Summary
Melanosit fonksiyonlarının düzenleyicileri, pigmentasyon sonucundaki gözle görülür farklılıkları yönetir. Aday pigmentasyon geninin moleküler fonksiyonunu deşifre etmek bir zorluk teşkil eder. Burada, adayları tanımlamak ve bunları melanin içeriği ve melanosit sayısının düzenleyicileri olarak sınıflandırmak için bir zebra balığı model sisteminin kullanımını gösteriyoruz.
Abstract
Melanositler, epidermal deride bulunan özelleşmiş nöral tepe türevli hücrelerdir. Bu hücreler, genomu zararlı ultraviyole radyasyonlardan koruyan melanin pigmentini sentezler. Melanosit fonksiyonlarındaki bozulmalar piebaldizm, albinizm, vitiligo, melazma ve melanom gibi pigmenter bozukluklara yol açar. Zebrafish, melanosit fonksiyonlarını anlamak için mükemmel bir model sistemdir. Göze çarpan pigmentli melanositlerin varlığı, genetik manipülasyon kolaylığı ve transgenik floresan hatlarının mevcudiyeti pigmentasyon çalışmasını kolaylaştırır. Bu çalışma, melanositlerin çeşitli aşamalarını işaretleyen mitfa ve tyrp1 promotörleri altında yeşil floresan protein (GFP) ekspresyonunu yönlendiren vahşi tip ve transgenik zebra balığı çizgilerinin kullanımını kullanmaktadır.
Larva pigmentasyonu üzerindeki fenotipik sonucu değerlendirmek için aday genlerin morfolino bazlı susturulması sağlanır ve pigmentasyon düzenleyicileri için tarama için uygulanabilir. Bu protokol, pigmentasyon sonucunu kapsamlı bir şekilde değerlendirmek için mikroenjeksiyondan görüntülemeye ve floresanla aktive hücre sıralama (FACS) bazlı fenotiplerin iki aday gen, karbonik anhidraz 14 (Ca14) ve bir histon varyantı (H2afv) kullanılarak diseksiyonuna kadar olan yöntemi göstermektedir. Ayrıca, bu protokol, aday genlerin, sırasıyla hücre başına melanosit sayılarını ve melanin içeriğini seçici olarak değiştiren melanosit belirteçlerine ve farklılaştırıcılarına ayrıldığını göstermektedir.
Introduction
Fotokoruma için melanin kullanımı hayvan krallığında birkaç kez evrimleşmiş olsa da, omurgalılar süreci mükemmelleştirmiş gibi görünmektedir. Melanini sentezlemek ve içermek için ayrıntılı bir makineye sahip özel pigment üreten hücreler balıklardan insanlara korunur1. Bununla birlikte, pigmentasyonun sonucu, renkten resme kadar değişen ve bütünlükler, cilt ve saç2 üzerinde canlı desenler olarak ortaya çıkan çarpıcı bir şekilde çeşitlidir. Çeşitliliğe rağmen, pigmentasyon yanıtında rol oynayan genlerin repertuarı çarpıcı bir şekilde korunmuştur. Melanin sentezleyen makinenin temel bileşenleri, örneğin anahtar melanin sentezleyici enzimler, melanozomların bileşenleri ve sinyal yoluna yukarı akış bağlantısı, organizmalar arasında temelde aynı kalır. İnce genetik farklılıklar, tür3'te gözlenen pigmentasyon modellerinde dramatik değişiklikler meydana getirir. Bu nedenle, daha düşük omurgalı bir organizma olan zebra balığında (Danio rerio) ters genetik bir yaklaşım, genlerin pigmentlidurumun 4 oluşturulmasındaki katılımını deşifre etmek için mükemmel bir fırsat sunar.
Zebra balığı embriyoları, tek hücreli döllenmiş bir zigottan larvaya döllenme sonrası ~24 saatlik bir süre içinde gelişir (hpf)5. Çarpıcı bir şekilde, melanosit eşdeğeri hücreler - melanoforlar - dermiste bulunan ve koyu melanin içeriği6 nedeniyle göze çarpan büyük hücrelerdir. Bu nöral tepe türevli hücreler ~11 hpf yayar ve ~24 hpf 6,7 pigmente başlar. Korunmuş gen ekspresyon modülleri, melanosit fonksiyonlarını düzenleyen anahtar faktörlerin tanımlanmasını sağlamış ve melanosit gelişiminin seçici aşamalarını etiketleyen transgenik floresan muhabir hatları Tg (sox10: GFP), Tg (mitfa: GFP) ve Tg (ftyrp1: GFP) 8,9,10'un geliştirilmesine yol açmıştır. Bu transgenik balık çizgilerinin kullanılması, melanositlerin hücre biyolojisinin doku bağlamında organizma düzeyinde gelişimsel zaman çizelgelerine göre uygun ipuçlarıyla sorgulanmasını sağlar. Bu muhabirler, melanositlerin pigment bazlı kantitasyonunu tamamlar ve melanin içeriğinden bağımsız olarak melanosit sayılarının farklı bir şekilde değerlendirilmesini sağlar.
