Summary
Aqui, é apresentado um protocolo para a triagem eficiente e precisa dos genótipos do tabaco para resistência à Phytophthora nicotianae em mudas. Trata-se de uma abordagem prática para a reprodução de precisão, bem como para a pesquisa de mecanismos moleculares.
Abstract
A haste preta, causada pelos oomycetes Phytophthora nicotianae, é destrutiva para o tabaco, e este patógeno é altamente patogênico para muitas culturas solanáceos. P. nicotianae é bem adaptado a altas temperaturas; portanto, a pesquisa sobre esse patógeno está ganhando importância na agricultura mundial por causa do aquecimento global. As variedades resistentes à p. nicotianae de plantas de tabaco são comumente rastreadas pela inoculação com grãos de aveia colonizados por P. nicotianae e monitoramento dos sintomas da doença. No entanto, é difícil quantificar a intensidade da inoculação, uma vez que a inoculação precisa é crucial neste caso. Este estudo teve como objetivo desenvolver um método eficiente e confiável para avaliar a resistência do tabaco à infecção com P. nicotianae. Este método tem sido usado com sucesso para identificar variedades resistentes, e a eficiência da inoculação foi confirmada por PCR em tempo real. O método de avaliação de resistência apresentado neste estudo é eficiente e prático para a reprodução de precisão, bem como para a pesquisa de mecanismos moleculares.
Introduction
P. nicotianae é destrutivo para muitas culturas solanáceas. Pode causar tabaco "pernil preto"1, batata foliar e tuber rot2, tomate e pimenta doce coroa e raiz rot3, e goji colar e raiz rot4. P. nicotianae pode atacar todas as partes das plantas de tabaco, incluindo as raízes, caules e folhas em qualquer estágio de crescimento5. O sintoma mais comum da doença é a base negra do talo. As raízes são inicialmente visíveis como encharcadas de água e depois tornam-se necrosadas, e as folhas apresentam grandes lesões circulares5. Essa doença pode ser devastadora para uma planta de tabaco na estufa, bem como no campo6. O método mais prático e econômico para controlar p. nicotianae é o uso de variedades resistentes7. No entanto, é necessário um protocolo de triagem eficaz para a identificação de adesões resistentes à P. nicotianae a partir de coleções de germoplasma de tabaco.
Vários métodos de identificação foram descritos para avaliar a resistência à P. nicotianae no tabaco7,8,9,10,11,12,13,14,15,16. Em geral, três abordagens importantes têm sido utilizadas para a identificação de genótipos de tabaco resistentes à P. nicotianae. O primeiro inclui a mistura de micélia com meio de ágar em placas de Petri contendo P. nicotianae. As micélias são então cultivadas no escuro à temperatura ambiente por 2 semanas. 1 L de água deionizada é adicionado à micélia e homogeneizado para 30 s. O inóculo é mantido no gelo até que seja necessário. Dois orifícios (1 cm de diâmetro e 4-5 cm de profundidade) são feitos em cada lado da planta, e 10 mL do inóculo são derramados em cada orifício. Os buracos são então preenchidos com o solo circundante, e o desenvolvimento de doenças é monitorado diariamente por 2 semanas8,10.
No segundo método, as plantas são inoculadas com palitos infestados de patógenos. Para esta abordagem, as plantas devem ser utilizadas aproximadamente 6 semanas após o transplante e devem ter uma altura mínima de 30 cm. Palitos de dente autoclavados são colocados na superfície de culturas que contêm P. nicotianae mycelia. Os pratos de cultura são então armazenados sob a luz à temperatura ambiente por 7 dias. Então, palitos colonizados são usados para vacinar as plantas. Palitos de dente são inseridos nas hastes de tabaco entre o quarto e o quinto nós. As plantas são monitoradas diariamente durante 5 dias9,15. Este método não é aplicável para pequenas mudas. Como o inóculo é um palito infestado de patógenos, a intensidade da inoculação não pode ser precisamente controlada.
