Summary
Regulatorer av melanocyttfunksjoner styrer synlige forskjeller i pigmenteringsresultatet. Dechiffrering av den molekylære funksjonen til kandidatpigmenteringsgenet utgjør en utfordring. Her demonstrerer vi bruken av et sebrafiskmodellsystem for å identifisere kandidater og klassifisere dem i regulatorer av melanininnhold og melanocyttnummer.
Abstract
Melanocytter er spesialiserte neural crest-avledede celler som er tilstede i epidermal hud. Disse cellene syntetiserer melaninpigment som beskytter genomet mot skadelige ultrafiolette strålinger. Forstyrrelser i melanocyttfunksjonen fører til pigmentforstyrrelser som piebaldisme, albinisme, vitiligo, melasma og melanom. Sebrafisk er et utmerket modellsystem for å forstå melanocyttfunksjoner. Tilstedeværelsen av iøynefallende pigmenterte melanocytter, enkel genetisk manipulasjon og tilgjengeligheten av transgene fluorescerende linjer letter studiet av pigmentering. Denne studien benytter bruk av villtype og transgene sebrafisklinjer som driver grønt fluorescerende protein (GFP) -uttrykk under mitfa - og tyrp1-promotorer som markerer forskjellige stadier av melanocytter.
Morfolinobasert deaktivering av kandidatgener oppnås for å evaluere det fenotypiske utfallet på larvepigmentering og er anvendelig for screening for regulatorer av pigmentering. Denne protokollen demonstrerer metoden fra mikroinjeksjon til avbildning og fluorescensaktivert cellesortering (FACS)-basert disseksjon av fenotyper ved bruk av to kandidatgener, karbonanhydrase 14 (Ca14) og en histonvariant (H2afv), for å vurdere pigmenteringsresultatet grundig. Videre demonstrerer denne protokollen segregering av kandidatgener i melanocyttspesifikatorer og differensiatorer som selektivt endrer henholdsvis melanocyttall og melanininnhold per celle.
Introduction
Mens bruken av melanin for fotobeskyttelse har utviklet seg flere ganger over dyreriket, har vertebrater tilsynelatende perfeksjonert prosessen. Dedikerte pigmentproduserende celler med et forseggjort maskineri for å syntetisere og inneholde melanin er konservert fra fisk til mennesker1. Imidlertid er utfallet av pigmentering dramatisk variert, alt i farge til recipience og presenterer som levende mønstre på integrater, huden og håret2. Til tross for mangfoldet er repertoaret av gener involvert i pigmenteringsrespons påfallende konservert. Kjernekomponentene i det melaninsyntetiserende maskineriet, som de viktigste melaninsyntetiserende enzymene, komponentene i melanosomene og oppstrømsforbindelsen til signalveien, forblir i det vesentlige identiske på tvers av organismer. Subtile genetiske forskjeller medfører dramatiske endringer i pigmenteringsmønstrene observert på tvers av arter3. Derfor gir en omvendt genetisk tilnærming i en lavere virveldyrorganisme, sebrafisken (Danio rerio), en utmerket mulighet til å dechiffrere involvering av gener i å gjengi pigmentert tilstand4.
Sebrafiskembryoer utvikler seg fra en encellet befruktet zygote til en larve innenfor et spenn på ~24 timer etter befruktning (hpf)5. Påfallende nok er melanocytt-ekvivalente celler - melanophorene - store celler som er tilstede i dermis og er iøynefallende på grunn av det mørke melanininnholdet6. Disse nevrale kamavledede cellene utstråler ~ 11 hpf og begynner å pigmentere ~ 24 hpf 6,7. Konserverte genuttrykksmoduler har gjort det mulig å identifisere nøkkelfaktorer som orkestrerer melanocyttfunksjoner og ført til utvikling av transgene fluorescerende reporterlinjer Tg (sox10: GFP), Tg (mitfa: GFP) og Tg (ftyrp1: GFP) 8,9,10 som merker selektive stadier av melanocyttutvikling. Ved å bruke disse transgene fiskelinjene muliggjøres undersøkelse av cellebiologi av melanocytter på organismenivå i vevskonteksten med passende signaler i henhold til utviklingstidslinjene. Disse reporterne utfyller pigmentbasert kvantifisering av melanocytter og muliggjør en tydelig vurdering av melanocytttall uavhengig av melanininnhold.