Bu makale, melanin içeriği ve melanosit sayıları olmak üzere iki kritik parametreyi değerlendirerek melanositlerin biyolojisini deşifre etmek için ayrıntılı bir protokol sunmaktadır. Birincisi, bir hipopigmentasyon yanıtından kaynaklanan yaygın bir fonksiyonel okuma iken, ikincisi melanositlerin spesifikasyonunda veya hayatta kalmasında bir azalma ile ilişkilidir ve genellikle genetik veya edinilmiş depigmentasyon koşullarıyla ilişkilidir. Bu ters genetik taramanın genel stratejisi, bir morfolino kullanarak seçilmiş genleri susturmak ve melanosit spesifik sonuçları araştırmaktır. Melanin içeriği, ortalama gri değerlerin görüntüye dayalı nicelleştirilmesi kullanılarak analiz edilir ve ardından bir melanin içeriği testi kullanılarak doğrulanır. Olgunlaşmanın çeşitli aşamalarındaki melanositlerin sayısı, görüntü tabanlı kantitasyon kullanılarak analiz edilir ve FACS analizi kullanılarak daha da doğrulanır. Burada, tarama protokolü, melanogenezde rol oynayan karbonik anhidraz 14 olmak üzere iki aday gen ve nöral krest öncü popülasyonundan melanositlerin spesifikasyonunda yer alan bir histon varyantı H2AFZ.2 kullanılarak gösterilmiştir. Birincisi melanosit sayılarını değil melanin içeriğini değiştirirken, ikincisi belirtilen melanositlerin sayısını ve sonuç olarak embriyodaki melanin içeriğini değiştirir. Sonuçta, bu yöntem, bir aday genin pigmentasyondaki rolünü tanımlamak ve melanosit sayılarını melanin içeriğine karşı kontrol etmedeki rolünü ayırt etmek için ayrıntılı bir protokol sağlar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Zebra balığı deneyleri, Hindistan'daki CSIR-Genomik ve Bütünleştirici Biyoloji Enstitüsü'nün (IGIB) kurumsal hayvan etiği onayına (IAEC) sıkı sıkıya bağlı olarak gerçekleştirildi (Öneri No 45a). Hayvanların çektiği acıları en aza indirmek için tüm çabalar gösterildi.
1. Zebra balığı embriyolarına morfolino enjekte edilmesi
- Standart bir iğne çektirici kullanarak, çok keskin ve kapalı uçlu pipetler çizin.
- Morfolino içeren çözeltiyi bir mikroyükleyici ucu kullanarak mikropipetlere yükleyin ve mikroenjektör aparatına yerleştirin. Mikropipeti kilitlemek için vidayı düzgün bir şekilde sıkın.
NOT: Morfolinoların dozaj standardizasyonu gereklidir. Uygun dozaj% >70 sağkalım oranına ve 24 hpf'de spesifik bir fenotipe sahiptir. - İnce forseps kullanarak mikropipetin ucunu kesin ve kalibre edin11.
- Kalibre etmek için, mikropipetten kılcal tüpe 1 hacim morfolino çözeltisi enjekte edin ve enjeksiyon süresini 1 sn'de tutun. Bunu beş kez tekrarlayın. 1 mm = 30 nL hacim standardını kullanarak, kılcal boruyu bir ölçüm ölçeğine karşı tutarak 5 saniyede enjekte edilen hacmi bulun. Yukarıdaki bilgileri kullanarak, enjeksiyon12 başına 1-3 nL enjekte etmek için gereken süreyi (saniye cinsinden) hesaplayın.
NOT: Standart, 1 mm = 30 nL, mikroenjektör basınç ayarlarına ve kalibrasyon için kullanılan kılcal damarın çapına özgüdür. İdeal olarak, enjeksiyon, döllenmeden sonra 15-20 dakika içinde oluşan yumurta sarısı hücresi arayüzüne yapılmalıdır. Çoklu enjeksiyonları kolaylaştırmak için, embriyoları daha düşük bir sıcaklıkta (18 ° C) tutarak gelişim biraz geciktirilebilir. Bununla birlikte, bu minimumda tutulmalı ve düşük sıcaklığın gen ekspresyon değişiklikleri üzerindeki bileşik etkisi nedeniyle 30 dakikadan fazla uzatılmamalıdır. - Embriyoları agaroz dökümlü bir Petri kabına (60 mm) monte edin. Embriyoları sırtların içine sıkıca istifleyin. Ateşle cilalanmış cam pipetler kullanarak, enjeksiyon için doğru yönde hizalayın.
- Bir mikroskop altında, mikropipeti embriyoya yaklaştırmak için manipülatörler kullanın ve ayak pedalına basarak yumurta sarısı hücresi arayüzünün içine enjekte edin.
- Tüm embriyoları benzer şekilde enjekte edin; Onları taze embriyo su ortamı içeren bir Petri kabında toplayın ve 28 ° C'de inkübe edin.
- Enjekte edilen embriyoları 6-8 saat sonra kontrol edin. Yüksek opaklıkları nedeniyle tanımlanabilen tüm ölü embriyoları çıkarın ve enfeksiyonu önlemek için embriyo suyunu günde en az bir kez değiştirmeye devam edin.
2. Pigmentasyon analizi
- 3 dpf zebra balığı embriyolarında lateral orta hat melanoforlarını saymak için hazırlık
- Embriyoları hareketsiz hale getirmek için% 0.016 nöro-müsküler anestezi ile tedavi edin.
- Embriyoları görüntüleme için monte etmek için, Petri kabına (60 mm) birkaç mililitre% 1.5-2 metilselüloz ekleyin, böylece ince bir tabaka oluşturur. Bir Pasteur pipet kullanarak, görüntüleme sırasında daha fazla hareketi kısıtlamak için embriyoları seçin ve yavaşça metilselüloz içine yerleştirin.
