Summary
Регуляторы функций меланоцитов регулируют видимые различия в результатах пигментации. Расшифровка молекулярной функции гена-кандидата в пигментацию представляет собой сложную задачу. Здесь мы демонстрируем использование модельной системы рыбок данио-рерио для идентификации кандидатов и классификации их по регуляторам содержания меланина и количества меланоцитов.
Abstract
Меланоциты представляют собой специализированные клетки, полученные из нервного гребня, присутствующие в эпидермальной коже. Эти клетки синтезируют пигмент меланин, который защищает геном от вредного ультрафиолетового излучения. Нарушения в функционировании меланоцитов приводят к пигментным нарушениям, таким как пипебалдизм, альбинизм, витилиго, меланодермия и меланома. Рыбки данио-рерио - отличная модельная система для понимания функций меланоцитов. Наличие заметных пигментированных меланоцитов, простота генетических манипуляций и наличие трансгенных флуоресцентных линий облегчают изучение пигментации. В этом исследовании используется использование линий рыбок данио-рерио дикого типа и трансгенных, которые управляют экспрессией зеленого флуоресцентного белка (GFP) под промоторами mitfa и tyrp1 , которые отмечают различные стадии меланоцитов.
Сайленсинг генов-кандидатов на основе морфолино достигается для оценки фенотипического результата при личиночной пигментации и применим для скрининга регуляторов пигментации. Этот протокол демонстрирует метод от микроинъекции до визуализации и рассечения фенотипов на основе флуоресцентно-активированной клеточной сортировки (FACS) с использованием двух генов-кандидатов, карбоангидразы 14 (Ca14) и варианта гистона (H2afv), для всесторонней оценки результата пигментации. Кроме того, этот протокол демонстрирует разделение генов-кандидатов на спецификаторы и дифференциаторы меланоцитов, которые избирательно изменяют количество меланоцитов и содержание меланина на клетку соответственно.
Introduction
В то время как использование меланина для фотозащиты несколько раз развивалось в животном мире, позвоночные, по-видимому, усовершенствовали этот процесс. Специальные пигментные продуцирующие клетки со сложным механизмом синтеза и содержания меланина сохраняются от рыбы к человеку1. Тем не менее, результат пигментации сильно варьируется, варьируясь от цвета до взаимности и проявляясь в виде ярких узоров на кожных покровах, коже и волосах2. Несмотря на разнообразие, репертуар генов, участвующих в реакции пигментации, поразительно консервативен. Основные компоненты меланин-синтезирующего механизма, такие как ключевые меланин-синтезирующие ферменты, компоненты меланосом и восходящая связь с сигнальным путем, остаются по существу идентичными для всех организмов. Тонкие генетические различия приводят к резким изменениям в характере пигментации, наблюдаемых у разных видов3. Следовательно, обратный генетический подход в организме низших позвоночных, рыбок данио-рерио (Danio rerio), дает прекрасную возможность расшифровать участие генов в передаче пигментированного состояния4.
Эмбрионы рыбок данио-рерио развиваются от одноклеточной оплодотворенной зиготы до личинки в течение ~ 24 ч после оплодотворения (HPF)5. Поразительно, что клетки, эквивалентные меланоцитам - меланофоры - представляют собой крупные клетки, которые присутствуют в дерме и бросаются в глаза из-за содержания темного меланина6. Эти клетки, полученные из нервного гребня, излучают ~ 11 hpf и начинают пигментировать ~ 24 hpf 6,7. Консервативные модули экспрессии генов позволили идентифицировать ключевые факторы, которые управляют функциями меланоцитов, и привели к разработке трансгенных флуоресцентных репортерных линий Tg (sox10: GFP), Tg (mitfa: GFP) и Tg (ftyrp1: GFP) 8,9,10, которые маркируют селективные стадии развития меланоцитов. Использование этих трансгенных рыбных линий позволяет исследовать клеточную биологию меланоцитов на уровне организма в тканевом контексте с соответствующими сигналами в соответствии с временными линиями развития. Эти репортеры дополняют количественное определение меланоцитов на основе пигментов и позволяют четко оценить количество меланоцитов независимо от содержания меланина.
