Summary
يحكم منظمو وظائف الخلايا الصباغية الاختلافات المرئية في نتيجة التصبغ. يشكل فك رموز الوظيفة الجزيئية لجين التصبغ المرشح تحديا. هنا ، نوضح استخدام نظام نموذج الزرد لتحديد المرشحين وتصنيفهم إلى منظمات لمحتوى الميلانين وعدد الخلايا الصباغية.
Abstract
الخلايا الصباغية هي خلايا متخصصة مشتقة من القمة العصبية موجودة في جلد البشرة. تقوم هذه الخلايا بتوليف صبغة الميلانين التي تحمي الجينوم من الأشعة فوق البنفسجية الضارة. تؤدي الاضطرابات في عمل الخلايا الصباغية إلى اضطرابات صباغية مثل piebaldism والمهق والبهاق والكلف وسرطان الجلد. الزرد هو نظام نموذجي ممتاز لفهم وظائف الخلايا الصباغية. إن وجود الخلايا الصباغية المصطبغة الواضحة ، وسهولة التلاعب الجيني ، وتوافر خطوط الفلورسنت المعدلة وراثيا يسهل دراسة التصبغ. تستخدم هذه الدراسة استخدام خطوط الزرد من النوع البري والمعدل وراثيا التي تدفع تعبير البروتين الفلوري الأخضر (GFP) تحت مروجي mitfa و tyrp1 التي تميز مراحل مختلفة من الخلايا الصباغية.
يتم تحقيق إسكات الجينات المرشحة على أساس المورفولينو لتقييم نتيجة النمط الظاهري على تصبغ اليرقات وينطبق على فحص منظمات التصبغ. يوضح هذا البروتوكول الطريقة من الحقن المجهري إلى التصوير والتشريح القائم على فرز الخلايا المنشط بالفلورة (FACS) للأنماط الظاهرية باستخدام جينين مرشحين ، الأنهيدراز الكربوني 14 (Ca14) ومتغير هيستون (H2afv) ، لتقييم شامل لنتائج التصبغ. علاوة على ذلك ، يوضح هذا البروتوكول فصل الجينات المرشحة إلى محددات الخلايا الصباغية والمتمايزة التي تغير بشكل انتقائي أعداد الخلايا الصباغية ومحتوى الميلانين لكل خلية ، على التوالي.
Introduction
في حين أن استخدام الميلانين للحماية من الضوء قد تطور عدة مرات في جميع أنحاء المملكة الحيوانية ، يبدو أن الفقاريات قد أتقنت العملية. يتم حفظ الخلايا المخصصة المنتجة للصبغة مع آلية متقنة لتجميع واحتواء الميلانين من الأسماك إلى البشر1. ومع ذلك ، فإن نتيجة التصبغ متنوعة بشكل كبير ، تتراوح في اللون إلى الارتداد وتظهر كأنماط حية على التكامل والجلد والشعر2. على الرغم من التنوع ، يتم الحفاظ على ذخيرة الجينات المشاركة في استجابة التصبغ بشكل لافت للنظر. تظل المكونات الأساسية لآلية تخليق الميلانين ، مثل إنزيمات تخليق الميلانين الرئيسية ، ومكونات الميلانوزومات ، والاتصال المنبع بمسار الإشارات ، متطابقة بشكل أساسي عبر الكائنات الحية. تؤدي الاختلافات الجينية الدقيقة إلى تغييرات جذرية في أنماط التصبغ التي لوحظت عبر الأنواع3. ومن ثم ، فإن النهج الجيني العكسي في كائن فقاري أدنى ، الزرد (Danio rerio) ، يوفر فرصة ممتازة لفك تشفير مشاركة الجينات في تقديم الحالة المصطبغة4.
تتطور أجنة الزرد من زيجوت مخصب وحيد الخلية إلى يرقة في غضون ~ 24 ساعة بعد الإخصاب (HPF) 5. ومن اللافت للنظر أن الخلايا المكافئة للخلايا الصباغية - الميلانوفور - هي خلايا كبيرة موجودة في الأدمة وتكون واضحة بسبب محتوى الميلانين الداكن6. تنبعث هذه الخلايا المشتقة من القمة العصبية ~ 11 hpf وتبدأ في الصباغ ~ 24 hpf 6,7. مكنت وحدات التعبير الجيني المحفوظة من تحديد العوامل الرئيسية التي تنظم وظائف الخلايا الصباغية وأدت إلى تطوير خطوط مراسل الفلورسنت المعدلة وراثيا Tg (sox10: GFP) و Tg (mitfa: GFP) و Tg (ftyrp1: GFP) 8،9،10 التي تسمي المراحل الانتقائية لتطور الخلايا الصباغية. يتيح استخدام خطوط الأسماك المعدلة وراثيا هذه استجواب بيولوجيا الخلية للخلايا الصباغية على المستوى العضوي في سياق الأنسجة مع الإشارات المناسبة وفقا للجداول الزمنية التنموية. يكمل هؤلاء المراسلون القياس الكمي القائم على الصباغ للخلايا الصباغية ويمكنون من إجراء تقييم متميز لأعداد الخلايا الصباغية بغض النظر عن محتوى الميلانين.
