Summary
मेलानोसाइट कार्यों के नियामक रंजकता परिणाम में दिखाई देने वाले अंतर को नियंत्रित करते हैं। उम्मीदवार रंजकता जीन के आणविक कार्य को समझना एक चुनौती है। यहां, हम उम्मीदवारों की पहचान करने और उन्हें मेलेनिन सामग्री और मेलेनोसाइट संख्या के नियामकों में वर्गीकृत करने के लिए एक ज़ेब्राफिश मॉडल सिस्टम के उपयोग का प्रदर्शन करते हैं।
Abstract
मेलानोसाइट्स एपिडर्मल त्वचा में मौजूद विशेष तंत्रिका शिखा-व्युत्पन्न कोशिकाएं हैं। ये कोशिकाएं मेलेनिन वर्णक को संश्लेषित करती हैं जो जीनोम को हानिकारक पराबैंगनी विकिरण से बचाती हैं। मेलानोसाइट के कामकाज में गड़बड़ी पिगमेंटरी विकारों जैसे कि पीबाल्डिज्म, ऐल्बिनिज़म, विटिलिगो, मेलास्मा और मेलेनोमा को जन्म देती है। जेब्राफिश मेलानोसाइट कार्यों को समझने के लिए एक उत्कृष्ट मॉडल प्रणाली है। विशिष्ट वर्णक मेलानोसाइट्स की उपस्थिति, आनुवंशिक हेरफेर में आसानी, और ट्रांसजेनिक फ्लोरोसेंट लाइनों की उपलब्धता रंजकता के अध्ययन की सुविधा प्रदान करती है। यह अध्ययन जंगली प्रकार और ट्रांसजेनिक ज़ेब्राफिश लाइनों के उपयोग को नियोजित करता है जो मिटफा और टायरपी 1 प्रमोटरों के तहत हरे फ्लोरोसेंट प्रोटीन (जीएफपी) अभिव्यक्ति को चलाते हैं जो मेलानोसाइट्स के विभिन्न चरणों को चिह्नित करते हैं।
लार्वा पिगमेंटेशन पर फेनोटाइपिक परिणाम का मूल्यांकन करने के लिए उम्मीदवार जीन की मोर्फोलिनो-आधारित साइलेंसिंग हासिल की जाती है और पिग्मेंटेशन के नियामकों के लिए स्क्रीन पर लागू होती है। यह प्रोटोकॉल दो उम्मीदवार जीनों, कार्बोनिक एनहाइड्रेज 14 (सीए 14) और एक हिस्टोन संस्करण (एच 2 एएफवी) का उपयोग करके माइक्रोइंजेक्शन से इमेजिंग और फ्लोरेसेंस-एक्टिवेटेड सेल सॉर्टिंग (एफएसीएस) -आधारित फेनोटाइप्स के विच्छेदन तक की विधि को प्रदर्शित करता है, ताकि पिग्मेंटेशन परिणाम का व्यापक रूप से आकलन किया जा सके। इसके अलावा, यह प्रोटोकॉल उम्मीदवार जीन को मेलानोसाइट निर्दिष्टकर्ताओं और विभेदकों में अलग करने का प्रदर्शन करता है जो क्रमशः प्रति सेल मेलानोसाइट संख्या और मेलेनिन सामग्री को चुनिंदा रूप से बदलते हैं।
Introduction
जबकि फोटोप्रोटेक्शन के लिए मेलेनिन का उपयोग जानवरों के साम्राज्य में कई बार विकसित हुआ है, कशेरुकियों ने इस प्रक्रिया को पूरा किया है। मेलेनिन को संश्लेषित करने और शामिल करने के लिए एक विस्तृत मशीनरी के साथ समर्पित वर्णक-उत्पादक कोशिकाओं को मछलीसे मनुष्यों तक संरक्षित किया जाता है। हालांकि, पिग्मेंटेशन का परिणाम नाटकीय रूप से विविध है, रंग से लेकर पुनरावृत्ति तक और इंटेग्यूमेंट्स, त्वचा और बालों पर ज्वलंत पैटर्न के रूप में प्रस्तुत करताहै। विविधता के बावजूद, रंजकता प्रतिक्रिया में शामिल जीनों की सूची आश्चर्यजनक रूप से संरक्षित है। मेलेनिन-संश्लेषित मशीनरी के मुख्य घटक, जैसे कि प्रमुख मेलेनिन-संश्लेषित एंजाइम, मेलानोसोम के घटक, और सिग्नलिंग मार्ग के लिए अपस्ट्रीम कनेक्टिविटी, जीवों में अनिवार्य रूप से समान रहते हैं। सूक्ष्म आनुवंशिक अंतर प्रजातियों में देखे गए रंजकता के पैटर्न में नाटकीय परिवर्तन लातेहैं। इसलिए, एक निचले कशेरुक जीव में एक रिवर्स आनुवंशिक दृष्टिकोण, ज़ेबराफिश (डेनियो रेरियो), रंजित अवस्था 4 को प्रस्तुत करने में जीन की भागीदारी को समझने का एक उत्कृष्ट अवसर प्रदान करताहै।
ज़ेबराफ़िश भ्रूण एक एकल-कोशिका निषेचित युग्मनज से ~ 24 घंटे की अवधि के भीतर एक लार्वा में विकसित होते हैं। आश्चर्यजनक रूप से, मेलानोसाइट-समकक्ष कोशिकाएं-मेलानोफोरस-बड़ी कोशिकाएं हैं जो डर्मिस में मौजूद हैं और अंधेरे मेलेनिन सामग्री6 के कारण विशिष्ट हैं। ये तंत्रिका शिखा-व्युत्पन्न कोशिकाएं ~ 11 एचपीएफ से निकलती हैं और वर्णक ~ 24 एचपीएफ 6,7 शुरू करती हैं। संरक्षित जीन अभिव्यक्ति मॉड्यूल ने प्रमुख कारकों की पहचान को सक्षम किया है जो मेलानोसाइट कार्यों को व्यवस्थित करते हैं और ट्रांसजेनिक फ्लोरोसेंट रिपोर्टर लाइनों टीजी (एसओएक्स 10: जीएफपी), टीजी (मिटफा: जीएफपी), और टीजी (ftyrp1: GFP) 8,9,10 के विकास का नेतृत्व करते हैं जो मेलानोसाइट विकास के चुनिंदा चरणों को लेबल करते हैं। इन ट्रांसजेनिक मछली लाइनों का उपयोग विकास ता्मक समयरेखा के अनुसार उचित संकेतों के साथ ऊतक संदर्भ में जीव स्तर पर मेलानोसाइट्स के सेल जीव विज्ञान की पूछताछ को सक्षम बनाता है। ये रिपोर्टर मेलानोसाइट्स के वर्णक-आधारित मात्रा के पूरक हैं और मेलेनिन सामग्री के बावजूद मेलानोसाइट संख्याओं का एक अलग मूल्यांकन सक्षम करते हैं।