В этой статье представлен подробный протокол расшифровки биологии меланоцитов путем оценки двух критических параметров, а именно содержания меланина и количества меланоцитов. В то время как первый является общим функциональным считыванием, исходящим из реакции гипопигментации, второй связан со снижением спецификации или выживаемости меланоцитов и часто связан с генетическими или приобретенными состояниями депигментации. Общая стратегия этого обратного генетического скрининга состоит в том, чтобы заставить замолчать выбранные гены с помощью морфолино и исследовать специфические для меланоцитов результаты. Содержание меланина анализируется с использованием количественного определения средних значений серого на основе изображений с последующим подтверждением с помощью анализа содержания меланина. Количество меланоцитов на различных стадиях созревания анализируется с помощью количественного определения на основе изображений и дополнительно подтверждается с помощью анализа FACS. Здесь протокол скрининга демонстрируется с использованием двух генов-кандидатов, а именно карбоангидразы 14, участвующей в меланогенезе, и варианта гистона H2AFZ.2, участвующего в спецификации меланоцитов из популяции предшественников нервного гребня. В то время как первый изменяет содержание меланина, а не количество меланоцитов, второй изменяет количество определенных меланоцитов и, следовательно, содержание меланина в эмбрионе. В целом, этот метод предоставляет подробный протокол для определения роли гена-кандидата в пигментации и различения его роли в контроле количества меланоцитов по сравнению с содержанием меланина.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Эксперименты с рыбками данио-рерио проводились в строгом соответствии с институциональным одобрением этики животных (IAEC) CSIR-Института геномики и интегративной биологии (IGIB), Индия (предложение No 45a). Были приложены все усилия, чтобы свести к минимуму страдания животных.
1. Введение морфолино эмбрионам рыбок данио-рерио
- Используя стандартный игольчатый съемник, нарисуйте очень острые пипетки с закрытыми наконечниками.
- Загрузите раствор, содержащий морфолино, в микропипетки с помощью наконечника микрозагрузчика и вставьте его в аппарат микроинжектора. Правильно затяните винт, чтобы зафиксировать микропипетку.
ПРИМЕЧАНИЕ: Необходима стандартизация дозировки морфолино. Подходящая дозировка имеет выживаемость >70% и специфический фенотип при 24 hpf. - Отрежьте кончик микропипетки с помощью тонких щипцов и откалибруйте его11.
- Для калибровки вводят 1 объем раствора морфолино в капиллярную трубку из микропипетки, выдерживая время введения на уровне 1 с. Повторите это пять раз. Используя стандарт 1 мм = объем 30 нл, найдите объем, введенный за 5 с, поднеся капиллярную трубку к измерительной шкале. Используя приведенную выше информацию, рассчитайте время (в секундах), необходимое для введения 1-3 нл на инъекцию12.
ПРИМЕЧАНИЕ: Стандарт 1 мм = 30 нл зависит от настроек давления в микроинжекторе и диаметра капилляра, используемого для калибровки. В идеале инъекция должна быть сделана в границу раздела желток-клетка, которая образуется в течение 15-20 минут после оплодотворения. Чтобы облегчить многократные инъекции, развитие можно немного задержать, поддерживая эмбрионы при более низкой температуре (18 ° C). Однако это должно быть сведено к минимуму и не должно превышать 30 минут из-за сложного эффекта более низкой температуры на изменения экспрессии генов. - Установите эмбрионы на чашку Петри с агарозным литием (60 мм). Плотно уложите зародыши в гребни. Используя отполированные стеклянные пипетки, выровняйте их в правильной ориентации для инъекций.
- Под микроскопом используйте манипуляторы, чтобы приблизить микропипетку к эмбриону и ввести внутрь границы раздела желток-клетка, нажав ножной переключатель.
- Вводите все эмбрионы одинаково; собрать их в чашку Петри, содержащую свежую среду для зародышей, и инкубировать при температуре 28 °C.
- Проверьте инъецированные эмбрионы через 6-8 ч. Удалите все мертвые эмбрионы, которые можно идентифицировать из-за их высокой непрозрачности, и продолжайте менять воду для эмбрионов не реже одного раза в день, чтобы избежать инфекции.
2. Анализ пигментации
- Подготовка к подсчету латеральных срединных меланофоров у 3 эмбрионов рыбок данио-рерио
- Обработайте эмбрионы 0,016% нервно-мышечным анестетиком, чтобы обездвижить их.
- Чтобы смонтировать эмбрионы для визуализации, добавьте несколько миллилитров 1,5-2% метилцеллюлозы в чашку Петри (60 мм), чтобы она образовала тонкий слой. Используя пипетку Пастера, выберите эмбрионы и осторожно поместите их в метилцеллюлозу, чтобы ограничить дальнейшее движение во время визуализации.
- Отрегулируйте их положение для оптимального латерального (дорсальная полоса, вентральная полоса, желточная полоса и срединные меланофоры) или дорсального (меланофоры на дорсальной части головы) визуализации. Для лучшего разрешения соседних меланофоров изображение с большим увеличением (>5x)
- Визуализация светлого поля
ПРИМЕЧАНИЕ: Визуализация светлого поля выполняется с помощью стереомикроскопа с 8-10-кратным увеличением.- Поместите чашку Петри, содержащую эмбрионы рыбок данио, под микроскоп. С помощью манипулятора отрегулируйте рыбу в такой ориентации так, чтобы были видны все пять эмбриональных полос меланоцитов (спинная, вентральная, две боковые, желток) одновременно (рис. 1В). Быстро делайте снимки с помощью программного обеспечения для сбора данных. В случае, если животное восстанавливает движение до того, как оно будет изображено, повторно погрузите его в анестетик и приступайте к визуализации, как только оно будет достаточно иммобилизовано.
