surface où l’échantillon sera placé.
REMARQUE: La fonction d’histogramme est utile pour s’assurer que les tranches de tissu ne sont pas surexposées. - Fixez ou activez un déclencheur à distance filaire ou sans fil pour empêcher le tremblement de l’appareil photo lorsque l’obturateur est relâché.
REMARQUE: Une alternative consiste à activer une fonction d’obturation retardée, ce qui retardera la gâchette de 2 ou 10 s après avoir appuyé sur le bouton de déclenchement. - Immergez complètement les tranches de cœur dans un récipient avec PBS.
REMARQUE: Les toboggans immergés ont tendance à flotter loin de leur position. Pour minimiser le flottement des tranches, utilisez le plus petit plateau possible dans lequel toutes les tranches peuvent tenir et la quantité minimale de solution d’immersion, en veillant à ce que l’échantillon soit complètement immergé. D’autres méthodes incluent le placement des tranches entre les lames de verre ou l’utilisation d’un filtre polarisant sur la lentille. Un filtre polarisant circulaire est fixé à l’objectif et pivoté jusqu’à ce que les reflets dans un affichage en direct de la caméra disparaissent. - Disposez les tranches de cerveau dans un plateau sec sans PBS ni autres liquides.
REMARQUE: Un filtre polarisant est très pratique pour capturer des images de tranches de cerveau. - Placez le récipient avec des tranches sous l’appareil photo avec l’objectif macro et assurez-vous que toutes les tranches s’adaptent parfaitement au champ de vision. Assurez-vous que les tranches sont sur le même plan, c’est-à-dire qu’elles ne sont ni courbées ni roulées.
- Vérifiez l’exposition et ajustez les paramètres de l’appareil photo si nécessaire.
REMARQUE: Une fois réglé, ne modifiez pas l’exposition et les autres paramètres pendant toute l’expérience. - Capturez le numéro (ou toute autre identification) de l’échantillon et imagez la tranche de tissu à l’aide d’un déclencheur à distance.
REMARQUE: Un marqueur de taille, tel qu’une règle de mm, doit être inclus dans le champ de vision lorsque la quantification absolue de la taille de l’échantillon est nécessaire. - Faites pivoter les tranches et capturez leurs images de l’autre côté.
Representative Results
La figure 3A est une photographie d’une tranche cardiaque colorée au bleu de méthylène et au TTC après un infarctus du myocarde, qui contient suffisamment de détails et d’informations sur la couleur pour une analyse planimétrique plus approfondie de la taille de l’infarctus (figure 3B). Nous avons testé comment la congélation du cœur pendant 24 heures affecte l’intégrité des tissus cardiaques (Figure 3C). La congélation pendant une période prolongée (>1 h, figure 3C) réduit la fonction mitochondriale; ainsi, la coloration du cœur par TTC n’est pas rouge mais rose pâle, et la frontière entre les tissus nécrotiques et viables est floue (figure 3C).
En outre, deux méthodes ont été comparées pour la réduction des réflexions dans les échantillons. L’immersion est la méthode la plus efficace et produit des images détaillées avec un bon contraste (Figure 4A). La deuxième méthode consiste à utiliser un filtre polarisant fixé à la lentille. Le filtre polarisant est également efficace; cependant, le filtre réduit légèrement la résolution et le microcontraste de l’image (Figure 4B). Un exemple d’image d’une tranche de cœur sans immersion ni filtre (Figure 4C) contient de nombreuses réflexions et ne convient pas à une analyse plus approfondie.
Les tranches de cerveau ne sont pas immergées en raison de problèmes de gestion des tranches (flottantes). Dans l’analyse planimétrique, il est important de comparer le côté non affecté (sain) du cerveau (figure 5A) avec le côté affecté par l’AVC (figure 5B). Les tranches de cerveau sont plus faciles à gérer sur une plaque ou un plateau sec, et un filtre polarisant est utilisé pour éliminer les reflets. Un plateau avec fond bleu est utilisé pour la photographie de tranches de cerveau (sélection d’arrière-plan décrite précédemment5).