यह लेख दो महत्वपूर्ण मापदंडों, अर्थात् मेलेनिन सामग्री और मेलानोसाइट संख्याओं का आकलन करके मेलानोसाइट्स के जीव विज्ञान को समझने के लिए एक विस्तृत प्रोटोकॉल प्रदान करता है। जबकि पूर्व एक हाइपोपिग्मेंटेशन प्रतिक्रिया से निकलने वाला एक सामान्य कार्यात्मक रीडआउट है, उत्तरार्द्ध मेलानोसाइट्स के विनिर्देश या अस्तित्व में कमी के साथ जुड़ा हुआ है और अक्सर आनुवंशिक या अधिग्रहित डिपिग्मेंटेशन स्थितियों से जुड़ा होता है। इस रिवर्स जेनेटिक स्क्रीन की समग्र रणनीति एक मोर्फोलिनो का उपयोग करके चुनिंदा जीनों को चुप करना और मेलानोसाइट-विशिष्ट परिणामों की जांच करना है। मेलेनिन सामग्री का विश्लेषण औसत ग्रे मूल्यों की छवि-आधारित मात्रा का उपयोग करके किया जाता है, जिसके बाद मेलेनिन सामग्री परख का उपयोग करके पुष्टि की जाती है। परिपक्वता के विभिन्न चरणों में मेलानोसाइट्स की संख्या का विश्लेषण छवि-आधारित मात्रा का उपयोग करके किया जाता है और एफएसीएस विश्लेषण का उपयोग करके आगे की पुष्टि की जाती है। यहां, स्क्रीनिंग प्रोटोकॉल को दो उम्मीदवार जीनों का उपयोग करके प्रदर्शित किया जाता है, अर्थात् कार्बोनिक एनहाइड्रेज 14, मेलनोजेनेसिस में शामिल है, और एक हिस्टोन संस्करण एच 2एएफजेड.2 तंत्रिका शिखा अग्रदूत आबादी से मेलानोसाइट्स के विनिर्देश में शामिल है। जबकि पूर्व मेलेनिन सामग्री को बदल देता है और मेलानोसाइट संख्या नहीं, उत्तरार्द्ध निर्दिष्ट मेलानोसाइट्स की संख्या को बदल देता है और परिणामस्वरूप, भ्रूण में मेलेनिन सामग्री। कुल मिलाकर, यह विधि रंजकता में एक उम्मीदवार जीन की भूमिका की पहचान करने और मेलेनिन सामग्री बनाम मेलानोसाइट संख्या को नियंत्रित करने में इसकी भूमिका को अलग करने के लिए एक विस्तृत प्रोटोकॉल प्रदान करती है।
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Protocol
जेब्राफिश प्रयोग सीएसआईआर-इंस्टीट्यूट ऑफ जीनोमिक्स एंड इंटीग्रेटिव बायोलॉजी (आईजीआईबी), भारत (प्रस्ताव संख्या 45 ए) के संस्थागत पशु नैतिकता अनुमोदन (आईएईसी) के अनुसार सख्ती से किए गए थे। जानवरों की पीड़ा को कम करने के लिए सभी प्रयास किए गए थे।
1. जेब्राफिश भ्रूण में मोर्फोलिनो इंजेक्ट करना
- एक मानक सुई खींचने वाले का उपयोग करके, बहुत तेज और बंद-टिप पाइप खींचें।
- माइक्रोलोडर टिप का उपयोग करके माइक्रोपिपेट्स में मोर्फोलिनो युक्त समाधान लोड करें और इसे माइक्रोइंजेक्टर उपकरण में डालें। माइक्रोपिपेट को लॉक करने के लिए स्क्रू को ठीक से कस लें।
नोट: मोर्फोलिनो का खुराक मानकीकरण आवश्यक है। उपयुक्त खुराक में >70% की जीवित रहने की दर और 24 एचपीएफ पर एक विशिष्ट फेनोटाइप है। - माइक्रोपिपेट की नोक को बारीक बल का उपयोग करके काटें और इसे11 कैलिब्रेट करें।
- कैलिब्रेट करने के लिए, माइक्रोपिपेट से केशिका ट्यूब में मोर्फोलिनो समाधान की 1 मात्रा इंजेक्ट करें, इंजेक्शन का समय 1 सेकंड पर रखें। इसे पांच बार दोहराएं। मानक, 1 मिमी = 30 nL आयतन का उपयोग करके, केशिका ट्यूब को मापने के पैमाने के खिलाफ रखकर 5 सेकंड में इंजेक्ट की गई मात्रा ज्ञात करें। उपरोक्त जानकारी का उपयोग करके, प्रति इंजेक्शन12 में 1-3 एनएल इंजेक्ट करने के लिए आवश्यक समय (सेकंड में) की गणना करें।
नोट: मानक, 1 मिमी = 30 एनएल, अंशांकन के लिए उपयोग किए जाने वाले केशिका के माइक्रोइंजेक्टर दबाव सेटिंग्स और व्यास के लिए विशिष्ट है। आदर्श रूप से, इंजेक्शन को जर्दी-सेल इंटरफ़ेस में बनाया जाना चाहिए, जो निषेचन के बाद 15-20 मिनट के भीतर बनता है। कई इंजेक्शन की सुविधा के लिए, कम तापमान (18 डिग्री सेल्सियस) पर भ्रूण को बनाए रखने से विकास में थोड़ी देरी हो सकती है। हालांकि, इसे न्यूनतम रखा जाना चाहिए और जीन अभिव्यक्ति परिवर्तनों पर कम तापमान के कंपाउंडिंग प्रभाव के कारण 30 मिनट से अधिक नहीं बढ़ाया जाना चाहिए। - एक अगारोस-कास्ट पेट्री डिश (60 मिमी) पर भ्रूण को माउंट करें। लकीरों के भीतर भ्रूण को कसकर ढेर करें। आग-पॉलिश किए गए ग्लास पिपेट का उपयोग करके, उन्हें इंजेक्शन के लिए उचित अभिविन्यास में संरेखित करें।
- माइक्रोस्कोप के तहत, माइक्रोपिपेट को भ्रूण के करीब लाने के लिए मैनिपुलेटर्स का उपयोग करें और पैर की खुजली को दबाकर जर्दी-सेल इंटरफ़ेस के अंदर इंजेक्ट करें।
- सभी भ्रूणों को समान रूप से इंजेक्ट करें; उन्हें एक पेट्री डिश में इकट्ठा करें जिसमें ताजा भ्रूण के पानी का माध्यम हो और 28 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें।
- 6-8 घंटे के बाद इंजेक्शन भ्रूण की जांच करें। उनकी उच्च अस्पष्टता के कारण पहचाने जाने योग्य सभी मृत भ्रूणों को हटा दें और संक्रमण से बचने के लिए प्रति दिन कम से कम एक बार भ्रूण के पानी को बदलते रहें।
2. पिग्मेंटेशन विश्लेषण