- Повторите это со всеми рыбами и убедитесь, что увеличение остается одинаковым для каждого изображения.
- Расчет среднего значения серого с помощью программного обеспечения ImageJ
- Сделайте дорсальные и боковые снимки 2 эмбрионов рыбок данио.
- Откройте изображение, подлежащее количественной оценке, в ImageJ с помощью инструмента «Открыть ». Используйте инструмент « Фигура от руки », чтобы обвести область для анализа. Перейдите к опции « Установить измерения » и выберите «Среднее значение серого | область». Нажмите клавишу M (или Analyze | Measure), чтобы вычислить среднее значение серого для выбранной области.
- Сохраняя площадь, подлежащую анализу, постоянной, рассчитайте среднюю серую область для каждого животного отдельно.
- Постройте гистограмму с полученными данными (рис. 2F).
- Анализ на содержание меланина
- При 2 dpf используйте стеклянную пипетку Пастера, чтобы собрать ~ 25 эмбрионов рыбок данио.
- Выполните ручное дехорионирование с помощью инсулиновых игл объемом 1 мл и добавьте их в микроцентрифужные пробирки объемом 1,5 мл.
- Осторожно выбросьте среду эмбриона и добавьте 1 мл ледяного буфера лизиса (20 мМ фосфата натрия (pH 6,8), 1% Triton X-100, 1 мМ PMSF, 1 мМ ЭДТА) с коктейлем ингибитора протеазы и приготовьте белковые лизаты с помощью ультразвука.
- Растворяют лизаты в 1 мл 1 N NaOH и инкубируют образцы при 100 °C в течение 50 мин на водяной бане. Периодически встряхивайте его, чтобы полностью гомогенизировать лизаты.
- Снимите показания поглощения образцов на длине волны 490 нм с помощью спектрофотометра.
- Рассчитайте содержание меланина, сравнив поглощение образца со стандартной кривой известных концентраций синтетического меланина (рис. 2G).
3. Количество меланофоров
ПРИМЕЧАНИЕ: Флуоресцентный анализ у трансгенных эмбрионов рыбок данио-рерио может быть выполнен двумя методами: 1) подсчет GFP-положительных клеток; 2) измерение интенсивности флуоресценции.
- Подготовка к подсчету GFP-положительных клеток на основе FACS ранних эмбрионов рыбок данио-рерио
- Соберите 200-250 эмбрионов ftyrp:GFP и промойте их в ситечке с использованием простой воды для эмбрионов. В качестве отрицательного контроля обработайте GFP-отрицательные эмбрионы дикого типа (Assam Wildtype)12.
- В зависимости от интересующей стадии перенесите эмбрионы в чашку Петри, содержащую 0,6 мг/мл проназы. Через 5-10 минут с помощью пастеровской пипетки перенесите дехорионированные эмбрионы в свежую чашку Петри, содержащую простую эмбриональную воду. Используя стеклянную пипетку Пастера, соберите ~ 100 эмбрионов и перенесите их в микроцентрифужную пробирку объемом 2 мл.
- Тщательно откажитесь от среды и добавьте 200 мкл ледяного раствора Рингера (буфер для дежелтка). Держа тюбик на льду, пипеткой взбивайте содержимое вверх и вниз ~20 раз, пока желток не растворится. Центрифугируют пробирки при 100 × г в течение 1 мин в настольной центрифуге при температуре 4 °C. Снова центрифугу и аккуратно выбросьте надосадочную жидкость.
- С помощью пипетки объемом 1 мл перенесите дежелтованные эмбрионы в чашку Петри, содержащую 10 мл раствора трипсина (буфер диссоциации клеток). Выполняйте его в нескольких чашках Петри, чтобы избежать скученности эмбрионов и неэффективной трипсинизации. Используйте пипетку объемом 1 мл, смешайте раствор, содержащий тела эмбриона, один или два раза, чтобы уменьшить агрегацию.
- Инкубируйте чашки Петри при комнатной температуре в течение 15 мин (<24 эмбриона hpf) или 30 мин (24-30 эмбрионов hpf). Время от времени аспирируйте и дозируйте суспензию с помощью пипетки объемом 1 мл, чтобы способствовать распаду клеток.
- Во время инкубационного периода инициализируйте проточный цитометр для подсчета клеток.
- Поместите клеточный сетчатый фильтр размером 70 мкм над конической трубкой объемом 50 мл и пропустите трипсинизированную суспензию через сетчатый фильтр, чтобы получить одноклеточную суспензию. Вымойте чашки Петри той же суспензией несколько раз, чтобы удалить прилипшие к поверхности клетки.
- Отжим образцов при 450 × г, 4 °C в течение 5 мин в роторе качающегося ковша.
- Выбросьте надосадочную жидкость и ресуспендируйте гранулу в 1 мл ледяного 1x фосфатно-буферного физиологического раствора (PBS).