Les réglages manuels de l’appareil photo ont été utilisés pour assurer un contrôle total de l’exposition et de la balance des blancs. Les réglages de la caméra doivent être ajustés avant ou au début de l’expérience en fonction de la source lumineuse disponible. Cela garantit une exposition et une balance des blancs optimales de toutes les images pour permettre une analyse uniforme (Figure 6A). Les réglages automatiques de l’appareil photo ne sont pas parfaits et peuvent entraîner des paramètres variables de l’appareil photo, provoquant des résultats inappropriés et l’introduction d’une variabilité d’image à image.
La figure 6 montre des exemples d’images surexposées (figure 6B) et sous-exposées (figure 6C) de tranches de cœur. Une attention suffisante doit être accordée aux paramètres de balance des blancs corrects de l’appareil photo pour correspondre à une source lumineuse particulière utilisée dans la configuration de l’éclairage de l’appareil photo. Des réglages de balance des blancs incorrects peuvent entraîner un décalage vers le bleu ou le jaune (Figure 6D) et le magenta ou le vert (Figure 6E) dans l’image.
Figure 3 : Images de tranches cardiaques de rat. (A) Une tranche de cœur fraîche a été analysée dans le logiciel ImageProPlus 6.3 à l’aide de la segmentation des couleurs (B). (C) La coloration TTC fait une mauvaise distinction entre le tissu viable et le tissu nécrotique dans la tranche de cœur congelée (congelée pendant 24 h). Abréviation : TTC = chlorure de 2,3,5-triphényl-2H-tétrazolium. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 4 : Techniques de réduction des réflexions. Image de tranche de cœur de rat capturée immergée dans PBS (A) et utilisant un filtre polarisant (B). (C) Tranche de cœur avec reflets lorsque ni immersion ni filtre n’est utilisé. Abréviation = PBS = solution saline tamponnée au phosphate. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 5 : Images de tranches de cerveau de rat. Le cerveau du rat a été coupé en sept tranches et coloré avec TTC après ischémie-reperfusion. L’utilisation d’un filtre polarisant permet d’obtenir une image sans réflexion. (A) Tranches de l’hémisphère intact ; (B) Tranches de l’hémisphère affecté par l’AVC. Abréviation : TTC = chlorure de 2,3,5-triphényl-2H-tétrazolium. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 6 : Images de tranches de cœur de rat. Correctement (A) et incorrectement (B-E) capturé des images de tranches de cœur. Des paramètres d’exposition incorrects entraînent une surexposition (B) et une sous-exposition des images (C). Des réglages de balance des blancs incorrects entraînent une diffusion jaune (D) ou verte dans l’image (E). Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Discussion
La préparation du cœur après IR commence par la réocclusion des artères cardiaques sanguines et la perfusion de colorant bleu pour la discrimination des zones à risque des zones non à risque. Les colorants bleu méthylène ou bleu Evans sont les plus fréquemment utilisés à cette fin2. Comme une pression excessivement élevée peut endommager les valves cardiaques et, par conséquent, tacher partiellement ou complètement les zones à risque, il est préférable de perfuser le cœur avec un système à pression contrôlée, tel que l’appareil Langendorff ou une version simplifiée d’une seringue ou d’une pompe équipée d’un système de pression hydrostatique. La perfusion contrôlée assurera une pression physiologique et le colorant ne pénètre généralement pas dans la région occluse du cœur. Les techniques de contrôle de la vitesse d’écoulement et de la pression sont des mesures de protection contre les dépassements.