A abordagem mais utilizada envolve grãos de aveia para inoculação. Neste caso, os grãos de aveia são preparados por autoclaving 500 mL de aveia e 300 mL de água deionizada a 121 °C por 1h uma vez por dia durante 3 dias. Em seguida, os grãos de aveia são adicionados ao meio de cultura colonizada por patógenos. Os pratos são selados com filme de parafina e incubados a 25 °C em luz por 7-12 dias. Quatro buracos de 5 cm de profundidade separados são feitos no solo de vasos, 4 cm de cada planta, e um grão de aveia infestado de patógenos é colocado em cada orifício. O período de incubação é determinado com base em quando o primeiro sintoma acima do solo ocorre7,11,12,13,14,15,16. Este método é eficiente e aplicável para a triagem de resistência em larga escala. No entanto, uma limitação dessa abordagem é que o inóculo é de grãos de aveia infestados de patógenos, portanto a intensidade da inoculação não pode ser precisamente controlada.
No entanto, aqui apresentado é um método mais preciso que é aplicável à avaliação da resistência da câmara de crescimento. Em comparação com as outras abordagens, o inóculo é a suspensão do zoospore, portanto a intensidade da inoculação é controlável e ajustável. Como as plantas de tabaco neste estudo são cultivadas sem solo, os resultados são mais fáceis de observar. Além disso, a amostragem das raízes vegetais do solo sempre causa danos às raízes, o que induz uma série de respostas fisiológicas17. Neste método, como as plantas são cultivadas sem solo, a interferência no dano radicular pode ser eliminada. Em conclusão, este método é mais prático para pesquisa de mecanismos moleculares e criação de precisão. Usando este protocolo, os dados são normalmente obtidos dentro de 5 dias, com mais de 200 plantas avaliadas em um único experimento.
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Protocol
1. Materiais
- Obter variedades de tabaco.
NOTA: Para este experimento "Beinhart1000-1" (uma seleção de Beinhart 1000) (BH) e "Xiaohuangjin1025" (XHJ) foram obtidos do Genbank Nacional de Médio Prazo do Recurso de Germplasma do Tabaco da China. BH é resistente, enquanto XHJ é suscetível à infecção por P. nicotianae16. Um isolamento de campo da P. nicotianae race 0, que foi preservada no Instituto de Pesquisa do Tabaco da Academia Chinesa de Ciências Agrícolas, foi usado para todas as vacinas ao longo do estudo.
2. Plantio de genótipos de tabaco para avaliação de resistência p. nicotianae
- Misture as sementes de tabaco com vermiculite e transmita as sementes suavemente no solo esterilizado. Coloque os potes na câmara de crescimento. Mantenha uma temperatura constante de 25 °C, sob um fotoperíodo escuro de 16 h/8 h.
- Prepare dispositivos hidropônicos com bandejas e folhas de espuma. Após as sementes germinarem, pique as mudas do solo de vaso, lave as raízes suavemente com água deionizada estéril e transplante-as nos dispositivos hidropônicos.
- Coloque os dispositivos em câmaras climáticas a 25 °C sob um fotoperíodo escuro de 16 h/8 h por 24 h.
- Prepare a solução de nutrientes Hoagland com antecedência (Tabela 1). Transplante das mudas para dispositivos hidropônicos com solução de nutrientes Hoagland (aproximadamente 125 mL por planta).
- Coloque os dispositivos em uma câmara climática a 25 °C sob um fotoperíodo escuro de 16 h/8h por 2 semanas.
3. Preparação da suspensão do zoológico de P. nicotianae
- Prepare o ágar médio de aveia.
- Pesar 33 g de aveia e transferir para vidros e adicionar 1.000 mL de água estéril. Ferva em um forno de fogão eletromagnético.
- Depois que a aveia ficar pegajosa, coe a solução líquida através de um pedaço de gaze estéril.
- Despeje a solução líquida em um cilindro graduado de 1.000 mL e ajuste o volume para 1.000 mL com água estéril.
- Despeje a solução líquida em uma garrafa de reagente de vidro e adicione 18 g de ágar. Agite bem e autoclave a mistura (meio de áteis de aveia) a 121 °C por 15 min. Deixe em temperatura ambiente por 30 minutos.
- Despeje cerca de 20 mL do meio de ágar de aveia esterilizado em cada placa de Petri. Deixe as placas de Petri à temperatura ambiente para esfriar bem antes do cultivo micelial.
- Realize o cultivo de micélio.
- Prepare socos de 1 cm de diâmetro e palitos de dente de antemão, autoclavando-os a 121 °Cfor 15 min.
- Furos nas culturas mycelial mycelial P. nicotianae para fazer tapetes miceliais redondos.