- Снова отжим при 450 × г, 4 °C в течение 5 мин и выбросьте надосадочную жидкость.
- Наконец, ресуспендируйте гранулу в PBS + 5% эмбриональной бычьей сыворотке и держите ее на льду до запуска FACS.
- Подготовка проточного цитометра
- Включите проточный цитометр и начните запуск.
ПРИМЕЧАНИЕ: Перед включением машины опорожните мусорное ведро и заполните бак для жидкости в оболочке. - Нормализуйте поток потока для сопла 70 мкм (или 85 мкм). Оставьте его нетронутым на 10-15 минут, если он нестабилен.
- Включите проточный цитометр и начните запуск.
- Подсчет флуоресцентно меченных клеток с помощью проточного цитометра
- Инициализируйте новую папку эксперимента и составьте точечную диаграмму прямого рассеяния и бокового рассеяния и гистограмму интенсивности флуоресцеина изотиоцианата (FITC).
- Сначала загрузите ячейки дикого типа, чтобы установить передние и боковые ворота рассеяния (чтобы исключить дублеты и мусор) и порог FITC.
- После того, как ворота установлены, удалите образец и загрузите клетки, выделенные из эмбрионов Tg (ftyrp1: GFP), для подсчета меланоцитов.
ПРИМЕЧАНИЕ: Здесь, поскольку ftyrp1: GFP специфически маркирует зрелые меланоциты, количество GFP-положительных клеток под воротами FITC будет соответствовать количеству меланоцитов. - Повторите описанный выше шаг с образцами, введенными морфолино, чтобы оценить и сравнить количество меланоцитов с контролем.
- Измерение интенсивности флуоресценции у эмбрионов рыбок данио-рерио
- Используя стеклянную пипетку Пастера, соберите 100-120 эмбрионов и перенесите их в чашку Петри, содержащую простую воду для эмбрионов.
- При ~ 10-12 hpf перенесите эмбрионы на 0,003% 1-фенил-2-тиомочевины, чтобы ингибировать пигментацию.
- Выполните ручное дехорионирование с использованием инсулиновых игл для визуализации эмбрионов <48 hpf.
- Чтобы обездвижить эмбрионы, обработайте их 0,016% трикаином.
- Чтобы смонтировать эмбрионы для визуализации, поместите несколько мл 1,5-2% метилцеллюлозы в чашку Петри (60 мм) так, чтобы она образовала тонкий слой. Добавьте эмбрионы в метилцеллюлозу, чтобы ограничить любое дальнейшее движение во время визуализации. Поместите чашку Петри с образцами под микроскоп. С помощью наконечника пипетки отрегулируйте животное в нужной ориентации.
- Получение изображений с помощью программного обеспечения для сбора данных. Для эмбрионов <24 hpf захватите весь эмбрион сразу под 10-кратным увеличением. Для ступеней >24 hpf приобретите несколько полей сканирования, а затем соберите (сшите) их вместе.
- Повторите это со всеми рыбами и убедитесь, что установка для приобретения остается постоянной на протяжении всего эксперимента.
- Квантификация
- Проанализируйте изображение с помощью программного обеспечения ImageJ.
- Откройте изображение, подлежащее количественной оценке, в ImageJ с помощью инструмента «Открыть ».
- Используйте инструмент «Фигура от руки », чтобы наметить область для анализа (рис. 3E).
- Нажмите клавишу M (или Analyze | Measure), чтобы получить выбранное измерение интенсивности области.
- Сохраняя площадь, подлежащую анализу, постоянной, рассчитайте среднюю интенсивность на площадь для каждого животного отдельно.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Рабочий процесс, описанный на рисунке 1 , был использован для выполнения генетического возмущения на основе морфолино на стадии одной клетки рыбок данио. Анализ пигментации проводился с использованием различных методов, как указано ниже. Чтобы проиллюстрировать репрезентативные результаты, стандартизированные объемы антисмысловых морфолиногенов, нацеленных на гены h2afv и ca14 , вводили в желтковую или одноклеточную стадию эмбриона рыбки данио. Первоначальное фенотипирование, основанное на визуализации светлого поля, было выполнено через 48 часов после оплодотворения (hpf), когда были видны все пять пигментированных меланофорных полос (дорсальная, вентральная, желток, две боковые).
На рисунке 2A,B представлен подход к анализу пигментации путем расчета количества боковых меланофоров на эмбрион. Латеральные меланофоры подсчитывались вручную на стадии 48 hpf путем увеличения боковой области наклоненных рыбок данио. Альтернативный метод количественной оценки пигментированных меланофоров (дополнительный рисунок S1) включает ручной подсчет головных меланофоров путем визуализации дорсального вида рыбок данио.
