Summary
Her præsenteres en protokol til effektiv og nøjagtig screening af tobaksgenotyper for Phytophthora nicotianae-resistens hos frøplanter. Dette er en praktisk tilgang til præcisionsavl samt molekylær mekanismeforskning.
Abstract
Sort skaft, forårsaget af oomycetes Phytophthora nicotianae, er ødelæggende for tobak, og dette patogen er højpatogent for mange solanaceous afgrøder. P. nicotianae er velegnet til høje temperaturer; derfor får forskning i dette patogen betydning i landbruget over hele verden på grund af den globale opvarmning. P. nicotianae-resistente sorter af tobaksplanter screenes almindeligvis ved podning med havrekorn koloniseret af P. nicotianae og overvågning af sygdomssymptomerne. Det er imidlertid vanskeligt at kvantificere podningsintensiteten, da nøjagtig podning er afgørende i dette tilfælde. Denne undersøgelse havde til formål at udvikle en effektiv og pålidelig metode til evaluering af tobaks resistens over for infektion med P. nicotianae. Denne metode er med succes blevet brugt til at identificere resistente sorter, og podningseffektiviteten blev bekræftet af PCR i realtid. Resistensevalueringsmetoden, der præsenteres i denne undersøgelse, er effektiv og praktisk til præcisionsforædling samt molekylær mekanismeforskning.
Introduction
P. nicotianae er ødelæggende for mange solanaceous afgrøder. Det kan forårsage tobak "sort skaft"1, kartoffelblad og knoldrot2, tomat og sød peber krone og rodrot3 og Goji krave og rodrot4. P. nicotianae kan angribe alle dele af tobaksplanter, herunder rødder, stilke og blade på ethvert vækststadium5. Det mest almindelige symptom på sygdommen er den sorte base af stilken. Rødderne er oprindeligt synlige som vandgennemblødte og bliver derefter nekrotiske, og bladene viser store cirkulære læsioner5. Denne sygdom kan være ødelæggende for en tobaksplante i drivhuset såvel som i marken6. Den mest praktiske og økonomiske metode til bekæmpelse af P. nicotianae er brugen af resistente sorter7. Der kræves imidlertid en effektiv screeningsprotokol til identifikation af P. nicotianae-resistente tiltrædelser fra tobakskimplasmasamlinger.
Forskellige identifikationsmetoder er blevet beskrevet for at vurdere P. nicotianae-resistens i tobak7,8,9,10,11,12,13,14,15,16. Generelt er der anvendt tre hovedtilgange til identifikation af P. nicotianae-resistente tobaksgenotyper. Den første omfatter blanding af mycelier med agarmedium på Petri-plader indeholdende P. nicotianae. Mycelien dyrkes derefter i mørke ved stuetemperatur i 2 uger. 1 liter deioniseret vand tilsættes mycelien og homogeniseres i 30 s. Inokulumet holdes på is, indtil det er nødvendigt. To huller (1 cm i diameter og 4-5 cm dybe) er lavet på hver side af planten, og 10 ml af inokulumet hældes i hvert hul. Hullerne fyldes derefter med den omgivende jord, og sygdomsudviklingen overvåges dagligt i 2 uger8,10.
I den anden metode podes planterne med patogeninficerede tandstikkere. Til denne tilgang skal planterne anvendes ca. 6 uger efter transplantation og skal have en minimumshøjde på 30 cm. Autoklaverede tandstikkere placeres på overfladen af kulturer, der indeholder P. nicotianae mycelia. Kulturretterne opbevares derefter under lyset ved stuetemperatur i 7 dage. Derefter bruges koloniserede tandstikkere til at inokulere planterne. Tandstikkere indsættes i tobaksstængerne mellem fjerde og femte knude. Planterne overvåges dagligt i 5 dage9,15. Denne metode er ikke anvendelig til små frøplanter. Da inokulumet er patogeninficerede tandstikkere, kan podningsintensiteten ikke kontrolleres præcist.
Den mest anvendte tilgang involverer havrekorn til podning. I dette tilfælde fremstilles havrekorn ved autoklavering af 500 ml havre og 300 ml deioniseret vand ved 121 ° C i 1 time en gang om dagen i 3 dage. Derefter tilsættes havrekorn til det patogenkoloniserede kulturmedium. Skålene forsegles med paraffinfilm og inkuberes ved 25 ° C i lys i 7-12 dage. Fire separate 5 cm dybe huller er lavetpå pottejorden, 4 cm fra hver plante, og et patogeninficeret havrekorn placeres i hvert hul. Inkubationstiden bestemmes ud fra, hvornår det første overjordiske symptom opstår7,11,12,13,14,15,16. Denne metode er effektiv og anvendelig til modstandsscreening i stor skala. En begrænsning ved denne tilgang er imidlertid, at inokulumet er patogeninficerede havrekorn, hvorfor podningsintensiteten ikke kan kontrolleres præcist.