توفر هذه المقالة بروتوكولا مفصلا لفك رموز بيولوجيا الخلايا الصباغية من خلال تقييم معلمتين مهمتين ، وهما محتوى الميلانين وأرقام الخلايا الصباغية. في حين أن الأول هو قراءة وظيفية شائعة تنبع من استجابة نقص التصبغ ، فإن الأخير يرتبط بانخفاض في مواصفات الخلايا الصباغية أو بقائها وغالبا ما يرتبط بظروف إزالة التصبغ الوراثية أو المكتسبة. تتمثل الإستراتيجية العامة لهذا الفحص الجيني العكسي في إسكات جينات مختارة باستخدام مورفولينو والتحقيق في النتائج الخاصة بالخلايا الصباغية. يتم تحليل محتوى الميلانين باستخدام القياس الكمي القائم على الصور لمتوسط القيم الرمادية متبوعا بتأكيد باستخدام مقايسة محتوى الميلانين. يتم تحليل عدد الخلايا الصباغية في مراحل مختلفة من النضج باستخدام القياس الكمي القائم على الصور وتأكيده باستخدام تحليل FACS. هنا ، يتم عرض بروتوكول الفحص باستخدام جينين مرشحين ، وهما الأنهيدراز الكربوني 14 ، المتورط في تكوين الميلانين ، ومتغير هيستون H2AFZ.2 المتورط في مواصفات الخلايا الصباغية من سلائف القمة العصبية. في حين أن الأول يغير محتوى الميلانين وليس أعداد الخلايا الصباغية ، فإن الأخير يغير عدد الخلايا الصباغية المحددة ، وبالتالي محتوى الميلانين في الجنين. إجمالا ، توفر هذه الطريقة بروتوكولا مفصلا لتحديد دور الجين المرشح في التصبغ وتمييز دوره في التحكم في أعداد الخلايا الصباغية مقابل محتوى الميلانين.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
تم إجراء تجارب الزرد بما يتفق بدقة مع الموافقة المؤسسية لأخلاقيات الحيوان (IAEC) من CSIR-Institute of Genomics and Integrative Biology (IGIB) ، الهند (الاقتراح رقم 45 أ). بذلت كل الجهود لتقليل معاناة الحيوانات.
1. حقن المورفولينو في أجنة الزرد
- باستخدام مجتذب إبرة قياسي ، ارسم ماصات حادة جدا ومغلقة الرأس.
- قم بتحميل المحلول الذي يحتوي على مورفولينو في الماصات الدقيقة باستخدام طرف محمل دقيق وأدخله في جهاز الحاقن الدقيق. أحكم ربط المسمار بشكل صحيح لقفل الماصة الدقيقة.
ملاحظة: توحيد جرعة المورفولينوس ضروري. الجرعة المناسبة لديها معدل البقاء على قيد الحياة من >70 ٪ والنمط الظاهري المحدد في 24 hpf. - قطع طرف micropipette باستخدام ملقط دقيق ومعايرته11.
- للمعايرة ، قم بحقن حجم واحد من محلول المورفولينو في الأنبوب الشعري من الماصة الدقيقة ، مع الحفاظ على وقت الحقن عند 1 ثانية. كرر هذا خمس مرات. باستخدام المعيار ، 1 مم = 30 نانولتر الحجم ، أوجد الحجم المحقون في 5 ثوان عن طريق إبقاء الأنبوب الشعري مقابل مقياس قياس. باستخدام المعلومات الواردة أعلاه ، احسب الوقت (بالثواني) المطلوب لحقن 1-3 نانولتر لكل حقنة12.
ملاحظة: المعيار ، 1 مم = 30 نانولتر ، خاص بإعدادات ضغط الحاقن الدقيق وقطر الشعيرات الدموية المستخدمة للمعايرة. من الناحية المثالية ، يجب أن يتم الحقن في واجهة خلية صفار البيض ، والتي تتشكل في غضون 15-20 دقيقة بعد الإخصاب. لتسهيل الحقن المتعددة ، يمكن أن يتأخر النمو قليلا عن طريق الحفاظ على الأجنة عند درجة حرارة منخفضة (18 درجة مئوية). ومع ذلك ، يجب أن يبقى هذا عند الحد الأدنى ولا يمتد إلى ما بعد 30 دقيقة بسبب التأثير المركب لانخفاض درجة الحرارة على تغيرات التعبير الجيني. - قم بتركيب الأجنة على طبق بتري مصبوب من الأغاروز (60 مم). كومة الأجنة بإحكام داخل التلال. باستخدام ماصات زجاجية مصقولة بالنار ، قم بمحاذاتها في الاتجاه الصحيح للحقن.
- تحت المجهر ، استخدم المتلاعبين لتقريب الماصة الدقيقة من الجنين وحقنها داخل واجهة خلية الصفار عن طريق الضغط على مفتاح القدم.
- حقن جميع الأجنة بالمثل. اجمعها في طبق بتري يحتوي على وسط مائي للجنين الطازج واحتضانها عند 28 درجة مئوية.
- تحقق من الأجنة المحقونة بعد 6-8 ساعات. قم بإزالة جميع الأجنة الميتة التي يمكن التعرف عليها بسبب عتامتها العالية واستمر في تغيير ماء الجنين مرة واحدة على الأقل يوميا لتجنب العدوى.
2. تحليل التصبغ
- التحضير لحساب الميلانوفورات الجانبية في خط الوسط في 3 أجنة من الزرد dpf
- علاج الأجنة بمخدر عصبي عضلي 0.016٪ لشل حركتها.
- لتركيب الأجنة للتصوير ، أضف بضعة ملليلتر من 1.5-2 ٪ ميثيل سلولوز في طبق بتري (60 مم) بحيث يشكل طبقة رقيقة. باستخدام ماصة باستور ، اختر الأجنة وضعها برفق في ميثيل سلولوز لتقييد المزيد من الحركة أثناء التصوير.