Содержание меланина на эмбрион рассчитывается путем измерения среднего значения серого, сохраняя интересующую область постоянной с помощью программного обеспечения ImageJ. На рисунке 2C-F показано, что среднее значение серого для морфантов ca14 и h2afv было выше, чем у контрольных морфантов. Поскольку среднее значение серого обратно пропорционально содержанию меланина, нокдаун генов ca14 и h2afv привел к снижению содержания меланина на эмбрион. Другим надежным методом количественной оценки содержания меланина является спектрофотометрический метод поглощения на основе NaOH. Как показано на рисунке 2G, общее содержание меланина в морфантах ca14 было меньше, чем в контрольных морфантах.
Флуоресцентная визуализация выявила две различные стадии развития меланофора рыбок данио: ранние уточненные меланофоры (mitfa: gfp) и дифференцирующие меланофоры (ftyrp: gfp). Морфолиновое изменение оценивали с помощью флуоресцентной визуализации (рис. 3A и рис. 3C). Для дальнейшей проверки этих наблюдений частота GFP-положительных клеток была рассчитана с использованием FACS. Нокдаун h2afv, но не ca14, значительно уменьшил количество меланофоров по сравнению с контролем (рис. 3A-D). Кроме того, уменьшение средней интенсивности/площади флуоресценции может быть рассчитано с помощью программного обеспечения ImageJ, сохраняя интересующую область постоянной. Морфанты H2afv демонстрируют значительное снижение средней интенсивности/площади флуоресценции по сравнению с контрольными морфантами (рис. 3E, F).
Рисунок 1: Рабочий процесс для обратного генетического подхода для идентификации регуляторов биологии меланоцитов с использованием рыбок данио. (A) Блок-схема, изображающая экспериментальный рабочий процесс, начиная с микроинъекции и заканчивая оценкой пигментации различными методами. (B) Держатель иглы для микроинъекций и микроманипулятор, наряду с препарирующим микроскопом, является типичной установкой для микроинъекций эмбрионов рыбок данио-рерио на одной клеточной стадии. (C) Эмбриональный рисунок меланоцитов у рыбок данио-рерио при 3 dpf, показывающий все пять полос: дорсолатеральную, две боковые срединные линии (обозначенные четырьмя красными стрелками), вентральную полосу и полосу желтка. (D) Чтобы изучить исход пигментации после инъекции морфолино, латеральные меланофоры средней линии можно подсчитать под стереомикроскопом. Светлопольное изображение дорсальной области при 2 dpf; Содержание меланина можно количественно определить путем измерения среднего значения серого. (E) Средние значения серого обратно пропорциональны содержанию меланина в эмбрионе. Меланофоры, заполненные меланином, при 2 dpf у эмбрионов дикого типа. (F) Анализ содержания меланина может быть выполнен для оценки продукции меланина в этих меланофорах. Трансгенные рыбки данио-рерио мечут клетки, экспрессирующие белок TYRP1 при 2 dpf. G) флуоресцентно меченные клетки могут быть количественно определены с помощью СУИМ; масштабная линейка = 100 мкм. Трансгенные рыбки данио-рерио мечут клетки, экспрессирующие белок Mitfa при 1 dpf. Среднюю интенсивность флуоресценции на животное можно измерить с помощью программного обеспечения ImageJ. Масштабные линейки = 100 мкм. Сокращения: dpf = дни после оплодотворения; FACS = сортировка клеток, активируемая флуоресценцией. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 2: Подсчет латеральных меланофоров средней линии, измерение среднего значения серого и анализ содержания меланина. Для количественной оценки содержания меланина с помощью программного обеспечения ImageJ использовались светлопольные микроскопические изображения бокового вида морфантов. (A) Контрольные и гистоновые морфанты h2afv (h2afv) при 3 dpf; Справа увеличены области ствола этих эмбрионов, изображающие количество меланоцитов. (B) Количество меланофоров в морфантах h2afv резко снижается по сравнению с контролем, n > 10 каждый в 3 биологических репликах. (C) Репрезентативное изображение контроля по сравнению с морфантами карбоангидразы 14 при 2 dpf. (D) Количественное определение меланина ca14 по сравнению с контрольными морфантами, n > 10 по 3 биологическим репликам. (E) Вид сбоку h2afv по сравнению с контрольными морфантами при 2 dpf. (F) Количественное определение содержания меланина в h2afv по сравнению с контрольными морфантами. Красные прямоугольники обозначают рентабельность инвестиций, выбранную для анализа на основе ImageJ. (G) Анализ содержания меланина, проводимый на эмбрионах, введенных морфолино, для количественного определения общего содержания меланина. Среднее значение трех независимых экспериментов ± SEM.; **P < 0,01, **** P < 0,0001. t-критерий Стьюдента; Полосы погрешностей являются средними ± стандартной погрешности среднего значения (SEM). Масштабные линейки = 100 мкм. Сокращения: МО = морфолино; DPF = дни после оплодотворения; ROI = регион интереса. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 3: Количественная оценка флуоресцентно меченных клеток с использованием FACS и измерение средней интенсивности флуоресценции. (A) Флуоресцентные изображения ca14 и контрольных морфантных эмбрионов при 2 dpf от линии Tg (ftyrp1: GFP), где дифференцирующие меланоциты отмечены экспрессией GFP. (B) Количество меланофоров в ca14 и контрольных морфантных эмбрионах при 2 dpf остается неизменным, n = 3 биологических репликатов. (C) Флуоресцентные изображения при 2 dpf h2afv и контрольных морфантах из линии Tg(ftyrp1:GFP). (D) Количество меланофоров в морфантах h2afv значительно снижается по сравнению с контрольными эмбрионами-морфантами при 2 dpf, n = 3 биологических репликах. (E) Флуоресцентные изображения контрольных и h2afv-морфантных эмбрионов при 36 hpf из Tg (mitfa: GFP) с мечеными меланоцитами. (F) MFI на животное рассчитывается с использованием программного обеспечения ImageJ и представляется в виде гистограммы, отображающей отдельные наборы данных. MFI значительно снижен в морфантах h2afv по сравнению с контролем. Красный прямоугольник обозначает рентабельность инвестиций, выбранную для программного анализа ImageJ. n = 3 биологических репликаты; P < 0,001, ****P < 0,0001. t-критерий Стьюдента; полосы погрешности - это среднее значение ± стандартной погрешности среднего значения (SEM); масштабные линейки = 100 мкм. Сокращения: МО = морфолино; FACS = сортировка клеток, активируемая флуоресценцией; GFP = зеленый флуоресцентный белок; DPF = дни после оплодотворения; ROI = регион интереса; MFI = средняя интенсивность флуоресценции. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Дополнительный рисунок S1: Количественное определение меланофоров головы. (A) Дорсальный вид морфантов h2afv и контрольной группы при 48 hpf, показывающий меланофоры головы. Красная рамка представляет рентабельность инвестиций. Сохраняя область интереса постоянной, количество головных меланофоров можно количественно определить вручную. (B) Количество меланофоров головы значительно уменьшилось после нокдауна h2afv. Столбцы представляют собой среднее геометрическое значение с 95% ДИ от числа головных меланофоров на эмбрион с >30 эмбрионами в каждом. Масштабные линейки = 100 мкм. Сокращения: МО = морфолино; ДИ = доверительный интервал; HPF = часы после оплодотворения; ROI = регион интереса. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.
Дополнительный рисунок S2: Микрочип первичных меланоцитов человека, обработанных ПТУ. Тепловая карта показывает экспрессию генов пигментации (mitf, тирозиназа, dct, mc1r) при лечении в первичных меланоцитах человека. Сокращения: PTU = 1-фенил-2-тиомочевина; tyr = тирозиназа. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Фенотип пигментации часто проявляется в виде изменения содержания меланина или количества пигментсодержащих меланоцитов. Способ, описанный в настоящем описании, позволяет вскрывать эту дихотомию и позволяет проводить как качественную, так и количественную оценку содержания меланина и количества меланофоров на эмбрион, независимо от содержания меланина. Высокая плодовитость рыбок данио, видимая природа пигментированных меланоцитов и отсутствие переноса меланосом позволяют анализировать биологию меланоцитов с использованием этого обратного генетического подхода, который поддается скринингу со средней пропускной способностью.
Выбор сайленсинга на основе морфолино обусловлен простотой сайленсинга и возможностью параллельного тестирования нескольких кандидатов. Существуют определенные ограничения использования подхода к сайленсингу на основе морфолино, и рекомендации по использованию и интерпретации этих ценных инструментов были описаны ранее13. По сути, валидация фенотипа при нокдауне с использованием нескольких МО обеспечивает ощутимое решение этой проблемы. Альтернативной стратегией является использование генетических возмущений на основе CRISPR. Пенетрантность фенотипа ограничена из-за более низкой частоты генетических событий и может усугубляться гетерогенными мутациями. Это ограничивает его использование для обратного генетического скрининга14.
Оценка фенотипа меланоцитарно-селективных возмущений часто приводит к снижению содержания пигмента из-за измененного меланогенного ответа. Тем не менее, есть несколько генов, которые нарушают спецификацию меланоцитов и, следовательно, вызывают снижение пигментации из-за уменьшения общего количества меланоцитов. Систематическое препарирование этих двух сценариев необходимо для определения молекулярной функции гена в пигментации. Измерение содержания меланина усугубляется сложной природой полимера меланина. Из двух доступных способов, а именно солюбилизации меланина NaOH и обнаружения на основе ВЭЖХ стабильных продуктов окисления меланина 1H-пиррол-2,3,5-трикарбоновой кислоты и пиррол-2,3-дикарбоновой кислоты, первый способ может быть обычно выполнен в лабораторных условиях, в то время как второй требует специальных стандартов и сложного инструментария15.