L’une des erreurs les plus graves dans le traitement des tissus viables est de garder les tissus dans un congélateur pendant une période prolongée avant de les tacher. La congélation est principalement utilisée parce que les chercheurs veulent effectuer une coloration cardiaque le lendemain de l’expérience IR ou plus tard. De plus, la congélation est utilisée pour faciliter la coupe du cœur. Nous avons constaté que la congélation à court terme du cœur jusqu’à 5-10 minutes affecte de manière négligeable l’intégrité des tissus cardiaques et facilite la coupe des tissus (en particulier pour les cœurs de souris) en fines tranches. Cependant, la congélation pendant des périodes prolongées endommage les membranes et diminue la viabilité cellulaire et la fonction mitochondriale13. En conséquence, la coloration TTC des mitochondries fonctionnelles est affectée et la frontière entre les tissus nécrotiques et viables est mal délimitée (floue). Dans l’ensemble, la congélation des cœurs de rat doit être évitée et seule la congélation à court terme des cœurs de souris peut être utilisée pour faciliter la coupe.
L’étape suivante consiste à colorer les tissus dans une solution de TTC à 1 % à 37 °C14. La solution de coloration doit être préavertée, ce qui est particulièrement important pour la coloration des tranches de cerveau. Lors de l’utilisation de la solution préavertée, le temps de coloration optimal pour les tranches de cœur est de 10 min. Une incubation plus longue ou une température supérieure à 37 °C entraîne une coloration brune des tissus cardiaques. Une coloration appropriée des échantillons et une intensité de couleur rouge constante sont importantes pour une analyse plus approfondie de l’image. Dans les dernières étapes avant la photographie, les tranches de tissu sont rincées 2 à 3 fois avec du PBS froid ou un tampon similaire pour éliminer le TTC et l’excès de bleu de méthylène de la solution afin d’éviter la coulée bleue sur la photographie. Les tranches de cœur doivent être photographiées peu de temps après la coloration pour obtenir la meilleure qualité d’image. La coloration cardiaque reste de bonne qualité si elle est conservée jusqu’à 60 min au froid (+4 °C) PBS. Les tranches de cerveau colorées et les tissus aortiques sont généralement stockés dans une solution de formaldéhyde neutre à 4% et conservent une bonne qualité pendant une semaine. Le stockage de nuit des tissus cérébraux dans du formol (+4 °C) n’altère pas l’intensité de couleur des tissus normaux et est acceptable pour l’acquisition d’images. Cependant, le formol induit un gonflement et une détérioration des tranches de cœur. Par conséquent, le stockage des tissus cardiaques dans le formol n’est pas recommandé.
L’étape suivante est l’acquisition d’images. De nombreux laboratoires utilisent des scanners à plat comme outil d’acquisition d’images qui devrait remplacer un appareil photo numérique et une configuration d’éclairage. Nous avons déterminé que la numérisation des tranches ne fournit pas une résolution d’image et une séparation des couleurs suffisantes et ne convient donc pas à l’imagerie des tranches cardiaques. En particulier, la résolution du scanner est insuffisante pour les cœurs de souris, et nous avons remarqué un mauvais rendu du bleu de méthylène. En revanche, un scanner pourrait être une alternative à un appareil photo pour imager des tranches de cerveau colorées uniquement avec du TTC ou d’autres colorants simples. Pour la numérisation des tranches de tissu, un logiciel de numérisation qui assure des réglages d’exposition constants est essentiel. Dans l’ensemble, un scanner à plat est moins performant et ne peut pas remplacer un appareil photo numérique pour la plupart des applications d’imagerie.