Denne artikkelen gir en detaljert protokoll for å dechiffrere biologien til melanocytter ved å vurdere to kritiske parametere, nemlig melanininnhold og melanocyttall. Mens førstnevnte er en vanlig funksjonell avlesning som kommer fra en hypopigmenteringsrespons, er sistnevnte forbundet med en reduksjon i spesifikasjonen eller overlevelsen av melanocytter og er ofte forbundet med genetiske eller ervervede depigmenteringsforhold. Den overordnede strategien for denne omvendte genetiske skjermen er å stille utvalgte gener ved hjelp av en morfolino og undersøke melanocyttspesifikke utfall. Melanininnhold analyseres ved hjelp av bildebasert kvantifisering av gjennomsnittlige gråverdier etterfulgt av bekreftelse ved hjelp av en melanininnholdsanalyse. Antall melanocytter i ulike stadier av modning analyseres ved hjelp av bildebasert kvantifisering og bekreftes videre ved hjelp av FACS-analyse. Her er screeningprotokollen demonstrert ved bruk av to kandidatgener, nemlig karbonanhydrase 14, involvert i melanogenese, og en histonvariant H2AFZ.2 involvert i spesifiseringen av melanocytter fra forløperpopulasjonen til nevralkammen. Mens førstnevnte endrer melanininnholdet og ikke melanocyttallene, endrer sistnevnte antall spesifiserte melanocytter og følgelig melanininnholdet i embryoet. Alt i alt gir denne metoden en detaljert protokoll for å identifisere rollen til et kandidatgen i pigmentering og skille sin rolle i å kontrollere antall melanocytter versus melanininnhold.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Sebrafiskforsøk ble utført i strengt samsvar med institusjonell dyreetikkgodkjenning (IAEC) fra CSIR-Institute of Genomics and Integrative Biology (IGIB), India (forslag nr. 45a). Alle anstrengelser ble gjort for å minimere dyrs lidelse.
1. Injisering av morfolino i sebrafiskembryoer
- Bruk en standard nåleavtrekker til å trekke opp svært skarpe og lukkede pipeter.
- Legg oppløsningen som inneholder morfolino inn i mikropipettene ved hjelp av en mikrolasterspiss og sett den inn i mikroinjektorapparatet. Stram skruen ordentlig for å låse mikropipetten.
MERK: Doseringsstandardisering av morfoliner er nødvendig. Den riktige dosen har en overlevelsesrate på >70% og en spesifikk fenotype ved 24 hpf. - Klipp spissen av mikropipetten med fin tang og kalibrer den11.
- For å kalibrere, injiser 1 volum morfolinooppløsning i kapillærrøret fra mikropipetten, og hold injeksjonstiden på 1 s. Gjenta dette fem ganger. Ved å bruke standarden, 1 mm = 30 nL volum, finn volumet injisert i 5 s ved å holde kapillærrøret mot en måleskala. Ved hjelp av informasjonen ovenfor beregner du tiden (i sekunder) som kreves for å injisere 1-3 nL per injeksjon12.
MERK: Standarden, 1 mm = 30 nL, er spesifikk for mikroinjektortrykkinnstillingene og diameteren til kapillæren som brukes til kalibrering. Ideelt sett må injeksjonen gjøres til eggeplomme-cellegrensesnittet, som dannes innen 15-20 minutter etter befruktning. For å lette flere injeksjoner, kan utviklingen bli noe forsinket ved å opprettholde embryoer ved lavere temperatur (18 ° C). Dette bør imidlertid holdes på et minimum og ikke forlenges utover 30 minutter på grunn av den sammensatte effekten av lavere temperatur på genuttrykksendringer. - Monter embryoene på en agarosestøpt petriskål (60 mm). Stable embryoene tett innenfor ryggene. Bruk brannpolerte glasspipetter til å justere dem i riktig retning for injeksjon.
- Under et mikroskop, bruk manipulatorer for å bringe mikropipetten nærmere embryoet og injisere inne i eggeplomme-cellegrensesnittet ved å trykke på fotbryteren.
- Injiser alle embryoene på samme måte; samle dem i en petriskål som inneholder ferskt embryovannmedium og ruge ved 28 °C.
- Kontroller de injiserte embryoene etter 6-8 timer. Fjern alle døde embryoer som kan identifiseres på grunn av deres høye opasitet og fortsett å endre embryovannet minst en gang per dag for å unngå infeksjon.
2. Pigmentering analyse
- Forberedelse til telling av laterale midtlinjemelanophorer i 3 dpf sebrafiskembryoer
- Behandle embryoer med 0,016% nevro-muskulær bedøvelse for å immobilisere dem.
- For å montere embryoene for avbildning, tilsett noen få milliliter 1,5-2% metylcellulose i petriskålen (60 mm) slik at den danner et tynt lag. Bruk en Pasteur-pipette, plukk embryoer og plasser dem forsiktig i metylcellulose for å begrense videre bevegelse under avbildning.
- Juster posisjonen for optimal lateral (dorsalstripe, ventral stripe, eggeplomme stripe og midtlinje melanophorer) eller dorsale (melanophorer på den dorsale delen av hodet) avbildning. For bedre oppløsning av tilstøtende melanophorer, bilde ved høyere forstørrelse (>5x)
- Brightfield-avbildning
MERK: Brightfield-avbildning utføres ved hjelp av et stereomikroskop med 8-10x forstørrelse.- Plasser petriskålen som inneholder sebrafiskembryoene under mikroskopet. Bruk en manipulator, juster fisken i en slik orientering slik at alle fem melanocytt embryonale striper er synlige (dorsal, ventral, to laterale, eggeplomme) samtidig (figur 1C). Ta raskt bilder ved hjelp av oppkjøpsprogramvaren. I tilfelle hvor dyret gjenvinner bevegelse før det er avbildet, fordyp det i bedøvelse og fortsett med avbildning når det er tilstrekkelig immobilisert.