- Optimal lateral (dorsal şerit, ventral şerit, yumurta sarısı şeridi ve orta hat melanoforları) veya dorsal (başın dorsal kısmındaki melanoforlar) görüntüleme için konumlarını ayarlayın. Bitişik melanoforların daha iyi çözünürlüğü için, daha yüksek büyütmede görüntü (>5x)
- Parlak alan görüntüleme
NOT: Parlak alan görüntüleme, 8-10x büyütmeli bir stereomikroskop kullanılarak gerçekleştirilir.- Zebra balığı embriyolarını içeren Petri kabını mikroskop altına yerleştirin. Bir manipülatör kullanarak, balığı bu yönde ayarlayın, böylece beş melanosit embriyonik çizgisinin tümü aynı anda görünür (dorsal, ventral, iki lateral, yumurta sarısı) (Şekil 1C). Alma yazılımını kullanarak görüntüleri hızla yakalayın. Hayvanın görüntülenmeden önce hareketi yeniden kazanması durumunda, tekrar anesteziye daldırın ve yeterince hareketsiz hale getirildikten sonra görüntülemeye devam edin.
- Bunu tüm balıklarla tekrarlayın ve büyütmenin her görüntü için aynı kalmasını sağlayın.
- ImageJ yazılımını kullanarak ortalama gri değeri hesaplama
- 2 dpf zebra balığı embriyosunun dorsal ve lateral görüntülerini alın.
- Aç aracını kullanarak ImageJ'de ölçülecek görüntüyü açın. Analiz edilecek alanın ana hatlarını çizmek için serbest şekil aracını kullanın. Ölçümleri ayarla seçeneğine gidin ve Ortalama gri değer | alanı'nı seçin. M'ye basın (veya Analiz Et | Ölçüm) kullanarak seçilen alanın ortalama gri değerini hesaplar.
- Analiz edilecek alanı sabit tutarak, her hayvan için ortalama gri alanı ayrı ayrı hesaplayın.
- Elde edilen verilerle bir çubuk grafik çizin (Şekil 2F).
- Melanin içeriği analizi
- 2 dpf'de, ~ 25 zebra balığı embriyosu toplamak için bir cam Pasteur pipet kullanın.
- 1 mL insülin iğneleri kullanarak manuel dekoryonasyon yapın ve bunları 1,5 mL mikrosantrifüj tüplerine ekleyin.
- Embriyo ortamını dikkatlice atın ve proteaz inhibitörü kokteyli ile 1 mL buz gibi soğuk lizis tamponu (20 mM sodyum fosfat (pH 6.8),% 1 Triton X-100, 1 mM PMSF, 1 mM EDTA) ekleyin ve sonikasyon ile protein lizatları hazırlayın.
- Lizatları 1 mL 1 N NaOH içinde çözün ve numuneleri bir su banyosunda 50 dakika boyunca 100 ° C'de inkübe edin. Lizatları tamamen homojenize etmek için aralıklı olarak vorteks.
- Bir spektrofotometre kullanarak numunelerin 490 nm'de absorbans okumalarını alın.
- Numune absorbansını bilinen sentetik melanin konsantrasyonlarının standart bir eğrisiyle karşılaştırarak melanin içeriğini hesaplayın (Şekil 2G).
3. Melanofor sayısı
NOT: Transgenik Zebra balığı embriyolarında floresan analizi iki yöntemle yapılabilir: 1) GFP-pozitif hücrelerin sayılması; 2) floresan yoğunluğunun ölçülmesi.
- Erken zebra balığı embriyolarında GFP-pozitif hücrelerin FACS tabanlı sayımı için hazırlık
- 200-250 ftyrp:GFP embriyo toplayın ve düz embriyo suyu kullanarak bir süzgeçte yıkayın. Negatif bir kontrol olarak, GFP-negatif, aşama uyumlu vahşi tip (Assam Wildtype) embriyolarıişleyin 12.
- İlgilenilen aşamaya bağlı olarak, embriyoları 0.6 mg / mL pronaz içeren bir Petri kabına aktarın. 5-10 dakika sonra, bir Pasteur pipet kullanarak, dekoryonlanmış embriyoları sade embriyo suyu içeren taze bir Petri kabına aktarın. Bir cam Pasteur pipet kullanarak, ~ 100 embriyo toplayın ve bunları 2 mL'lik bir mikrosantrifüj tüpüne aktarın.
- Ortamı dikkatlice atın ve 200 μL buz gibi soğuk Ringer çözeltisi (yumurta açma tamponu) ekleyin. Tüpü buz üzerinde tutarak, yumurta sarısı çözülene kadar içeriği ~ 20 kez yukarı ve aşağı doğru pipetleyin. Tüpleri 100 × g'da 4 °C'de bir masa üstü santrifüjde 1 dakika boyunca santrifüj edin. Tekrar santrifüj yapın ve süpernatanı dikkatlice atın.
- 1 mL'lik bir pipet kullanarak, yumurta sarısı çıkarılmış embriyoları 10 mL tripsin çözeltisi (hücre ayrışma tamponu) içeren bir Petri kabına aktarın. Embriyoların aşırı kalabalıklaşmasını ve verimsiz tripsinizasyonu önlemek için birden fazla Petri kabında uygulayın. 1 mL'lik bir pipet kullanın, agregasyonu azaltmak için embriyo gövdelerini içeren çözeltiyi bir veya iki kez karıştırın.
- Petri kaplarını oda sıcaklığında 15 dakika (<24 hpf embriyo) veya 30 dakika (24-30 hpf embriyo) inkübe edin. Hücrelerin parçalanmasına yardımcı olmak için ara sıra 1 mL'lik bir pipet kullanarak süspansiyonu aspire edin ve dağıtın.
- Kuluçka döneminde, hücre sayımı için akış sitometre makinesini başlatın.