Men præsenteret her er en mere præcis metode, der gælder for vækstkammerresistensevaluering. Sammenlignet med de andre tilgange er inokulumet zoosporesuspension, hvorfor podningsintensiteten er kontrollerbar og justerbar. Da tobaksplanterne i denne undersøgelse dyrkes uden jord, er resultaterne lettere at observere. Desuden forårsager prøveudtagning af planterødder fra jord altid skade på rødderne, hvilket inducerer en række fysiologiske reaktioner17. I denne metode, da planter dyrkes uden jord, kan interferensen i rodskader elimineres. Afslutningsvis er denne metode mere praktisk til molekylær mekanismeforskning og præcisionsavl. Ved hjælp af denne protokol opnås data typisk inden for 5 dage, hvor mere end 200 planter evalueres i et enkelt eksperiment.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Materialer
- Få tobakssorter.
BEMÆRK: Til dette eksperiment blev "Beinhart1000-1" (et udvalg af Beinhart 1000) (BH) og "Xiaohuangjin1025" (XHJ) opnået fra National Medium-term Genbank of the Tobacco Germplasm Resource of China. BH er resistent, mens XHJ er modtagelig for P. nicotianae-infektion16. Et feltisolat af P. nicotianae race 0, som blev bevaret i Tobacco Research Institute of the Chinese Academy of Agricultural Sciences, blev brugt til alle podninger gennem hele undersøgelsen.
2. Plantning af tobaksgenotyper til evaluering af P. nicotianaeresistens
- Bland tobaksfrø med vermikulit og send frøene forsigtigt på den steriliserede pottejord. Placer potterne i vækstkammeret. Oprethold en konstant temperatur på 25 °C under en 16 timers lys/8 timers mørk fotoperiode.
- Forbered hydroponiske enheder med bakker og skumplader. Når frøene spirer, skal du stikke frøplanter ud af pottejorden, vaske rødderne forsigtigt med sterilt deioniseret vand og transplantere dem i de hydroponiske anordninger.
- Anbring enhederne i klimakamre ved 25 °C under en 16 timers lys/8 timers mørk fotoperiode i 24 timer.
- Forbered Hoagland næringsopløsning på forhånd (tabel 1). Transplanter frøplanterne til hydroponiske anordninger med Hoagland næringsopløsning (ca. 125 ml pr. Plante).
- Anbring enhederne i et klimakammer ved 25 °C under et 16 timers lys/8 timers mørkt fotoår i 2 uger.
3. Forberedelse af P. nicotianae zoospore suspension
- Forbered havregryn agar medium.
- Der vejes 33 g havregryn, og der overføres til glasvarer, og der tilsættes 1.000 ml sterilt vand. Kog på en elektromagnetisk komfurovn.
- Når havregryn bliver klæbrig, spændes den flydende opløsning gennem et stykke sterilt gasbind.
- Hæld den flydende opløsning i en 1.000 ml gradueret cylinder og juster volumenet til 1.000 ml med sterilt vand.
- Hæld den flydende opløsning i en glasreagensflaske og tilsæt 18 g agar. Blandingen (havregrynsagarmedium) rystes godt og autoklaveres ved 121 °C i 15 minutter. Lad det stå ved stuetemperatur i 30 minutter.
- Hæld ca. 20 ml af det steriliserede havregrynsagarmedium i hver petriskål. Lad petriskålene ved stuetemperatur afkøle grundigt inden myceldyrkning.
- Udfør mycelial dyrkning.
- Forbered stans og tandstikkere med en diameter på 1 cm på forhånd ved at autoklavere dem ved 121 °Ci 15 min.
- Slå huller i P. nicotianae mycelial agar kulturer for at lave runde myceliale måtter.
- Vælg mycelmåtterne, læg mycelsiden nedad på havregrynsagarmediet, og inkuber myceliet ved 25 ° C i mørke i 14 dage.
- Forbered P. nicotianae zoospore suspension.
- Der tilsættes 0,1 % KNO3-opløsning til hver myceldyrkning (15 ml/fad), efterfulgt af dyrkning ved 4 °C i 20 minutter for at fremkalde sporangium.
- Opbevar opvasken ved 25 °C i 25 minutter for at frigive zoosporer.