- Gjenta dette med all fisken og sørg for at forstørrelsen forblir den samme for hvert bilde.
- Beregne gjennomsnittlig grå verdi ved hjelp av ImageJ-programvare
- Ta dorsale og laterale bilder av 2 dpf sebrafiskembryoer.
- Åpne bildet som skal kvantifiseres i ImageJ ved hjelp av Åpne-verktøyet . Bruk frihåndsformverktøyet til å disponere området som skal analyseres. Gå til alternativet Angi målinger og velg Middelgrå verdi | område. Trykk M (eller Analyser | Mål) for å beregne gjennomsnittlig grå verdi for det valgte området.
- Hold området som skal analyseres konstant, beregne gjennomsnittlig grått område for hvert dyr separat.
- Plott et søylediagram med de innhentede dataene (figur 2F).
- Melanin innhold analyse
- Ved 2 dpf, bruk en glass Pasteur pipette for å samle ~ 25 sebrafisk embryoer.
- Utfør manuell dekorering med 1 ml insulinnåler og tilsett dem i 1,5 ml mikrosentrifugerør.
- Kast embryomediet forsiktig og tilsett 1 ml iskald lysisbuffer (20 mM natriumfosfat (pH 6,8), 1% Triton X-100, 1 mM PMSF, 1 mM EDTA) med proteaseinhibitorcocktail og fremstill proteinlysater ved sonikering.
- Løs lysatene i 1 ml av 1 N NaOH og inkuber prøvene ved 100 °C i 50 minutter i et vannbad. Vortex det intermitterende å homogenisere lysatene helt.
- Ta absorbansavlesninger av prøvene ved 490 nm ved hjelp av et spektrofotometer.
- Beregn melanininnholdet ved å sammenligne prøveabsorbansen med en standardkurve for kjente konsentrasjoner av syntetisk melanin (figur 2G).
3. Melanophore teller
MERK: Fluorescensanalyse i transgene sebrafiskembryoer kan gjøres ved to metoder: 1) telling av GFP-positive celler; 2) måling av fluorescensintensitet.
- Forberedelse for FACS-basert telling av GFP-positive celler i tidlige sebrafiskembryoer
- Samle 200-250 ftyrp: GFP-embryoer og vask dem i en sil med vanlig embryovann. Som en negativ kontroll, behandle GFP-negative, stadiematchede villtypeembryoer (Assam Wildtype)12.
- Basert på stadiet av interesse, overfør embryoene til en petriskål inneholdende 0,6 mg / ml pronase. Etter 5-10 min, ved hjelp av en Pasteur-pipette, overfør de dekorerte embryoene til en fersk petriskål som inneholder vanlig embryovann. Bruk en Pasteur-pipette i glass til å samle ~100 embryoer og overføre dem til et 2 ml mikrosentrifugerør.
- Kast mediet forsiktig og tilsett 200 μL iskald Ringer-løsning (deyolking buffer). Hold røret på is, pipetter innholdet opp og ned ~ 20 ganger til eggeplommen er oppløst. Sentrifuger rørene ved 100 × g i 1 min i en bordplatesentrifuge ved 4 °C. Sentrifuge igjen og kast forsiktig supernatanten.
- Bruk en 1 ml pipette, overfør de deyolked embryoene til en petriskål inneholdende 10 ml trypsinoppløsning (celledissosiasjonsbuffer). Utfør det i flere petriskåler for å unngå overbefolkning av embryoer og ineffektiv trypsinisering. Bruk en 1 ml pipette, bland oppløsningen som inneholder embryolegemene en eller to ganger for å redusere aggregeringen.
- Inkuber petriskålene ved romtemperatur i 15 minutter (<24 hpf-embryoer) eller 30 minutter (24-30 hpf-embryoer). Aspirer og dispenser suspensjonen av og til ved hjelp av en 1 ml pipette for å hjelpe oppløsningen av celler.
- I løpet av inkubasjonsperioden, initialiser strømningscytometermaskinen for celletelling.
- Plasser en 70 μm cellesil over et 50 ml konisk rør og pass den trypsiniserte suspensjonen gjennom silen for å oppnå en enkeltcellesuspensjon. Vask petriskålen med samme suspensjon noen ganger for å fjerne celler som er festet til overflaten.
- Spinn prøvene ved 450 × g, 4 °C i 5 minutter i en svingbar bøtterotor.
- Kast supernatanten og resuspender pelleten i 1 ml iskald 1x fosfatbufret saltvann (PBS).