- 3 डीपीएफ जेब्राफिश भ्रूण में पार्श्व मध्य रेखा मेलानोफोर की गिनती की तैयारी
- भ्रूण को गतिहीन करने के लिए 0.016% न्यूरो-मस्कुलर एनेस्थेटिक के साथ इलाज करें।
- इमेजिंग के लिए भ्रूण को माउंट करने के लिए, पेट्री डिश (60 मिमी) में 1.5-2% मेथिलसेल्यूलोज के कुछ मिलीलीटर जोड़ें ताकि यह एक पतली परत बना सके। पाश्चर पिपेट का उपयोग करके, भ्रूण चुनें और इमेजिंग के दौरान आगे की गति को प्रतिबंधित करने के लिए उन्हें धीरे से मिथाइलसेल्यूलोज में रखें।
- इष्टतम पार्श्व (पृष्ठीय पट्टी, उदर पट्टी, जर्दी पट्टी, और मध्य-रेखा मेलानोफोर) या पृष्ठीय (सिर के पृष्ठीय भाग पर मेलानोफोर) इमेजिंग के लिए उनकी स्थिति समायोजित करें। आसन्न मेलानोफोर के बेहतर रिज़ॉल्यूशन के लिए, उच्च आवर्धन पर छवि (>5x)
- ब्राइटफील्ड इमेजिंग
नोट: ब्राइटफील्ड इमेजिंग 8-10x आवर्धन के साथ स्टीरियोमाइक्रोस्कोप का उपयोग करके किया जाता है।- माइक्रोस्कोप के नीचे जेब्राफिश भ्रूण युक्त पेट्री डिश रखें। मैनिपुलेटर का उपयोग करके, मछली को इस तरह के अभिविन्यास में समायोजित करें ताकि सभी पांच मेलानोसाइट भ्रूण धारियां एक साथ दिखाई दें (पृष्ठीय, उदर, दो पार्श्व, जर्दी) (चित्रा 1 सी)। अधिग्रहण सॉफ्टवेयर का उपयोग करके छवियों को जल्दी से कैप्चर करें। ऐसे मामले में जहां जानवर छवि बनाने से पहले आंदोलन को पुनः प्राप्त करता है, इसे एनेस्थेटिक में फिर से डुबोएं और पर्याप्त रूप से स्थिर होने के बाद इमेजिंग के साथ आगे बढ़ें।
- इसे सभी मछलियों के साथ दोहराएं और सुनिश्चित करें कि आवर्धन हर छवि के लिए समान रहे।
- ImageJ सॉफ्टवेयर का उपयोग कर माध्य ग्रे मान की गणना करना
- 2 डीपीएफ जेब्राफिश भ्रूण की पृष्ठीय और पार्श्व छवियां लें।
- ओपन टूल का उपयोग करके इमेजजे में परिमाणित होने के लिए छवि खोलें । विश्लेषण के लिए क्षेत्र को रेखांकित करने के लिए फ्रीहैंड आकार उपकरण का उपयोग करें। सेट माप विकल्प पर जाएं और माध्य ग्रे मान | क्षेत्र का चयन करें। एम दबाएं (या विश्लेषण करें | माप) चयनित क्षेत्र के लिए औसत ग्रे मान की गणना करने के लिए।
- विश्लेषण किए जाने वाले क्षेत्र को स्थिर रखते हुए, प्रत्येक जानवर के लिए औसत ग्रे क्षेत्र की अलग से गणना करें।
- अधिग्रहित डेटा (चित्रा 2 एफ) के साथ एक बार ग्राफ प्लॉट करें।
- मेलेनिन सामग्री परख
- 2 डीपीएफ पर, ~ 25 जेब्राफिश भ्रूण एकत्र करने के लिए ग्लास पाश्चर पिपेट का उपयोग करें।
- 1 एमएल इंसुलिन सुइयों का उपयोग करके मैन्युअल डिकोरियोशन करें और उन्हें 1.5 एमएल माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूबों में जोड़ें।
- भ्रूण माध्यम को ध्यान से छोड़ दें और प्रोटीज अवरोधक कॉकटेल के साथ 1 एमएल आइस-कोल्ड लाइसिस बफर (20 एमएम सोडियम फॉस्फेट (पीएच 6.8), 1% ट्राइटन एक्स -100, 1 एमएम पीएमएसएफ, 1 एमएम ईडीटीए जोड़ें और सोनिकेशन द्वारा प्रोटीन लाइसेट तैयार करें।
- लाइसेट को 1 N NaOH के 1 mL में घोलें और पानी के स्नान में 50 मिनट के लिए 100 डिग्री सेल्सियस पर नमूने को इनक्यूबेट करें। भंवर यह रुक-रुक कर लाइसेट को पूरी तरह से समरूप करने के लिए होता है।
- स्पेक्ट्रोफोटोमीटर का उपयोग करके 490 एनएम पर नमूनों की अवशोषण रीडिंग लें।
- सिंथेटिक मेलेनिन (चित्रा 2 जी) की ज्ञात सांद्रता के मानक वक्र के लिए नमूना अवशोषण की तुलना करके मेलेनिन सामग्री की गणना करें।
3. मेलानोफोर गिनती
नोट: ट्रांसजेनिक ज़ेबराफिश भ्रूण में प्रतिदीप्ति विश्लेषण दो तरीकों से किया जा सकता है: 1) जीएफपी-पॉजिटिव कोशिकाओं की गिनती; 2) प्रतिदीप्ति तीव्रता को मापना।
- प्रारंभिक ज़ेब्राफिश भ्रूण में जीएफपी-पॉजिटिव कोशिकाओं की एफएसीएस-आधारित गिनती की तैयारी
- 200-250 ftyrp: GFP भ्रूण एकत्र करें और उन्हें सादे भ्रूण के पानी का उपयोग करके छन्नी में धोएं। एक नकारात्मक नियंत्रण के रूप में, जीएफपी-नकारात्मक, चरण-मिलान जंगली-प्रकार (असम वाइल्डटाइप) भ्रूण12 को संसाधित करें।
- रुचि के चरण के आधार पर, भ्रूण को 0.6 मिलीग्राम / एमएल प्रोनेस युक्त पेट्री डिश में स्थानांतरित करें। 5-10 मिनट के बाद, पाश्चर पिपेट का उपयोग करके, डिकोरियोनेटेड भ्रूण को सादे भ्रूण के पानी वाले एक ताजा पेट्री डिश में स्थानांतरित करें। ग्लास पाश्चर पिपेट का उपयोग करके, ~ 100 भ्रूण एकत्र करें और उन्हें 2 एमएल माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूब में स्थानांतरित करें।
- माध्यम को सावधानी से छोड़ दें और बर्फ-ठंडा रिंगर के घोल (डियोलिंग बफर) के 200 μL जोड़ें। ट्यूब को बर्फ पर रखते हुए, सामग्री को ~ 20 बार ऊपर और नीचे रखें जब तक कि जर्दी भंग न हो जाए। 4 डिग्री सेल्सियस पर टेबलटॉप सेंट्रीफ्यूज में 1 मिनट के लिए ट्यूबों को 100 × ग्राम पर सेंट्रीफ्यूज करें। सेंट्रीफ्यूज फिर से और सावधानी से सुपरनैटेंट को छोड़ दें।