- Saml zoosporesuspensionen i et bægerglas, og mål zoosporekoncentrationen ved hjælp af et mikroskop og hæmocytometer.
- Juster zoosporekoncentrationen til 1 x 104 zoosporer/ml med sterilt vand.
4. Identifikation af sygdomsresistente tobakssorter
- Tag frøplanterne fra Hoagland næringsopløsningen og inokuler dem ved at nedsænke rødderne i 20 ml P. nicotianae zoospore suspension i en petriskål (90 mm) ved 25 ° C i 3 timer i mørket.
- Efter podning sættes tobaksplanterne i nye petriskåle med 10 ml sterilt vand, der nedsænker rødderne. Hold rødderne fugtige ved at dække med to stykker filterpapir. Hold opvasken ved 25 °C med en 16 timers lys/8 timers mørk fotoopholder.
- Efter 2-3 dage skal du observere sygdommens sværhedsgrad.
- Til kontrolbehandlingen sættes tobaksplanterne direkte i petriskålene med 10 ml sterilt vand, der nedsænker rødderne, og dæk rødderne med to stykker filterpapir.
BEMÆRK: Hver behandling havde tre replikationer, med 8 planter pr. Eksperiment.
- Til kontrolbehandlingen sættes tobaksplanterne direkte i petriskålene med 10 ml sterilt vand, der nedsænker rødderne, og dæk rødderne med to stykker filterpapir.
5. Evaluering af P. nicotianae-infektion
- Evaluer sygdommens sværhedsgrad 4-5 dage efter podning. Baseret på den kinesiske nationale standard18 skal du score individuelle plantesygdommes sværhedsgrad på en skala fra 0 til 9 (tabel 2, figur 1).
- Beregn sygdomsindekset ved hjælp af følgende formel18:
Sygdomsindeks =
hvor a, b, c, d, e og f er antallet af planter i hver sygdoms sværhedsgradsgrad.
BEMÆRK: Sygdommens sværhedsgrad blev opdelt i 6 lønklasser18 (tabel 3).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
4 uger gamle planter af den resistente sort BH og modtagelige sort XHJ blev udfordret med P. nicotianae ved hjælp af metoden i denne artikel. Eksperimentet blev designet med tre replikater, hver med 8 planter pr. Gruppe. P. nicotianae-infektion af de to tobakssorter, BH og XHJ, er vist i figur 2. 3 dage efter podning dækkede stammelæsioner for XHJ ca. halvdelen af stammeomkredsen, og halvdelen af bladene var let visne; i den resistente sort BH blev der ikke observeret symptomer. 4 dage efter podning forekom bladvisning og alvorlige stammelæsioner i XHJ, mens disse symptomer ikke forekom i BH.
5 dage efter podning blev den enkelte plantesygdoms sværhedsgrad registreret og beregnet ud fra den kinesiske nationale standard for "Grade and Investigation Method of Tobacco Diseases and Insect Pests"18 (tabel 4). Det gennemsnitlige sygdomsindeks for BH var 6,48, hvilket blev betragtet som resistent (R) i henhold til standarden, og det gennemsnitlige sygdomsindeks for XHJ var 76,85, hvilket blev betragtet som modtageligt (S) i henhold til standarden.
For at bekræfte podningseffektiviteten blev relativ patogenbiomasse kvantificeret ved PCR i realtid (figur 3). Plante- og patogengenomisk DNA blev isoleret fra inficeret BH og XHJ og indsamlet ved 24 timer, 72 timer og 168 timer efter infektion ved hjælp af CTAB-protokollen19. Relativ patogenbiomasse blev kvantificeret ved hjælp af primerparrene Pn-Fw (5'-CTCCAGAACGTGTACATCCG-3') / Pn-Rev (5'-TAGCGCCCTTCTCCTCAG-3'), der forstærker 40S ribosomalproteinet S3A (WS21) af P. nicotianae20 og Nt-Fw (5'-CAAGGAAATCACCGCTTTGG-3') / Nt-Rev (5'-AAGGGATGCGAGGATGGA-3'), hvilket forstærker tobaksreferencegenet 26S rRNA-genet21. Ekspressionsfoldændringer mellem patogen og tobaks-gDNA blev beregnet ved hjælp af 2-ΔΔCT Ct-metoden. Resultaterne af PCR i realtid bekræftede de fænotypiske observationer.
