Summary
Tidlig udvikling er afhængig af moderens arvede produkter, og mange af disse produkters rolle er i øjeblikket ukendt. Heri beskrev vi en protokol, der bruger CRISPR-Cas9 til at identificere fænotyper med modereffekt i en enkelt generation.
Abstract
Tidlig udvikling afhænger af en pulje af moderlige faktorer inkorporeret i den modne oocyt under oogenese, der udfører alle cellulære funktioner, der er nødvendige for udvikling indtil zygotisk genomaktivering. Typisk kræver genetisk målretning af disse moderfaktorer en yderligere generation for at identificere fænotyper med modereffekt, hvilket hindrer evnen til at bestemme moderens udtrykte geners rolle under udviklingen. Opdagelsen af CRISPR-Cas9's bialleliske redigeringsmuligheder har muliggjort screening af embryonale fænotyper i somatisk væv af injicerede embryoner eller "crispants", hvilket øger forståelsen af den rolle, zygotisk udtrykte gener spiller i udviklingsprogrammer. Denne artikel beskriver en protokol, der er en udvidelse af crispant-metoden. I denne metode giver den bialleliske redigering af kimceller mulighed for isolering af en modereffektfænotype i en enkelt generation eller "moderlige sprøde stoffer". Multiplexing guider RNA'er til et enkelt mål fremmer den effektive produktion af maternel crispants, mens sekvensanalyse af maternel crispant haploider giver en enkel metode til at bekræfte genetiske læsioner, der producerer en moderlig effekt fænotype. Brugen af moderens crispants understøtter hurtig identifikation af essentielle moderlige udtrykte gener, hvilket letter forståelsen af tidlig udvikling.
Introduction
En pulje af moderligt deponerede produkter (f.eks. RNA'er, proteiner og andre biomolekyler) er nødvendig for alle tidlige cellulære processer, indtil embryonets zygotiske genom aktiveres1. Den for tidlige udtømning af disse produkter fra oocyten er typisk embryonal dødelig. På trods af betydningen af disse gener i udvikling er rollen for mange moderligt udtrykte gener i øjeblikket ukendt. Fremskridt inden for genredigeringsteknologi i zebrafisk, såsom CRISPR-Cas9, muliggør målretning af moderligt udtrykte gener 2,3,4. Identifikationen af en modereffektfænotype kræver imidlertid en ekstra generation sammenlignet med en zygotisk fænotype, hvilket kræver flere ressourcer. For nylig er CRISPR-Cas9's bialleliske redigeringsevne blevet brugt til at screene for embryonale fænotyper i somatisk væv af injicerede (F0) embryoner, kendt som "crispants"5,6,7,8,9,10. Crispant-teknikken muliggør ressourceeffektiv screening af kandidatgener i somatiske celler, hvilket letter forståelsen af specifikke aspekter i udviklingen. Protokollen beskrevet i dette papir gør det muligt at identificere fænotyper med modereffekt eller "moderlige sprøde stoffer" i en enkelt generation11. Denne ordning kan opnås ved at multiplexere guide-RNA'er til et enkelt gen og fremme bialleliske redigeringshændelser i kimlinjen. Disse moderlige sprøde embryoner kan identificeres ved grove morfologiske fænotyper og gennemgår primær karakterisering, såsom mærkning for cellegrænser og DNA-mønster11. Kombineret analyse af den observerbare fænotype og grundlæggende molekylære karakterisering af de inducerede INDEL'er gør det muligt at forudsige det målrettede gens rolle i tidlig udvikling.
I zebrafisk udvikler en lille gruppe celler sig i løbet af de første 24 timer efter befrugtning (hpf) til de oprindelige kimceller, en forløber for kimlinjen12,13,14,15. I koblinger lagt af F0-hunner afhænger andelen af moderlige crispantembryoner, der genvindes, af, hvor mange kimceller der indeholder en biallelisk redigeringshændelse i det målrettede gen. Generelt, jo tidligere redigeringshændelsen forekommer i embryoet, jo større er sandsynligheden for, at CRISPR-Cas9-mutationer observeres i kimlinjen. I de fleste tilfælde kommer fænotyperne af maternel crispantembryoner fra tab af funktion i de to maternel alleler, der er til stede i den udviklende oocyt. Når oocyten er færdig med meiose, ekstruderes en af moderens alleler fra embryoet via polarlegemet, mens den anden allel bliver inkorporeret i moderens pronukleus. Sekventering af flere maternel crispant haploider vil repræsentere en blanding af mutationerne (indsættelser og / eller deletioner (INDELs)) til stede i kimlinjen, der bidrager til fænotype11.
Følgende protokol beskriver de nødvendige trin til at skabe CRISPR-Cas9-mutationer i modereffektgener og identificere den tilsvarende fænotype ved hjælp af en maternel crispant-tilgang (figur 1). Afsnit et vil forklare, hvordan man effektivt designer og opretter guide-RNA'er, mens afsnit to og tre indeholder kritiske trin til oprettelse af moderlige sprøde stoffer ved mikroinjektion. Efter injektion af CRISPR-Cas9-blandingen screenes injicerede embryoner for somatiske redigeringer via PCR (afsnit fire). Når de injicerede F0-embryoner udvikler sig og når seksuel modenhed, krydses F0-hunnerne til vildtypehanner, og deres afkom screenes for fænotyper med modereffekt (afsnit fem). Afsnit seks indeholder instruktioner om fremstilling af moderlige sprøde haploider, der kan kombineres med Sanger-sekventering for at identificere CRISPR-Cas9-inducerede INDEL'er. Derudover indeholder diskussionen ændringer, der kan foretages i protokollen for at øge følsomheden og kraften i denne metode.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
I undersøgelser, der førte til udviklingen af denne protokol, blev alle zebrafiskhuse og eksperimenter godkendt af University of Wisconsin-Madison Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC-M005268-R2).
1. Syntese af guide RNA'er
BEMÆRK: Zygotiske crispants er blevet oprettet ved hjælp af et enkelt guide RNA eller multiplexing flere guide RNA'er til et enkelt mål 5,6,7,8,9,10. Multiplexingen af guide-RNA'er øger procentdelen af embryoner, der viser en zygotisk crispant fænotype10. På grund af denne øgede frekvens af embryoner, der udviser en fænotype, skabes moderens crispants ved multiplexing fire guide RNA'er til et enkelt gen. En mere detaljeret protokol om brug af CHOPCHOP til at designe guide-RNA'er og en udglødningsmetode til at syntetisere guide-RNA'er til zebrafisk kan findes andre steder 16,17,18,19,20.
- For at identificere et moderligt udtrykt gen, der skal målrettes, skal du fastslå mRNA-transkriptionsniveauerne under udviklingen via en RNA-sekvensdatabase, der giver transkriptominformation fra zygote til 5 dage21. Generelt udtrykkes moderspecifikke gener stærkt i det tidlige embryo og nedbrydes, efter at det zygotiske genom er aktiveret22.
- Når et moderligt udtrykt målgen er blevet identificeret, skal du bestemme det første forudsagte proteindomæne ved hjælp af afsnittet "domæner og funktioner", der er tilgængeligt i Ensembl-genombrowseren23. Brug dette domæne som målområde for de fire guide-RNA'er.
- Brug guide RNA-udvælgelsesprogrammet CHOPCHOP til at identificere fire guide RNA-målsteder i det første aktive domæne. Design genspecifikke oligonukleotider, som vist nedenfor for hvert målsted. I det genspecifikke oligonukleotid svarer N20-sektionen til målsekvensen minus PAM-stedet (NGG) fra CHOPCHOP. Bestil disse genspecifikke oligonukleotider og det konstante oligonukleotid ved hjælp af standard desaltrensning (se Materialetabel).
Genspecifikt oligonukleotid:
5' TAATACGACTCACTATA- N20 -GTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAG 3' - For at oprette en vejledende RNA-skabelon for hvert genspecifikt oligonukleotid skal det udglødes til det konstante oligonukleotid og udfyldes udhængene med T4-DNA-polymerase som tidligere beskrevet16. Når de fire guide RNA-skabeloner er samlet, skal du rense og koncentrere dem sammen ved hjælp af et DNA-oprydnings- og koncentratorsæt i henhold til producentens anvisninger (se Materialetabel).