- 1 एमएल पिपेट का उपयोग करके, डिओल्केड भ्रूण को एक पेट्री डिश में स्थानांतरित करें जिसमें 10 एमएल ट्रिप्सिन समाधान (सेल पृथक्करण बफर) होता है। भ्रूण की भीड़भाड़ और अक्षम ट्रिप्सिनाइजेशन से बचने के लिए इसे कई पेट्री व्यंजनों में करें। एकत्रीकरण को कम करने के लिए 1 एमएल पिपेट का उपयोग करें, भ्रूण के शरीर वाले घोल को एक या दो बार मिलाएं।
- 15 मिनट (<24 एचपीएफ भ्रूण) या 30 मिनट (24-30 एचपीएफ भ्रूण) के लिए कमरे के तापमान पर पेट्री व्यंजनों को इनक्यूबेट करें। कोशिकाओं के विघटन में सहायता के लिए कभी-कभी 1 एमएल पिपेट का उपयोग करके एस्पिरेटेड और डिस्पेंसरेशन।
- इनक्यूबेशन अवधि के दौरान, सेल गिनती के लिए प्रवाह साइटोमीटर मशीन शुरू करें।
- 50 एमएल शंक्वाकार ट्यूब के ऊपर 70 μm सेल छन्नी रखें और एकल-सेल निलंबन प्राप्त करने के लिए छन्नी के माध्यम से ट्रिप्सिनाइज्ड निलंबन पारित करें। सतह पर चिपकी कोशिकाओं को हटाने के लिए पेट्री व्यंजनों को कुछ बार एक ही निलंबन के साथ धोएं।
- झूलते हुए बाल्टी रोटर में 5 मिनट के लिए नमूने को 450 × ग्राम, 4 डिग्री सेल्सियस पर घुमाएं।
- सतह पर तैरने वाले को त्याग दें और गोली को 1 एमएल बर्फ-ठंडा 1x फॉस्फेट-बफर्ड खारा (पीबीएस) में फिर से निलंबित करें।
- 5 मिनट के लिए 450 × ग्राम, 4 डिग्री सेल्सियस पर फिर से घुमाएं और सतह पर तैरने वाले को छोड़ दें।
- अंत में, पीबीएस + 5% भ्रूण गोजातीय सीरम में गोली को फिर से निलंबित करें और इसे एफएसीएस चलने तक बर्फ पर रखें।
- प्रवाह साइटोमीटर तैयार करना
- प्रवाह साइटोमीटर चालू करें और स्टार्ट-अप शुरू करें।
नोट: मशीन को चालू करने से पहले, अपशिष्ट बिन खाली करें और शीथ द्रव टैंक भरें। - धारा के प्रवाह को 70 μm (या 85 μm) नोजल के लिए सामान्य करें। यदि यह अस्थिर है तो इसे 10-15 मिनट के लिए अबाधित छोड़ दें।
- प्रवाह साइटोमीटर चालू करें और स्टार्ट-अप शुरू करें।
- प्रवाह साइटोमीटर का उपयोग करके फ्लोरोसेंटली लेबल कोशिकाओं की गिनती
- एक नया प्रयोग फ़ोल्डर शुरू करें और आगे स्कैटर बनाम साइड स्कैटर का एक स्कैटर प्लॉट बनाएं और फ्लोरेसिन आइसोथियोसाइनेट (एफआईटीसी) तीव्रता का हिस्टोग्राम बनाएं।
- जंगली प्रकार की कोशिकाओं को पहले आगे और साइड स्कैटर गेट (डबलऔर मलबे को बाहर करने के लिए) और एफआईटीसी सीमा सेट करने के लिए लोड करें।
- गेट सेट होने के बाद, नमूना हटा दें और मेलानोसाइट्स की गिनती के लिए टीजी (ftyrp1: GFP) भ्रूण से अलग कोशिकाओं को लोड करें।
नोट: यहां, जैसा कि ftyrp1: GFP विशेष रूप से परिपक्व मेलानोसाइट्स को लेबल करता है, FITC गेट के तहत GFP-पॉजिटिव कोशिकाओं की संख्या मेलानोसाइट्स की संख्या के अनुरूप होगी। - नियंत्रण के साथ मेलानोसाइट्स की संख्या का अनुमान लगाने और तुलना करने के लिए मोर्फोलिनो-इंजेक्शन नमूनों के साथ उपरोक्त चरण को दोहराएं।
- जेब्राफिश भ्रूण में प्रतिदीप्ति तीव्रता को मापना
- एक ग्लास पाश्चर पिपेट का उपयोग करके, 100-120 भ्रूण एकत्र करें और उन्हें सादे भ्रूण के पानी वाले पेट्री डिश में स्थानांतरित करें।
- ~ 10-12 एचपीएफ पर, पिग्मेंटेशन को रोकने के लिए भ्रूण को 0.003% 1-फिनाइल-2-थियारिया में स्थानांतरित करें।
- <48 एचपीएफ भ्रूण की इमेजिंग के लिए इंसुलिन सुइयों का उपयोग करके मैनुअल डिकोरियोनेशन करें।
- भ्रूण को स्थिर करने के लिए, उन्हें 0.016% ट्राइकेन के साथ इलाज करें।
- इमेजिंग के लिए भ्रूण को माउंट करने के लिए, पेट्री डिश (60 मिमी) में 1.5-2% मिथाइलसेल्यूलोज के कुछ एमएल डालें ताकि यह एक पतली परत बना सके। इमेजिंग के दौरान किसी भी आगे की गति को प्रतिबंधित करने के लिए भ्रूण को मेथिलसेल्यूलोज में जोड़ें। माइक्रोस्कोप के नीचे नमूने युक्त पेट्री डिश रखें। पिपेट टिप का उपयोग करके, जानवर को वांछित अभिविन्यास में समायोजित करें।
- अधिग्रहण सॉफ्टवेयर का उपयोग करके छवियां प्राप्त करें। भ्रूण <24 एचपीएफ के लिए, पूरे भ्रूण को 10x आवर्धन के तहत एक बार में पकड़ें। >24 एचपीएफ चरणों के लिए, कई स्कैन-फ़ील्ड प्राप्त करें और बाद में उन्हें एक साथ इकट्ठा (सिलाई) करें।
- इसे सभी मछलियों के साथ दोहराएं और सुनिश्चित करें कि अधिग्रहण के लिए सेटिंग प्रयोग के माध्यम से स्थिर रहे।
- प्रमात्रीकरण
- ImageJ सॉफ्टवेयर का उपयोग करके छवि का विश्लेषण करें।
- ओपन टूल का उपयोग करके इमेजजे में परिमाणित होने के लिए छवि खोलें ।
- विश्लेषण के लिए क्षेत्र को रेखांकित करने के लिए फ्रीहैंड आकार उपकरण का उपयोग करें (चित्रा 3 ई)।
- एम दबाएं (या विश्लेषण करें | माप) एक चयनित क्षेत्र तीव्रता माप प्राप्त करने के लिए।