- Escolha os tapetes de micrúbio, coloque o lado mycelial no meio de ágar de aveia e incuba o micélio a 25 °C no escuro por 14 dias.
- Prepare a suspensão do zoológico de P. nicotianae .
- Adicione 0,1% de solução KNO3 a cada cultivo micelial (15 mL/prato), seguido de cultivo a 4 °C por 20 min para induzir esporangium.
- Mantenha os pratos a 25 °C por 25 minutos para liberar zoospores.
- Colete a suspensão do zoospore em um béquer e meça a concentração de zoospore usando um microscópio ehemocímetro.
- Ajuste a concentração de zoospore para 1 x 104 zoospores/mL com água estéril.
4. Identificação de variedades de tabaco resistentes a doenças
- Pegue as mudas da solução de nutrientes Hoagland e inocula-as imergindo as raízes em 20 mL de suspensão zoospora P. nicotianae em uma placa de Petri (90 mm) a 25 °C por 3 h no escuro.
- Após a inoculação, coloque as mudas de tabaco em novas placas de Petri com 10 mL de água estéril imergindo as raízes. Mantenha as raízes úmidas cobrindo com dois pedaços de papel filtro. Mantenha os pratos a 25 °C com um fotoperíodo escuro de 16h/8 h.
- Após 2-3 dias, observe a gravidade da doença.
- Para o tratamento de controle, coloque as mudas de tabaco diretamente nas placas de Petri com água estéril de 10 mL imergindo as raízes, e cubra as raízes com dois pedaços de papel filtro.
NOTA: Cada tratamento teve três replicações, sendo 8 plantas por experimento.
- Para o tratamento de controle, coloque as mudas de tabaco diretamente nas placas de Petri com água estéril de 10 mL imergindo as raízes, e cubra as raízes com dois pedaços de papel filtro.
5. Avaliação da infecção por P. nicotianae
- Avalie a gravidade da doença de 4 a 5 dias após a inoculação. Com base no padrão nacional chinês18, escore a gravidade da doença vegetal individual em uma escala de 0 a 9 (Tabela 2, Figura 1).
- Calcule o índice da doença usando a seguinte fórmula18:
Índice da doença =
onde a, b, c, d, e, e e e f são o número de plantas em cada grau de gravidade da doença.
NOTA: A gravidade da doença foi dividida em 6 séries18 (Tabela 3).
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Representative Results
Plantas de 4 semanas de idade da variedade resistente BH e variedade suscetível XHJ foram desafiadas com P. nicotianae utilizando o método apresentado neste artigo. O experimento foi projetado com três réplicas, cada uma com 8 plantas por grupo. A infecção por P. nicotianae das duas variedades de tabaco, BH e XHJ, é apresentada na Figura 2. Aos 3 dias após a inoculação, para XHJ, as lesões do caule cobriram aproximadamente metade da cintura do caule, e metade das folhas estavam ligeiramente murchas; na variedade resistente BH, não foram observados sintomas. Aos 4 dias após a inoculação, o murcho da folha e lesões graves da haste ocorreram no XHJ, enquanto esses sintomas não apareceram em BH.
Aos 5 dias após a inoculação, foi registrada a gravidade da doença vegetal individual e calculada com base no padrão nacional chinês para o "Método de Grau e Investigação de Doenças do Tabaco e Pragas de Insetos"18 (Tabela 4). O índice médio da doença de BH foi de 6,48, considerado resistente (R) conforme o padrão, e o índice médio da doença de XHJ foi de 76,85, considerado suscetível (S) conforme a norma.
Para confirmar a eficiência da inoculação, a biomassa relativa do patógeno foi quantificada por PCR em tempo real (Figura 3). O DNA genômico de plantas e patógenos foi isolado de BH e XHJ infectados e coletado às 24h, 72 h e 168 h de infecção pós-CTAB usando o protocolo CTAB19. A biomassa relativa do patógeno foi quantificada utilizando-se os pares de primer Pn-Fw (5'-CTCCAGAACGTGTACATCCGG-3') / Pn-Rev (5'-TAGCGCCCCTCCCCTCAG-3'), amplificando a proteína ribossômica S3A (WS21) de P. nicotianae20, e Nt-Fw (5'-CAAGGAAATCACCCTTTGG-3') / Nt-Rev (5'-AAGGGATGAGGATGGA-3'), amplificando o gene de referência do tabaco 26S rRNA gene21. As alterações da dobra de expressão entre patógeno e gDNA de tabaco foram calculadas utilizando-se o método 2-ΔΔCT Ct. Os resultados do PCR em tempo real confirmaram as observações fenotípicas.