- اضبط موضعها للحصول على التصوير الجانبي الأمثل (الشريط الظهري ، الشريط البطني ، شريط صفار البيض ، وميلانوفورس منتصف الخط) أو التصوير الظهري (الميلانوفورات على الجزء الظهري من الرأس). للحصول على دقة أفضل للميلانوفور المجاور ، الصورة بتكبير أعلى (>5x)
- تصوير برايتفيلد
ملاحظة: يتم إجراء تصوير برايتفيلد باستخدام مجهر مجسم بتكبير 8-10x.- ضع طبق بتري الذي يحتوي على أجنة الزرد تحت المجهر. باستخدام مناور ، اضبط الأسماك في هذا الاتجاه بحيث تكون جميع الخطوط الجنينية الخمسة للخلايا الصباغية مرئية (ظهرية ، بطنية ، جانبيتان ، صفار) في وقت واحد (الشكل 1C). التقط الصور بسرعة باستخدام برنامج الاستحواذ. في حالة استعادة الحيوان للحركة قبل تصويره ، أعد غمره في مخدر واستمر في التصوير بمجرد تجميده بشكل كاف.
- كرر هذا مع جميع الأسماك وتأكد من أن التكبير يظل كما هو لكل صورة.
- حساب متوسط القيمة الرمادية باستخدام برنامج ImageJ
- التقط صورا ظهرية وجانبية ل 2 أجنة من الزرد dpf.
- افتح الصورة المراد قياسها كميا في ImageJ باستخدام أداة فتح . استخدم أداة الشكل الحر لتخطيط المساحة المراد تحليلها. انتقل إلى خيار تعيين القياسات وحدد منطقة متوسط القيمة الرمادية |. اضغط على M (أو تحليل | Measure) لحساب متوسط القيمة الرمادية للمنطقة المحددة.
- مع الحفاظ على المنطقة المراد تحليلها ثابتة ، احسب متوسط المنطقة الرمادية لكل على حدة.
- ارسم رسما بيانيا شريطيا بالبيانات المكتسبة (الشكل 2F).
- فحص محتوى الميلانين
- في 2 dpf ، استخدم ماصة باستور الزجاجية لجمع ~ 25 أجنة الزرد.
- قم بإجراء إزالة الشوائب يدويا باستخدام إبر الأنسولين سعة 1 مل وأضفها إلى أنابيب الطرد المركزي الدقيقة سعة 1.5 مل.
- تخلص من وسط الجنين بعناية وأضف 1 مل من محلول التحلل المثلج البارد (20 مللي متر فوسفات الصوديوم (درجة الحموضة 6.8) ، 1٪ Triton X-100 ، 1 mM PMSF ، 1 mM EDTA) مع كوكتيل مثبط الأنزيم البروتيني وإعداد محللات البروتين عن طريق صوتنة.
- قم بإذابة المحللات في 1 مل من 1 N NaOH واحتضان العينات عند 100 درجة مئوية لمدة 50 دقيقة في حمام مائي. دوامة ذلك بشكل متقطع لتجانس المحللة تماما.
- خذ قراءات امتصاص العينات عند 490 نانومتر باستخدام مقياس الطيف الضوئي.
- احسب محتوى الميلانين من خلال مقارنة امتصاص العينة بمنحنى قياسي للتركيزات المعروفة للميلانين الصناعي (الشكل 2G).
3. عدد الميلانوفور
ملاحظة: يمكن إجراء تحليل مضان في أجنة الزرد المعدلة وراثيا بطريقتين: 1) عد الخلايا الإيجابية ل GFP. 2) قياس شدة التألق.
- التحضير للعد القائم على FACS للخلايا الإيجابية GFP في أجنة الزرد المبكرة
- اجمع 200-250 ftyrp: أجنة GFP واغسلها في مصفاة باستخدام ماء الجنين العادي. كعنصر تحكم سلبي ، قم بمعالجة أجنة GFP السلبية والمطابقة للمرحلة من النوع البري (Assam Wildtype)12.
- بناء على مرحلة الاهتمام ، انقل الأجنة إلى طبق بتري يحتوي على 0.6 مجم / مل بروناز. بعد 5-10 دقائق ، باستخدام ماصة باستور ، انقل الأجنة المنزوعة الأيونات إلى طبق بتري طازج يحتوي على ماء جنين عادي. باستخدام ماصة باستور الزجاجية ، اجمع ~ 100 جنين وانقلها إلى أنبوب طرد مركزي دقيق سعة 2 مل.
- تخلص من الوسط بعناية وأضف 200 ميكرولتر من محلول رينغر المثلج (مخزن deyolking المؤقت). الحفاظ على الأنبوب على الجليد ، ماصة المحتويات صعودا وهبوطا ~ 20 مرة حتى يذوب صفار البيض. أجهزة الطرد المركزي الأنابيب في 100 × غرام لمدة 1 دقيقة في جهاز طرد مركزي منضدية عند 4 °C. أجهزة الطرد المركزي مرة أخرى وتجاهل بعناية طاف .
- باستخدام ماصة سعة 1 مل ، انقل الأجنة منزوعة الأصداء إلى طبق بتري يحتوي على 10 مل من محلول التربسين (محلول تفكك الخلايا). قم بأدائها في أطباق بتري متعددة لتجنب اكتظاظ الأجنة وعدم كفاءة التربسين. استخدم ماصة سعة 1 مل ، امزج المحلول الذي يحتوي على أجسام الجنين مرة أو مرتين لتقليل التجميع.
- احتضان أطباق بتري في درجة حرارة الغرفة لمدة 15 دقيقة (<24 أجنة hpf) أو 30 دقيقة (24-30 hpf الأجنة). نضح وتوزيع التعليق من حين لآخر باستخدام ماصة 1 مل للمساعدة في تفكك الخلايا.
- خلال فترة الحضانة ، قم بتهيئة آلة مقياس التدفق الخلوي لعد الخلايا.
- ضع مصفاة خلية 70 ميكرومتر فوق أنبوب مخروطي سعة 50 مل وقم بتمرير تعليق التربسين عبر المصفاة للحصول على تعليق أحادي الخلية. اغسل أطباق بتري بنفس التعليق عدة مرات لإزالة الخلايا الملتصقة بالسطح.
- قم بتدوير العينات عند 450 × جم ، 4 درجات مئوية لمدة 5 دقائق في دوار دلو متأرجح.