- Syntetiser sgRNA-blandingen fra den samlede guide RNA-skabelon ved hjælp af et in vitro T7-transkriptionssæt (se Materialetabel). Udfør in vitro-transkriptionen i henhold til producentens anvisninger. Brug af halvreaktioner af T7-transkriptionssættet kan reducere omkostningerne pr. Reaktion.
- Efter RNA-syntese renses den resulterende pool af sgRNA'er ved hjælp af en ethanol / ammoniumacetatprotokol som tidligere beskrevet 16,20,24. Efter at RNA'et er blevet isoleret, resuspenderes det i 20 μL nukleasefrit vand. Hvis halvreaktioner af T7-transkriptionssættet blev brugt til at transskribere puljen af sgRNA'er, skal det rensede RNA resuspenderes til 10-15 μL nukleasefrit vand.
- Kvantificer mængden af samlede sgRNA'er, der blev oprettet ved hjælp af et spektrofotometer. Fortynd puljen af sgRNA'er i nukleasefrit vand til en fortynding på 1500 ng/μL ± 500 ng/μL. Typisk varierer det endelige volumen af arbejdsfortyndingen fra 30-50 μL.
- Efter bestemmelse af koncentrationen af puljen af sgRNA'er verificeres integriteten af sgRNA'erne på en 1% agarosegel.
- Der støbes en 1% agarose/0,5 μg/ml ethidiumbromid/TBE gel. Når gelen er størknet, skal du placere den i TBE-kørende buffer.
- Bland 1 μL af sgRNA-blandingen og 1 μL RNA-gelbelastningsbuffer (se Materialetabel). Læg denne prøve i gelen og kør gelen ved 100 V i 5 min.
- Visualiser båndene ved hjælp af ultraviolet (UV) lys. Puljen af sgRNA'er skal vises som et enkelt bånd. Hvis der observeres en udtværing, har RNA-nedbrydning sandsynligvis fundet sted.
- Opbevar puljen af sgRNA'er i engangsbrug 1 μL aliquoter i nukleasefrie PCR-strimmelrør i -80 ° C fryseren. For store mængder sgRNA-blanding (30 μL eller mere) aliquot blandes halvdelen af volumenet i de nukleasefrie PCR-strimmelrør, og den anden halvdel opbevares som et større volumen i et nukleasefrit mikrocentrifugerør. Tø op og aliquot, når det er nødvendigt.
- For at forhindre RNA-nedbrydning skal du sikre dig, at prøverne i mikrocentrifugerøret ikke gennemgår mere end to fryse-optøningscyklusser.
2. Forberedelse af reagenser og materialer til mikroinjektion
BEMÆRK: I zebrafisk kan injektionen af Cas9 mRNA skabe zygotiske sprøde stoffer. Undersøgelser har imidlertid vist, at Cas9-protein er mere effektivt til at skabe INDEL'er i injicerede embryoner16,25. Denne protokol bruger Cas9-protein til at generere moderens sprøde midler, fordi dette protein ikke oplever den samme forsinkelse i aktivitet som injiceret Cas9 mRNA. I teorien skulle dette øge sandsynligheden for, at en biallelisk mutation tidligt i udviklingen resulterer i en øget chance for, at en mere omfattende del af kimlinjen påvirkes. Andre protokoller og ressourcer, der beskriver, hvordan man forbereder sig på mikroinjektioner, findes andre steder24,26.
- Køb eller generer Cas9-protein (se Materialetabel). Cas9-proteinet genudsættes i nukleasefrit vand for at fremstille en 2 mg/ml opløsning og aliquot 1 μL i RNase-fri polypropylenmikrocentrifugerør. Disse opbevares som engangsrør ved -80 °C.
- Eftermiddagen før injektionen skal du bruge en mikropipettetrækker til at trække en glaskapillær og skabe en injektionsnål. Opbevar den ubrudte nål i en lukket nåleholder indtil morgenen med mikroinjektioner.
- For at skabe en injektionsplade hældes 20 ml 1,5% agarose/steril H2O for at fylde halvdelen af en 100 mm X 15 mm petriskål og vente på, at den størkner. Når agaroseopløsningen er indstillet, tilsættes 20 ml 1,5% agarose/steril H2 O til petriskålen og plastformen (se Materialetabel) i den flydende agarose og lader den hærde.
- Når agarosen er hærdet, skal du fjerne plastformen og opbevare sprøjtepladen på hovedet i køleskab indtil injektionsmorgenen. En enkelt plade kan bruges til flere injektioner, så længe brøndene bevarer deres integritet.
3. Mikroinjektion af CRISPR-Cas9-cocktail i et encellet zebrafiskembryo for at generere moderens sprøde stoffer
BEMÆRK: Flere ressourcer til mikroinjektion i zebrafiskembryoner kan findes andre steder24,26,27. Injektion af CRISPR-Cas9-blandingen i den udviklende blastodisc af encellede embryoner kan øge sandsynligheden for at skabe moderlige crispants. Blandingen kan også injiceres i æggeblommesækken op til 2-cellestadiet. Blandinger, der injiceres i æggeblommen, afhænger imidlertid af ooplasmisk streaming for at nå blastodiscen, så CRISPR-Cas9 injiceret i æggeblommen kan reducere skæreeffektiviteten af CRISPR-Cas928.
- Eftermiddagen før mikroinjektioner skal du sætte vildkryds op i zebrafiskens parringskasser. Opbevar både han- og hunfisken i samme tank, men adskil dem med en parringsboksdeler, eller placer hunnen inde i en æglægningsindsats.
- Om morgenen for eksperimentet tages en 2 mg / ml aliquot Cas9-protein og en aliquot af puljen af sgRNA'er. I det RNase-frie polypropylenmikrocentrifugerør, der indeholder Cas9-proteinet, samles en 5 μL injektionsblanding, der inkluderer puljen af sgRNA'er, 1 μL 0,5% phenolrød opløsning og nukleasefrit vand. Målet er en endelig koncentration på 400 ng/μL Cas9-protein og 200 ng/μL af de samlede sgRNA'er i RNase-frit vand eller et 2:1-forhold mellem Cas9-protein og sgRNA'er i det injicerede embryo. Denne injektionsblanding kan opbevares på is om morgenen for injektionen.
- Fjern en injektionsplade fra køleskabet, og lad den varme op til stuetemperatur (RT) i mindst 20 minutter.
- Når injektionscocktailen er samlet, skal hannen og hunnen have lov til at parre sig, f.eks. ved at fjerne parringsboksdeleren eller ved at placere hannen i samme æglægningsindsats som hunnen, alt efter hvad der er relevant.
- Efter at fisken har lagt, men før embryonerne er opsamlet, skal du skære spidsen af en ubrudt nål ved hjælp af et nyt barberblad eller fine tang for at skabe en nål, der har en boring, der er lille nok til at undgå embryoskader, men er bred nok, så den ikke bliver tilstoppet med injektionsblanding. Når nålen er skåret, fyldes nålen med injektionsblandingen ved hjælp af en mikroloaderpipettespids indsat i bagenden af kapillæren (se Materialetabeller).
- Når nålen er fyldt, inkuberes nålen i 5 minutter ved RT for at samle Cas9-sgRNA-komplekser.
- Tænd mikroinjektoren, og indsæt nålen i mikromanipulatoren. Placer en dråbe mineralolie på et mikrometerglas, og kalibrer nålen ved at justere injektionstrykket, indtil nålen skubber en 1 nL bolus ud i mineralolien.