Cinco progens da população BC4F2 de um cruzamento entre BH e XHJ e duas variedades de resistência intermediária, K326 e Yunyan87, foram avaliados utilizando-se o método de inoculação de suspensão do zoospore e o método de inoculação de grãos de aveia (Tabela 5). O método de suspensão do zoospore foi realizado em pequenas mudas, e o método de inoculação de grãos de aveia foi realizado em plantas adultas. Para os cinco progênios da população BC4F2, o índice da doença variou de 16,49 a 77,60 para o método de suspensão do zoospore e de 10,33 a 83,08 para o método de grãos de aveia. As classificações de resistência entre os dois métodos de infecção foram em sua maioria consistentes entre si. Com as duas variedades de resistência intermediária, K326 e Yunyan87, a avaliação mostrou-se "resistente" em ambos os métodos. Esses dados ilustram a correlação entre os dois métodos de inoculação, apesar de serem realizados em plantas de tabaco em diferentes períodos de crescimento.
| Licor original | Proporção | Volume original de licor (mL) | Elementos nutrientes | Conteúdo (g) |
| OL 1 | Mil× | 500 | Mgso4•7 H2O | 30.81 |
| OL 2 | Mil× | 500 | Ca(NO3)2•4 h2O | 221.39 |
| OL 3 | Mil× | 500 | NaH2PO4•2 H2O | 19.5 |
| OL 4 | Mil× | 500 | NH4NO3 | 75.04 |
| OL 5 | Mil× | 500 | (NH4) algarismo SO4 | 123.75 |
| OL 6 | Mil× | 500 | CaCl2 | 104.06 |
| OL 7 | Mil× | 500 | Feso4•7 H2O | 2.78 |
| Na2-EDTA | 3.73 | |||
| OL 8 | Mil× | 500 | K2SO4 | 87.1 |
| OL 9 | 4000× | 1000 | MnCl2•4 H2O | 7.24 |
| H3BO3 | 11.44 | |||
| ZnSO4•7 H2O | 0.88 | |||
| Cuso4•5 H2O | 0.32 | |||
| (NH4) 6 mo7O24•2 H2O | 0.36 |
Tabela 1: Solução de nutrientes Hoagland.
| Grau | Aparecimento de fenótipo |
| Grau 0 | Sem sintomas em toda a planta |
| Grau 1 | Lesões de tronco < 1/3 da cintura-tronco ou <1/3 das folhas murchando |
| Grau 3 | Lesões de tronco entre 1/3 e 1/2 de cintura-tronco ou entre 1/3 e 1/2 de folhas ligeiramente murchas |
| Grau 5 | Lesões de tronco > 1/2 da cintura do caule, mas não completamente ao redor da cintura, ou entre 1/2 e 2/3 de folhas murchando |
| Grau 7 | Lesões de tronco em torno de toda a cintura da haste ou >2/3 de folhas murchando |
| Grau 9 | Plantas parecem mortas |
Tabela 2: Classificação de gravidade da doença da haste negra. Com base no padrão nacional chinês para o "Método de Grau e Investigação de Doenças do Tabaco e Pragas de Insetos" (GB/T 23222-2008), a gravidade da doença vegetal individual foi pontuada em uma escala de 0 a 9.
| Índice de doenças | Avaliação da resistência |
| 0 | Altamente resistente ou imune (I) |
| 0.1 a 20 | Resistente (R) |
| 20.1 a 40 | Resistente moderadamente (RM) |
| 40.1 a 60 | Moderadamente suscetível (EM) |
| 60,1 a 80 | Suscetível (S) |
| 80,1 a 100 | Altamente suscetível (HS) |
Tabela 3: Avaliação da resistência segundo o índice da doença. A gravidade da doença foi dividida em 6 graus de acordo com o índice da doença. 0 significa altamente resistente ou imune (I), 0,1 a 20 significa resistente (R), 20,1 a 40 significa moderadamente resistente (RM), 40,1 a 60 significa moderadamente suscetível (EM), 60,1 a 80 significa suscetível (S), 80,1 a 100 significa altamente suscetível (S).