- تخلص من المادة الطافية وأعد تعليق الحبيبات في 1 مل من محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS) بارد 1x.
- أدر مرة أخرى على حرارة 450 × جم ، 4 درجات مئوية لمدة 5 دقائق وتخلص من المادة الطافية.
- أخيرا ، أعد تعليق الحبيبات في PBS + 5٪ مصل بقري جنيني واحتفظ بها على الجليد حتى تشغيل FACS.
- تحضير مقياس التدفق الخلوي
- قم بتشغيل مقياس التدفق الخلوي وابدأ بدء التشغيل.
ملاحظة: قبل تشغيل الجهاز، أفرغ سلة المهملات واملأ خزان سائل الغمد. - تطبيع تدفق التيار لفوهة 70 ميكرومتر (أو 85 ميكرومتر). اتركه دون إزعاج لمدة 10-15 دقيقة إذا كان غير مستقر.
- قم بتشغيل مقياس التدفق الخلوي وابدأ بدء التشغيل.
- عد الخلايا ذات العلامات الفلورية باستخدام مقياس التدفق الخلوي
- قم بتهيئة مجلد تجربة جديد وقم بعمل مخطط تشتت للتشتت الأمامي مقابل التشتت الجانبي ورسم بياني لشدة إيزوثيوسيانات الفلوريسئين (FITC).
- قم بتحميل الخلايا من النوع البري أولا لتعيين بوابات التشتت الأمامية والجانبية (لاستبعاد الازدواجية والحطام) وعتبة FITC.
- بعد ضبط البوابات ، قم بإزالة العينة وتحميل الخلايا المعزولة من أجنة Tg (ftyrp1: GFP) لحساب الخلايا الصباغية.
ملاحظة: هنا ، نظرا لأن ftyrp1: GFP يسمي الخلايا الصباغية الناضجة على وجه التحديد ، فإن عدد الخلايا الإيجابية ل GFP تحت بوابة FITC سيتوافق مع عدد الخلايا الصباغية. - كرر الخطوة المذكورة أعلاه مع العينات المحقونة بالمورفولينو لتقدير ومقارنة عدد الخلايا الصباغية مع عنصر التحكم.
- قياس شدة التألق في أجنة الزرد
- باستخدام ماصة باستور الزجاجية ، اجمع 100-120 جنينا وانقلها إلى طبق بتري يحتوي على ماء جنين عادي.
- عند ~ 10-12 hpf ، انقل الأجنة إلى 0.003٪ 1-phenyl-2-thiourea لمنع التصبغ.
- إجراء الإزالة اليدوية باستخدام إبر الأنسولين لتصوير أجنة <48 hpf.
- لشل حركة الأجنة ، تعامل مع 0.016 ٪ تريكايين.
- لتركيب الأجنة للتصوير ، ضع بضعة مل من 1.5-2 ٪ ميثيل سلولوز في طبق بتري (60 مم) بحيث يشكل طبقة رقيقة. أضف الأجنة إلى ميثيل سلولوز لتقييد أي حركة أخرى أثناء التصوير. ضع طبق بتري الذي يحتوي على العينات تحت المجهر. باستخدام طرف ماصة ، اضبط الحيوان في الاتجاه المطلوب.
- الحصول على الصور باستخدام برنامج الاستحواذ. بالنسبة للأجنة <24 حصان ، التقط الجنين بالكامل مرة واحدة تحت تكبير 10x. بالنسبة لمراحل >24 hpf ، احصل على حقول مسح متعددة ثم قم بتجميعها (غرزها) معا.
- كرر هذا مع جميع الأسماك وتأكد من أن الإعداد للاكتساب يظل ثابتا خلال التجربة.
- التحديد الكمي
- قم بتحليل الصورة بشكل أكبر باستخدام برنامج ImageJ.
- افتح الصورة المراد قياسها كميا في ImageJ باستخدام أداة فتح .
- استخدم أداة الشكل اليدوي لتحديد المنطقة المراد تحليلها (الشكل 3E).
- اضغط على M (أو تحليل | Measure) للحصول على قياس كثافة منطقة محددة .
- الحفاظ على المنطقة المراد تحليلها ثابتة ، وحساب متوسط الكثافة لكل منطقة لكل على حدة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
تم استخدام سير العمل الموصوف في الشكل 1 لإجراء اضطراب وراثي قائم على المورفولينو في مرحلة الخلية الواحدة لسمك الزرد. تم إجراء تحليل التصبغ باستخدام طرق مختلفة ، كما هو مذكور أدناه. لتوضيح النتائج التمثيلية ، تم حقن أحجام موحدة من المورفولينو المضاد للحساسية الذي يستهدف جينات h2afv و ca14 في مرحلة صفار البيض أو الخلية الواحدة من جنين الزرد. تم إجراء التنميط الظاهري الأولي القائم على التصوير الساطع في 48 ساعة بعد الإخصاب (hpf) ، عندما كانت جميع خطوط الميلانوفور الخمسة المصطبغة (الظهرية ، البطنية ، صفار البيض ، الجانبيان) واضحة.
يمثل الشكل 2 أ ، ب نهجا لتحليل التصبغ عن طريق حساب عدد الميلانوفورات الجانبية لكل جنين. تم حساب الميلانوفور الجانبي يدويا في مرحلة 48 hpf عن طريق تكبير المنطقة الجانبية لسمك الزرد المائل. تتضمن طريقة بديلة لتحديد كمية الميلانوفورات المصطبغة (الشكل التكميلي S1) العد اليدوي لميلانوفورات الرأس عن طريق تصوير المنظر الظهري لسمك الزرد.