L’arrière-plan derrière les spécimens est également important. Idéalement, le fond du plateau devrait être d’une couleur qui n’est pas présente dans le spécimen taché. Par exemple, pour quantifier la zone de coloration au bleu de méthylène et au TTC (rouge) de manière automatisée ou semi-automatisée, les fonds blancs, rouges, bleus, jaunes et bruns doivent être évités. Ainsi, un fond vert serait préférable. Néanmoins, la sélection des couleurs dépend des préférences de l’opérateur, qui post-traite l’image. De nombreux scientifiques préfèrent un fond blanc car un fond blanc peut être supprimé dans le post-traitement de l’image et converti en blanc complet (code blanc RVB 255,255,255). Ensuite, il faut exclure complètement le blanc de la liste des couleurs sélectionnées utilisées pour l’analyse semi-automatisée et ne compter que les zones nécrotiques pâles, qui ne sont pas complètement blanches si elles ne sont pas surexposées. Les fonds bleus et verts conviennent à la photographie de tranches de cerveau et d’aortes.
L’outil d’imagerie optimal pour la photographie tissulaire est un appareil photo numérique reflex à objectif unique ou à objectif interchangeable sans miroir avec un objectif macro compatible. La capture de très petits objets peut nécessiter une combinaison d’une caméra et d’un microscope; néanmoins, un objectif macro a généralement un grossissement suffisant (au moins 1:2) pour obtenir des images détaillées d’un cœur de souris. De nombreux fabricants proposent des appareils photo numériques et des objectifs macro abordables pour obtenir des photographies haute résolution et à fort grossissement. Tous les appareils photo numériques à jour ont des caractéristiques et des fonctions nécessaires à la photographie macro, y compris la possibilité de monter sur un support, un nombre élevé de pixels (généralement >20 Mpx), la vue en direct, le verrouillage du miroir, les fonctions time-lapse, l’obturateur à distance et la possibilité de régler manuellement les paramètres de l’appareil photo, assurant ainsi une vitesse d’obturation constante, une ouverture, une balance des blancs et un réglage ISO. Les appareils photo compacts avec les caractéristiques mentionnées ci-dessus et un grossissement de l’objectif d’au moins 1: 2 peuvent également être utilisés pour la photographie macro. En raison des caractéristiques de l’objectif, certains appareils photo compacts doivent être placés à proximité de l’objet, et l’expérimentateur doit s’assurer que le boîtier de l’appareil photo n’affecte pas l’éclairage de l’échantillon.
Pour la photographie macro avec n’importe quel type d’appareil photo à objectif interchangeable, un objectif macro à fort grossissement (1:1-1:2) est requis. Nous vous suggérons d’utiliser des objectifs macro avec une distance focale allant de 50 mm à 100 (120) mm ou équivalent sur le capteur plein format (24 mm x 36 mm). Les caméras à capteur plus petites ont des tailles de capteur différentes et le grossissement doit être recalculé en conséquence. Pour la photographie de tranches de cœur, une distance ergonomique de l’élément avant de l’objectif macro de 100 mm par rapport au sujet est d’environ 150 mm. Ce réglage permet aux opérateurs de garder tout l’équipement sur une table, avec un accès facile aux commandes de la caméra. Un objectif macro de 50 mm peut être envisagé pour la photographie d’objets plus grands, tels que des tranches de cerveau, car un champ de vision plus large est nécessaire pour obtenir toutes les tranches d’une seule photographie.
Pour obtenir des images nettes avec une haute résolution, un appareil photo doit être monté sur un support robuste, qui, avec une configuration lumineuse, est appelé un support de copie de photographie. Le montage de la caméra sur un support et une gâchette à distance (filaire ou sans fil) élimine les tremblements de la caméra et assure une distance constante de la cible. Une configuration d’éclairage de caméra avec deux sources de lumière constante des deux côtés, inclinées d’environ 30 à 60 ° par rapport au plan du sujet, assure un éclairage suffisant des échantillons et permet d’éviter les reflets en même temps. La caméra doit être montée avec précision afin que le capteur soit parallèle au plan du sujet. Pour éclairer uniformément le champ d’image, les deux lampes doivent être également orientées et placées à la même distance du sujet. Les sources lumineuses placées à différentes distances du sujet provoquent un éclairage inégal. De plus, les sources de lumière clignotantes sont une raison des variations dans l’exposition de l’image. Dans l’ensemble, il est important de placer avec précision la caméra et les sources lumineuses pour acquérir avec précision des images de spécimens bien éclairés.