BEMÆRK: Ved indsprøjtning i mineralolien vil en 1 nL bolus have en diameter på ca. 0,125 mm (eller radius på 0,062 mm) målt med mikrometerglasset. - For at synkronisere embryonerne skal du samle dem efter 10 minutter ved hjælp af en plastsi og skylle dem i en petriskål ved hjælp af 1x E3-medier (5 mM NaCl, 0,17 mM KCl, 0,33 mM CaCl2, 0,33 mM MgSO4, og tilsæt 20 μL 0,03 M methylenblåt pr. 1 L 1x E3). Fjern 10-15 embryoner og læg dem i en separat petriskål, der skal opbevares som ikke-injiceret kontrol.
- Overfør resten af de udviklende embryoner i injektionspladens brønde.
- Der injiceres 1 nL opløsning (i alt 400 pg Cas9-protein og 200 pg sgRNA'er) i den udviklende blastodik af et encellet embryon. Hvis spidsen af nålen bliver tilstoppet, skal du bruge tang til at bryde spidsen tilbage og kalibrere nålen igen for at skubbe en 1 nL bolus ud. Sørg for at injicere alle embryoner i løbet af de første 40 minutters udvikling efter befrugtning.
- Når injektionen er afsluttet, skal du returnere de injicerede embryoner i en mærket petriskål, der indeholder 1x E3-medier, og lade dem udvikle sig hele dagen. Fjern eventuelle embryoner, der ikke er befrugtede eller ikke udvikler sig normalt i henhold til zebrafiskens iscenesættelsesserie29.
4. Screening for somatiske INDEL'er i F0-injicerede embryoner
BEMÆRK: Andre metoder til identifikation af INDEL'er, såsom T7 endonuklease I-assay eller smelteanalyse med høj opløsning, kan anvendes til bestemmelse af, om embryonerne indeholder somatiske INDEL'er 30.
- Den næste dag efter injektioner skal du fjerne defekte og lyserede embryoner fra petriskålen og udskifte 1x E3-mediet for at opretholde embryons sundhed.
- Efter rengøring af skålen skal du samle seks sunde injicerede embryoner og to kontrolembryoner fra den ikke-injicerede plade. Anbring hvert embryo individuelt i en enkelt brønd i et PCR-strimmelrør og mærk toppen af rørene.
- For at ekstrahere det genomiske DNA fra individuelle embryoner skal du fjerne det overskydende E3-medie fra strimmelrørets brønde og tilføje 100 μL 50 mM NaOH pr. Brønd.
- Embryonerne udruges ved 95 °C i 20 min. Derefter afkøles prøverne til 4 °C, der tilsættes 10 μL 1 M Tris HCL (pH 7,5), og der hvirvles dem i 5 til 10 s. Dette ekstraherede DNA kan opbevares ved -20 °C i mindst 6 måneder uden væsentlig DNA-nedbrydning.
- Design unikke screeningsprimere til hvert guidested for at forstærke et 100-110 bp DNA-fragment, der inkluderer CRISPR-Cas9-målstedet. Hvis det er muligt, skal du placere målstedet midt i det forstærkede fragment, hvilket giver mulighed for identifikation af større sletninger.
- For hvert af de fire vejledende målsteder opstilles otte 25 μL PCR-reaktioner ved hjælp af 5 μL af det forberedte enkeltembryo-genomiske DNA, PCR-blanding og de guidespecifikke screeningsprimere til identifikation af somatiske mutationer på målstedet (tabel 1).
- Kast en 2,5% agarose/0,5 μg/ml ethidiumbromid/TBE-gel ved hjælp af kamme, der skaber ca. 0,625 cm brede brønde. Denne brede kam giver mulighed for bedre opløsning, når der detekteres størrelsesændringer i den genomiske sekvens. Når gelen er størknet, placeres den i et elektroforesekammer, der indeholder TBE-løbende buffer.
- Tilsæt 5 μL 6x indlæsningsfarve til PCR-produktet og læg 25 μL af denne blanding i gelen. Sørg for, at injektions- og kontrolprøverne køres på samme gelrække. Når alle prøverne er indlæst, tilsættes 5 μL ethidiumbromid pr. 1 liter TBE-løbende buffer til den positive ende af gelkassen.
- Kør gelen ved 120 V, indtil DNA-båndene løsner sig, eller DNA'et har nærmet sig enden af banen. Hvis Cas9 oprettede INDEL'er på målstedet, observeres der typisk en udtværing i injicerede prøver, men ikke kontrollerne.
- Hvis der observeres udtværinger i mindst tre ud af de fire guidesteder i embryoner injiceret med fire guide-RNA'er, vokser de søskendeinjicerede embryoner op.
- Når de injicerede prøver ikke indeholder udtværinger i det krævede antal guidesteder, skal du designe nye guide-RNA'er til at erstatte dem, der ikke fungerede, og oprette en ny pulje af guide-RNA'er, der inkluderer dem, der fungerede, og de nydesignede. Injicer og test den nye pulje til somatiske INDEL'er som beskrevet ovenfor.
5. Identifikation af fænotyper med modervirkning i moderens sprøde embryoner
BEMÆRK: Når de injicerede F0-hunner har nået seksuel modenhed, har deres kimlinjeceller potentialet til at generere en blanding af moderens sprøde og vildtypeembryoner. Selvom denne blanding giver mulighed for intern kontrol til befrugtning og udviklingstiming, er det stadig en fordel at oprette en vildtype incross som en ekstern kontrol, hvis en kobling fra F0-hunnen kun indeholder moderlige sprøde embryoner.
- Eftermiddagen før eksperimentet satte F0 injicerede hunner op mod vildtypehanner og kontrollerede vildtypekrydsninger i standard zebrafiskparringsbokse. Placer både han- og hunfisken i samme tank, men adskil dem med en parringsboksdeler, eller placer hunnen inde i en æglægningsindsats.
- Om morgenen for eksperimentet skal du lade hannen og hunnen begynde parringen, f.eks. ved at fjerne parringsboksdeleren eller placere hannen i samme æglægningsindsats som hunnen.
- Saml embryonerne hvert 10. minut ved at flytte æglægningsindsatsen til en ny parringstankbund, der indeholder frisk systemvand, og mærk tanken med et mærke, der identificerer den enkelte F0-hun. Tag den gamle parringstank og hæld vandet gennem en te-sil for at samle embryonerne fra en individuel 10-minutters kobling.
- Når embryonerne fra en enkelt 10-minutters kobling er blevet opsamlet i silen, overføres de til en petriskål indeholdende 1x E3-medier. Mærk petriskålen med indsamlingstidspunktet og fiskeoplysningerne.
- Under et dissekerende mikroskop med en transmitteret lyskilde observeres embryonerne under udvikling hver time i de første 6-8 timer og dagligt i de næste 5 dage.
- Identificer potentielle moderlige crispantembryoner ved grove morfologiske ændringer i deres udvikling sammenlignet med tidsmatchede vildtypekontroller29.
- Flyt de potentielle moderlige sprøde embryoner til en petriskål, der indeholder 1x E3-medier og assay for morfologisk fænotype ved 24 hpf og levedygtighed (f.eks. Svømmeblæreinflation) 5 dage efter befrugtning.
6. Sekventering af alleler i moderens sprøde haploider
BEMÆRK: Maternelle sprøde haploider indeholder en enkelt allel i det målrettede locus, hvilket gør det muligt at identificere INDEL'er i målgenet via Sanger-sekventering. Maternelle sprøde haploidembryoner kan også analyseres ved hjælp af næste generations sekventeringsassays. Embryoner, der viser en moderlig crispantfænotype, forventes at bære en læsion på mindst et af de fire målsteder (se diskussion).
- Eftermiddagen før eksperimentet oprettede parringspar af F0-hunner, der vides at producere moderlige sprøde embryoner, krydset til vildtypehanner. Hold vildtypehannerne fysisk adskilt fra hunnerne ved hjælp af en parringsboksdeler, eller placer hunnen i æglægningsindsatsen.
- Om morgenen for eksperimentet skal du fjerne den fysiske skillevæg eller placere både hanner og hunner i æglægningsindsatsen for at indlede parring. Ved det første tegn på æglægning afbrydes avlen ved at adskille han- og F0-hunnerne. Opbevar hver adskilt F0-hun i individuelle parringsbokse.