يتم حساب محتوى الميلانين لكل جنين عن طريق قياس متوسط القيمة الرمادية ، مع الحفاظ على منطقة الاهتمام ثابتة بمساعدة برنامج ImageJ. يوضح الشكل 2C-F أن متوسط القيمة الرمادية لمورفانتات ca14 و h2afv كانت أعلى منها في مورفانت السيطرة. نظرا لأن متوسط القيمة الرمادية يتناسب عكسيا مع محتوى الميلانين ، فقد أدى الضربة القاضية لجينات ca14 و h2afv إلى انخفاض في محتوى الميلانين لكل جنين. طريقة أخرى قوية لتحديد محتوى الميلانين هي طريقة الامتصاص الطيفي القائمة على هيدروكسيد الصوديوم. كما هو موضح في الشكل 2G ، كان إجمالي محتوى الميلانين في مورفانت ca14 أقل منه في مورفانت السيطرة.
كشف التصوير الفلوري عن مرحلتين مختلفتين من تطور ميلانوفور الزرد: الميلانوفورات المحددة المبكرة (mitfa: gfp) وتمييز الميلانوفورات (ftyrp: gfp). تم تقييم التغيير القائم على المورفولينو عن طريق التصوير الفلوري (الشكل 3A والشكل 3C). لمزيد من التحقق من صحة هذه الملاحظات ، تم حساب تواتر الخلايا الإيجابية ل GFP باستخدام FACS. أدت ضربة قاضية h2afv ولكن ليس ca14 إلى تقليل عدد الميلانوفورات بشكل كبير فيما يتعلق بالتحكم (الشكل 3A-D). علاوة على ذلك ، يمكن حساب انخفاض في متوسط شدة / مساحة التألق باستخدام برنامج ImageJ ، مع الحفاظ على منطقة الاهتمام ثابتة. تظهر مورفانات H2afv انخفاضا كبيرا في متوسط كثافة / مساحة الفلورسنت بالنسبة إلى مورفانتس التحكم (الشكل 3E ، F).
الشكل 1: سير العمل لنهج وراثي عكسي لتحديد منظمات بيولوجيا الخلايا الصباغية باستخدام الزرد. (أ) مخطط انسيابي يصور سير العمل التجريبي بدءا من الحقن الدقيق إلى تقييم التصبغ بطرق مختلفة. (ب) حامل إبرة الحقن المجهري والمناور الدقيق ، جنبا إلى جنب مع مجهر التشريح ، هو إعداد نموذجي للحقن المجهري لأجنة الزرد ذات المرحلة الواحدة. (ج) نمط الخلايا الصباغية الجنينية في الزرد عند 3 dpf يوضح جميع الخطوط الخمسة: الظهرية الجانبية ، وخطان وسطيان جانبيان (مدببان بأربعة أسهم حمراء) ، وشريط بطني ، وشريط صفار البيض. (د) لدراسة نتيجة التصبغ عند حقن المورفولينو، يمكن عد ميلانوفورات خط الوسط الجانبية تحت المجهر المجسم. صورة برايتفيلد لمنطقة ظهرية عند 2 dpf ؛ يمكن قياس محتوى الميلانين عن طريق قياس متوسط القيمة الرمادية. (ه) القيم الرمادية المتوسطة تتناسب عكسيا مع محتوى الميلانين في الجنين. الميلانوفور المملوء بالميلانين عند 2 dpf في الأجنة البرية. (F) يمكن إجراء اختبار محتوى الميلانين لتقدير إنتاج الميلانين داخل هذه الميلانوفورات. الزرد المعدل وراثيا يضع علامة على الخلايا التي تعبر عن بروتين TYRP1 عند 2 dpf. (ز) يمكن قياس كمية الخلايا الموسومة بالفلورسنت باستخدام FACS؛ شريط المقياس = 100 ميكرومتر. الزرد المعدل وراثيا يضع علامة على الخلايا التي تعبر عن بروتين Mitfa عند 1 dpf. يمكن قياس متوسط شدة التألق لكل باستخدام برنامج ImageJ. قضبان المقياس = 100 ميكرومتر. الاختصارات: dpf = أيام بعد الإخصاب. FACS = فرز الخلايا المنشط بالفلورة. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: عد ميلانوفورات خط الوسط الجانبية ، وقياس متوسط القيمة الرمادية ، ومقايسة محتوى الميلانين. تم استخدام صور برايتفيلد المجهرية للمنظر الجانبي للمورفانتس لتحديد محتوى الميلانين باستخدام برنامج ImageJ. (أ) مورفانت التحكم ومتغير هيستون h2afv (h2afv) عند 3 dpf ؛ على اليمين توجد مناطق جذع مكبرة لهذه الأجنة تصور أعداد الخلايا الصباغية. (ب) انخفض عدد الميلانوفورات في مورفانت h2afv بشكل كبير بالنسبة إلى السيطرة ، n > 10 لكل 3 مكررات بيولوجية. (C) صورة تمثيلية للمراقبة مقابل مورفانت الأنهيدراز الكربوني 14 عند 2 dpf. (د) القياس الكمي للميلانين ل ca14 مقابل مورفانت التحكم ، n > 10 عبر 3 تكرارات بيولوجية. (ه) منظر جانبي ل h2afv مقابل مورفانتس التحكم عند 2 dpf. (F) القياس الكمي لمحتوى الميلانين ل h2afv مقابل مورفانت التحكم. تمثل المستطيلات الحمراء عائد الاستثمار المختار للتحليل المستند إلى ImageJ. (ز) إجراء مقايسة محتوى الميلانين على الأجنة المحقونة بالمورفولينو لتحديد إجمالي محتوى الميلانين. متوسط ثلاث تجارب مستقلة ± SEM. ** P < 0.01 ، **** P < 0.0001. اختبار t للطالب ؛ أشرطة الخطأ هي متوسط ± الخطأ القياسي للمتوسط (SEM). قضبان المقياس = 100 ميكرومتر. الاختصارات: MO = مورفولينو. dpf = أيام بعد الإخصاب ؛ عائد الاستثمار = منطقة الاهتمام. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3: تحديد كمية الخلايا ذات العلامات الفلورية باستخدام FACS وقياس متوسط شدة التألق. (أ) صور مضان ل ca14 وأجنة مورفانت تحكم عند 2 dpf من خط Tg (ftyrp1: GFP) ، حيث يتم تمييز الخلايا الصباغية المتمايزة بتعبير GFP. (ب) يبقى عدد الميلانوفورات في ca14 والأجنة المورفانية الضابطة عند 2 dpf دون تغيير ، n = 3 تكرارات بيولوجية. (C) صور مضان عند 2 dpf من h2afv ومورفانت التحكم من خط Tg (ftyrp1: GFP). (د) انخفض عدد الميلانوفورات في مورفانت h2afv بشكل كبير مقارنة بأجنة مورفانت الضابطة عند 2 dpf ، n = 3 تكرارات بيولوجية. (ه) صور مضان للأجنة الضابطة والمورفانت h2afv عند 36 hpf من Tg (mitfa: GFP) مع الخلايا الصباغية الموسومة. (F) يتم حساب MFI لكل باستخدام برنامج ImageJ ويتم تمثيله كرسم بياني شريطي يصور مجموعات البيانات الفردية. يتم تقليل MFI بشكل كبير في مورفانت h2afv مقارنة بالسيطرة. يمثل المستطيل الأحمر عائد الاستثمار المختار للتحليل المستند إلى برامج ImageJ. n = 3 مكررات بيولوجية ؛ P < 0.001 ، **** P < 0.0001. اختبار t للطالب ؛ أشرطة الخطأ هي متوسط ± الخطأ القياسي للمتوسط (SEM) ؛ قضبان المقياس = 100 ميكرومتر. الاختصارات: MO = مورفولينو. FACS = فرز الخلايا المنشط بالتألق ؛ GFP = بروتين الفلورسنت الأخضر ؛ dpf = أيام بعد الإخصاب ؛ عائد الاستثمار = منطقة الاهتمام ؛ MFI = متوسط شدة التألق. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل التكميلي S1: كمية ميلانوفورات الرأس. (أ) منظر ظهري ل h2afv ومورفانات التحكم عند 48 hpf تظهر ميلانوفورات الرأس. يمثل المربع الأحمر عائد الاستثمار. مع الحفاظ على منطقة الاهتمام ثابتة ، يمكن تحديد عدد ميلانوفور الرأس يدويا. (ب) انخفض عدد ميلانوفورات الرأس بشكل كبير عند ضربة قاضية h2afv. تمثل القضبان متوسطا هندسيا بنسبة 95٪ CI من عدد ميلانوفورات الرأس لكل جنين مع >30 جنينا لكل جنين. قضبان المقياس = 100 ميكرومتر. الاختصارات: MO = مورفولينو. CI = فاصل الثقة ؛ HPF = ساعات بعد الإخصاب ؛ عائد الاستثمار = منطقة الاهتمام. الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الملف.
الشكل التكميلي S2: مجموعة دقيقة من الخلايا الصباغية الأولية البشرية المعالجة ب PTU. تظهر خريطة الحرارة التعبير عن جينات التصبغ (mitf ، tyrosinase ، dct ، mc1r) عند العلاج في الخلايا الصباغية الأولية البشرية. الاختصارات: PTU = 1-فينيل-2-ثيوريا. صور = التيروزيناز. الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الملف.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
غالبا ما يتجلى النمط الظاهري للتصبغ على أنه تغيرات في محتوى الميلانين أو عدد الخلايا الصباغية الحاملة للصبغة. تسمح الطريقة الموصوفة هنا بتشريح هذا الانقسام وتسمح بالتقييم النوعي والكمي لمحتوى الميلانين وعدد الميلانوفور لكل جنين ، بغض النظر عن محتوى الميلانين. إن الخصوبة العالية لسمك الزرد ، والطبيعة المرئية للخلايا الصباغية المصطبغة ، ونقص نقل الميلانوزوم تمكن من تشريح بيولوجيا الخلايا الصباغية باستخدام هذا النهج الجيني العكسي القابل للفحص متوسط الإنتاجية.
ينبع اختيار الإسكات القائم على المورفولينو من سهولة الإسكات والقدرة على اختبار العديد من المرشحين بالتوازي. هناك بعض القيود على استخدام نهج الإسكات القائم على المورفولينو ، وقد تم وصف المبادئ التوجيهية لاستخدام وتفسير هذه الأدوات القيمة سابقا13. بشكل أساسي ، يوفر التحقق من صحة النمط الظاهري عند الضربة القاضية باستخدام MOs متعددة حلا ملموسا لهذه المشكلة. استراتيجية بديلة هي استخدام الاضطراب الجيني القائم على كريسبر. إن اختراق النمط الظاهري محدود بسبب انخفاض تواتر الأحداث الجينية بطبيعته ويمكن أن يتفاقم بسبب الطفرات غير المتجانسة. هذا يحد من استخدامه للفحص الجيني العكسي14.
غالبا ما يؤدي تقييم النمط الظاهري للاضطرابات الانتقائية للخلايا الصباغية إلى انخفاض محتوى الصباغ بسبب تغير الاستجابة الميلانينية. ومع ذلك ، هناك العديد من الجينات التي تزعج مواصفات الخلايا الصباغية وبالتالي تسبب انخفاضا في التصبغ بسبب انخفاض أعداد الخلايا الصباغية الإجمالية. يعد التشريح المنهجي للسيناريوهين أمرا ضروريا لإسناد الوظيفة الجزيئية للجين في التصبغ. يضاعف قياس محتوى الميلانين بسبب الطبيعة المعقدة لبوليمر الميلانين. من بين الطريقتين المتاحتين ، وهما إذابة الميلانين بواسطة NaOH والكشف القائم على HPLC لمنتجات أكسدة الميلانين المستقرة 1H-pyrrole-2،3،5-حمض ثلاثي الكربوكسيل وحمض pyrrole-2،3- ثنائي الكربوكسيل ، يمكن إجراء الطريقة الأولى بشكل روتيني في بيئة معملية بينما تتطلب الأخيرة معايير محددة وأجهزة متطورة15.