- 50 mL'lik bir konik tüpün üzerine 70 μm'lik bir hücre süzgeci yerleştirin ve tek hücreli bir süspansiyon elde etmek için tripnize edilmiş süspansiyonu süzgeçten geçirin. Petri bulaşıklarını yüzeye yapışmış hücreleri çıkarmak için aynı süspansiyonla birkaç kez yıkayın.
- Numuneleri 450 × g, 4 °C'de sallanan kova rotorunda 5 dakika boyunca döndürün.
- Süpernatantı atın ve peleti 1mL buz gibi soğuk 1x fosfat tamponlu salin (PBS) içinde yeniden askıya alın.
- 450 × g, 4 ° C'de 5 dakika boyunca tekrar döndürün ve süpernatanı atın.
- Son olarak, pelet PBS +% 5 fetal sığır serumunda tekrar askıya alın ve FACS çalışana kadar buz üzerinde tutun.
- Akış sitometresinin hazırlanması
- Akış sitometresini açın ve başlatmayı başlatın.
NOT: Makineyi açmadan önce, atık kutusunu boşaltın ve kılıf sıvısı tankını doldurun. - 70 μm (veya 85 μm) nozul için akışın akışını normalleştirin. Kararsızsa 10-15 dakika boyunca rahatsız edilmeden bırakın.
- Akış sitometresini açın ve başlatmayı başlatın.
- Bir akış sitometresi kullanarak floresan olarak etiketlenmiş hücreleri sayma
- Yeni bir deneme klasörü başlatın ve yan saçılmaya karşı ileri saçılmanın ve floresein izotiyosiyanat (FITC) yoğunluğunun histogramının bir dağılım grafiğini oluşturun.
- İleri ve yan saçılma kapılarını (çiftleri ve kalıntıları dışlamak için) ve FITC eşiğini ayarlamak için önce vahşi tip hücreleri yükleyin.
- Kapılar ayarlandıktan sonra, numuneyi çıkarın ve melanositleri saymak için Tg (ftyrp1: GFP) embriyolarından izole edilen hücreleri yükleyin.
NOT: Burada, ftyrp1: GFP özellikle olgun melanositleri etiketlediğinden, FITC kapısı altındaki GFP-pozitif hücrelerin sayısı melanosit sayısına karşılık gelecektir. - Melanosit sayısını kontrol ile tahmin etmek ve karşılaştırmak için yukarıdaki adımı morfolino enjekte edilmiş örneklerle tekrarlayın.
- Zebra balığı embriyolarında floresan yoğunluğunun ölçülmesi
- Bir cam Pasteur pipet kullanarak, 100-120 embriyo toplayın ve bunları düz embriyo suyu içeren bir Petri kabına aktarın.
- ~ 10-12 hpf'de, pigmentasyonu inhibe etmek için embriyoları% 0.003 1-fenil-2-tiyoüreye aktarın.
- <48 hpf embriyoları görüntülemek için insülin iğneleri kullanarak manuel dekoryonasyon gerçekleştirin.
- Embriyoları hareketsiz hale getirmek için,% 0.016 trikain ile tedavi edin.
- Görüntüleme için embriyoları monte etmek için, Petri kabına (60 mm) birkaç mL% 1.5-2 metilselüloz koyun, böylece ince bir tabaka oluşturur. Görüntüleme sırasında daha fazla hareketi kısıtlamak için embriyoları metilselüloza ekleyin. Örnekleri içeren Petri kabını mikroskop altına yerleştirin. Bir pipet ucu kullanarak, hayvanı istediğiniz yönde ayarlayın.
- Alma yazılımını kullanarak görüntüleri alın. <24 hpf embriyolar için, tüm embriyoyu bir kerede 10x büyütme altında yakalayın. >24 hpf aşamaları için, birden fazla tarama alanı elde edin ve daha sonra bunları bir araya getirin (dikin).
- Bunu tüm balıklarla tekrarlayın ve edinme ayarının deney boyunca sabit kaldığından emin olun.
- Miktar
- ImageJ yazılımını kullanarak görüntüyü daha fazla analiz edin.
- Aç aracını kullanarak ImageJ'de ölçülecek görüntüyü açın.
- Analiz için alanın ana hatlarını çizmek üzere serbest şekil aracını kullanın (Şekil 3E).
- M'ye basın (veya Analiz Et | Ölçüm) seçili bir alan yoğunluğu ölçümü elde etmek için.
- Analiz edilecek alanı sabit tutarak, her hayvan için alan başına ortalama yoğunluğu ayrı ayrı hesaplayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Şekil 1'de açıklanan iş akışı, zebra balığı tek hücreli aşamasında morfolino bazlı genetik pertürbasyon gerçekleştirmek için kullanılmıştır. Pigmentasyon analizi aşağıda belirtildiği gibi çeşitli yöntemler kullanılarak yapılmıştır. Temsili sonuçları göstermek için, zebra balığı embriyosunun sarısına veya tek hücreli aşamasına h2afv ve ca14 genlerini hedef alan standartlaştırılmış antisens morfolino hacimleri enjekte edildi. Parlak alan görüntülemesine dayanan ilk fenotipleme, döllenmeden (hpf) 48 saat sonra, beş pigmentli melanofor şeridinin (dorsal, ventral, yumurta sarısı, iki lateral) belirgin olduğu zaman gerçekleştirildi.
Şekil 2A, B, embriyo başına lateral melanofor sayısını hesaplayarak pigmentasyonu analiz etmek için bir yaklaşımı temsil etmektedir. Lateral melanoforlar, 48 hpf aşamasında, eğik zebra balığının lateral bölgesine yakınlaştırılarak manuel olarak sayıldı. Pigmentli melanoforları ölçmek için alternatif bir yöntem (Ek Şekil S1), zebra balıklarının sırt görünümünü görüntüleyerek kafa melanoforlarının manuel olarak sayılmasını içerir.