- Spinn igjen ved 450 × g, 4 °C i 5 minutter og kast supernatanten.
- Til slutt, resuspender pelleten i PBS + 5% føtal bovint serum og hold den på is til FACS kjører.
- Klargjøring av flowcytometeret
- Slå på flowcytometeret og start oppstart.
NOTAT: Før du slår på maskinen, tøm avfallsbeholderen og fyll kappevæsketanken. - Normaliser strømmen av strømmen for en 70 μm (eller 85 μm) dyse. La den stå uforstyrret i 10-15 min hvis den er ustabil.
- Slå på flowcytometeret og start oppstart.
- Telle fluorescerende merkede celler ved hjelp av et flowcytometer
- Initialiser en ny eksperimentmappe og lag et punktdiagram med foroverspredning kontra sidespredning og et histogram av fluoresceinisotiocyanat (FITC)-intensitet.
- Last inn wild-type celler først for å sette fremover og side scatter porter (for å ekskludere dubletter og rusk) og FITC terskelen.
- Etter at portene er satt, fjern prøven og last cellene isolert fra Tg (ftyrp1: GFP) embryoer for å telle melanocytter.
MERK: Her, som ftyrp1: GFP spesifikt merker modne melanocytter, vil antall GFP-positive celler under FITC-porten tilsvare antall melanocytter. - Gjenta trinnet ovenfor med morfolinoinjiserte prøver for å estimere og sammenligne antall melanocytter med kontrollen.
- Måling av fluorescensintensitet i sebrafiskembryoer
- Bruk en Pasteur-pipette i glass til å samle 100-120 embryoer og overføre dem til en petriskål som inneholder rent embryovann.
- Ved ~10-12 hpf, overfør embryoene til 0,003% 1-fenyl-2-tiourea for å hemme pigmentering.
- Utfør manuell dekorering ved hjelp av insulinnåler for avbildning av <48 hpf-embryoer.
- For å immobilisere embryoer, behandle dem med 0,016% tricaine.
- For å montere embryoer for avbildning, legg noen få ml 1,5-2% metylcellulose i petriskålen (60 mm) slik at den danner et tynt lag. Legg embryoene til metylcellulose for å begrense ytterligere bevegelse under avbildning. Plasser petriskålen som inneholder prøvene under mikroskopet. Bruk en pipettespiss til å justere dyret i ønsket retning.
- Skaff bilder ved hjelp av anskaffelsesprogramvaren. For embryoer <24 hpf, fang hele embryoet på en gang under 10x forstørrelse. For >24 hpf trinn, skaff flere scan-felt og deretter montere (sy) dem sammen.
- Gjenta dette med all fisken og sørg for at innstillingen for anskaffelse forblir konstant gjennom hele forsøket.
- Kvantifisering
- Analyser bildet videre ved hjelp av ImageJ-programvaren.
- Åpne bildet som skal kvantifiseres i ImageJ ved hjelp av Åpne-verktøyet .
- Bruk frihåndsformverktøyet til å skissere analyseområdet (figur 3E).
- Trykk M (eller Analyser | Mål) for å oppnå en valgt områdeintensitetsmåling.
- Hold området som skal analyseres konstant, beregne gjennomsnittlig intensitet per område for hvert dyr separat.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Arbeidsflyten beskrevet i figur 1 ble brukt til å utføre morfolinobasert genetisk forstyrrelse på sebrafiskens encellestadium. Pigmenteringsanalyse ble utført ved hjelp av ulike metoder, som nevnt nedenfor. For å illustrere de representative resultatene ble standardiserte volumer av antisensemorfolino rettet mot h2afv- og ca14-gener injisert i eggeplomme- eller encellestadiet av sebrafiskembryoet. Den initiale fenotypingen basert på brightfield-avbildning ble utført 48 timer etter befruktning (hpf), da alle de fem pigmenterte melanophorstripene (dorsal, ventral, eggeplomme, to laterale) var tydelige.
Figur 2A,B representerer en tilnærming til å analysere pigmentering ved å beregne antall laterale melanophorer per embryo. Laterale melanophorer ble manuelt talt på 48 hpf-stadiet ved å zoome inn på den laterale regionen av den vippede sebrafisken. En alternativ metode for å kvantifisere de pigmenterte melanophorene (tilleggsfigur S1) innebærer manuell telling av hodemelanophorene ved å avbilde ryggbildet av sebrafisken.
Melanininnholdet per embryo beregnes ved å måle den gjennomsnittlige gråverdien, og holde interesseområdet konstant ved hjelp av ImageJ-programvare. Figur 2C-F viser at gjennomsnittlig gråverdi av ca14- og h2afv-morfanter var høyere enn i kontrollmorfanter. Siden den gjennomsnittlige gråverdien er omvendt proporsjonal med melanininnholdet, førte nedslag av ca14- og h2afv-gener til en reduksjon i melanininnhold per embryo. En annen robust metode for å kvantifisere melanininnholdet er en NaOH-basert spektrofotometrisk absorpsjonsmetode. Som vist i figur 2G var det totale melanininnholdet i ca14-morfanter mindre enn i kontrollmorfanter.