- Forbered UV-behandlet sædopløsning ved hjælp af testikler fra en vildtype mand for hver 100 μL af Hanks opløsning (tabel 2), tilstrækkelig til at befrugte ekstruderede æg fra en kvinde, som tidligere beskrevet31.
- Ekstruder manuelt modne æg fra de forudvalgte F0-hunner, og udfør in vitro-befrugtning (IVF) ved hjælp af den UV-behandlede sæd31.
- Efter in vitro-befrugtning skal de haploide embryoner udvikle sig, indtil moderens sprøde fænotype observeres, og placere disse embryoner i en anden petriskål.
- Når moderens sprøde haploide embryoner er blevet identificeret, skal de have mulighed for at udvikle sig i mindst 6 timer efter befrugtning.
- For at ekstrahere det genomiske DNA fra mindst ti maternel sprøde haploide embryoner skal du placere et enkelt haploidt embryo i en individuel brønd i et PCR-strimmelrør, fjerne overskydende E3-medier fra brønden og tilføje 50 μL 50 mM NaOH.
- Embryonerne udruges ved 95 °C i 20 min. Derefter afkøles prøverne ned til 4 °C, der tilsættes 5 μL 1 M Tris HCL (pH 7,5) og hvirvel i 5-10 s. Det ekstraherede DNA kan opbevares ved -20 °C i op til 6 måneder.
- For at identificere, hvilke guidesider der indeholder INDEL'er, skal du designe sekventeringsprimere for at forstærke et DNA-fragment, der inkluderer alle fire CRISPR-Cas9-målsteder. Disse sekventeringsprimere giver mulighed for identifikation af INDEL'er, der spænder over flere guidesider.
- Der opsættes to 25 μL PCR-reaktioner pr. embryo ved hjælp af 5 μL af det forberedte genomiske DNA og sekventeringsprimerne.
- Når PCR er færdig, renses og koncentreres de to prøver ved hjælp af et DNA-oprydnings- og koncentratorsæt (se Materialetabel). Indsend derefter DNA-fragmentet til Sanger-sekventering ved hjælp af både fremadgående og omvendt sekventeringsprimere.
- Når det haploide maternel sprøde fragment er blevet sekventeret, skal du justere det til wildtype-sekvensen og identificere INDEL'er på målstederne ved hjælp af et sekvensjusteringsprogram.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Den eksperimentelle tilgang, der er beskrevet i denne protokol, gør det muligt at identificere fænotyper med moderens virkning på en hurtig og ressourceeffektiv måde (figur 1).
Generering af moderlige sprøde anretninger:
Ved design af de fire guide-RNA'er til at målrette mod et enkelt kandidat-modereffektgen bør der tages særligt hensyn til, hvor guide-RNA'erne vil binde sig til DNA. Generelt bør de alle grupperes sammen med minimale eller ingen overlappende regioner mellem guide-RNA'er i starten af det første forudsagte proteindomæne (figur 2A). Målretning af guide-RNA'erne til dette domæne øger chancen for, at både in-frame og out-of-frame INDEL'er vil påvirke proteinets funktion. Andre variabler, der bør overvejes, når man designer guide-RNA'er, er at reducere effektiviteten og antallet af off-target-steder i genomet.
Efter injektion af CRISPR-Cas9-opløsningen kan den somatiske aktivitet af Cas9 bestemmes ved at køre et lille PCR-fragment, ca. 100 bp, på en agarosegel. Hvis der blev skabt INDEL'er i det injicerede embryon, skal der observeres en udtværing i de injicerede prøver, men ikke i den ikke-injicerede kontrol (figur 2B). Hvert guidested skal testes uafhængigt for Cas9-aktivitet i somatiske celler. Hvis der ses udtværinger på mindst tre guidesteder, skal søskendeinjicerede embryoner vokse op og screenes for moderens sprøde fænotyper.
Identifikation af moderens crispants:
For at afgøre, om moderens crispants er skabt i naturlige kryds, kan embryonerne fra en F0-hunfisk sammenlignes med tidsmatchede vildtypekontroller for at observere eventuelle ændringer i den tidlige udvikling. F0-koblinger skal også scores ved 24 hpf og 5 dage efter befrugtning for at undersøge udviklingen af henholdsvis den grundlæggende kropsplan og levedygtighed for at identificere moderfaktorer, der kan regulere senere stadier af embryonal udvikling. Identifikation af en fælles fænotype i koblinger fra forskellige F0-hunner letter skelnen mellem virkninger forårsaget af tab af funktion af et målgen fra off-target eller ikke-specifikke effekter.
Derudover er koblinger, der indeholder moderlige crispants, typisk mosaik (dvs. de inkluderer både fænotypiske vildtype- og moderlige sprøde embryoner), hvilket gør det muligt for vildtypeembryoner at fungere som en intern kontrol for variabler såsom befrugtningstiming og udviklingshastighed. I gennemsnit vil koblinger fra F0-hunner indeholde ca. 69% maternelle crispantembryoner, med koblinger indeholdende op til 100% maternel crispantembryoer observeret11.
Efter identifikation af moderens sprøde embryoner kan de bruges til primær molekylær karakterisering, dvs. immunmærkning for cellegrænser eller farvning af DNA med DAPI, som kan give indsigt i den cellulære karakter af den berørte udviklingsproces11. Moderens crispant-metode kan også bruges til at fænokopiere kendte modereffektmutationer, såsom modley, tmi og aura (figur 3)11.
Sekventering af moderens sprøde haploider:
For at identificere de genetiske læsioner, der bidrager til moderens sprøde fænotype, kombineres UV-behandlet sæd og IVF for at skabe moderens sprøde haploider (figur 4). UV-behandlet sæd giver en centriol, men bidrager ikke faderligt DNA, hvilket tillader cellulær opdeling at forekomme med kun moderens genomiske materiale. Oprettelsen af en haploid tillader Sanger-sekventering af moderens allel og identifikation af moderens sprøde INDEL'er (figur 4). I gennemsnit blev der observeret to alleler pr. kobling af moderens crispant haploid. De INDEL'er, der er identificeret via Sanger-sekventering, omfatter redigeringer både på enkeltguidesider og sletninger, der spænder over flere guidesider (figur 4C, tabel 3). En undersøgelse af moderens sprøde haploide INDEL'er fra forskellige F0-hunner viser, at de samme guidesteder er redigeret i flere embryoner, og de fleste af de genvundne mutationer er for tidlige stopkodoner (tabel 3)11.