- विश्लेषण किए जाने वाले क्षेत्र को स्थिर रखते हुए, प्रत्येक जानवर के लिए प्रति क्षेत्र औसत तीव्रता की अलग-अलग गणना करें।
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Representative Results
चित्रा 1 में वर्णित वर्कफ़्लो का उपयोग ज़ेबराफ़िश वन-सेल चरण में मोर्फोलिनो-आधारित आनुवंशिक गड़बड़ी करने के लिए किया गया था। पिग्मेंटेशन विश्लेषण विभिन्न तरीकों का उपयोग करके किया गया था, जैसा कि नीचे उल्लेख किया गया है। प्रतिनिधि परिणामों को स्पष्ट करने के लिए, एच 2 ए एफवी और सीए 14 जीन को लक्षित करने वाले एंटीसेंस मोर्फोलिनो के मानकीकृत संस्करणों को ज़ेबराफिश भ्रूण के जर्दी या एक-सेल चरण में इंजेक्ट किया गया था। ब्राइटफील्ड इमेजिंग पर आधारित प्रारंभिक फेनोटाइपिंग निषेचन (एचपीएफ) के 48 घंटे बाद की गई थी, जब सभी पांच पिगमेंटेड मेलानोफोर धारियां (पृष्ठीय, उदर, जर्दी, दो पार्श्व) स्पष्ट थीं।
चित्रा 2 ए, बी प्रति भ्रूण पार्श्व मेलानोफोर की संख्या की गणना करके रंजकता का विश्लेषण करने के लिए एक दृष्टिकोण का प्रतिनिधित्व करता है। झुके हुए ज़ेबराफिश के पार्श्व क्षेत्र पर ज़ूम करके 48 एचपीएफ चरण में पार्श्व मेलानोफोर को मैन्युअल रूप से गिना गया था। पिगमेंटेड मेलानोफोर (पूरक चित्रा एस 1) को निर्धारित करने के लिए एक वैकल्पिक विधि में जेब्राफिश के पृष्ठीय दृश्य की इमेजिंग करके सिर मेलानोफोर की मैन्युअल गिनती शामिल है।
इमेजजे सॉफ्टवेयर की मदद से ब्याज के क्षेत्र को स्थिर रखते हुए, प्रति भ्रूण मेलेनिन सामग्री की गणना औसत ग्रे मूल्य को मापकर की जाती है। चित्रा 2 सी-एफ से पता चलता है कि सीए 14 और एच 2 ए एफवी मॉर्फेंट्स का औसत ग्रे मान नियंत्रण मॉर्फेंट्स की तुलना में अधिक था। चूंकि औसत ग्रे मान मेलेनिन सामग्री के व्युत्क्रमानुपाती है, सीए 14 और एच 2 ए एफवी जीन के वध से प्रति भ्रूण मेलेनिन सामग्री में कमी आई है। मेलेनिन सामग्री को मापने के लिए एक और मजबूत विधि एक एनएओएच-आधारित स्पेक्ट्रोफोटोमेट्रिक अवशोषण विधि है। जैसा कि चित्रा 2 जी में दिखाया गया है, सीए 14 मॉर्फेंट्स में कुल मेलेनिन सामग्री नियंत्रण मॉर्फेंट्स की तुलना में कम थी।
फ्लोरोसेंट इमेजिंग ने ज़ेब्राफिश मेलानोफोर विकास के दो अलग-अलग चरणों का खुलासा किया: प्रारंभिक निर्दिष्ट मेलानोफोरस (मिटफा: जीएफपी) और मेलानोफोर (एफटीवाईआरपी: जीएफपी) को अलग करना। मोर्फोलिनो-आधारित परिवर्तन का मूल्यांकन फ्लोरोसेंट इमेजिंग (चित्रा 3 ए और चित्रा 3 सी) द्वारा किया गया था। इन टिप्पणियों को और मान्य करने के लिए, एफएसीएस का उपयोग करके जीएफपी-पॉजिटिव कोशिकाओं की आवृत्ति की गणना की गई थी। H2afv के वध लेकिन ca14 के वध ने नियंत्रण के संबंध में मेलानोफोर की संख्या को काफी कम कर दिया (चित्रा 3A-D)। इसके अलावा, औसत प्रतिदीप्ति तीव्रता / क्षेत्र में कमी की गणना इमेजजे सॉफ्टवेयर का उपयोग करके की जा सकती है, ब्याज के क्षेत्र को स्थिर रखते हुए। एच 2 ए एफवी मॉर्फेंट्स नियंत्रण मॉर्फेंट्स के सापेक्ष औसत फ्लोरोसेंट तीव्रता / क्षेत्र में महत्वपूर्ण कमी दिखाते हैं (चित्रा 3 ई, एफ)।
चित्रा 1: जेब्राफिश का उपयोग करके मेलानोसाइट जीव विज्ञान के नियामकों की पहचान करने के लिए रिवर्स आनुवंशिक दृष्टिकोण के लिए वर्कफ़्लो। (ए) फ्लोचार्ट विभिन्न तरीकों से पिग्मेंटेशन का मूल्यांकन करने के लिए माइक्रोइंजेक्शन से शुरू होने वाले प्रयोगात्मक वर्कफ़्लो को दर्शाता है। (बी) माइक्रोइंजेक्शन नीडल होल्डर और माइक्रोमैनिपुलेटर, एक विच्छेदन माइक्रोस्कोप के साथ, एक-सेल चरण जेब्राफिश भ्रूण के माइक्रोइंजेक्शन के लिए एक विशिष्ट सेटअप है। (सी) 3 डीपीएफ पर जेब्राफिश में भ्रूण मेलानोसाइट पैटर्निंग सभी पांच धारियों को दर्शाती है: डोरसोलेटरल, दो पार्श्व मध्य रेखाएं (चार लाल तीरों द्वारा इंगित), उदर पट्टी, और जर्दी पट्टी। (डी) मोर्फोलिनो इंजेक्शन पर रंजकता परिणाम का अध्ययन करने के लिए, पार्श्व मध्यरेखा मेलानोफोर को स्टीरियोमाइक्रोस्कोप के तहत गिना जा सकता है। 2 डीपीएफ पर एक पृष्ठीय क्षेत्र की उज्ज्वल क्षेत्र छवि; मेलेनिन सामग्री को औसत ग्रे मूल्य को मापकर निर्धारित किया जा सकता है। (ई) औसत ग्रे मान भ्रूण की मेलेनिन सामग्री के व्युत्क्रमानुपाती होते हैं। जंगली प्रकार के भ्रूण में 2 डीपीएफ पर मेलेनिन से भरे मेलानोफोर। (एफ) मेलेनिन सामग्री परख इन मेलानोफोर के भीतर मेलेनिन उत्पादन का अनुमान लगाने के लिए किया जा सकता है। ट्रांसजेनिक जेब्राफिश 2 डीपीएफ पर टीवाईआरपी 1 प्रोटीन व्यक्त करने वाली कोशिकाओं को लेबल करता है। (जी) फ्लोरोसेंटली लेबल कोशिकाओं को एफएसीएस का उपयोग करके परिमाणित किया जा सकता है; स्केल बार = 100 μm. ट्रांसजेनिक जेब्राफिश 1 डीपीएफ पर मिटफा प्रोटीन व्यक्त करने वाली कोशिकाओं को लेबल करता है। इमेजजे सॉफ्टवेयर का उपयोग करके प्रति पशु औसत प्रतिदीप्ति तीव्रता को मापा जा सकता है। स्केल सलाखों = 100 μm. संक्षेप: डीपीएफ = निषेचन के बाद के दिन; एफएसीएस = प्रतिदीप्ति-सक्रिय सेल सॉर्टिंग। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