Fluorescerende avbildning viste to ulike stadier av melanophoreutvikling hos sebrafisk: tidlig spesifiserte melanophorer (mitfa:gfp) og differensierende melanophorer (ftyrp:gfp). Den morfolinobaserte endringen ble evaluert ved fluorescerende avbildning (figur 3A og figur 3C). For ytterligere å validere disse observasjonene ble frekvensen av GFP-positive celler beregnet ved hjelp av FACS. Nedslaget av h2afv, men ikke ca14, reduserte signifikant antall melanophorer med hensyn til kontroll (figur 3A-D). Videre kan en reduksjon i gjennomsnittlig fluorescensintensitet / område beregnes ved hjelp av ImageJ-programvare, og holde interesseområdet konstant. H2afv-morfanter viser en signifikant reduksjon i gjennomsnittlig fluorescerende intensitet/areal i forhold til kontrollmorfanter (figur 3E,F).
Figur 1: Arbeidsflyt for omvendt genetisk tilnærming for å identifisere regulatorer av melanocytbiologi ved bruk av sebrafisk. (A) Flytskjema som viser den eksperimentelle arbeidsflyten fra mikroinjeksjon til evaluering av pigmentering ved forskjellige metoder. (B) Mikroinjeksjonsnålholder og mikromanipulator, sammen med et dissekerende mikroskop, er et typisk oppsett for mikroinjeksjon av encellede sebrafiskembryoer. (C) Embryonalt melanocyttmønster hos sebrafisk ved 3 dpf som viser alle fem stripene: dorsolaterale, to laterale midtlinjer (spisset av fire røde piler), ventral stripe og eggeplommestripe. (D) For å studere pigmenteringsresultatet ved morfolinoinjeksjon, kan laterale midtlinjemelanophorer telles under et stereomikroskop. Brightfield-bilde av en dorsalregion ved 2 dpf; Melanininnholdet kan kvantifiseres ved å måle gjennomsnittlig grå verdi. (E) De gjennomsnittlige grå verdiene er omvendt proporsjonale med melanininnholdet i embryoet. Melaninfylte melanophorer ved 2 dpf i villtypeembryoer. (F) Melanininnholdsanalyse kan utføres for å estimere melaninproduksjonen i disse melanophorene. Transgen sebrafisk som merker cellene som uttrykker TYRP1-protein ved 2 dpf. (G) Fluorescerende merkede celler kan kvantifiseres ved hjelp av FACS; skala bar = 100 μm. Transgen sebrafisk som merker cellene som uttrykker Mitfa-protein ved 1 dpf. Gjennomsnittlig fluorescensintensitet per dyr kan måles ved hjelp av ImageJ-programvare. Skalastenger = 100 μm. Forkortelser: dpf = dager etter befruktning; FACS = fluorescensaktivert cellesortering. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Telling av laterale midtlinjemelanophorer, måling av gjennomsnittlig gråverdi og analyse av melanininnhold. Brightfield mikroskopiske bilder av lateral visning av morphants ble brukt til å kvantifisere melanininnhold ved hjelp av ImageJ-programvare. (A) Kontroll- og histonvariant h2afv (h2afv) morfanter ved 3 dpf; Til høyre er innzoomede trunkregioner av disse embryoene som viser melanocyttall. (B) Antall melanophorer i h2afv-morfanter er drastisk redusert i forhold til kontroll, n > 10 hver i 3 biologiske replikater. (C) Representativt bilde av kontroll vs karbonanhydrase 14 morfanter ved 2 dpf. (D) Melaninkvantifisering av ca14 vs kontrollmorfanter, n > 10 over 3 biologiske replikater. (E) Lateral visning av h2afv vs kontrollmorfanter ved 2 dpf. (F) Melanininnholdskvantifisering av h2afv vs kontrollmorfanter. Røde rektangler representerer ROI valgt for ImageJ-basert analyse. (G) Melanininnholdsanalyse utført på morfolinoinjiserte embryoer for kvantifisering av det totale melanininnholdet. Gjennomsnitt av tre uavhengige eksperimenter ± SEM .; **P < 0,01, **** P < 0,0001. Student t-test; feilfelt betyr ± standardfeil for gjennomsnittet (SEM). Skalastenger = 100 μm. Forkortelser: MO = morfolino; dpf = dager etter befruktning; ROI = interesseområde. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: Kvantifisering av fluorescerende merkede celler ved hjelp av FACS og måling av gjennomsnittlig fluorescensintensitet. (A) Fluorescensbilder av ca14 og kontrollmorfe embryoer ved 2 dpf fra Tg (ftyrp1: GFP) linje, hvor de differensierende melanocyttene er markert med GFP-uttrykk. (B) Antall melanophorer i ca14 og kontrollmorfe embryoer ved 2 dpf forblir uendret, n = 3 biologiske replikater. (C) Fluorescensbilder ved 2 dpf av h2afv og kontrollmorfanter fra Tg (ftyrp1: GFP) linje. (D) Antall melanophorer i h2afv-morfanter er signifikant redusert sammenlignet med kontrollmorfeembryoene ved 2 dpf, n = 3 biologiske replikater. (E) Fluorescensbilder av kontroll og h2afv morfe embryoer ved 36 hpf fra Tg (mitfa: GFP) med merkede melanocytter. (F) MFI per dyr beregnes ved hjelp av ImageJ-programvare og representeres som et søylediagram som viser individuelle datasett. MFI er signifikant redusert i h2afv morphants sammenlignet med kontroll. Rødt rektangel representerer ROI valgt for ImageJ-programvarebasert analyse. n = 3 biologiske replikater; P < 0,001, ****P < 0,0001. Student t-test; feilfelt betyr ± standardfeil av gjennomsnittet (SEM); skalastenger = 100 μm. Forkortelser: MO = morfolino; FACS = fluorescensaktivert cellesortering; GFP = grønt fluorescerende protein; dpf = dager etter befruktning; ROI = interesseområde; MFI = gjennomsnittlig fluorescensintensitet. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Tilleggsfigur S1: Kvantifisering av hodemelanophorer. (A) Dorsal visning av h2afv og kontroll morphants ved 48 hpf viser hodet melanophores. Rød boks representerer avkastningen. Ved å holde interesseområdet konstant, kan antall hodemelanophorer kvantifiseres manuelt. (B) Antall hodemelanophorer signifikant redusert ved h2afv knockdown. Barer representerer geometrisk gjennomsnitt med 95% KI av antall hodemelanophorer per embryo med >30 embryoer hver. Skalastenger = 100 μm. Forkortelser: MO = morfolino; CI = konfidensintervall; hpf = timer etter befruktning; ROI = interesseområde. Klikk her for å laste ned denne filen.
Tilleggsfigur S2: Mikromatrise av humane primære melanocytter behandlet med PTU. Varmekart viser uttrykket av pigmenteringsgener (mitf, tyrosinase, dct, mc1r) ved behandling i humane primære melanocytter. Forkortelser: PTU = 1-fenyl-2-tiourea; tyr = tyrosinase. Klikk her for å laste ned denne filen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Pigmenteringsfenotype manifesteres ofte som endringer i innholdet av melanin eller antall pigmentbærende melanocytter. Metoden beskrevet her tillater disseksjon av denne dikotomien og tillater kvalitativ så vel som kvantitativ vurdering av melanininnhold og antall melanophorer per embryo, uavhengig av melanininnholdet. Den høye fecundity av sebrafisk, synlig natur pigmenterte melanocytter, og mangel på melanosomoverføring muliggjør disseksjon av melanocytbiologi ved hjelp av denne omvendte genetiske tilnærmingen som er mottagelig for middels gjennomstrømning screening.
Valget av morfolinobasert lyddemping kommer fra den enkle lyddempingen og muligheten til å teste flere kandidater parallelt. Det er visse begrensninger ved å bruke en morfolinobasert silencing-tilnærming, og retningslinjer for bruk og tolkning av disse verdifulle verktøyene er beskrevet tidligere13. I hovedsak gir validering av fenotype ved knockdown ved bruk av flere MOer en konkret løsning på dette problemet. En alternativ strategi er bruk av CRISPR-basert genetisk forstyrrelse. Penetransen av fenotypen er begrenset på grunn av den iboende lavere frekvensen av genetiske hendelser og kan forsterkes av heterogene mutasjoner. Det begrenser bruken til omvendt genetisk screening14.
Fenotypevurdering av melanocyttselektive forstyrrelser resulterer ofte i redusert pigmentinnhold på grunn av endret melanogen respons. Imidlertid er det flere gener som forstyrrer spesifikasjonen av melanocytter og dermed forårsaker en reduksjon i pigmentering på grunn av en reduksjon i det totale antallet melanocytter. En systematisk disseksjon av de to scenariene er avgjørende for å tilskrive genets molekylære funksjon i pigmentering. Måling av melanininnhold er sammensatt av den komplekse naturen av melaninpolymer. Av de to tilgjengelige metodene, nemlig melaninoppløseliggjøring ved NaOH og HPLC-basert påvisning av stabile melaninoksidasjonsprodukter 1H-pyrrol-2,3,5-trikarboksylsyre og pyrrol-2,3-dikarboksylsyre, kan den førstnevnte metoden rutinemessig utføres i en laboratorieinnstilling mens sistnevnte krever spesifikke standarder og sofistikert instrumentering15.