Figur 1: Moderens sprøde arbejdsgang. For at skabe en moderlig crispant skal du begynde med at designe fire gRNA'er, der er målrettet mod genets første aktive domæne. 1) Syntetiser derefter de fire gRNA'er i en enkelt reaktion. 2) Efter syntetisering og rensning af gRNA'erne skal du oprette en CRISPR-Cas9-cocktail og injicere den i blastodiscen i et enkeltcellet embryo. 3) Screene derefter de injicerede embryoner for somatiske mutationer ved hjælp af PCR og gelelektroforese. Hvis INDEL'er blev oprettet i injicerede prøver, ville der forekomme en udtværing i de injicerede embryoner i modsætning til det stramme bånd af vildtypekontrollen. 4) Lad søskende til de injicerede embryoner vokse i 3-6 måneder for at nå seksuel modenhed. Når seksuel modenhed er nået, skal du krydse en F0-injiceret kvinde mod en vildtypehan. Det resulterende afkom kan være en blanding af vildtype og moderlige sprøde embryoner. Identificer en F0-injiceret kvinde, hvis embryoner viser fænotypen med modereffekt. 5) For at identificere de læsioner, der bidrager til fænotypen, udføres IVF ved hjælp af UV-behandlet sæd for at skabe moderens sprøde haploider til Sanger-sekventering. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 2: Generering af INDEL'er i målrettede gener. (A) Genstrukturdiagram, der viser hypotetiske proteindomæner (lyse og mørke lilla blokke), placering af gRNA'er (røde linjer) og PAM-steder (røde stjerner). GRNA'erne er målrettet mod det første aktive domæne. Exons vises som blokke, og introns vises som linjer. (B) Udstrygninger i en 2,5% agarosegel er tegn på INDEL'er i somatiske celler i injicerede embryoner. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 3: Maternelle crispants rekapitulerer fænotypen af kendte modereffektmutationer. Repræsentativ sammenligning af levende, tidsmatchet vildtype (venstre kolonne), kendte modermutanter (midterste kolonne) og moderlige sprøde embryoner (højre kolonne). (A) broget/birc5b, (B) tmi/prc1l, (C) aura/mid1ipIl-mutanter/moderlige crispants viser defekter i cytokinese i tidlige embryonale opdelinger, hvilket fører til fuldt synkronial blastula (A, B) eller delvist acellulære embryoner (C, hvid boks). Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 4: Brug af maternel crispant haploider til at sekvensere CRISPR-Cas9-inducerede mutationer . (A) En F0-injiceret hun krydset mod en vildtypehan resulterer i et diploid embryo med en fænotype med moderens effektfænotype. (B) IVF udføres ved hjælp af UV-behandlet sæd til at skabe maternel crispant haploider, hvilket giver mulighed for sekventering og analyse af inducerede INDEL'er i moderens allel. (C) Repræsentativ sekventering af birc5b maternal crispant haploid, der viser en stor sletning mellem guidested 3 og 4 (boks). Klik her for at se en større version af denne figur.
| PCR-blanding | ||
| Tilføje | ||
| steril H2O | 171,12 ml | |
| MgCl2 (1 M) | 0,393 ml | |
| Tris-HCl (1 M, pH 8,4) | 2.618 ml | |
| KCl (1 M) | 13.092 ml | |
| Autoklave i 20 min, og afkøl derefter opløsningen på is. Næste tilføj | ||
| BSA (100 mg/ml) | 3.468 ml | |
| dATP (100 mM) | 0,262 ml | |
| dCTP (100 mM) | 0,262 ml | |
| dGTP (100 mM) | 0,262 ml | |
| dTTP (100 mM) | 0,262 ml | |
| Aliquot i sterile mikrocentrifugerør | ||
| PCR-opskrift | pr. prøve | |
| PCR-blanding | 17,9 μL | |
| F + R Primer (10 μM) | 0,2 μL | |
| ROH2O | 1,8 μL | |
| Taq DNA-polymerase | 0,1 μL | |
| DNA | 5 μL | |
Tabel 1: PCR-blanding.
| Hanks løsning | |||
| Hanks forblanding | Kombiner følgende i rækkefølge: (1) 10,0 ml HS #1, (2) 1,0 ml HS#2, (3) 1,0 ml HS#4, (4) 86 ml ddH2O, (5) 1,0 ml HS#5. Opbevar alle HS-løsninger ved 4 °C | ||
| Hanks lagerløsning #1 | 8,0 g NaCl, 0,4 g KCl i 100 ml ddH2O | ||
| Hanks lagerløsning #2 | 0,358 g Na2HPO4 vandfri; 0,60 g K 2 H 2 PO4 i 100 ml ddH2O | ||
| Hanks lagerløsning #4 | 0,72 g CaCl 2 i 50 ml ddH2 O | ||
| Hanks lagerløsning #5 | 1,23 g MgSO4·7H 2 O i 50 ml ddH20 | ||
| Hanks lagerløsning #6 | 0,35 g NaHCO3 i 10,0 ml ddH20; Gør frisk på brugsdagen | ||
| Hanks sidste arbejdsløsning | Kombiner 9,9 ml Hank's Premix med 0,1 ml HS Stock #6 | ||
Tabel 2: Hanks løsning.
| Birc5B #1 | Birc5B #2 | Birc5B #3 | Prc1L #1 | Prc1L #2 | ||
| Samlet antal embryoner sekventeret | 3 | 9 | 12 | 8 | 10 | |
| Samlet antal embryoner med INDEL'er | 3 | 9 | 12 | 8 | 10 | |
| Mutation på ét sted | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | |
| Mutationer flere steder | 3 | 9 | 12 | 8 | 10 | |
| Placering af INDEL'er | ||||||
| Guide websted 1 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | |
| Guide websted 2 | 0 | 0 | 0 | 8 | 10 | |
| Guide site 3 | 3 | 9 | 12 | 8 | 10 | |
| Guide site 4 | 3 | 9 | 12 | 0 | 10 | |
| Typer af INDEL'er | ||||||
| In-frame mutation | 1 | 2 | 2 | 7 | 10 | |
| Mutation af rammeskift | 4 | 7 | 10 | 9 | 10 | |
Tabel 3: Placeringen og typen af INDEL'er, der findes i to forskellige sæt moderlige sprøde haploider: birc5b og prc1l.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Protokollen præsenteret i dette manuskript muliggør identifikation og primær molekylær karakterisering af en modereffektfænotype i en enkelt generation i stedet for de flere generationer, der kræves til både fremadgående og omvendte genetiske teknikker. I øjeblikket er rollen for mange moderligt udtrykte gener ukendt. Denne mangel på viden skyldes til dels den ekstra generation, der kræves for at visualisere en fænotype, når man identificerer gener fra modereffekt. Tidligere kunne hurtig identifikation af modereffektgener i zebrafisk opnås ved at injicere translationsblokerende morpholino oligonukleotider i dyrkede oocytter32. Denne metode viste sig at være vellykket ved at fænokopiere flere kendte modereffektgener, men manipulation af en umoden oocyt kan være et delikat, tidskrævende eksperiment. Maternelle RNA'er kan også målrettes mod nedbrydning ved hjælp af CRISPR-RfxCas13d-komplekser, men injektionen af disse komplekser i det encellede embryo kan ikke målrette moderligt tilvejebragt protein33. For nylig er det blevet opdaget, at CRISPR-Cas9 kan inducere bialleliske mutationer i kimlinjen, hvilket muliggør hurtig identifikation af nye modereffektgener i en enkelt generation11.
Denne protokol indeholder flere kritiske trin, der bidrager til genopretning af moderens sprøde embryoner. I teorien, fordi kimceller er specificeret i tidlig embryonal udvikling, jo tidligere en DNA-læsion skabes i et målgen, jo større er sandsynligheden for, at en celle, der indeholder mutationer, bliver en del af kimlinjen. Denne metode bruger Cas9-protein injiceret i den udviklende blastodisc af et encellet embryo for at øge sandsynligheden for redigeringer i kimlinjen. En anden kritisk faktor, der påvirker procentdelen af genvundne moderlige sprøde embryoner, er effektiviteten af guide-RNA'erne til at skabe genetiske redigeringer på målsteder. Denne procedure omfatter et afsnit om bestemmelse af styre-RNA'ers evne til at skabe somatiske INDEL'er ved 24 hpf ved PCR. Hvis et guide-RNA ikke foretager somatiske redigeringer, har det en lav sandsynlighed for at producere redigeringer i kimlinjen med en høj nok hastighed til at generere en moderlig crispant. Denne protokol leder brugeren til at teste somatiske redigeringer, som skal være synlige på tre eller flere guidesider.
Efter observation af fænotypen af moderens sprøde embryoner kan de genetiske læsioner, der bidrager til fænotypen, analyseres på sekvensniveau via IVF med UV-behandlet sæd. For at opnå tilstrækkeligt udgangsmateriale til PCR bør moderens sprøde haploide embryoner udvikle sig i mindst seks til otte timer, hvilket gør det muligt at forekomme flere cyklusser af DNA-replikation. Det genomiske DNA skal også ekstraheres i 50 μL 50mM NaOH for at koncentrere DNA'et. Hvis moderens sprøde haploide embryoner ikke kan overleve i 6-8 timer, skal embryonerne samles på et tidligere tidspunkt. For at tage højde for, at embryoet gennemgår færre cyklusser af DNA-replikation, ekstraheres DNA'et i et mindre volumen på 50 mM NaOH, samtidig med at den samme andel af NaOH og Tris-HCL opretholdes. En anden mulighed er at koncentrere det ekstraherede DNA ved hjælp af et DNA-oprydnings- og koncentratorsæt. Efter at DNA'et er ekstraheret, skal PCR-fragmentet, der anvendes til sekventering, omfatte alle fire målsteder, hvis det er muligt. Dette fragment vil gøre det muligt at identificere store deletioner, der spænder over flere guidesteder i moderens sprøde embryoner.