Кроме того, количество эмбрионов, необходимых для метода NaOH, также выше из-за нескольких этапов, связанных с обнаружением. Гидролиз на основе NaOH солюбилизирует меланин и обеспечивает спектрофотометрическое количественное определение. Хотя этот метод является надежным и может быть принят для экрана со средней пропускной способностью (10-15 кандидатов одновременно), ксантин, присутствующий в ксантофорах, является потенциальным мешающим веществом из-за присущего ему поглощения в диапазоне 400-450 нм16. Следовательно, необходимо провести согласование между определением среднего значения серого на основе анализа изображений и анализом содержания меланина, чтобы подтвердить снижение содержания меланина.
PTU предлагает простой инструмент для уменьшения пигментации и визуализации прозрачного эмбриона. Использование может привести к изменениям обратной связи и вызвать изменения в меланоцитах. Тем не менее, мы наблюдали минимальные изменения в экспрессии генов пигментации (дополнительный рисунок S2).
Подсчет меланоцитов легче всего в латеральной средней линии и области головы, так как меланоциты относительно отчетливо наблюдаются в этих областях (дополнительный рисунок S1). Меланофоры боковой линии возникают из популяции стволовых клеток меланоцитов, которая находится близко к ганглиям дорсальных корешков18. Визуализация этой популяции имеет ряд преимуществ, таких как фиксированное количество эмбрионов и четкое различие. Тем не менее, две контралатеральные линии необходимо визуализировать, слегка наклонив эмбрион; в противном случае они сливаются из-за прозрачной природы эмбриона, что затрудняет подсчет (рис. 1C против рис. 2C).
Меланофоры рыбок данио-рерио отличаются от пигментированных клеток глаза, которые происходят из нейроэктодермы. Они различимы по их расположению внутри эмбриона и очевидны в глазу по сравнению с телом. В эксперименте, основанном на FACS, клетки, полученные из глаза, можно отличить по размеру, поскольку они значительно меньше, чем меланофоры, и могут быть закрыты с использованием критериев размера или рассеяния.
Оценки меланоцитов на разных стадиях созревания с использованием трансгенных линий легко проводятся с помощью количественного определения на основе изображений. Количественная оценка количества меланофоров боковой линии является надежной, поскольку их количество колеблется в окне от 2 до 5 dpf с каждой стороны эмбриона17. Однако количество меланофоров боковой линии определяется миграцией и созданием пула стволовых клеток, ассоциированного с ганглием дорсального корешка18. Следовательно, любые изменения в этих процессах могут привести к аналогичному наблюдению. Чтобы обойти этот мешающий фактор, оценка всех меланофоров на основе FACS является ощутимым решением.
С другой стороны, количественное определение меланофоров головы может быть выполнено, как показано на дополнительном рисунке S1 , в качестве суррогата числа меланофоров. Интересно отметить, что изменения в стационарных уровнях числа меланоцитов могут означать две противоположные функции для рассматриваемого гена-кандидата. Это может либо привести к снижению спецификации меланоцитов из предшественников нервного гребня, либо вызвать специфическую для меланоцитов смерть, и ее необходимо решать с помощью таких методов, как туннельный анализ. Такие вариации, как микроинъекции с последующей визуализацией живых клеток, позволят контролировать другие специфические для меланоцитов фенотипы, такие как миграция и паттернирование. Интерес для исследователей пигментных клеток представляет процесс переноса меланосом, который не действует в рыбной системе. Тем не менее, согласованное движение меланосом в меланофорах может быть изучено с изменениями в визуализации живых клеток, описанными в настоящем документе, с модификациями. В целом, подробный протокол, представленный в этой видеостатье, позволит исследователям биологии пигментных клеток запрашивать гены-кандидаты и оценивать их роль в биологии меланоцитов.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Все авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.