بالإضافة إلى ذلك ، فإن عدد الأجنة التي تتطلبها طريقة NaOH أعلى أيضا بسبب عدة خطوات متضمنة في الكشف. يعمل التحلل المائي القائم على هيدروكسيد الصوديوم على إذابة الميلانين وتمكين القياس الطيفي الطيفي. في حين أن هذه الطريقة قوية ويمكن اعتمادها لشاشة متوسطة الإنتاجية (10-15 مرشحا في المرة الواحدة) ، فإن الزانثين الموجود في الزانثوفور هو مادة متداخلة محتملة بسبب امتصاصه المتأصل في نطاق 400-450 نانومتر16. ومن ثم ، يجب إجراء توافق بين تحديد متوسط القيمة الرمادية القائم على تحليل الصور وفحص محتوى الميلانين لتأكيد انخفاض محتوى الميلانين.
يوفر PTU أداة سهلة لتقليل التصبغ وتصور الجنين الشفاف. يمكن أن يؤدي الاستخدام إلى تغييرات في التغذية المرتدة واستدعاء تغييرات في الخلايا الصباغية. ومع ذلك ، فقد لاحظنا تغييرات طفيفة في التعبير عن جينات التصبغ (الشكل التكميلي S2).
يكون عد الخلايا الصباغية أسهل في خط الوسط الجانبي ومنطقة الرأس ، حيث يمكن ملاحظة الخلايا الصباغية بشكل واضح نسبيا في هذه المناطق (الشكل التكميلي S1). تنشأ ميلانوفورات الخط الجانبي من مجموعة الخلايا الجذعية الصباغية الموجودة بالقرب من العقد الجذرية الظهرية18. تصوير هذه الفئة من السكان له العديد من المزايا مثل العدد الثابت لكل جنين والتمييز الواضح. ومع ذلك ، يجب تصوير الخطين المتقابلين عن طريق إمالة الجنين قليلا. وإلا يندمج الاثنان بسبب الطبيعة الشفافة للجنين ، مما يجعل من الصعب عده (الشكل 1C مقابل الشكل 2C).
تختلف ميلانوفورات الزرد عن الخلايا المصطبغة للعين المشتقة من الأديم الظاهر العصبي. يمكن تمييزها من خلال وضعها داخل الجنين وهي واضحة في العين مقابل نمط الجسم. في التجربة القائمة على FACS ، يمكن تمييز الخلايا المشتقة من العين بحجمها لأنها أصغر بكثير من الميلانوفور ويمكن إغلاقها باستخدام معايير الحجم أو التشتت.
يتم إجراء تقديرات الخلايا الصباغية في مراحل النضج المختلفة باستخدام الخطوط المعدلة وراثيا بسهولة باستخدام القياس الكمي القائم على الصور. يعد القياس الكمي لعدد الميلانوفورات في الخط الجانبي قويا حيث يختلف عددها في نافذة تتراوح بين 2 dpf و 5 dpf على كل جانب من الجنين17. ومع ذلك ، يتم تحديد عدد الميلانوفورات في الخط الجانبي من خلال هجرة وإنشاء تجمع الخلايا الجذعية المرتبطة بعقدة الجذر الظهرية18. وبالتالي ، فإن أي تغييرات في هذه العمليات يمكن أن تؤدي إلى ملاحظة مماثلة. للتحايل على هذا العامل المربك ، يعد التقدير المستند إلى FACS لجميع الميلانوفورات حلا ملموسا.
بالتناوب ، يمكن إجراء القياس الكمي لميلانوفور الرأس كما هو محدد في الشكل التكميلي S1 كبديل لأرقام الميلانوفور. من المثير للاهتمام ملاحظة أن التغيرات في مستويات الحالة المستقرة لأعداد الخلايا الصباغية يمكن أن تشير إلى وظيفتين متعاكستين للجين المرشح المعني. يمكن أن يؤدي إما إلى انخفاض مواصفات الخلايا الصباغية من سلائف القمة العصبية أو التسبب في وفاة خاصة بالخلايا الصباغية وتحتاج إلى معالجتها باستخدام طرق مثل فحص النفق. ستمكن الاختلافات مثل الحقن المجهري متبوعا بتصوير الخلايا الحية من مراقبة الأنماط الظاهرية الأخرى الخاصة بالخلايا الصباغية مثل الهجرة والنماذج. من مصلحة الباحثين في الخلايا الصبغية عملية نقل الميلانوزوم ، والتي لا تعمل في نظام الأسماك. ومع ذلك ، يمكن دراسة حركة الميلانوزوم المنسقة في الميلانوفور مع تعديلات في تصوير الخلايا الحية الموصوفة هنا مع التعديلات. إجمالا ، فإن البروتوكول التفصيلي المقدم في مقالة الفيديو هذه سيمكن الباحثين في بيولوجيا الخلايا الصبغية من الاستعلام عن الجينات المرشحة وتقييم دورها في بيولوجيا الخلايا الصباغية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
يعلن جميع المؤلفين عدم وجود تضارب في المصالح.