Fem afkom fra BC4F2-populationen af en krydsning mellem BH og XHJ og to mellemliggende resistenssorter, K326 og Yunyan87, blev evalueret ved hjælp af zoosporesuspensionspodningsmetoden og havrekornspodningsmetoden (tabel 5). Zoosporesuspensionsmetoden blev udført på små frøplanter, og havrekornspodningsmetoden blev udført på voksne planter. For de fem afkom fra BC4F2-populationen varierede sygdomsindekset fra 16,49 til 77,60 for zoosporesuspensionsmetoden og fra 10,33 til 83,08 for havrekornsmetoden. Resistensklassifikationerne mellem de to infektionsmetoder var for det meste i overensstemmelse med hinanden. Med de to mellemresistenssorter, K326 og Yunyan87, viste evalueringen "resistent" i begge metoder. Disse data illustrerer sammenhængen mellem de to podningsmetoder, på trods af at de udføres på tobaksplanter i forskellige vækstperioder.
| Original spiritus | Andel | Originalt væskevolumen (ml) | Næringsstoffer elementer | Indhold (g) |
| OL 1 | 1000× | 500 | MgSO4•7 H2O | 30.81 |
| OL 2 | 1000× | 500 | Ca(NO3)2•4 H2O | 221.39 |
| OL 3 | 1000× | 500 | NaH2PO4•2 H2O | 19.5 |
| OL 4 | 1000× | 500 | 44 KR. | 75.04 |
| OL 5 | 1000× | 500 | (NH4) 2 SO4 | 123.75 |
| OL 6 | 1000× | 500 | CaCl2 | 104.06 |
| OL 7 | 1000× | 500 | FeSO4•7 H2O | 2.78 |
| Na2-EDTA | 3.73 | |||
| OL 8 | 1000× | 500 | K2SO4 | 87.1 |
| OL 9 | 4000× | 1000 | MnCl2•4 H2O | 7.24 |
| H3BO3 | 11.44 | |||
| ZnSO4•7 H2O | 0.88 | |||
| CuSO4•5 H2O | 0.32 | |||
| (NH4) 6 Mo7O24•2 H2O | 0.36 |
Tabel 1: Hoagland næringsopløsning.
| Grad | Udseende af fænotype |
| Lønklasse 0 | Ingen symptomer på hele planten |
| Lønklasse 1 | Stammelæsioner < 1/3 af stammens omkreds eller <1/3 af blade, der visner |
| Lønklasse 3 | Stammelæsioner mellem 1/3 og 1/2 af stammeomkredsen eller mellem 1/3 og 1/2 af bladene lidt visnende |
| Lønklasse 5 | Stammelæsioner >1/2 af stammeomkredsen, men ikke helt omkring omkredsen eller mellem 1/2 og 2/3 af bladene, der visner |
| Lønklasse 7 | Stamme læsioner omkring hele stammen omkreds eller >2/3 af blade, der visner |
| Lønklasse 9 | Planter ser døde ud |
Tabel 2: Rangordning af sværhedsgraden af sort skaftsygdom. Baseret på den kinesiske nationale standard for "Grade and Investigation Method of Tobacco Diseases and Insect Pests" (GB/T 23222-2008) blev individuelle plantesygdommes sværhedsgrad scoret på en skala fra 0 til 9.
| Sygdomsindeks | Evaluering af resistens |
| 0 | Meget resistent eller immun (I) |
| 0,1 til 20 | Modstandsdygtig (R) |
| 20.1 til 40 | Moderat resistent (MR) |
| 40.1 til 60 | Moderat modtagelig (MS) |
| 60.1 til 80 | Modtagelige (S) |
| 80.1 til 100 | Meget modtagelig (HS) |
Tabel 3: Evaluering af resistens i henhold til sygdomsindeks. Sygdommens sværhedsgrad blev opdelt i 6 kvaliteter i henhold til sygdomsindekset. 0 betyder meget resistent eller immun (I), 0,1 til 20 betyder resistent (R), 20,1 til 40 betyder moderat resistent (MR), 40,1 til 60 betyder moderat modtagelig (MS), 60,1 til 80 betyder modtagelig (S), 80,1 til 100 betyder meget modtagelig (HS).
| Sort | Gentage | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 | Sygdomsindeks | Betyde | Evaluering af resistens | |
| BH | 1 | 0 | 1 | 0 | 0 | 1 | 0 | 1 | 0 | 4.17 | 6.48 | ||
| 2 | 1 | 0 | 0 | 0 | 3 | 1 | 0 | 1 | 8.33 | R | |||
| 3 | 1 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 3 | 1 | 6.94 | ||||
| XHJ | 1 | 7 | 5 | 7 | 7 | 9 | 7 | 7 | 7 | 77.78 | 76.85 | ||
| 2 | 9 | 7 | 9 | 7 | 5 | 9 | 7 | 5 | 80.56 | S | |||
| 3 | 7 | 5 | 7 | 9 | 5 | 9 | 5 | 5 | 72.22 | ||||
Tabel 4: Sygdomsindeks og resistens i BH og XHJ. Det gennemsnitlige sygdomsindeks for BH var 6,48, hvilket viser resistens (R) i henhold til standarden, og det gennemsnitlige sygdomsindeks for XHJ var 76,85, hvilket viser modtagelighed (S) i henhold til standarden.