Embriyo başına melanin içeriği, ImageJ yazılımı yardımıyla ilgilenilen bölgeyi sabit tutarak ortalama gri değerin ölçülmesiyle hesaplanır. Şekil 2C-F, ca14 ve h2afv morfantlarının ortalama gri değerinin kontrol morfantlarından daha yüksek olduğunu göstermektedir. Ortalama gri değer melanin içeriği ile ters orantılı olduğundan, ca14 ve h2afv genlerinin yıkılması, embriyo başına melanin içeriğinde bir azalmaya neden olmuştur. Melanin içeriğini ölçmek için bir başka sağlam yöntem de NaOH bazlı spektrofotometrik absorpsiyon yöntemidir. Şekil 2G'de gösterildiği gibi, ca14 morfantlarındaki toplam melanin içeriği kontrol morfantlarından daha azdı.
Floresan görüntüleme, zebra balığı melanofor gelişiminin iki farklı aşamasını ortaya çıkardı: erken tanımlanmış melanoforlar (mitfa: gfp) ve farklılaştırıcı melanoforlar (ftyrp: gfp). Morfolino bazlı değişiklik floresan görüntüleme ile değerlendirildi (Şekil 3A ve Şekil 3C). Bu gözlemleri daha da doğrulamak için, GFP-pozitif hücrelerin sıklığı FACS kullanılarak hesaplandı. H2afv'nin nakavt edilmesi, ancak ca14'ün değil, kontrole göre melanofor sayısını önemli ölçüde azaltmıştır (Şekil 3A-D). Ayrıca, ortalama floresan yoğunluğundaki/alanındaki bir azalma, ImageJ yazılımı kullanılarak hesaplanabilir ve ilgilenilen bölge sabit tutulur. H2afv morfantları, kontrol morfantlarına göre ortalama floresan yoğunluğunda/alanında anlamlı bir azalma göstermektedir (Şekil 3E,F).
Şekil 1: Zebra balığı kullanarak melanosit biyolojisinin düzenleyicilerini tanımlamak için ters genetik yaklaşım için iş akışı. (A) Mikroenjeksiyondan başlayarak pigmentasyonun çeşitli yöntemlerle değerlendirilmesine kadar deneysel iş akışını gösteren akış şeması. (B) Mikroenjeksiyon iğne tutucu ve mikromanipülatör, diseksiyon mikroskobu ile birlikte, tek hücreli evre zebra balığı embriyolarının mikroenjeksiyonu için tipik bir kurulumdur. (C) Zebra balığında 3 dpf'de beş çizginin tümünü gösteren embriyonik melanosit deseni: dorsolateral, iki lateral orta çizgi (dört kırmızı okla işaret edilen), ventral şerit ve yumurta sarısı şeridi. (D) Morbolino enjeksiyonu üzerine pigmentasyon sonucunu incelemek için, lateral orta hat melanoforları stereomikroskop altında sayılabilir. 2 dpf'de bir dorsal bölgenin parlak alan görüntüsü; Melanin içeriği, ortalama gri değer ölçülerek ölçülebilir. (E) Ortalama gri değerler, embriyonun melanin içeriği ile ters orantılıdır. Vahşi tip embriyolarda 2 dpf'de melanin dolu melanoforlar. (F) Bu melanoforlardaki melanin üretimini tahmin etmek için melanin içeriği testi yapılabilir. Transgenik zebra balığı, TYRP1 proteinini 2 dpf'de eksprese eden hücreleri etiketler. (G) Floresan olarak etiketlenmiş hücreler FACS kullanılarak ölçülebilir; ölçek çubuğu = 100 μm. Transgenik zebra balığı, Mitfa proteinini 1 dpf'de eksprese eden hücreleri etiketler. Hayvan başına ortalama floresan yoğunluğu, ImageJ yazılımı kullanılarak ölçülebilir. Ölçek çubukları = 100 μm. Kısaltmalar: dpf = döllenmeden sonraki günler; FACS = floresan ile aktive edilmiş hücre sıralama. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: Lateral orta hat melanoforlarının sayılması, ortalama gri değerin ölçülmesi ve melanin içeriği analizi. Morfantların yanal görünümünün parlak alan mikroskobik görüntüleri, ImageJ yazılımını kullanarak melanin içeriğini ölçmek için kullanıldı. (A) 3 dpf'de kontrol ve Histon varyantı h2afv (h2afv) morfantları; Sağda, melanosit sayılarını gösteren bu embriyoların yakınlaştırılmış gövde bölgeleri vardır. (B) H2afv morfantlarındaki melanoforların sayısı kontrole göre büyük ölçüde azalır, n > 3 biyolojik replikadan her biri 10'dur. (C) 2 dpf'de karbonik anhidraz 14 morfantlarına karşı kontrolün temsili görüntüsü. (D) 3 biyolojik replikada ca14 vs kontrol morfantlarının melanin miktarı, n > 10. (E) 2 dpf'de h2afv ve kontrol morfantlarının yanal görünümü. (F) H2afv'nin melanin içeriği ile kontrol morfantlarının miktarının belirlenmesi. Kırmızı dikdörtgenler, ImageJ tabanlı analiz için seçilen YG'yi temsil eder. (G) Toplam melanin içeriğini ölçmek için morfolino enjekte edilen embriyolar üzerinde yapılan melanin içeriği testi. SEM'± üç bağımsız deneyin ortalaması; **P < 0,01, **** P < 0,0001. Öğrencinin t-testi; hata çubukları, ortalamanın (SEM) ortalama ± standart hatasıdır. Ölçek çubukları = 100 μm. Kısaltmalar: MO = morpholino; dpf = döllenmeden sonraki günler; ROI = ilgilenilen bölge. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: FACS kullanarak floresan olarak etiketlenmiş hücrelerin ölçümü ve ortalama floresan yoğunluğunun ölçülmesi. (A) Ca14'ün floresan görüntüleri ve farklılaşan melanositlerin GFP ekspresyonu ile işaretlendiği Tg (ftyrp1: GFP) çizgisinden 2 dpf'de morfant embriyoları kontrol eder. (B) Ca14'teki melanofor sayısı ve 2 dpf'deki kontrol morfant embriyoları değişmeden kalır, n = 3 biyolojik replika. (C) 2 dpf h2afv'de floresan görüntüler ve Tg(ftyrp1:GFP) hattından kontrol morfantları. (D) H2afv morfantlarındaki melanofor sayısı, 2 dpf, n = 3 biyolojik replikasyondaki kontrol morfant embriyolarına kıyasla önemli ölçüde azalır. (E) Etiketli melanositlerle Tg'den (mitfa: GFP) 36 hpf'de kontrol ve h2afv morfant embriyoların floresan görüntüleri. (F) Hayvan başına MFI, ImageJ yazılımı kullanılarak hesaplanır ve tek tek veri kümelerini gösteren bir çubuk grafik olarak gösterilir. MFI, h2afv morfantlarında kontrole kıyasla önemli ölçüde azalmıştır. Kırmızı dikdörtgen, ImageJ yazılım tabanlı analiz için seçilen YG'yi temsil eder. n = 3 biyolojik çoğalır; P < 0.001, ****P < 0.0001. Öğrencinin t-testi; hata çubukları, ortalamanın (SEM) ortalama ± standart hatasıdır; ölçek çubukları = 100 μm. Kısaltmalar: MO = morpholino; FACS = floresan ile aktive edilmiş hücre sıralama; GFP = yeşil floresan proteini; dpf = döllenmeden sonraki günler; ROI = ilgilenilen bölge; MFI = ortalama floresan yoğunluğu. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.
Ek Şekil S1: Baş melanoforlarının kantitasyonu. (A) H2afv'nin dorsal görünümü ve kafa melanoforlarını gösteren 48 hpf'de kontrol morfantları. Kırmızı kutu YG'yi temsil eder. İlgi alanını sabit tutarak, kafa melanoforlarının sayısı manuel olarak ölçülebilir. (B) Kafa melanoforlarının sayısı h2afv nakavtı üzerine önemli ölçüde azalmıştır. Barlar, her biri >30 embriyo ile embriyo başına kafa melanoforu sayısının% 95'i ile geometrik ortalamayı temsil eder. Ölçek çubukları = 100 μm. Kısaltmalar: MO = morpholino; CI = güven aralığı; HPF = döllenmeden sonraki saatler; ROI = ilgilenilen bölge. Bu Dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.
Ek Şekil S2: PTU ile tedavi edilen insan primer melanositlerinin mikrodizisi. Isı haritası, insan primer melanositlerinde tedavi üzerine pigmentasyon genlerinin (mitf, tirozinaz, dct, mc1r) ekspresyonunu gösterir. Kısaltmalar: PTU = 1-fenil-2-tiourea; tyr = tirozinaz. Bu Dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Pigmentasyon fenotipi genellikle melanin içeriğindeki değişiklikler veya pigment taşıyan melanositlerin sayısındaki değişiklikler olarak kendini gösterir. Burada açıklanan yöntem, bu dikotominin diseksiyonuna izin verir ve melanin içeriğinden bağımsız olarak, melanin içeriğinin ve embriyo başına melanofor sayısının kalitatif ve kantitatif olarak değerlendirilmesine izin verir. Zebra balıklarının yüksek doğurganlığı, pigmentli melanositlerin görünür doğası ve melanozom transferinin olmaması, orta verimli taramaya uygun bu ters genetik yaklaşımı kullanarak melanosit biyolojisinin diseksiyonunu sağlar.
Morfolino bazlı susturma seçimi, susturma kolaylığından ve birden fazla adayı paralel olarak test etme yeteneğinden kaynaklanmaktadır. Morbolino bazlı bir susturma yaklaşımı kullanmanın belirli sınırlamaları vardır ve bu değerli araçların kullanımı ve yorumlanması için kılavuzlar daha önce açıklanmıştır13. Temel olarak, birden fazla MO kullanılarak nakavt üzerine fenotipin doğrulanması, bu soruna somut bir çözüm sağlar. Alternatif bir strateji, CRISPR tabanlı genetik pertürbasyonun kullanılmasıdır. Fenotipin penetransı, genetik olayların doğal olarak daha düşük sıklığı nedeniyle sınırlıdır ve heterojen mutasyonlarla birleştirilebilir. Bu, ters genetik tarama için kullanımını sınırlar14.
Melanosit seçici pertürbasyonların fenotip değerlendirmesi genellikle değişmiş melanojenik yanıt nedeniyle pigment içeriğinin azalmasına neden olur. Bununla birlikte, melanositlerin spesifikasyonunu bozan ve dolayısıyla genel melanosit sayılarındaki azalmaya bağlı olarak pigmentasyonda bir azalmaya neden olan birkaç gen vardır. İki senaryonun sistematik bir diseksiyonu, genin pigmentasyondaki moleküler işlevini atfetmek için gereklidir. Melanin içeriğinin ölçümü, melanin polimerinin karmaşık doğası ile birleştirilir. Mevcut iki yöntemden, yani NaOH ile melanin çözünürlüğü ve kararlı melanin oksidasyon ürünlerinin HPLC tabanlı tespiti 1H-pirrol-2,3,5-trikarboksilik asit ve pirrol-2,3- dikarboksilik asit, ilk yöntem laboratuvar ortamında rutin olarak gerçekleştirilebilirken, ikincisi belirli standartlar ve sofistike enstrümantasyon gerektirir15.