Acknowledgments
نحن نقدر الدعم التمويلي المقدم من مجلس البحوث العلمية والصناعية من خلال مشروع MLP2008 وقسم العلوم والتكنولوجيا لمشروع GAP165 لدعم العمل المقدم في هذه المخطوطة. نشكر جياشري رينجاراجو وشيتان ميشرا على مساعدتهما في التجارب.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.5 mL Microtubes | Axygen | MCT-150-A | For preparing MO solution |
| 2 mL Microtubes | Axygen | MCT-200-C | For washing steps in FACS protocol |
| Agarose | Sigma-Aldrich | A-9539-500G | For microinjection |
| BD FACSAria II | BD Biosciences | NA | For cell sorting |
| Capillary tube | Drummond | 1-000-0010 | |
| Corning cell strainer | Corning | CLS431751 | For making single cell suspension |
| DMEM High Glucose Media | Sigma-Aldrich | D5648 | FACS protocol |
| Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate (Tricaine) | Sigma-Aldrich | E10521-50G | to immobilize ZF for imaging |
| Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt dihydrate (EDTA) | Sigma-Aldrich | E5134 | For cold lysis buffer |
| FACS tubes | BD-Biosciences | 342065 | FACS protocol |
| Fetal bovine serum (FBS) | Invitrogen | 10270 | FACS protocol |
| Graphpad prism Software | Graphstats Technologies | NA | For data representation |
| ImageJ Software | National Institute of health | NA | For image analysis |
| Insulin Syringes (1 mL) | DispoVan | NA | For manual dechorionation |
| Melanin, Synthetic | Sigma-Aldrich | M8631 | For melanin content assay |
| Methylcellulose | Sigma-Aldrich | M7027-250G | to immobilize ZF for imaging |
| Microloader tips | Eppendorf | 5242956003 | For microinjection |
| Morpholino | Gene-tools | NA | For knock-down experiments |
| N-Phenylthiourea (PTU) | Sigma-Aldrich | P7629 | to inhibit melanin formation |
| Needle puller | Sutter Instrument | P-97 | For microinjection |
| Nunc 15 mL Conical Sterile Polypropylene Centrifuge Tubes | Thermo Fisher Scientific | 339650 | FACS protocol |
| Petridish (60 mm) | Tarsons | 460090 | For embryo plates |
| Phenylmethylsulphonyl fluoride | Sigma-Aldrich | 10837091001 | For cold lysis buffer |
| Phosphate buffer saline (PBS) | HiMedia | TL1099-500mL | For washing cells |
| Pronase | Sigma-Aldrich | 53702 | For dechorionation |
| Protease inhibitor cocktail | Sigma-Aldrich | P8340 | For cold lysis buffer |
| Sheath fluid | BD FACSFlowTM | 342003 | FACS protocol |
| Sodium phosphate | Merck | 7558-79-4 | Cold lysis buffer |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T9284-500ML | For cold lysis buffer |
| TrypLE | Gibco | 1677119 | For trypsinization |
References
- Kelsh, R. N. Genetics and evolution of pigment patterns in fish. Pigment Cell Research. 17 (4), 326-336 (2004).
- Jablonski, N. G. The evolution of human skin and skin color. Annual Review of Anthropology. 33, 585-623 (2004).
- Hoekstra, H. Genetics, development and evolution of adaptive pigmentation in vertebrates. Heredity. 97 (3), 222-234 (2006).
- Quigley, I. K., Parichy, D. M. Pigment pattern formation in zebrafish: a model for developmental genetics and the evolution of form. Microscopy Research and Technique. 58 (6), 442-455 (2002).
- Meyers, J. R. Zebrafish: development of a vertebrate model organism. Current Protocols Essential Laboratory Techniques. 16 (1), 19 (2018).
- Kelsh, R. N., Schmid, B., Eisen, J. S. Genetic analysis of melanophore development in zebrafish embryos. Developmental Biology. 225 (2), 277-293 (2000).
- Rocha, M., Singh, N., Ahsan, K., Beiriger, A., Prince, V. E. Neural crest development: insights from the zebrafish. Developmental Dynamics. 249 (1), 88-111 (2020).
- Carney, T. J., et al. A direct role for Sox10 in specification of neural crest-derived sensory neurons. Development. 133 (23), 4619-4630 (2006).
- Curran, K., Raible, D. W., Lister, J. A. Foxd3 controls melanophore specification in the zebrafish neural crest by regulation of Mitf. Developmental Biology. 332 (2), 408-417 (2009).
- Zou, J., Beermann, F., Wang, J., Kawakami, K., Wei, X. The Fugu tyrp1 promoter directs specific GFP expression in zebrafish: tools to study the RPE and the neural crest-derived melanophores. Pigment Cell Research. 19 (6), 615-627 (2006).
- Xu, Q.
- Hermanson, S., Davidson, A. E., Sivasubbu, S., Balciunas, D., Ekker, S. C. Sleeping Beauty transposon for efficient gene delivery. Methods in Cell Biology. 77, 349-362 (2004).
- Stainier, D. Y., et al. Guidelines for morpholino use in zebrafish. PLoS Genetics. 13 (10), 1007000 (2017).
- Wu, N., et al. The progress of CRISPR/Cas9-mediated gene editing in generating mouse/zebrafish models of human skeletal diseases. Computational and Structural Biotechnology Journal. 17, 954-962 (2019).
- Affenzeller, S., Frauendorf, H., Licha, T., Jackson, D. J., Wolkenstein, K. Quantitation of eumelanin and pheomelanin markers in diverse biological samples by HPLC-UV-MS following solid-phase extraction. PLoS One. 14 (10), 0223552 (2019).
- Fernandes, B., Matamá, T., Guimarães, D., Gomes, A., Cavaco-Paulo, A.
- Hultman, K. A., Johnson, S. L. Differential contribution of direct-developing and stem cell-derived melanocytes to the zebrafish larval pigment pattern. Developmental Biology. 337 (2), 425-431 (2010).
- Mort, R. L., Jackson, I. J., Patton, E. E. The melanocyte lineage in development and disease. Development. 142 (4), 620-632 (2015).