| Genotype | Zoospore suspension | Havre korn metode | ||||||
| Forsøg 1 | Forsøg 2 | Betyde | Klassifikation | Forsøg 1 | Forsøg 2 | Betyde | Klassifikation | |
| BH | 4.17 | 8.33 | 6.94 | R | 0 | 0 | 0 | Jeg |
| XHJ | 77.78 | 80.56 | 72.22 | S | 84.89 | 90 | 87.45 | HS |
| K326 | 12.5 | 12.5 | 12.5 | R | 5.39 | 15.67 | 10.53 | R |
| Yunyan87 | 19.45 | 8.33 | 13.89 | R | 4.7 | 28.89 | 16.8 | R |
| C42-4 | 21.28 | 21.89 | 21.59 | HR | 7.56 | 13.11 | 10.33 | R |
| C13-4 | 18.16 | 14.81 | 16.49 | R | 38.89 | 19.66 | 29.27 | HR |
| C9-5 | 77.41 | 77.78 | 77.6 | S | 79.83 | 82.86 | 81.34 | HS |
| C46-8 | 55.56 | 51.11 | 53.34 | MS | 62.91 | 72.65 | 67.78 | S |
| C66-9 | 79.88 | 74.07 | 76.98 | S | 93.94 | 72.22 | 83.08 | HS |
Tabel 5: P. nicotianae-infektionsrespons i forskellige genotyper med zoosporesuspensionspodningsmetoden og havrekornspodningsmetoden. Zoospore suspension inokulationsmetoden blev udført på små frøplanter, og havrekornspodningsmetoden blev udført på voksne planter. Disse data illustrerer sammenhængen mellem zoosporesuspensionspodningsmetoden og havrekornspodningsmetoden. K326 og Yunyan87 har mellemliggende resistensniveauer, og C42-4, C13-4, C9-5, C46-8, C66-9 er afkom fra BC4F2-populationen i en krydsning mellem BH og XHJ. Planterne blev klassificeret som immune, resistente, moderat resistente, moderat modtagelige, modtagelige eller meget modtagelige.
Figur 1: Symptom på hver klasse. (A) Grad 0, hele planten symptomfri. (B) Grad 1, stammelæsion <1/3 af stammeomkreds eller <1/3 blade, der visner. C) Grad 3, stammelæsioner mellem 1/3 og 1/2 af stammeomkredsen eller mellem 1/3 og 1/2 af bladene, der visner let. D) Grad 5, stammelæsioner >1/2 af stammeomkredsen, men ikke helt omkring omkredsen, eller mellem 1/2 og 2/3 af bladene, der visner. (E) Grad 7, stammelæsioner omkring hele stammeomkredsen eller >2/3 af blade, der visner. (F) Grad 9, planter ser døde ud. Røde pile angiver stammelæsionerne. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 2: Variation observeret i to tobaksgenotyper. (A) Hele planten symptomfri i resistent sort BH 3 dage efter podning. (B) Stængellæsioner er omkring 1/2 af stammens omkreds og 1/2 af bladene lidt visne i XHJ 3 dage efter podning. (C) Hele planten symptomfri i resistent sort BH 4 dage efter podning. (D) Stængellæsioner >1/2 af stammeomkreds, men ikke helt omkring omkredsen, og mellem 1/2 og 2/3 af blade, der visner i modtagelig sort XHJ 4 dage efter podning. Røde pile angiver stammelæsionerne. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 3: Relativ P. nikotin biomasse kvantificering i inficeret BH og XHJ ved 24 timer, 72 timer og 168 timer efter podning. Dette beregnes som forholdet mellem P. nicotianae WS21 genamplifikation i sammenligning med tobak 26S rRNA genet. Klik her for at se en større version af denne figur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Flere resistenskilder er blevet brugt til at forbedre P. nicotianae-resistens i dyrket tobak. Enkelt dominerende R-gener, Php og Phl, er blevet introgresseret fra henholdsvis Nicotiana plumbaginifolia og Nicotiana longiflora10. Cigartobakssorten Beinhart 1000 har det højeste rapporterede niveau af kvantitativ resistens over for P. nicotianae13. Flere intervalkortlægningseksperimenter har antydet, at mindst seks kvantitative træk loci (QTL'er) kan bidrage til modstandeni denne linje13,22. Ud over de resistente kilder, der er nævnt ovenfor, har et andet fremmed gen, Wz, også vist sig at give et højt niveau af resistens over for race 0 og race 123,24. I betragtning af de mange resistente kilder og den komplicerede genetiske baggrund for resistente sorter kræves der en præcis og pålidelig metode til resistensvurdering for 1) identifikation af P. nicotianae-resistente tobaksgenotyper, 2) avlsresistente sorter og 3) molekylære mekanismeundersøgelser af plantepatogeninteraktioner. De tidligere metoder, der blev brugt til at vurdere sværhedsgraden af P. nicotianae-infektionen, var tidskrævende, eller podningsintensiteterne var vanskelige at kontrollere. Derfor haster det med at fastlægge en ny metode til evaluering af P. nicotianae-resistens.