Les échantillons de tissus réfléchissent la lumière (scintillement), qui apparaissent sous forme de taches blanches dans les images. Ces taches de réflexion de la lumière ne contiennent pas d’informations de couleur utiles et, par conséquent, ces parties des images ne peuvent pas être utilisées pour une analyse quantitative précise des images. Les reflets lumineux des tranches de tissu peuvent être éliminés par diverses méthodes. Le plus efficace est l’immersion totale des échantillons de tissus dans un récipient contenant une solution saline ou PBS. Une approche similaire consiste à insérer des tranches de tissu sous (ou entre) des plaques de verre. Cette méthode est efficace contre les réflexions; cependant, la résolution de l’image peut être inférieure à celle des photographies de tissus immergés.
On peut également utiliser un filtre polarisant monté sur une lentille pour éliminer les reflets de lumière. Les filtres polarisants circulaires sont largement disponibles, mais leur qualité varie considérablement en fonction du prix, et les filtres bon marché peuvent réduire considérablement la résolution de l’image. La lumière réfléchie peut être filtrée en tournant la partie mobile du filtre polarisant à un angle. L’efficacité du filtre polarisant peut être affectée par certaines sources lumineuses (par exemple, une forte lumière LED). Dans l’ensemble, après élimination du liquide supplémentaire, un filtre polarisant peut éliminer toutes les réflexions des tranches de cerveau; cependant, l’immersion d’échantillons dans une solution tampon est l’approche la plus simple et la plus rentable pour les tranches de cœur.
Les réglages manuels de la vitesse d’obturation, de l’ouverture, de l’ISO et de la balance des blancs sont importants pour maintenir un contrôle total du processus d’imagerie. L’échantillon, l’arrière-plan et les caractéristiques de la source lumineuse influencent le système de mesure de l’exposition de la caméra dans les réglages automatiques; par conséquent, des réglages manuels sont nécessaires pour maintenir une exposition et une balance des blancs constantes entre plusieurs photographies au cours de l’expérience. Pour la macrophotographie, le réglage d’ouverture suggéré est compris entre f/8 et f/16. En diminuant l’ouverture, la profondeur de champ augmente, ce qui est utile si l’objet n’est pas dans un seul plan. Cependant, la diffraction limite la résolution totale de la photographie dans le cas d’ouvertures plus petites. L’ouverture optimale pour la plupart des objectifs est généralement f/10 car dans ce réglage, la baisse de résolution est négligeable et la profondeur de champ est suffisante. Les valeurs ISO qui vont de 50 à 400 (plus bas c’est mieux) sont généralement optimales pour minimiser les artefacts d’image (bruit). La vitesse d’obturation reste ensuite à modifier pour obtenir une exposition correcte en utilisant les réglages d’ouverture et ISO mentionnés dans les conditions d’éclairage existantes. Les réglages manuels sont importants pour une analyse d’image cohérente. L’imagerie standardisée garantit l’utilisation des mêmes paramètres de seuil de couleur tout au long de toute étude, ce qui nécessite une analyse de segmentation. Par exemple, l’analyse semi-automatisée par le logiciel ImagePro basée sur un fichier de segmentation avec des couleurs prédéfinies de bleu, rouge et blanc (+ rose pâle) peut être utilisée au fil des ans si les images d’échantillons ont des couleurs, une balance des blancs et une exposition cohérentes.