चित्रा 2: पार्श्व मध्यरेखा मेलानोफोर की गिनती, औसत ग्रे मूल्य को मापना, और मेलेनिन सामग्री परख। इमेजजे सॉफ्टवेयर का उपयोग करके मेलेनिन सामग्री को मापने के लिए मॉर्फेंट्स के पार्श्व दृश्य की ब्राइटफील्ड माइक्रोस्कोपिक छवियों का उपयोग किया गया था। (ए) नियंत्रण और हिस्टोन संस्करण एच 2 ए एफवी (एच 2 ए एफ वी) 3 डीपीएफ पर मॉर्फेंट्स; दाईं ओर इन भ्रूणों के ज़ूम-इन ट्रंक क्षेत्र हैं जो मेलानोसाइट संख्याओं को दर्शाते हैं। (बी) एच 2 ए एफ वी मॉर्फेंट्स में मेलानोफोर की संख्या नियंत्रण के सापेक्ष काफी कम हो जाती है, एन > 3 जैविक प्रतिकृतियों में प्रत्येक में 10। (सी) नियंत्रण बनाम कार्बोनिक एनहाइड्रेज की प्रतिनिधि छवि 2 डीपीएफ पर 14 मॉर्फेंट्स। (डी) सीए 14 बनाम नियंत्रण मॉर्फेंट्स का मेलेनिन परिमाणीकरण, एन > 10 में 3 जैविक प्रतिकृतियां। (ई) 2 डीपीएफ पर एच 2 ए एफ वी बनाम नियंत्रण मोर्फेंट्स का पार्श्व दृश्य। (च) एच2एएफवी बनाम कंट्रोल मॉर्फेंट्स की मेलेनिन सामग्री का परिमाणीकरण। लाल आयताकार इमेजजे-आधारित विश्लेषण के लिए चुने गए आरओआई का प्रतिनिधित्व करते हैं। (जी) मेलेनिन सामग्री की कुल मात्रा निर्धारित करने के लिए मोर्फोलिनो-इंजेक्शन भ्रूण पर किए गए मेलेनिन सामग्री परख। एसईएम ± तीन स्वतंत्र प्रयोगों का औसत; ** पी < 0.01, **** पी < 0.0001। छात्र का टी-टेस्ट; त्रुटि पट्टियाँ माध्य (SEM) की मानक त्रुटि ± माध्य हैं। स्केल सलाखों = 100 μm. संक्षेप: एमओ = मोर्फोलिनो; डीपीएफ = निषेचन के बाद के दिन; ROI = रुचि का क्षेत्र। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
चित्रा 3: एफएसीएस का उपयोग करके फ्लोरोसेंटली लेबल कोशिकाओं की मात्रा निर्धारित करना और औसत प्रतिदीप्ति तीव्रता को मापना। (ए) सीए 14 की प्रतिदीप्ति छवियां और टीजी (ftyrp1: GFP) रेखा से 2 डीपीएफ पर मॉर्फेंट भ्रूण को नियंत्रित करें, जहां विभेदक मेलानोसाइट्स को जीएफपी अभिव्यक्ति द्वारा चिह्नित किया जाता है। (बी) सीए 14 में मेलानोफोर की संख्या और 2 डीपीएफ पर नियंत्रित मोर्फेंट भ्रूण अपरिवर्तित रहते हैं, एन = 3 जैविक प्रतिकृतियां। (सी) एच 2 ए एफवी के 2 डीपीएफ पर प्रतिदीप्ति छवियां और टीजी (ftyrp1: GFP) रेखा से नियंत्रित मॉर्फेंट्स। (डी) 2 डीपीएफ, एन = 3 जैविक प्रतिकृतियों पर नियंत्रण मोर्फेंट भ्रूण की तुलना में एच 2 ए एफवी मॉर्फेंट्स में मेलानोफोर की संख्या काफी कम हो जाती है। (ई) लेबल मेलानोसाइट्स के साथ टीजी (मिटफा: जीएफपी) से 36 एचपीएफ पर नियंत्रण और एच 2 ए वी मोर्फेंट भ्रूण की प्रतिदीप्ति छवियां। (एफ) प्रति पशु एमएफआई की गणना इमेजजे सॉफ्टवेयर का उपयोग करके की जाती है और व्यक्तिगत डेटा सेटों को दर्शाते हुए बार ग्राफ के रूप में दर्शाया जाता है। नियंत्रण की तुलना में एच 2 ए एफ वी मोर्फेंट्स में एमएफआई काफी कम हो जाता है। लाल आयत इमेजजे सॉफ्टवेयर-आधारित विश्लेषण के लिए चुने गए आरओआई का प्रतिनिधित्व करता है। एन = 3 जैविक प्रतिकृतियां; P < 0.001, ****P < 0.0001. छात्र का टी-टेस्ट; त्रुटि पट्टियाँ माध्य (एसईएम) की मानक त्रुटि ± माध्य हैं; स्केल सलाखों = 100 μm. संक्षेप: एमओ = मोर्फोलिनो; एफएसीएस = प्रतिदीप्ति-सक्रिय सेल सॉर्टिंग; जीएफपी = हरा फ्लोरोसेंट प्रोटीन; डीपीएफ = निषेचन के बाद के दिन; ROI = रुचि का क्षेत्र; एमएफआई = औसत प्रतिदीप्ति तीव्रता। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
पूरक चित्रा एस 1: सिर मेलानोफोर की मात्रा। (ए) एच 2 ए वी का पृष्ठीय दृश्य और 48 एचपीएफ पर नियंत्रण मॉर्फेंट्स सिर मेलानोफोर दिखाते हैं। लाल बॉक्स ROI का प्रतिनिधित्व करता है। ब्याज के क्षेत्र को स्थिर रखते हुए, हेड मेलानोफोर की संख्या को मैन्युअल रूप से निर्धारित किया जा सकता है। (बी) एच 2 ए वी वध पर सिर मेलानोफोर की संख्या में काफी कमी आई है। सलाखों में से प्रत्येक >30 भ्रूण के साथ प्रति भ्रूण सिर मेलानोफोर की संख्या के 95% सीआई के साथ ज्यामितीय माध्य का प्रतिनिधित्व करते हैं। स्केल सलाखों = 100 μm. संक्षेप: एमओ = मोर्फोलिनो; सीआई = आत्मविश्वास अंतराल; एचपीएफ = निषेचन के बाद घंटे; ROI = रुचि का क्षेत्र। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.