Efterligning af naturlige infektionsprocesser er nøglepunktet i vores nye metode. For det første er zoosporer i løbet af den typiske livscyklus for P. nicotianae de vigtigste infektiøse midler, der initierer plantesygdomme. Når zoosporerne når planteoverfladen, bliver de immobile cyster, spirer efterfølgende og danner kimrør. Derefter produceres appressoria ved spidsen af kimrørene25. I vores protokol blev zoosporesuspension brugt som inokulum, som efterligner den naturlige infektionssituation. For det andet spirede cysterne på Nicotiana benthamiana blade og koloniserede epidermale celler ved 3 h26. I Arabidopsis rødder trængte alle de encysted zoosporer med succes ind i rødderne ved 6 timer efter podning27. I vores tilgang involverede podningsprocessen nedsænkning af rødder i en P. nicotianae zoospore suspension i 3 timer i mørket, hvilket efterligner det naturlige miljø og fremmer koloniseringen af patogenet, hvilket fører til stabil og effektiv infektion.
Den hyppigst anvendte tilgang til vurdering af P. nicotianae-resistens i tobak, havrekornsmetoden, er effektiv og nem til podning af et stort antal planter7,11,12,13,14,15,16. Det har dog nogle ulemper. Den største ulempe er den ukontrollerede inokulatintensitet, som begrænser dens anvendelse i præcisionsavl. Sammenlignet med havrekornsmetoden og de to andre eksisterende tilgange anvendes zoosporesuspension i denne nye tilgang som inokulum, så inokulatintensiteten er kontrollerbar og justerbar. Da planterne dyrkes i et hydroponisk miljø, elimineres jordens interferens, hvilket øger evalueringsnøjagtigheden. Der findes dog en begrænsning for denne metode, som er, at den ikke kan brugespå voksne planter. Havrekornsmetoden er derimod anvendelig til storstilet resistensscreening af voksne planter7,13. Derfor kan denne metode og havrekornsmetoden supplere hinanden i forskellige vækstperioder af tobaksplanten og i forskellige situationer.
Protokollen beskrevet her er en effektiv og pålidelig metode til evaluering af tobaksresistens over for infektion med P. nicotianae på frøplantestadiet. Denne protokol kan bruges til avl og til molekylær mekanismeforskning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har intet at afsløre.