Le réglage de la balance des blancs doit être ajusté en fonction de la température de couleur de la source lumineuse utilisée pour éclairer un échantillon. La balance des blancs peut être sélectionnée à partir des préréglages intégrés de la caméra ou à l’aide de l’étalonnage manuel d’une cible grise. L’avantage de la capture d’image au format RAW est que la balance des blancs peut être ajustée pendant le post-traitement logiciel de l’image. Comme les fichiers RAW contiennent beaucoup plus d’informations que les fichiers JPEG, le post-traitement des fichiers RAW offre une excellente occasion de corriger la balance des couleurs et l’exposition, ainsi que d’obtenir une meilleure résolution d’image. Étant donné que la plupart des appareils photo peuvent capturer des fichiers JPEG et RAW simultanément, nous vous suggérons de capturer le fichier RAW et de l’enregistrer en tant que sauvegarde.
Dans l’ensemble, ce protocole décrit une méthodologie pour le tranchage et la coloration des tissus cardiaques et cérébraux de rats et fournit des lignes directrices pour établir des configurations d’éclairage et de caméra et des techniques de photographie pour l’acquisition d’images à haute résolution pour une analyse plus approfondie. Cette méthode est applicable à toutes les photographies expérimentales d’organes de petits animaux.
Disclosures
Les auteurs déclarent qu’ils n’ont aucun conflit d’intérêts.
Acknowledgments
Les auteurs ont été soutenus par le programme de recherche et d’innovation Horizon 2020 de l’Union européenne dans le cadre de la convention de subvention n° 857394, projet FAT4BRAIN.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 mL syringe | Sagimed | N/A | |
| 2,3,5-Triphenyltetrazolium chloride (TTC) | Sigma-Aldrich | 298-96-4 | |
| 5 mL syringe | Sagimed | N/A | |
| 50 mL syringe | Terumo | N/A | |
| Adult Rat Brain Slicer Matrix | Zivic Instruments | BSRAS001-1 | |
| Aortic cannula for mouse heart | ADInstruments | SP3787 | |
| Aortic cannula for rat heart | ADInstruments | SP3786 | |
| Calcium chloride dihydrate, ≥99% | Acros Organics | 207780010 | |
| Cover Glass Forceps, Angled | Fine Science Tools | 11073-10 | |
| Hemostatic forceps | Agnthos | 13008-12 | |
| Hoya 62 mm alpha Circular Polarizer Filter | Hoya | HOCPA62 | |
| Magnesium chloride hexahydrate | Penta | 16330-31000 | |
| Methylene Blue | SigmaAldrich | M9140 | |
| Mouse Heart Slicer Matrix | Zivic Instruments | HSMS005-1 | |
| Polyethylene plastic tubing | BD Intramedic | N/A | |
| Potassium chloride for biochemistry | Acros Organics | 418205000 | |
| Potassium phosphate, monobasic, ≥99% | Acros Organics | 205920025 | |
| Rat Heart Slicer Matrix | Zivic Instruments | HSRS001-1 | |
| Scissors curved with blunt ends | Agnthos | 14013-15 | |
| Scissors for cleaning heart | Agnthos | 14058-11 | |
| Single Edge Razor Blades | Zivic Instruments | BLADE012.1 | |
| Sodium bicarbonate for biochemistry, 99.5% | Acros Organics | 447100010 | |
| Sodium chloride | Fisher bioreagents | BP358-10 | |
| Sony Alpha a6000 Mirrorless Digital Camera | Sony | ILCE6000 | Can be repalaced by any up-to-date digiatal camera |
| Sony FE 90 mm F/ 2.8 Macro G OSS | Sony | SEL90M28G | Important, lens should be compatible with camera |
| Sony SF32UZ SDHC 32 GB Class 10 UHS | Sony | 2190246141 | |
| Surgical blade | Heinz Herenz Hamburg Germany | BS2982 | |
| Thermo-Shaker | BioSan | PST-60HL-4 | |
| Toothed tissue forceps | Agnthos | 11021-12 | |
| Toothed tissue forceps for cleaning heart | Agnthos | 11023-10 | |
| Weigh tray, 70 mL | Sarsted | 71,99,23,212 |
References
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