I tillegg er antall embryoer som kreves av NaOH-metoden også høyere på grunn av flere trinn involvert i deteksjonen. NaOH-basert hydrolyse solubiliserer melanin og muliggjør spektrofotometrisk kvantifisering. Selv om denne metoden er robust og kan tas i bruk for en medium gjennomstrømningsskjerm (10-15 kandidater om gangen), er xanthin tilstede i xantoforer et potensielt forstyrrende stoff på grunn av dets iboende absorpsjon i området 400-450 nm16. Derfor må det utføres samsvar mellom bildeanalysebasert gjennomsnittlig gråverdibestemmelse og melanininnholdsanalyse for å bekrefte reduksjonen i melanininnholdet.
PTU tilbyr et enkelt verktøy for å redusere pigmenteringen og visualisere det ellers gjennomsiktige embryoet. Bruken kan muligens resultere i tilbakemeldingsendringer og påkalle endringer i melanocytter. Vi har imidlertid observert minimale endringer i uttrykket av pigmenteringsgener (tilleggsfigur S2).
Tellingen av melanocytter er enklest i lateral midtlinje og hoderegion, da melanocyttene er relativt tydelig observerbare i disse regionene (tilleggsfigur S1). Laterale melanophorer utgår fra melanocyttstamcellepopulasjonen som ligger nær dorsalrotgangliene18. Imaging denne populasjonen har flere fordeler som fast antall per embryo og klart skille. Imidlertid må de to kontralaterale linjene avbildes ved å vippe embryoet litt; ellers smelter de to sammen på grunn av embryoets gjennomsiktige natur, noe som gjør det vanskelig å telle (figur 1C versus figur 2C).
Sebrafisk melanophorer er forskjellige fra de pigmenterte cellene i øyet som er avledet fra nevroektoderm. Disse skiller seg ut ved deres posisjonering i embryoet og er tydelige i øyet versus kroppsmønsteret. I det FACS-baserte eksperimentet kan de øyeavledede cellene skilles fra deres størrelse, da de er betydelig mindre enn melanophorene og kan styres ved hjelp av størrelse eller spredningskriterier.
Estimater av melanocytter ved forskjellige modningsstadier ved hjelp av transgene linjer utføres enkelt ved hjelp av bildebasert kvantifisering. Kvantifisering av antall laterale melanophorer er robust da antallet varierer i et vindu mellom 2 dpf og 5 dpf på hver side av embryoet17. Imidlertid bestemmes antall laterale melanophorer ved migrasjon og etablering av en dorsalrotganglionassosiert stamcellepool18. Derfor kan eventuelle endringer i disse prosessene føre til en lignende observasjon. For å omgå denne forvirrende faktoren er FACS-basert estimering av alle melanophorer en konkret løsning.
Alternativt kan kvantifisering av hodemelanophorer utføres som avgrenset i tilleggsfigur S1 som surrogat for melanophortall. Det er interessant å merke seg at endringene i steady-state nivåer av melanocytttall kan bety to motsatte funksjoner for kandidatgenet i spørsmålet. Det kan enten resultere i redusert spesifisering av melanocytter fra nevrale kamforløpere eller forårsake melanocyttspesifikk død og må adresseres ved hjelp av metoder som tunnelanalysen. Variasjoner som mikroinjeksjoner etterfulgt av levende celleavbildning vil muliggjøre overvåking av andre melanocyttspesifikke fenotyper som migrasjon og mønster. Av interesse for pigmentcelleforskere vil være prosessen med melanosomoverføring, som ikke er operativ i fiskesystemet. Imidlertid kan samordnet melanosombevegelse i melanophorer studeres med endringer i levende celleavbildning beskrevet her med modifikasjoner. Alt i alt vil den detaljerte protokollen som presenteres i denne videoartikkelen gjøre det mulig for pigmentcellebiologiforskere å spørre kandidatgener og vurdere deres rolle i melanocytbiologi.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Alle forfattere oppgir ingen interessekonflikt.