Når du indsamler moderens sprøde haploider til Sanger-sekventering, skal du indsamle alle de haploider, der viser fænotypen, og sende mindst 10 unikke haploide embryoprøver til Sanger-sekventering. Sekventering af flere haploide embryoner pr. kobling vil gøre det muligt at identificere flere INDEL'er, der findes i kimlinjen. Tidligere sekventeringsdata for moderens crispant haploider har vist, at flere alleler kan identificeres i et sæt maternelle crispant haploider11. Disse alleler genvindes imidlertid ikke i det forventede forhold1 til 11. Sekventering af flere embryoner vil også hjælpe med at understøtte ideen om, at fænotypen er forårsaget af en CRISPR-Cas9 INDEL i målgenet. Enhver vildtypesekvens observeret i sekventerede haploide embryoner, der viser en bestemt fænotype, vil tyde på, at fænotypen ikke er forbundet med det målrettede gen. Alle nye modereffektfænotyper, der identificeres ved at målrette tidligere ukarakteriserede gener, bør også bekræftes ved at etablere en stabil linje ved hjælp af søskende F0-hannerne11.
I nogle tilfælde kan det være udfordrende at identificere INDEL'er via haploidanalyse, hvor den identificerede maternel crispantfænotype har en bestemt fænotypisk egenskab. For eksempel kan moderens sprøde haploide embryoner, der ser ud til at være ubefrugtede eller lyse under spaltningsstadiet, være umulige at vælge. Maternelle sprøde embryoner med akseforlængelsesdefekter svarende til dem, der svarer til haploidsyndromet, kan heller ikke skelnes til analyse, når der genereres moderlige haploider34. I sådanne tilfælde rådes forskeren til at udføre analysen direkte ved hjælp af stabile linjer til genfænotypebekræftelse.
En begrænsning af den nuværende maternel crispant-protokol er, at den kun identificerer modereffektgener ved grove morfologiske defekter. For at øge metodens følsomhed og gøre den mere specifik for visse aspekter af tidlig udvikling kunne transgene reportere bruges til at fremhæve specifikke strukturer eller celletyper, som det er gjort for andre skærme 9,10,35. For eksempel kan CRISPR-Cas9-blandingen injiceres i Buc-GFP transgene linje for at identificere ikke-dødelige gener, der regulerer dannelsen og udviklingen af primordiale kimceller36. En anden begrænsning af moderens crispant-protokol er, at selvom den er nyttig for gener, der udelukkende udtrykkes under tidlig udvikling, er den muligvis ikke effektiv for gener med både maternel og zygotisk funktion, da CRISPR-Cas9-målretningen af genet kan være dødelig for det udviklende embryo. For at studere moderfunktionen af gener, der udtrykkes gennem hele udviklingen, kunne Cas9-aktivitet målrettes mod kimlinjen37, hvilket efterlader genets somatiske funktion upåvirket og tillader F0-hunnernes overlevelse til voksenalderen.
Maternelle crispants er et effektivt redskab til at identificere nye modereffektgener, der er nødvendige for tidlig udvikling. Kombinationen af multiplexing guide RNA'er til et enkelt mål og Cas9's bialleliske redigeringsevne gør det muligt at observere fænotypen med modereffekt i en enkelt generation, hvilket undgår avlsordninger i flere generationer, der typisk er nødvendige, når der udføres målrettet genredigering. Omgåelsen af flere generationer reducerer mængden af plads og ressourcer, der er nødvendige for at identificere gener med modereffekt.
Ud over at identificere nye modereffektgener tillader denne protokol ethvert zebrafisklaboratorium at fænokopiere og studere enhver kendt modereffektmutant uden at etablere og vedligeholde stabile linjer, hvilket letter detaljeret analyse af genetiske veje. I princippet kan denne maternel crispant-tilgang også bestemme funktionen af moderprodukter i ikke-genetiske modelarter.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer ingen konkurrerende økonomiske interesser.
Acknowledgments
Vi takker tidligere og nuværende Pelegri lab husdyrhold medarbejdere for deres pleje af vandanlægget. Vi er også taknemmelige for kommentarerne og indsigten i manuskriptet af Ryan Trevena og Diane Hanson. Finansiering blev ydet af NIH-tilskud til F.P. (GM065303)
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 M Tris-HCl (pH 8.4) | Invirogen | 15568025 | For PCR mix |
| 1.5 mL Eppendorf Tubes | Any Maker | ||
| 10 mM dNTPs | Thermo Fischer Scientific | 18427013 | Synthesis of gRNA |
| 100 BP ladder | Any Maker | For gel electrophoresis | |
| 100% RNAse free ethanol | Any Maker | ||
| 100% RNAse free ethanol | Any Maker | ||
| 100ml Beaker | Any Maker | For IVF | |
| 5 M Ammonium Accetate | Thermo Fischer Scientific | Found in the MEGAshortscript T7 Transcription Kit | Synthesis of gRNA |
| 70% Ethanol | Synthesis of gRNA (70 mL of ethanol + 30 mL of nuclease free water) | ||
| Borosil 1.0 mm OD x 0.5 mm ID | FHC INC | 27-30-1 | for Microinjection |
| Bulk Pharma Sodium Bicarbonate 35 pounds | Bulk Reef Supply | 255 | Fish supplies |
| CaCl2 | MiliporeSigma | C7902 | |
| Cas9 Protein with NLS | PNABio | CP01 | |
| ChopChop | https://chopchop.cbu.uib.no/ | ||
| Constant oligonucleotide | Integrated DNA Technologies (IDT) | AAAAGCACCGACTCGGTGCCAC TTTTTCAAGTTGATAACGGACTA GCCTTATTTTAACTTGCTATTTC TAGCTCTAAAAC |
|
| Depression Glass Plate | Thermo Fischer Scientific | 13-748B | For IVF |
| Dissecting Forceps | Dumont | SS | For IVF |
| Dissecting Scissors | Fine Science Tools | 14091-09 | For IVF |
| Dissecting Steroscope( with transmitted light source) | Any Maker | For IVF | |
| DNA Clean & Concentrator -5 | Zymo Research | D4014 | Synthesis of gRNA |
| DNA Gel Loading Dye (6x) | Any Maker | For gel electrophoresis | |
| EconoTaq DNA Polymerase | Lucigen | 30032-1 | For PCR mix |
| Electropheresis Power Supply | Any Maker | For gel electrophoresis | |
| Ensemble | https://useast.ensembl.org/index.html | ||
| Eppendorf Femtotips Microloader Tips for Femtojet Microinjector | Thermo Fischer Scientific | E5242956003 | for Microinjection |
| Ethanol (200 proof, nuclease-free) | Any Maker | ||
| FemtoJet 4i | Eppendorf | 5252000021 | for Microinjection |
| Fish Net | Any Maker | Fish supplies | |
| Frozen Brine Shrimp | Brine Shrimp Direct | Fish supplies | |
| General All Purpose Agarose | Any Maker | For gel electrophoresis | |
| Gene-Specific oligonucleotide | Integrated DNA Technologies (IDT) | TAATACGACTCACTATA- N20 -GTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAG | |
| Gloves | Any Maker | ||
| Ice Bucket | Any Maker | ||
| Instant Ocean salt | Any Maker | Fish supplies | |
| Invitrogen UltraPure Ethidium Bromide, 10 mg/mL | Thermo Fischer Scientific | 15-585-011 | |
| KCl | MiliporeSigma | P5405 | |
| KH2PO4 | MiliporeSigma | 7778-77-0 | |
| Kimwipes | Thermo Fischer Scientific | 06-666 | |
| Male & Female zebrafish | |||
| MEGAshortscript T7 Transcription Kit | Thermo Fischer Scientific | AM1354 | Synthesis of gRNA |
| Methylene Blue | Thermo Fischer Scientific | AC414240250 | For E3 |
| MgCl2 | MiliporeSigma | 7791-18-6 | For PCR mix |
| MgSO2·7H2O | MiliporeSigma | M2773 | |
| Microinjection plastic mold | World Precision Instruments | Z-Molds | for Microinjection |
| Micromanipulator | Any Maker | for Microinjection | |
| Micropipeters | Any Maker | ||
| Micropipette Puller | Sutter | P-87 | for Microinjection |
| Micropipetter tips with filters (all sizes) | Any Maker | ||
| Micropippetter tips without filters ( all sizes) | Any Maker | ||
| Microwave | Any Maker | ||
| Mineral Oil | MiliporeSigma | m5904-5ml | for Microinjection |
| MS-222 ( Tricaine-D) | Any Maker | FDA approved | |
| Na2HPO4 | MiliporeSigma | S3264 | |
| NaCl | MiliporeSigma | S5886 | |
| NaHC03 | MiliporeSigma | S5761 | |
| Nanodrop | Any Maker | ||
| NaOH | MiliporeSigma | 567530 | |
| Nonstick, RNase-free Microfuge Tubes, 1.5 mL | Ambion | AM12450 | Synthesis of gRNA |
| nuclease-free water | Any Maker | ||
| Paper Towel | Any Maker | ||
| Pastro Pipettes | Any Maker | ||
| PCR Strip Tubes | Any Maker | ||
| Petri Plates 100 mm diameter | Any Maker | ||
| Phenol Red solution | MiliporeSigma | P0290 | for Microinjection |
| Plastic Pestals | VWR | 47747-358 | For IVF |
| Plastic Spoon | Any Maker | For IVF | |
| Premium Grade Brine Shrimp Eggs | Brine Shrimp Direct | Fine Mesh | |
| RNA Gel Loading Dye | found in MEGAshortscript T7 Transcription Kit | For gel electrophoresis | |
| RNAse AWAY | Thermo Fischer Scientific | 21-402-178 | |
| Scale | Any Maker | ||
| Sharpie | Any Maker | ||
| Spatula | Any Maker | ||
| Sterile H2O | Any Maker | For PCR mix | |
| T4 DNA Polymerase | NEB | M0203 | Synthesis of gRNA |
| Tape | Any Maker | ||
| TBE (Tris-Borate-EDTA) 10x | Any Maker | For gel electrophoresis | |
| Tea Stainer | Amazon | IMU-71133W | Fish supplies |
| Thermo Scientific Owl 12-Tooth Comb, 1.0/1.5 mm Thick, Double Sided for B2 | Thermo Fischer Scientific | B2-12 | For gel electrophoresis |
| Thermo Scientific Owl EasyCast B2 Mini Gel Electrophoresis Systems | Thermo Fischer Scientific | 09-528-110B | For gel electrophoresis |
| Thermocycler | Any Maker | ||
| Thermocycler | Any Maker | ||
| Transilluminator | Any Maker | ||
| UV lamp | UVP | Model XX-15 (Cat NO. UVP18006201) | For IVF |
| UV safety glasses | Any Maker | For IVF | |
| Wash Bottle | Thermo Fischer Scientific | S39015 | Fish supplies |
| Zebrafish mating boxes | Aqua Schwarz | SpawningBox1 | Fish supplies |
| 1.5ml Eppendorf Tubes | Fisher Scientific | 05-402-11 | |
| 10 Molar dNTPs | Thermo Fischer Scientific | 18427013 | |
| 100 BP ladder | Thermo Fischer Scientific | 15628019 | |
| 100% RNAse free ethanol | any maker | ||
| 5m Ammonium Accetate | Thermo Fischer Scientific | ||
| 70% Ethanol | 70ml ethanol and 30 ml of nuclease free water | ||
| Accessories for Horizontal Gel Box | Fisher Scientific | 0.625 mm | |
| Agarose | any maker | ||
| CaCl2 | Sigma | 10043-52-4 | |
| CaCl2, dihydrate | Sigma | 10035-04-8 | E3 Medium |
| Capillary Tubing | Cole-Parmer | UX-03010-68 | for injection needles |
| Cas9 Protein | Thermo Fischer Scientific | A36496 | |
| ChopChop | https://chopchop.cbu.uib.no/ | ||
| Computer | any maker | ||
| Dissecting Forcepts | any maker | ||
| Dissecting Microscope | any maker | ||
| Dissecting Scissors | any maker | ||
| DNA Clean & Concentrator -5 | Zymo Research | D4014 | |
| DNA Gel Loading Dye (6X) | Thermo Fischer Scientific | R0611 | |
| EconoTaq DNA Polymerase | Lucigen | 30032-1 | |
| Ensemble | https://useast.ensembl.org/index.html | ||
| Eppendorf Microloader PipetteTips | Fischer Scientific | 10289651 | 20 microliters |
| Ethanol (200 proof, nuclease-free) | any maker | ||
| Ethidium Bromide | Thermo Fischer Scientific | 15585011 | |
| Fish Net | any maker | fine mesh | |
| Frozen Brine Shrimp | LiveAquaria | CD-12018 | fish food |
| Gel Comb (0.625mm) | any maker | ||
| Gel Electropheresis System | any maker | ||
| Gene-Specific oligonucleotide | Integrated DNA Technologies (IDT) | ||
| Glass Capilary Needle | Grainger | 21TZ99 | https://www.grainger.com/product/21TZ99?ef_id=Cj0KCQjw8Ia GBhCHARIsAGIRRYpqsyA3-LUXbpZVq7thnRbroBqQTbrZ_a88 VVcI964LtOC6SFLz4ZYaAhZzEAL w_wcB:G:s&s_kwcid=AL!2966!3! 264955916096!!!g!438976 780705!&gucid=N:N:PS:Paid :GGL:CSM-2295:4P7A1P:20501 231&gclid=Cj0KCQjw8IaGBh CHARIsAGIRRYpqsyA3-LUXbp ZVq7thnRbroBqQTbrZ_a88VVcI 964LtOC6SFLz4ZYaAhZzEALw _wcB&gclsrc=aw.ds |
| Glass Dishes | any maker | ||
| Gloves | any maker | ||
| Hank's Final Working Solution | Combine 9.9 ml of Hank's Premix with 0.1 ml HS Stock #6 | ||
| Hank's Premix | combine the following in order: (1) 10.0 ml HS #1, (2) 1.0 ml HS#2, (3) 1.0 ml HS#4, (4) 86 ml ddH2O, (5) 1.0 ml HS#5. Store all HS Solotions at 4C | ||
| Hanks Solution | |||
| Hank's Solution | https://www.jove.com/pdf-materials/51708/jove-materials-51708-production-of-haploid-zebrafish-embryos-by-in-vitro-fertilization | ||
| Hank's Stock Solution #1 | 8.0 g NaCl, 0.4 g KCl in 100 ml ddH2O | ||
| Hank's Stock Solution #2 | 0.358 g Na2HPO4 anhydrous; 0.60 g K2H2PO4 in 100 ml ddH2O | ||
| Hank's Stock Solution #4 | 0.72 g CaCl2 in 50 ml ddH2O | ||
| Hank's Stock Solution #5 | 1.23 g MgSO47H2O in 50 ml ddH20 | ||
| Hank's Stock Solution #6 | 0.35g NaHCO3 in 10.0 ml ddH20; make fresh day of use | ||
| HCl | Sigma | 7647-01-0 | |
| Ice Bucket | any maker | ||
| Instant Ocean salt | any maker | for fish water | |
| In-Vitro Transcription Kit Mega Short Script | Thermo Fischer Scientific | AM1354 | |
| Invitrogen™ UltraPure™ DNase/RNase-Free Distilled Water | Fisher Scientific | 10-977-023 | |
| KCl | Sigma | 7447-40-7 | E3 Medium |
| KH2PO4 | Sigma | 7778-77-0 | |
| Kimwipes | Fisher Scientific | 06-666 | |
| Male and Female zebrafish | |||