| Cultivar | Repetir | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 | Índice de doenças | Significar | Avaliação da resistência | |
| BH | 1 | 0 | 1 | 0 | 0 | 1 | 0 | 1 | 0 | 4.17 | 6.48 | ||
| 2 | 1 | 0 | 0 | 0 | 3 | 1 | 0 | 1 | 8.33 | R | |||
| 3 | 1 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 3 | 1 | 6.94 | ||||
| XHJ | 1 | 7 | 5 | 7 | 7 | 9 | 7 | 7 | 7 | 77.78 | 76.85 | ||
| 2 | 9 | 7 | 9 | 7 | 5 | 9 | 7 | 5 | 80.56 | S | |||
| 3 | 7 | 5 | 7 | 9 | 5 | 9 | 5 | 5 | 72.22 | ||||
Tabela 4: Índice de doenças e resistência em BH e XHJ. O índice médio da doença de BH foi de 6,48, o que mostra resistência (R) de acordo com a norma, e o índice médio de doença de XHJ foi de 76,85, o que mostra suscetibilidade (S) de acordo com a norma.
| Genótipo | Suspensão do zoospore | Método de grãos de aveia | ||||||
| Experimento 1 | Experimento 2 | Significar | Classificação | Experimento 1 | Experimento 2 | Significar | Classificação | |
| BH | 4.17 | 8.33 | 6.94 | R | 0 | 0 | 0 | Eu |
| XHJ | 77.78 | 80.56 | 72.22 | S | 84.89 | 90 | 87.45 | HS |
| K326 | 12.5 | 12.5 | 12.5 | R | 5.39 | 15.67 | 10.53 | R |
| Yunyan87 | 19.45 | 8.33 | 13.89 | R | 4.7 | 28.89 | 16.8 | R |
| C42-4 | 21.28 | 21.89 | 21.59 | SR | 7.56 | 13.11 | 10.33 | R |
| C13-4 | 18.16 | 14.81 | 16.49 | R | 38.89 | 19.66 | 29.27 | SR |
| C9-5 | 77.41 | 77.78 | 77.6 | S | 79.83 | 82.86 | 81.34 | HS |
| C46-8 | 55.56 | 51.11 | 53.34 | MS | 62.91 | 72.65 | 67.78 | S |
| C66-9 | 79.88 | 74.07 | 76.98 | S | 93.94 | 72.22 | 83.08 | HS |
Tabela 5: Resposta da infecção por P. nicotianae em diferentes genótipos com o método de inoculação de suspensão do zoospore e o método de inoculação de grãos de aveia. O método de inoculação da suspensão do zoospore foi realizado em pequenas mudas, e o método de inoculação de grãos de aveia foi realizado em plantas adultas. Esses dados ilustram a correlação entre o método de inoculação da suspensão do zoospore e o método de inoculação de grãos de aveia. K326 e Yunyan87 têm níveis intermediários de resistência, e C42-4, C13-4, C9-5, C46-8, C66-9 são progens da população BC4F2 de um cruzamento entre BH e XHJ. As plantas foram classificadas como imunes, resistentes, moderadamente resistentes, moderadamente suscetíveis, suscetíveis ou altamente suscetíveis.