Acknowledgments
Vi anerkjenner støtten fra Rådet for industriell og naturvitenskapelig forskning i prosjektet MLP2008 og Institutt for naturvitenskap og teknologi til prosjektet GAP165 for å støtte arbeidet som presenteres i dette manuskriptet. Vi takker Jeyashri Rengaraju og Chetan Mishra for deres hjelp med eksperimenter.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.5 mL Microtubes | Axygen | MCT-150-A | For preparing MO solution |
| 2 mL Microtubes | Axygen | MCT-200-C | For washing steps in FACS protocol |
| Agarose | Sigma-Aldrich | A-9539-500G | For microinjection |
| BD FACSAria II | BD Biosciences | NA | For cell sorting |
| Capillary tube | Drummond | 1-000-0010 | |
| Corning cell strainer | Corning | CLS431751 | For making single cell suspension |
| DMEM High Glucose Media | Sigma-Aldrich | D5648 | FACS protocol |
| Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate (Tricaine) | Sigma-Aldrich | E10521-50G | to immobilize ZF for imaging |
| Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt dihydrate (EDTA) | Sigma-Aldrich | E5134 | For cold lysis buffer |
| FACS tubes | BD-Biosciences | 342065 | FACS protocol |
| Fetal bovine serum (FBS) | Invitrogen | 10270 | FACS protocol |
| Graphpad prism Software | Graphstats Technologies | NA | For data representation |
| ImageJ Software | National Institute of health | NA | For image analysis |
| Insulin Syringes (1 mL) | DispoVan | NA | For manual dechorionation |
| Melanin, Synthetic | Sigma-Aldrich | M8631 | For melanin content assay |
| Methylcellulose | Sigma-Aldrich | M7027-250G | to immobilize ZF for imaging |
| Microloader tips | Eppendorf | 5242956003 | For microinjection |
| Morpholino | Gene-tools | NA | For knock-down experiments |
| N-Phenylthiourea (PTU) | Sigma-Aldrich | P7629 | to inhibit melanin formation |
| Needle puller | Sutter Instrument | P-97 | For microinjection |
| Nunc 15 mL Conical Sterile Polypropylene Centrifuge Tubes | Thermo Fisher Scientific | 339650 | FACS protocol |
| Petridish (60 mm) | Tarsons | 460090 | For embryo plates |
| Phenylmethylsulphonyl fluoride | Sigma-Aldrich | 10837091001 | For cold lysis buffer |
| Phosphate buffer saline (PBS) | HiMedia | TL1099-500mL | For washing cells |
| Pronase | Sigma-Aldrich | 53702 | For dechorionation |
| Protease inhibitor cocktail | Sigma-Aldrich | P8340 | For cold lysis buffer |
| Sheath fluid | BD FACSFlowTM | 342003 | FACS protocol |
| Sodium phosphate | Merck | 7558-79-4 | Cold lysis buffer |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T9284-500ML | For cold lysis buffer |
| TrypLE | Gibco | 1677119 | For trypsinization |
References
- Kelsh, R. N. Genetics and evolution of pigment patterns in fish. Pigment Cell Research. 17 (4), 326-336 (2004).
- Jablonski, N. G. The evolution of human skin and skin color. Annual Review of Anthropology. 33, 585-623 (2004).
- Hoekstra, H. Genetics, development and evolution of adaptive pigmentation in vertebrates. Heredity. 97 (3), 222-234 (2006).
- Quigley, I. K., Parichy, D. M. Pigment pattern formation in zebrafish: a model for developmental genetics and the evolution of form. Microscopy Research and Technique. 58 (6), 442-455 (2002).
- Meyers, J. R. Zebrafish: development of a vertebrate model organism. Current Protocols Essential Laboratory Techniques. 16 (1), 19 (2018).
- Kelsh, R. N., Schmid, B., Eisen, J. S. Genetic analysis of melanophore development in zebrafish embryos. Developmental Biology. 225 (2), 277-293 (2000).
- Rocha, M., Singh, N., Ahsan, K., Beiriger, A., Prince, V. E. Neural crest development: insights from the zebrafish. Developmental Dynamics. 249 (1), 88-111 (2020).
- Carney, T. J., et al. A direct role for Sox10 in specification of neural crest-derived sensory neurons. Development. 133 (23), 4619-4630 (2006).
- Curran, K., Raible, D. W., Lister, J. A. Foxd3 controls melanophore specification in the zebrafish neural crest by regulation of Mitf. Developmental Biology. 332 (2), 408-417 (2009).
- Zou, J., Beermann, F., Wang, J., Kawakami, K., Wei, X. The Fugu tyrp1 promoter directs specific GFP expression in zebrafish: tools to study the RPE and the neural crest-derived melanophores. Pigment Cell Research. 19 (6), 615-627 (2006).
- Xu, Q.
- Hermanson, S., Davidson, A. E., Sivasubbu, S., Balciunas, D., Ekker, S. C. Sleeping Beauty transposon for efficient gene delivery. Methods in Cell Biology. 77, 349-362 (2004).
- Stainier, D. Y., et al. Guidelines for morpholino use in zebrafish. PLoS Genetics. 13 (10), 1007000 (2017).
- Wu, N., et al. The progress of CRISPR/Cas9-mediated gene editing in generating mouse/zebrafish models of human skeletal diseases. Computational and Structural Biotechnology Journal. 17, 954-962 (2019).
- Affenzeller, S., Frauendorf, H., Licha, T., Jackson, D. J., Wolkenstein, K. Quantitation of eumelanin and pheomelanin markers in diverse biological samples by HPLC-UV-MS following solid-phase extraction. PLoS One. 14 (10), 0223552 (2019).
- Fernandes, B., Matamá, T., Guimarães, D., Gomes, A., Cavaco-Paulo, A.
- Hultman, K. A., Johnson, S. L. Differential contribution of direct-developing and stem cell-derived melanocytes to the zebrafish larval pigment pattern. Developmental Biology. 337 (2), 425-431 (2010).
- Mort, R. L., Jackson, I. J., Patton, E. E. The melanocyte lineage in development and disease. Development. 142 (4), 620-632 (2015).