पूरक चित्रा एस 2: पीटीयू के साथ इलाज किए गए मानव प्राथमिक मेलानोसाइट्स के माइक्रोएरे। हीट मैप मानव प्राथमिक मेलानोसाइट्स में उपचार पर पिग्मेंटेशन जीन (मिट्फ, टायरोसिनेस, डीसीटी, एमसी 1 आर) की अभिव्यक्ति को दर्शाता है। संक्षिप्तरूप: पीटीयू = 1-फिनाइल-2-थायोरिया; टायर = टायरोसिनेस। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.
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Discussion
पिग्मेंटेशन फेनोटाइप अक्सर मेलेनिन की सामग्री या वर्णक-असर मेलानोसाइट्स की संख्या में परिवर्तन के रूप में प्रकट होता है। यहां वर्णित विधि इस द्विभाजन के विच्छेदन की अनुमति देती है और मेलेनिन सामग्री के गुणात्मक और मात्रात्मक मूल्यांकन और मेलेनिन सामग्री के बावजूद प्रति भ्रूण मेलानोफोर की संख्या की अनुमति देती है। ज़ेबराफिश की उच्च उर्वरता, पिगमेंटेड मेलानोसाइट्स की दृश्य प्रकृति, और मेलानोसोम ट्रांसफर की कमी इस रिवर्स आनुवंशिक दृष्टिकोण का उपयोग करके मेलानोसाइट जीव विज्ञान के विच्छेदन को सक्षम करती है जो मध्यम-थ्रूपुट स्क्रीनिंग के लिए उत्तरदायी है।
मोर्फोलिनो-आधारित साइलेंसिंग का विकल्प साइलेंसिंग में आसानी और समानांतर रूप से कई उम्मीदवारों का परीक्षण करने की क्षमता से उत्पन्न होता है। मोर्फोलिनो-आधारित साइलेंसिंग दृष्टिकोण का उपयोग करने की कुछ सीमाएं हैं, और इन मूल्यवान उपकरणों का उपयोग और व्याख्या करने के लिए दिशानिर्देश पहलेवर्णित किए गए हैं। अनिवार्य रूप से, कई एमओ का उपयोग करके वध पर फेनोटाइप का सत्यापन इस समस्या का एक ठोस समाधान प्रदान करता है। एक वैकल्पिक रणनीति सीआरआईएसपीआर-आधारित आनुवंशिक गड़बड़ी का उपयोग है। आनुवंशिक घटनाओं की स्वाभाविक रूप से कम आवृत्ति के कारण फेनोटाइप का पेनेट्रेंस सीमित है और विषम उत्परिवर्तन द्वारा संयोजित किया जा सकता है। यह रिवर्स जेनेटिक स्क्रीनिंग 14 के लिए इसके उपयोगको सीमित करता है।
मेलानोसाइट-चयनात्मक गड़बड़ी के फेनोटाइप मूल्यांकन के परिणामस्वरूप अक्सर परिवर्तित मेलानोजेनिक प्रतिक्रिया के कारण वर्णक सामग्री में कमी आती है। हालांकि, ऐसे कई जीन हैं जो मेलानोसाइट्स के विनिर्देश को परेशान करते हैं और इसलिए समग्र मेलानोसाइट संख्या में कमी के कारण रंजकता में कमी का कारण बनते हैं। पिग्मेंटेशन में जीन के आणविक कार्य को लिखने के लिए दो परिदृश्यों का एक व्यवस्थित विच्छेदन आवश्यक है। मेलेनिन सामग्री का माप मेलेनिन बहुलक की जटिल प्रकृति से जटिल होता है। दो उपलब्ध तरीकों में से, अर्थात् एनएओएच द्वारा मेलेनिन घुलनशीलता और एचपीएलसी-आधारित स्थिर मेलेनिन ऑक्सीकरण उत्पादों 1एच-पाइरोल -2,3,5-ट्राइकारबॉक्सिलिक एसिड और पाइरोल -2,3- डाइकारबॉक्सिलिक एसिड का पता लगाना, पूर्व विधि को नियमित रूप से प्रयोगशाला सेटिंग में किया जा सकता है जबकि बाद में विशिष्ट मानकों और परिष्कृत इंस्ट्रूमेंटेशन15 की आवश्यकता होती है।
इसके अतिरिक्त, पता लगाने में शामिल कई चरणों के कारण एनएओएच विधि द्वारा आवश्यक भ्रूण की संख्या भी अधिक है। एनएओएच-आधारित हाइड्रोलिसिस मेलेनिन को घुलनशील करता है और स्पेक्ट्रोफोटोमेट्रिक मात्रा को सक्षम बनाता है। हालांकि यह विधि मजबूत है और इसे मध्यम-थ्रूपुट स्क्रीन (एक समय में 10-15 उम्मीदवार) के लिए अपनाया जा सकता है, 400-450 एनएम रेंज16 में इसके अंतर्निहित अवशोषण के कारण ज़ैंथोफोर में मौजूद ज़ैंथिन एक संभावित हस्तक्षेप पदार्थ है। इसलिए, मेलेनिन सामग्री में कमी की पुष्टि करने के लिए छवि विश्लेषण-आधारित औसत ग्रे मूल्य निर्धारण और मेलेनिन सामग्री परख के बीच एक सामंजस्य किया जाना चाहिए।
पीटीयू रंजकता को कम करने और अन्यथा पारदर्शी भ्रूण की कल्पना करने के लिए एक आसान उपकरण प्रदान करता है। उपयोग संभवतः प्रतिक्रिया परिवर्तन और मेलानोसाइट्स में परिवर्तन का आह्वान कर सकता है। हालांकि, हमने पिग्मेंटेशन जीन (पूरक चित्रा एस 2) की अभिव्यक्ति में न्यूनतम परिवर्तन देखा है।
पार्श्व मध्य रेखा और सिर क्षेत्र में मेलानोसाइट्स की गिनती सबसे आसान है, क्योंकि मेलानोसाइट्स इन क्षेत्रों में अपेक्षाकृत स्पष्ट रूप से देखने योग्य हैं (पूरक चित्रा एस 1)। पार्श्व रेखा मेलानोफोर मेलानोसाइट स्टेम सेल आबादी से उत्पन्न होती है जो पृष्ठीय रूट गैन्ग्लिया18 के करीब रहती है। इस आबादी की इमेजिंग के कई फायदे हैं जैसे कि प्रति भ्रूण निश्चित संख्या और स्पष्ट भेद। हालांकि, भ्रूण को थोड़ा झुकाकर दो विपरीत रेखाओं को चित्रित करने की आवश्यकता होती है; अन्यथा भ्रूण की पारदर्शी प्रकृति के कारण दोनों विलय हो जाते हैं, जिससे गिनती करना मुश्किल हो जाता है (चित्रा 1 सी बनाम चित्रा 2 सी)।
ज़ेबराफिश मेलानोफोर आंख की रंजित कोशिकाओं से अलग हैं जो न्यूरो-एक्टोडर्म से प्राप्त होते हैं। ये भ्रूण के भीतर उनकी स्थिति से अलग होते हैं और आंख बनाम शरीर के पैटर्न में स्पष्ट होते हैं। एफएसीएस-आधारित प्रयोग में, आंख-व्युत्पन्न कोशिकाओं को उनके आकार से अलग किया जा सकता है क्योंकि वे मेलानोफोर की तुलना में काफी छोटे होते हैं और आकार या स्कैटर मानदंडों का उपयोग करके गेट किए जा सकते हैं।