Figura 1: Sintoma de cada série. (A) Grau 0, inteiro sintoma vegetal livre. (B) Grau 1, lesão do caule <1/3 da cintura da haste ou <1/3 deixa murcha. (C) Grau 3, lesões de haste entre 1/3 e 1/2 da cintura de haste ou entre 1/3 e 1/2 de folhas ligeiramente murchas. (D) Grau 5, lesões de haste >1/2 da cintura da haste, mas não completamente ao redor da cintura, ou entre 1/2 e 2/3 de folhas murchando. (E) Grau 7, lesões de haste em torno de toda a cintura da haste ou >2/3 de folhas murchando. (F) Grau 9, plantas parecem mortas. Setas vermelhas indicam as lesões da haste. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Variação observada em dois genótipos do tabaco. (A) Sintoma vegetal inteiro livre em variedade resistente BH 3 dias após a inoculação. (B) As lesões do caule estão em torno de 1/2 da cintura do caule e 1/2 de folhas ligeiramente murchando em XHJ 3 dias após a inoculação. (C) Sintoma vegetal inteiro livre em variedade resistente BH 4 dias após a inoculação. (D) Lesões de tronco >1/2 da cintura do caule, mas não completamente ao redor da cintura, e entre 1/2 e 2/3 de folhas murchando em variedade suscetível XHJ 4 dias após a inoculação. Setas vermelhas indicam as lesões da haste. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Quantificação relativa da biomassa P. nicotianae em BH infectada e XHJ às 24h, 72 h e 168 h pós-inoculação. Isso é calculado como a razão de amplificação genética P. nicotianae WS21 em comparação com o gene de tabaco 26S rRNA. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
Múltiplas fontes de resistência têm sido usadas para melhorar a resistência à P. nicotianae no tabaco cultivado. Os genes R dominantes únicos, Php e Phl, foram introgressados de Nicotiana plumbaginifolia e Nicotiana longiflora, respectivamente10. A variedade de tabaco de charuto Beinhart 1000 tem o maior nível de resistência quantitativa relatado a P. nicotianae13. Experimentos de mapeamento de intervalo múltiplos sugerem que pelo menos seis loci de traço quantitativo (QTLs) podem contribuir para a resistência nesta linha13,22. Além das fontes resistentes mencionadas acima, outro gene alienígena, Wz, também foi encontrado para conferir um alto nível de resistência à raça 0 e à raça 123,24. Considerando as múltiplas fontes resistentes e o complicado histórico genético de variedades resistentes, é necessário um método preciso e confiável para avaliação de resistência para 1) a identificação de genótipos de tabaco resistentes à P. nicotianae, 2) variedades resistentes à reprodução e 3) estudos de mecanismos moleculares de interações vegetais-patógenos. Os métodos anteriores utilizados para avaliar as gravidades da infecção por P. nicotianae foram demorados ou as intensidades de inoculação foram difíceis de controlar. Por isso, é urgente estabelecer um novo método para a avaliação da resistência p. nicotianae.
Imitar processos de infecção natural é o ponto chave em nosso novo método. Em primeiro lugar, durante o ciclo típico de vida de P. nicotianae, os zoospores são os principais agentes infecciosos que iniciam doenças vegetais. Uma vez que os zoospores atingem a superfície da planta, eles se tornam cistos imóveis, posteriormente germinam, e formam tubos de germes. Em seguida, a appressoria é produzida na ponta dos tubos de germe25. Em nosso protocolo, a suspensão do zoospore foi usada como inóculo, que imita a situação de infecção natural. Em segundo lugar, nas folhas de Nicotiana benthamiana, os cistos germinaram e colonizaram células epidérmicas às 3h26. Nas raízes arabidopsis, todos os zoosporos enciclodidos penetraram com sucesso as raízes às 6h pós-inoculação27. Em nossa abordagem, o processo de inoculação envolveu a imersão de raízes em uma suspensão p. nicotianae zoospore por 3h no escuro, que imita o ambiente natural e promove a colonização do patógeno, levando, portanto, a uma infecção estável e eficaz.
A abordagem mais utilizada para avaliar a resistência de P. nicotianae no tabaco, o método de grãos de aveia, é eficiente e fácil para inocular um grande número de plantas7,11,12,13,14,15,16. No entanto, tem algumas desvantagens. A principal desvantagem é a intensidade inoculada descontrolada, que limita sua aplicação na reprodução de precisão. Em comparação com o método de grãos de aveia e as outras duas abordagens existentes, nesta nova abordagem, a suspensão do zoosporo é usada como inóculo, de modo que a intensidade inoculada é controlável e ajustável. Como as plantas são cultivadas em um ambiente hidropônico, a interferência do solo é eliminada, o que aumenta a precisão da avaliação. No entanto, existe uma limitação para este método, que é que ele não pode ser usado em plantas adultas. O método de grãos de aveia, por outro lado, é aplicável para a triagem de resistência em larga escala de plantas adultas7,13. Portanto, esse método e o método de grãos de aveia podem se complementar para diferentes períodos de crescimento da planta de tabaco e em diferentes situações.
O protocolo descrito aqui é um método eficiente e confiável para avaliar a resistência do tabaco à infecção por P. nicotianae na fase de mudas. Este protocolo pode ser usado para reprodução e para pesquisa de mecanismos moleculares.