Ek olarak, NaOH yönteminin gerektirdiği embriyo sayısı, tespitte yer alan birkaç adım nedeniyle daha yüksektir. NaOH bazlı hidroliz, melanini çözündürür ve spektrofotometrik kantitasyonu mümkün kılar. Bu yöntem sağlam olsa da ve orta verimli bir ekran için benimsenebilse de (bir seferde 10-15 aday), ksantoforlarda bulunan ksantin, 400-450 nm aralığındaki doğal emilimi nedeniyle potansiyel bir müdahale edici maddedir16. Bu nedenle, melanin içeriğindeki azalmayı doğrulamak için görüntü analizine dayalı ortalama gri değer belirleme ve melanin içeriği testi arasında bir uyum sağlanmalıdır.
PTU, pigmentasyonu azaltmak ve aksi takdirde şeffaf embriyoyu görselleştirmek için kolay bir araç sunar. Kullanım muhtemelen geri besleme değişikliklerine neden olabilir ve melanositlerde değişikliklere neden olabilir. Bununla birlikte, pigmentasyon genlerinin ekspresyonunda minimal değişiklikler gözlemledik (Ek Şekil S2).
Melanositlerin sayımı lateral orta hatta ve baş bölgesinde en kolay olanıdır, çünkü melanositler bu bölgelerde nispeten belirgin bir şekilde gözlemlenebilir (Ek Şekil S1). Lateral çizgi melanoforları, dorsal kök gangliyonlara yakın bulunan melanosit kök hücre popülasyonundan kaynaklanır18. Bu popülasyonun görüntülenmesi, embriyo başına sabit sayı ve net ayrım gibi çeşitli avantajlara sahiptir. Bununla birlikte, iki karşıt çizginin embriyoyu hafifçe eğerek görüntülenmesi gerekir; aksi takdirde embriyonun saydam doğası nedeniyle ikisi birleşir ve sayılmasını zorlaştırır (Şekil 1C'ye karşı Şekil 2C).
Zebra balığı melanoforları, nöro-ektodermden türetilen gözün pigmentli hücrelerinden farklıdır. Bunlar embriyo içindeki konumlarıyla ayırt edilebilir ve gözde vücut modeline karşı belirgindir. FACS tabanlı deneyde, göz kaynaklı hücreler, melanoforlardan önemli ölçüde daha küçük oldukları ve boyut veya dağılım kriterleri kullanılarak geçilebildikleri için boyutlarıyla ayırt edilebilir.
Transgenik çizgiler kullanılarak farklı olgunlaşma aşamalarındaki melanositlerin tahminleri, görüntü tabanlı kantitasyon kullanılarak kolayca gerçekleştirilir. Lateral hat melanoforlarının sayısının kantitasyonu, sayıları embriyonun her iki tarafında 2 dpf ile 5 dpf arasında bir pencerede değiştiğinden sağlamdır17. Bununla birlikte, lateral hat melanoforlarının sayısı, dorsal kök ganglion ile ilişkili kök hücre havuzunun göçü ve kurulması ile belirlenir18. Bu nedenle, bu süreçlerdeki herhangi bir değişiklik benzer bir gözleme yol açabilir. Bu kafa karıştırıcı faktörün üstesinden gelmek için, tüm melanoforların FACS tabanlı tahmini somut bir çözümdür.
Alternatif olarak, kafa melanoforlarının kantitasyonu, Ek Şekil S1'de melanofor sayıları için bir vekil olarak tanımlandığı gibi gerçekleştirilebilir. Melanosit sayılarının kararlı durum seviyelerindeki değişikliklerin, söz konusu aday gen için iki zıt fonksiyonu gösterebileceğini belirtmek ilginçtir. Ya nöral-tepe öncüllerinden melanositlerin spesifikasyonunun azalmasına neden olabilir ya da melanosit spesifik ölüme neden olabilir ve tünel testi gibi yöntemler kullanılarak ele alınması gerekir. Canlı hücre görüntülemesi ile takip edilen mikroenjeksiyonlar gibi varyasyonlar, migrasyon ve paternleme gibi diğer melanosit spesifik fenotiplerin izlenmesini sağlayacaktır. Pigment hücresi araştırmacılarının ilgisini çeken, balık sisteminde etkili olmayan melanozom transferi süreci olacaktır. Bununla birlikte, melanoforlardaki uyumlu melanozom hareketi, burada modifikasyonlarla açıklanan canlı hücre görüntülemesindeki değişikliklerle incelenebilir. Sonuçta, bu video makalesinde sunulan ayrıntılı protokol, pigment hücresi biyolojisi araştırmacılarının aday genleri sorgulamalarını ve melanosit biyolojisindeki rollerini değerlendirmelerini sağlayacaktır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Tüm yazarlar çıkar çatışması olmadığını beyan eder.