Acknowledgments
Denne forskning blev finansieret af National Natural Science Foundation of China (31571738) og Agricultural Science and Technology Innovation Program of China (ASTIP-TRIC01).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| (NH4)2SO4 | Sinopharm | 10002917 | Analytical Reagent |
| (NH4)6 Mo7O24•2 H2O | Sinopharm | XW131067681 | Analytical Reagent |
| 1.5 ml Safe-lock Microcentrifuge Tubes | Eppendorf | 30120086 | Used for Sample Extarction |
| 2 ml Safe-lock Microcentrifuge Tubes | Eppendorf | 30120094 | Used for Sample Extarction |
| Agar | MDBio, Inc | 9002-18-0 | Materials of Culture Medium |
| Analytical Balance | AOHAOSI | AX2202ZH | Equipment |
| Autoclave | Yamatuo | SQ510C | Equipment |
| Autoclave | YAMATUO | SQ510C | Equipment |
| Beaker | Bio Best | DHSB-2L | Materials of Culture Medium |
| Biological Incubator | JINGHONG | SHP-250 | Equipment |
| Ca(NO3)2•4 H2O | Sinopharm | 80029062 | Analytical Reagent |
| CaCl2 | Sinopharm | 10005817 | Analytical Reagent |
| CuSO4•5 H2O | Sinopharm | 10008218 | Analytical Reagent |
| Electromagnetic Oven | Bio Best | DHDCL | Equipment |
| FeSO4•7 H2O | Sinopharm | 10002918 | Analytical Reagent |
| Filter Paper | Bio Best | DHLZ-9CM | Material |
| Fluorescence Ration PCR Instrument | Roche | LightCycler96 | Equipment |
| Gauze | Bio Best | 17071202 | Materials of Culture Medium |
| H3BO3 | Phytotechnology | B210-500G | Analytical Reagent |
| Hemocytometer | Solarbio | 17072801 | Material for disease-resistant identification |
| K2SO4 | Sinopharm | 10017918 | Analytical Reagent |
| KNO3 | Sinopharm | 10017218 | Analytical Reagent |
| KT Foam Sheet | Bio Best | DHKTB | Material for Seedling |
| Low Constant Incubator | Jinghong | SHP-250 | Equipment |
| Measuring Cylinder | Bio Best | DHBLLT-1000ML | Materials of Culture Medium |
| MgSO4•7 H2O | Sinopharm | 10013080 | Analytical Reagent |
| Microscope | ECHO | RVL-100-G | Equipment |
| MnCl2•4 H2O | Sinopharm | G5468154 | Analytical Reagent |
| Na2-EDTA | Sinopharm | G21410-250 | Analytical Reagent |
| NaH2PO4•2 H2O | Sinopharm | 20040717 | Analytical Reagent |
| NH4NO3 | Sinopharm | B64586-100g | Analytical Reagent |
| Oatmeal | Bio Best | DHYMP-1.5KG | Materials of Culture Medium |
| Petri Dish | Bio Best | DHPYM-9CM | Material for disease-resistant identification |
| Pipettor | THERMO | S1 | Equipment |
| Potting | Bio Best | DHYCXHP-12CM | Material for Seedling |
| Potting Soil | Bio Best | DHYMJZ-50L | Seedling Material |
| Punch | Bio Best | DHDKW | Material |
| qRT-PCR Plate | Monad | MQ50401S | qRT-PCR Plate |
| SYBR Green Premix Pro Taq HS qPCR Kit | Accurate Biology | AG11718 | PCR Reagent |
| Toothpick | Bio Best | DHYQ-900 | Material |
| Total RNA Kit II | Omega | R6934-01 | PCR Reagent |
| TransScript® II One-Step gDNA Removal and cDNA Synthesis SuperMix | Transgen | AH311-02 | PCR Reagent |
| Trays | Bio Best | DHYMTP-90G | Material for Seedling |
| Vermiculite | Bio Best | DHZS | Seedling Material |
| Water Purification System | HEAL FORCE | HSE68-2 | Equipment |
| ZnSO4•7 H2O | Sinopharm | 10024018 | Analytical Reagent |
References
- Antonopoulos, D. F., Melton, T., Mila, A. L. Effects of chemical control, cultivar resistance, and structure of cultivar root system on black shank incidence of tobacco. Plant Disease. 94 (5), 613-620 (2010).
- Taylor, R. J., Pasche, J. S., Gallup, C. A., Shew, H. D., Gudmestad, N. C. A foliar blight and tuber rot of potato caused by Phytophthora nicotianae: New occurrences and characterization of isolates. Plant Disease. 92 (4), 492-503 (2008).
- Amalia, B. R., José, I. M. G., Miguel, D. C. G., Francisco, C. F., Julio, C. T. M. Pathogenicity of plant and soil isolates of Phytophthora parasitica on tomato and pepper. European Journal of Plant Pathology. 148 (3), 607-615 (2017).
- Corrado, C., Annamari, M., Leonardo, S., Antonio, I., Simona, M. S. First report of collar and root rot caused by Phytophthora nicotianae on Lycium barbarum. Journal of Plant Pathology. 100 (2), (2018).
- Meng, Y. L., Zhang, Q., Ding, W., Shan, W. X. Phytophthora parasitica.: a model oomycete plant pathogen. Mycology. 5 (2), 43-51 (2014).
- Biasi, A., Martin, F. N., Cacciola, S. O., Lio, G. M., Grunwald, N. J., Schena, L. Genetic analysis of Phytophthora nicotianae populations from different hosts using microsatellite markers. Phytopathology. 106 (9), 1006-1014 (2016).
- Sullivan, M. J., Melton, T. A., Shew, H. D. Fitness of races 0 and 1 of Phytophthora parasitica var. nicotianae. Plant Disease. 89 (11), 1220-1228 (2005).