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Disclosures
Os autores não têm nada a revelar.
Acknowledgments
Esta pesquisa foi financiada pela Fundação Nacional de Ciência Natural da China (31571738) e pelo Programa de Inovação em Ciência e Tecnologia Agrícola da China (ASTIP-TRIC01).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| (NH4)2SO4 | Sinopharm | 10002917 | Analytical Reagent |
| (NH4)6 Mo7O24•2 H2O | Sinopharm | XW131067681 | Analytical Reagent |
| 1.5 ml Safe-lock Microcentrifuge Tubes | Eppendorf | 30120086 | Used for Sample Extarction |
| 2 ml Safe-lock Microcentrifuge Tubes | Eppendorf | 30120094 | Used for Sample Extarction |
| Agar | MDBio, Inc | 9002-18-0 | Materials of Culture Medium |
| Analytical Balance | AOHAOSI | AX2202ZH | Equipment |
| Autoclave | Yamatuo | SQ510C | Equipment |
| Autoclave | YAMATUO | SQ510C | Equipment |
| Beaker | Bio Best | DHSB-2L | Materials of Culture Medium |
| Biological Incubator | JINGHONG | SHP-250 | Equipment |
| Ca(NO3)2•4 H2O | Sinopharm | 80029062 | Analytical Reagent |
| CaCl2 | Sinopharm | 10005817 | Analytical Reagent |
| CuSO4•5 H2O | Sinopharm | 10008218 | Analytical Reagent |
| Electromagnetic Oven | Bio Best | DHDCL | Equipment |
| FeSO4•7 H2O | Sinopharm | 10002918 | Analytical Reagent |
| Filter Paper | Bio Best | DHLZ-9CM | Material |
| Fluorescence Ration PCR Instrument | Roche | LightCycler96 | Equipment |
| Gauze | Bio Best | 17071202 | Materials of Culture Medium |
| H3BO3 | Phytotechnology | B210-500G | Analytical Reagent |
| Hemocytometer | Solarbio | 17072801 | Material for disease-resistant identification |
| K2SO4 | Sinopharm | 10017918 | Analytical Reagent |
| KNO3 | Sinopharm | 10017218 | Analytical Reagent |
| KT Foam Sheet | Bio Best | DHKTB | Material for Seedling |
| Low Constant Incubator | Jinghong | SHP-250 | Equipment |
| Measuring Cylinder | Bio Best | DHBLLT-1000ML | Materials of Culture Medium |
| MgSO4•7 H2O | Sinopharm | 10013080 | Analytical Reagent |
| Microscope | ECHO | RVL-100-G | Equipment |
| MnCl2•4 H2O | Sinopharm | G5468154 | Analytical Reagent |
| Na2-EDTA | Sinopharm | G21410-250 | Analytical Reagent |
| NaH2PO4•2 H2O | Sinopharm | 20040717 | Analytical Reagent |
| NH4NO3 | Sinopharm | B64586-100g | Analytical Reagent |
| Oatmeal | Bio Best | DHYMP-1.5KG | Materials of Culture Medium |
| Petri Dish | Bio Best | DHPYM-9CM | Material for disease-resistant identification |
| Pipettor | THERMO | S1 | Equipment |
| Potting | Bio Best | DHYCXHP-12CM | Material for Seedling |
| Potting Soil | Bio Best | DHYMJZ-50L | Seedling Material |
| Punch | Bio Best | DHDKW | Material |
| qRT-PCR Plate | Monad | MQ50401S | qRT-PCR Plate |
| SYBR Green Premix Pro Taq HS qPCR Kit | Accurate Biology | AG11718 | PCR Reagent |
| Toothpick | Bio Best | DHYQ-900 | Material |
| Total RNA Kit II | Omega | R6934-01 | PCR Reagent |
| TransScript® II One-Step gDNA Removal and cDNA Synthesis SuperMix | Transgen | AH311-02 | PCR Reagent |
| Trays | Bio Best | DHYMTP-90G | Material for Seedling |
| Vermiculite | Bio Best | DHZS | Seedling Material |
| Water Purification System | HEAL FORCE | HSE68-2 | Equipment |
| ZnSO4•7 H2O | Sinopharm | 10024018 | Analytical Reagent |
References
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