Acknowledgments
Bu makalede sunulan çalışmayı desteklemek için Bilimsel ve Endüstriyel Araştırma Konseyi vide projesi MLP2008 ve Bilim ve Teknoloji Bölümü'nün GAP165 projesi için finansman desteğini kabul ediyoruz. Jeyashri Rengaraju ve Chetan Mishra'ya deneylerdeki yardımları için teşekkür ederiz.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.5 mL Microtubes | Axygen | MCT-150-A | For preparing MO solution |
| 2 mL Microtubes | Axygen | MCT-200-C | For washing steps in FACS protocol |
| Agarose | Sigma-Aldrich | A-9539-500G | For microinjection |
| BD FACSAria II | BD Biosciences | NA | For cell sorting |
| Capillary tube | Drummond | 1-000-0010 | |
| Corning cell strainer | Corning | CLS431751 | For making single cell suspension |
| DMEM High Glucose Media | Sigma-Aldrich | D5648 | FACS protocol |
| Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate (Tricaine) | Sigma-Aldrich | E10521-50G | to immobilize ZF for imaging |
| Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt dihydrate (EDTA) | Sigma-Aldrich | E5134 | For cold lysis buffer |
| FACS tubes | BD-Biosciences | 342065 | FACS protocol |
| Fetal bovine serum (FBS) | Invitrogen | 10270 | FACS protocol |
| Graphpad prism Software | Graphstats Technologies | NA | For data representation |
| ImageJ Software | National Institute of health | NA | For image analysis |
| Insulin Syringes (1 mL) | DispoVan | NA | For manual dechorionation |
| Melanin, Synthetic | Sigma-Aldrich | M8631 | For melanin content assay |
| Methylcellulose | Sigma-Aldrich | M7027-250G | to immobilize ZF for imaging |
| Microloader tips | Eppendorf | 5242956003 | For microinjection |
| Morpholino | Gene-tools | NA | For knock-down experiments |
| N-Phenylthiourea (PTU) | Sigma-Aldrich | P7629 | to inhibit melanin formation |
| Needle puller | Sutter Instrument | P-97 | For microinjection |
| Nunc 15 mL Conical Sterile Polypropylene Centrifuge Tubes | Thermo Fisher Scientific | 339650 | FACS protocol |
| Petridish (60 mm) | Tarsons | 460090 | For embryo plates |
| Phenylmethylsulphonyl fluoride | Sigma-Aldrich | 10837091001 | For cold lysis buffer |
| Phosphate buffer saline (PBS) | HiMedia | TL1099-500mL | For washing cells |
| Pronase | Sigma-Aldrich | 53702 | For dechorionation |
| Protease inhibitor cocktail | Sigma-Aldrich | P8340 | For cold lysis buffer |
| Sheath fluid | BD FACSFlowTM | 342003 | FACS protocol |
| Sodium phosphate | Merck | 7558-79-4 | Cold lysis buffer |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T9284-500ML | For cold lysis buffer |
| TrypLE | Gibco | 1677119 | For trypsinization |
References
- Kelsh, R. N. Genetics and evolution of pigment patterns in fish. Pigment Cell Research. 17 (4), 326-336 (2004).
- Jablonski, N. G. The evolution of human skin and skin color. Annual Review of Anthropology. 33, 585-623 (2004).
- Hoekstra, H. Genetics, development and evolution of adaptive pigmentation in vertebrates. Heredity. 97 (3), 222-234 (2006).
- Quigley, I. K., Parichy, D. M. Pigment pattern formation in zebrafish: a model for developmental genetics and the evolution of form. Microscopy Research and Technique. 58 (6), 442-455 (2002).
- Meyers, J. R. Zebrafish: development of a vertebrate model organism. Current Protocols Essential Laboratory Techniques. 16 (1), 19 (2018).
- Kelsh, R. N., Schmid, B., Eisen, J. S. Genetic analysis of melanophore development in zebrafish embryos. Developmental Biology. 225 (2), 277-293 (2000).
- Rocha, M., Singh, N., Ahsan, K., Beiriger, A., Prince, V. E. Neural crest development: insights from the zebrafish. Developmental Dynamics. 249 (1), 88-111 (2020).
- Carney, T. J., et al. A direct role for Sox10 in specification of neural crest-derived sensory neurons. Development. 133 (23), 4619-4630 (2006).
- Curran, K., Raible, D. W., Lister, J. A. Foxd3 controls melanophore specification in the zebrafish neural crest by regulation of Mitf. Developmental Biology. 332 (2), 408-417 (2009).
- Zou, J., Beermann, F., Wang, J., Kawakami, K., Wei, X. The Fugu tyrp1 promoter directs specific GFP expression in zebrafish: tools to study the RPE and the neural crest-derived melanophores. Pigment Cell Research. 19 (6), 615-627 (2006).
- Xu, Q.
- Hermanson, S., Davidson, A. E., Sivasubbu, S., Balciunas, D., Ekker, S. C. Sleeping Beauty transposon for efficient gene delivery. Methods in Cell Biology. 77, 349-362 (2004).
- Stainier, D. Y., et al. Guidelines for morpholino use in zebrafish. PLoS Genetics. 13 (10), 1007000 (2017).
- Wu, N., et al. The progress of CRISPR/Cas9-mediated gene editing in generating mouse/zebrafish models of human skeletal diseases. Computational and Structural Biotechnology Journal. 17, 954-962 (2019).
- Affenzeller, S., Frauendorf, H., Licha, T., Jackson, D. J., Wolkenstein, K. Quantitation of eumelanin and pheomelanin markers in diverse biological samples by HPLC-UV-MS following solid-phase extraction. PLoS One. 14 (10), 0223552 (2019).
- Fernandes, B., Matamá, T., Guimarães, D., Gomes, A., Cavaco-Paulo, A.
- Hultman, K. A., Johnson, S. L. Differential contribution of direct-developing and stem cell-derived melanocytes to the zebrafish larval pigment pattern. Developmental Biology. 337 (2), 425-431 (2010).
- Mort, R. L., Jackson, I. J., Patton, E. E. The melanocyte lineage in development and disease. Development. 142 (4), 620-632 (2015).