- Carlson, S. R., Wolff, M. A. F., Shew, H. D., Wernsman, E. A. Inheritance of resistance to Race 0 of Phytophthora parasitica var. nicotianae from the flue-cured tobacco cultivar Coker 371-Gold. Plant Disease. 81 (11), 1269-1274 (1997).
- Csinos, A. S. Stem and root resistance to tobacco black shank. Plant Disease. 83 (8), 777-780 (1999).
- Johnson, E. S., Wolff, M. F., Wernsman, E. A., Atchley, W. R., Shew, H. D. Origin of the black shank resistance gene, Ph, in tobacco cultivar coker 371-Gold. Plant Disease. 86 (10), 1080-1084 (2002).
- Osmany, C., Ingrid, H., Roxana, P., Yunior, L., Merardo, P., Orlando, B. H. Identification of defense-related genes in tobacco responding to black shank disease. Plant Science. 177 (3), 175-180 (2009).
- Hernández, I., et al. Black shank resistant tobacco by silencing of glutathione S-transferase. Biochemical and Biophysical Research Communications. 387 (2), 300-304 (2009).
- Vontimitta, V., Lewis, R. S. Growth chamber evaluation of a tobacco 'Beinhart 1000' × 'Hicks' mapping population for quantitative trait loci affecting resistance to multiple races of Phytophthora nicotianae. Crop Science. 52 (1), 91-98 (2012).
- Xiao, B., et al. Location of genomic regions contributing to Phytophthora nicotianae resistance in tobacco cultivar florida 301. Crop Science. 53 (2), 473-481 (2013).
- McCorkle, K., Lewis, R., Shew, D. Resistance to Phytophthora nicotianae in tobacco breeding lines derived from variety Beinhart 1000. Plant Disease. 97 (2), 252-258 (2013).
- Zhang, Y., et al. Identification of stably expressed QTL for resistance to black shank disease in tobacco (Nicotiana tabacum L.) line Beinhart 1000-1. The Crop Journal. 6 (3), 282-290 (2018).
- Yu, X., Feng, B., He, P., Shan, L. From chaos to harmony: responses and signaling upon microbial pattern recognition. Annual Review of Phytopathology. 55, 109-137 (2017).
- Ren, G., et al. GB/T 23222 Grade and Investigation Method of Tobacco Diseases and Insect Pests. , China Standard Press. Beijing. (2008).
- Doyle, J. J., Doyle, J. L. A rapid DNA isolation procedure for small quantities of fresh leaf tissue. Phytochemical Bulletin. 19 (11), 11-15 (1987).
- Yan, H. Z., Liou, R. F. Selection of internal control genes for real-time quantitative RT-PCR assays in the oomycete plant pathogen Phytophthora parasitica. Fungal Genetics and Biology. 43, 430-438 (2006).
- Chacón, O., Hernández, I., Portieles, R., López, Y., Pujol, M., Borrás-Hidalgo, O. Identification of defense-related genes in tobacco responding to black shank disease. Plant Science. 117 (3), 175-180 (2009).
- Vijay, V., Ramsey, S. L. Mapping of quantitative trait loci affecting resistance to Phytophthora nicotianae in tobacco (Nicotiana tabacum L.) line Beinhart-1000. Molecular Breeding. 29 (1), 89-98 (2012).
- McCorkle, K. L., Drake-Stowe, K., Lewis, R. S., Shew, D. Characterization of Phytophthora nicotianae resistance conferred by the introgressed Nicotiana rustica region, Wz, in flue-cured tobacco. Plant Disease. 102 (2), 309-317 (2018).
- Drake, K. E., Moore, J. M., Bertrand, P., Fortnum, B., Peterson, P., Lewis, R. S. Black shank resistance and agronomic performance of flue-cured tobacco lines and hybrids carrying the introgressed Nicotiana rustica Region. Wz. Crop Science. 55 (1), 79-86 (2015).
- Kebdani, N., Pieuchot, L., Deleury, E., Panabières, F., Berre, J. -Y. L., Gourgues, M. Cellular and molecular characterization of Phytophthora parasitica appressorium-mediated penetration. New Phytologist. 185 (1), 248-257 (2010).
- Huang, G., et al. An RXLR effector secreted by Phytophthora parasitica is a virulence factor and triggers cell death in various plants. Molecular Plant Pathology. 20 (3), 1-16 (2019).
- Agnès, A., Mathieu, G., Nicolas, C. -T., Harald, K. The immediate activation of defense responses in Arabidopsis roots is not sufficient to prevent Phytophthora parasitica infection. New Phytologist. 187 (2), 229 (2010).