ट्रांसजेनिक लाइनों का उपयोग करके विभिन्न परिपक्वता चरणों में मेलानोसाइट्स का अनुमान आसानी से छवि-आधारित मात्रा का उपयोग करके किया जाता है। पार्श्व-रेखा मेलानोफोर की संख्या की मात्रा मजबूत है क्योंकि उनकी संख्या भ्रूण17 के प्रत्येक तरफ 2 डीपीएफ और 5 डीपीएफ के बीच एक खिड़की में भिन्न होती है। हालांकि, पार्श्व-लाइन मेलानोफोर की संख्या एक पृष्ठीय जड़ नाड़ीग्रन्थि से जुड़े स्टेम सेल पूल18 के प्रवास और स्थापना से निर्धारित होती है। इसलिए, इन प्रक्रियाओं में कोई भी परिवर्तन एक समान अवलोकन का कारण बन सकता है। इस भ्रामक कारक को दरकिनार करने के लिए, सभी मेलानोफोर का एफएसीएस-आधारित अनुमान एक मूर्त समाधान है।
वैकल्पिक रूप से, सिर मेलानोफोर की मात्रा पूरक चित्रा एस 1 में मेलानोफोर संख्याओं के लिए एक सरोगेट के रूप में चित्रित की जा सकती है। यह ध्यान रखना दिलचस्प है कि मेलानोसाइट संख्याओं के स्थिर-राज्य स्तरों में परिवर्तन उम्मीदवार जीन के लिए दो विपरीत कार्यों का संकेत दे सकता है। यह या तो तंत्रिका-शिखा अग्रदूतों से मेलानोसाइट्स के विनिर्देश में कमी ला सकता है या मेलानोसाइट-विशिष्ट मृत्यु का कारण बन सकता है और सुरंग परख जैसे तरीकों का उपयोग करके संबोधित करने की आवश्यकता है। लाइव-सेल इमेजिंग के बाद माइक्रोइंजेक्टेशन जैसी विविधताएं अन्य मेलानोसाइट-विशिष्ट फेनोटाइप्स जैसे माइग्रेशन और पैटर्निंग की निगरानी करने में सक्षम होंगी। वर्णक-कोशिका शोधकर्ताओं के लिए रुचि मेलानोसोम हस्तांतरण की प्रक्रिया होगी, जो मछली प्रणाली में संचालित नहीं है। हालांकि, मेलानोफोरस में ठोस मेलानोसोम आंदोलन का अध्ययन संशोधनों के साथ यहां वर्णित लाइव-सेल इमेजिंग में परिवर्तन के साथ किया जा सकता है। कुल मिलाकर, इस वीडियो लेख में प्रस्तुत विस्तृत प्रोटोकॉल वर्णक कोशिका जीव विज्ञान शोधकर्ताओं को उम्मीदवार जीन को क्वेरी करने और मेलानोसाइट जीव विज्ञान में उनकी भूमिका का आकलन करने में सक्षम करेगा।
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Disclosures
सभी लेखक ों ने हितों के टकराव की घोषणा नहीं की है।
Acknowledgments
हम इस पांडुलिपि में प्रस्तुत कार्य का समर्थन करने के लिए परियोजना एमएलपी 2008 द्वारा वैज्ञानिक और औद्योगिक अनुसंधान परिषद और जीएपी 165 परियोजना के लिए विज्ञान और प्रौद्योगिकी विभाग से वित्त पोषण समर्थन को स्वीकार करते हैं। हम जयश्री रेंगराजू और चेतन मिश्रा को प्रयोगों में उनकी मदद के लिए धन्यवाद देते हैं।
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.5 mL Microtubes | Axygen | MCT-150-A | For preparing MO solution |
| 2 mL Microtubes | Axygen | MCT-200-C | For washing steps in FACS protocol |
| Agarose | Sigma-Aldrich | A-9539-500G | For microinjection |
| BD FACSAria II | BD Biosciences | NA | For cell sorting |
| Capillary tube | Drummond | 1-000-0010 | |
| Corning cell strainer | Corning | CLS431751 | For making single cell suspension |
| DMEM High Glucose Media | Sigma-Aldrich | D5648 | FACS protocol |
| Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate (Tricaine) | Sigma-Aldrich | E10521-50G | to immobilize ZF for imaging |
| Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt dihydrate (EDTA) | Sigma-Aldrich | E5134 | For cold lysis buffer |
| FACS tubes | BD-Biosciences | 342065 | FACS protocol |
| Fetal bovine serum (FBS) | Invitrogen | 10270 | FACS protocol |
| Graphpad prism Software | Graphstats Technologies | NA | For data representation |
| ImageJ Software | National Institute of health | NA | For image analysis |
| Insulin Syringes (1 mL) | DispoVan | NA | For manual dechorionation |
| Melanin, Synthetic | Sigma-Aldrich | M8631 | For melanin content assay |
| Methylcellulose | Sigma-Aldrich | M7027-250G | to immobilize ZF for imaging |
| Microloader tips | Eppendorf | 5242956003 | For microinjection |
| Morpholino | Gene-tools | NA | For knock-down experiments |
| N-Phenylthiourea (PTU) | Sigma-Aldrich | P7629 | to inhibit melanin formation |
| Needle puller | Sutter Instrument | P-97 | For microinjection |
| Nunc 15 mL Conical Sterile Polypropylene Centrifuge Tubes | Thermo Fisher Scientific | 339650 | FACS protocol |
| Petridish (60 mm) | Tarsons | 460090 | For embryo plates |
| Phenylmethylsulphonyl fluoride | Sigma-Aldrich | 10837091001 | For cold lysis buffer |
| Phosphate buffer saline (PBS) | HiMedia | TL1099-500mL | For washing cells |
| Pronase | Sigma-Aldrich | 53702 | For dechorionation |
| Protease inhibitor cocktail | Sigma-Aldrich | P8340 | For cold lysis buffer |
| Sheath fluid | BD FACSFlowTM | 342003 | FACS protocol |
| Sodium phosphate | Merck | 7558-79-4 | Cold lysis buffer |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T9284-500ML | For cold lysis buffer |
| TrypLE | Gibco | 1677119 | For trypsinization |
References
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