Acknowledgments
Мы выражаем признательность Совету по научным и промышленным исследованиям за финансовую поддержку проекта MLP2008 и Департамента науки и технологий проекта GAP165 за поддержку работы, представленной в этой рукописи. Мы благодарим Джеяшри Ренгараджу и Четана Мишру за помощь в проведении экспериментов.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.5 mL Microtubes | Axygen | MCT-150-A | For preparing MO solution |
| 2 mL Microtubes | Axygen | MCT-200-C | For washing steps in FACS protocol |
| Agarose | Sigma-Aldrich | A-9539-500G | For microinjection |
| BD FACSAria II | BD Biosciences | NA | For cell sorting |
| Capillary tube | Drummond | 1-000-0010 | |
| Corning cell strainer | Corning | CLS431751 | For making single cell suspension |
| DMEM High Glucose Media | Sigma-Aldrich | D5648 | FACS protocol |
| Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate (Tricaine) | Sigma-Aldrich | E10521-50G | to immobilize ZF for imaging |
| Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt dihydrate (EDTA) | Sigma-Aldrich | E5134 | For cold lysis buffer |
| FACS tubes | BD-Biosciences | 342065 | FACS protocol |
| Fetal bovine serum (FBS) | Invitrogen | 10270 | FACS protocol |
| Graphpad prism Software | Graphstats Technologies | NA | For data representation |
| ImageJ Software | National Institute of health | NA | For image analysis |
| Insulin Syringes (1 mL) | DispoVan | NA | For manual dechorionation |
| Melanin, Synthetic | Sigma-Aldrich | M8631 | For melanin content assay |
| Methylcellulose | Sigma-Aldrich | M7027-250G | to immobilize ZF for imaging |
| Microloader tips | Eppendorf | 5242956003 | For microinjection |
| Morpholino | Gene-tools | NA | For knock-down experiments |
| N-Phenylthiourea (PTU) | Sigma-Aldrich | P7629 | to inhibit melanin formation |
| Needle puller | Sutter Instrument | P-97 | For microinjection |
| Nunc 15 mL Conical Sterile Polypropylene Centrifuge Tubes | Thermo Fisher Scientific | 339650 | FACS protocol |
| Petridish (60 mm) | Tarsons | 460090 | For embryo plates |
| Phenylmethylsulphonyl fluoride | Sigma-Aldrich | 10837091001 | For cold lysis buffer |
| Phosphate buffer saline (PBS) | HiMedia | TL1099-500mL | For washing cells |
| Pronase | Sigma-Aldrich | 53702 | For dechorionation |
| Protease inhibitor cocktail | Sigma-Aldrich | P8340 | For cold lysis buffer |
| Sheath fluid | BD FACSFlowTM | 342003 | FACS protocol |
| Sodium phosphate | Merck | 7558-79-4 | Cold lysis buffer |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T9284-500ML | For cold lysis buffer |
| TrypLE | Gibco | 1677119 | For trypsinization |
References
- Kelsh, R. N. Genetics and evolution of pigment patterns in fish. Pigment Cell Research. 17 (4), 326-336 (2004).
- Jablonski, N. G. The evolution of human skin and skin color. Annual Review of Anthropology. 33, 585-623 (2004).
- Hoekstra, H. Genetics, development and evolution of adaptive pigmentation in vertebrates. Heredity. 97 (3), 222-234 (2006).
- Quigley, I. K., Parichy, D. M. Pigment pattern formation in zebrafish: a model for developmental genetics and the evolution of form. Microscopy Research and Technique. 58 (6), 442-455 (2002).
- Meyers, J. R. Zebrafish: development of a vertebrate model organism. Current Protocols Essential Laboratory Techniques. 16 (1), 19 (2018).
- Kelsh, R. N., Schmid, B., Eisen, J. S. Genetic analysis of melanophore development in zebrafish embryos. Developmental Biology. 225 (2), 277-293 (2000).
- Rocha, M., Singh, N., Ahsan, K., Beiriger, A., Prince, V. E. Neural crest development: insights from the zebrafish. Developmental Dynamics. 249 (1), 88-111 (2020).
- Carney, T. J., et al. A direct role for Sox10 in specification of neural crest-derived sensory neurons. Development. 133 (23), 4619-4630 (2006).
- Curran, K., Raible, D. W., Lister, J. A. Foxd3 controls melanophore specification in the zebrafish neural crest by regulation of Mitf. Developmental Biology. 332 (2), 408-417 (2009).
- Zou, J., Beermann, F., Wang, J., Kawakami, K., Wei, X. The Fugu tyrp1 promoter directs specific GFP expression in zebrafish: tools to study the RPE and the neural crest-derived melanophores. Pigment Cell Research. 19 (6), 615-627 (2006).
- Xu, Q.
- Hermanson, S., Davidson, A. E., Sivasubbu, S., Balciunas, D., Ekker, S. C. Sleeping Beauty transposon for efficient gene delivery. Methods in Cell Biology. 77, 349-362 (2004).
- Stainier, D. Y., et al. Guidelines for morpholino use in zebrafish. PLoS Genetics. 13 (10), 1007000 (2017).
- Wu, N., et al. The progress of CRISPR/Cas9-mediated gene editing in generating mouse/zebrafish models of human skeletal diseases. Computational and Structural Biotechnology Journal. 17, 954-962 (2019).
- Affenzeller, S., Frauendorf, H., Licha, T., Jackson, D. J., Wolkenstein, K. Quantitation of eumelanin and pheomelanin markers in diverse biological samples by HPLC-UV-MS following solid-phase extraction. PLoS One. 14 (10), 0223552 (2019).
- Fernandes, B., Matamá, T., Guimarães, D., Gomes, A., Cavaco-Paulo, A.
- Hultman, K. A., Johnson, S. L. Differential contribution of direct-developing and stem cell-derived melanocytes to the zebrafish larval pigment pattern. Developmental Biology. 337 (2), 425-431 (2010).
- Mort, R. L., Jackson, I. J., Patton, E. E. The melanocyte lineage in development and disease. Development. 142 (4), 620-632 (2015).