| Mega Short Script T7 Transciption Kit | Thermo Fischer Scientific | AM1354 | |
| methylene blue | Fisher Scientific | AC414240250 | E3 Medium |
| MgSO2-7H2O | Sigma | M2773 | |
| Microimicromanipulator | |||
| Microinjection plastic mold | World Precision Instruments | Z-Molds | |
| Microinjector | |||
| Microneedle Slide | |||
| Micropipeter (1-10) with tips | any maker | need filtered p10 tips | |
| Micropipetter (20-200) with tips | any maker | ||
| Micropippetter (100-1000) with tips | any maker | ||
| Microplastic slide | |||
| Microwave | any maker | ||
| MiliQ Water | any maker | ||
| mineral oil | sigma-aldrich | m5904-5ml | |
| Na2HPO4 | Sigma | ||
| NaCl | Sigma | S9888 | |
| NaHC02 | Sigma | 223441 | |
| Nanodrop | |||
| NaOH | Sigma | 567530 | |
| Narrow Spatula | any maker | ||
| Needle Puller | Sutter | P-97 | |
| Paper Towel | any maker | ||
| Pastro Pipettes | Fisher Scientific | 13-678-20A | |
| PCR primer flanking guide site | Integrated DNA Technologies (IDT) | ||
| PCR primers flanking guide RNA cut site | Integrated DNA Technologies (IDT) | Standard desalted | |
| PCR Strip Tubes | Thermo Fischer Scientific | AB0771W | |
| Petri Dishes | Fisher Scientific | FB0875714 | 10 cm diameter 100mm x 15mm |
| Phenol Red | Fisher Science | S25464 | https://www.fishersci.com/shop/products/phenol-red-indicator-solution-0-02-w-v-2/S25464 |
| Pipette Tips | any maker | 10ul, 200ul and 1000ul tips | |
| Plastic Pestals | Fisher Scientific | 12-141-364 | |
| Plastic Spoon | any maker | ||
| Primer Guide Site | Integrated DNA Technologies (IDT) | ||
| Razor Blade | Uline | H-595B | |
| RNA gel Loading Dye | in megashort script kit(in vitro transciption kit) | ||
| RNAse away | Fisher | 21-402-178 | |
| RNAse free polypropylene microcentrifuge tubes | Thermo Fischer Scientific | AM12400 | https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/AM12400#/AM12400 |
| RNAse free water | Fisher Scientific | 10-977-023 | |
| Scale | any maker | ||
| Sharpie | any maker | ||
| Sodium bicarbonate (cell culture tested) | Sigma | S5761 | fish water |
| Sodium Bromide Solotion | Sigma | E1510 | |
| Software for sanger sequencing Analysis | |||
| Spectrophotometer | |||
| Sterlie H2O | any brand | ||
| T4 DNA Polymerase | NEB | M0203S | https://www.neb.com/products/m0203-t4-dna-polymerase#Product%20Information |
| Tape | any brand | ||
| TBE (Tris-Borate-EDTA) 10X | Thermo Fischer Scientific | B52 | https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/B52#/B52 |
| Tea Stainer | amazon | IMU-71133W | avaible in most kitchen stores |
| Thermocycler | |||
| Transfer Pipette | Uline | S-24320 | |
| Transilluminator | |||
| Tricaine | fisher scientific | NC0872873 | |
| Tris HCl 7.5 | Thermo Fischer Scientific | 15567027 | |
| Universal Primer | Integrated DNA Technologies (IDT) | AAAAGCACCGACTCGGTGCCAC TTTTTCAAGTTGATAACGGACTAG CCTTATTTTAACTTGCTATTTCTA GCTCTAAAAC |
|
| UV lamp | UVP | ||
| UV safety glasses | any maker | ||
| Wash Bottle | fisher scientific | S39015 | |
| Zebrafish mating boxes | any maker | ||
| PCR Buffer Recipe | Add 171.12mL sterile H20; 0.393 mL 1M MgCl2; 2.616mL 1M MgCl2; 2.618 mL 1M Tris-HCl (pH 8.4) 13.092mL 1M KCl; 0.262 mL 1% Gelatin. Autoclave for 20 minutes then chill the solotion on ice. Next add 3.468 mL 100mg/mL BSA; 0.262 mL dATP (100mM), 0.262mL dCTP (100mM); 0.262 mL dGTP (100mM); 0.262 mL dTTP (100mL). Alliquote into sterile eppendorf tubes |
References
- Pelegri, F.
- Campbell, P. D., Heim, A. E., Smith, M. Z., Marlow, F. L. Kinesin-1 interacts with Bucky ball to form germ cells and is required to pattern the zebrafish body axis. Development. 142 (17), Cambridge, England. 2996-3008 (2015).
- Eno, C., Solanki, B., Pelegri, F. aura (mid1ip1l) regulates the cytoskeleton at the zebrafish egg-to-embryo transition. Development. 143 (9), Cambridge, England. 1585-1599 (2016).
- He, W. -X., et al. Oocyte-specific maternal Slbp2 is required for replication-dependent histone storage and early nuclear cleavage in zebrafish oogenesis and embryogenesis. RNA. 24 (12), RNA. New York, N.Y. 1738-1748 (2018).
- Burger, A., et al. Maximizing mutagenesis with solubilized CRISPR-Cas9 ribonucleoprotein complexes. Development. 143 (11), Cambridge, England. 2025-2037 (2016).
- Jao, L. -E., Wente, S. R., Chen, W. Efficient multiplex biallelic zebrafish genome editing using a CRISPR nuclease system. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (34), 13904-13909 (2013).
- Shah, A. N., Davey, C. F., Whitebirch, A. C., Miller, A. C., Moens, C. B. Rapid reverse genetic screening using CRISPR in zebrafish. Nature Methods. 12 (6), 535-540 (2015).
- Shankaran, S. S., Dahlem, T. J., Bisgrove, B. W., Yost, H. J., Tristani-Firouzi, M. CRISPR/Cas9-directed gene editing for the generation of loss-of-function mutants in high-throughput zebrafish F0 screens. Current Protocols in Molecular Biology. 119 (1), 1-22 (2017).
- Trubiroha, A., et al. A Rapid CRISPR/Cas-based mutagenesis assay in zebrafish for identification of genes involved in thyroid morphogenesis and function. Scientific Reports. 8 (1), 5647 (2018).
- Wu, R. S., Lam, I. I., Clay, H., Duong, D. N., Deo, R. C., Coughlin, S. R. A Rapid method for directed gene knockout for screening in G0 zebrafish. Developmental Cell. 46 (1), 112-125 (2018).
- Moravec, C. E., Voit, G. C., Otterlee, J., Pelegri, F. Identification of maternal-effect genes in zebrafish using maternal crispants. Development. 148 (19), Cambridge, England. 199536 (2021).
- Braat, A. K., Zandbergen, T., van de Water, S., Goos, H. J., Zivkovic, D. Characterization of zebrafish primordial germ cells: morphology and early distribution of vasa RNA. Developmental Dynamics: An Official Publication of the American Association of Anatomists. 216 (2), 153-167 (1999).
- Eno, C., Hansen, C. L., Pelegri, F. Aggregation, segregation, and dispersal of homotypic germ plasm RNPs in the early zebrafish embryo. Developmental Dynamics. 248 (4), 306-318 (2019).
- Knaut, H., Steinbeisser, H., Schwarz, H., Nüsslein-Volhard, C. An evolutionary conserved region in the vasa 3'UTR targets RNA translation to the germ cells in the zebrafish. Current biology: CB. 12 (6), 454-466 (2002).
- Yoon, C., Kawakami, K., Hopkins, N. Zebrafish vasa homologue RNA is localized to the cleavage planes of 2- and 4-cell-stage embryos and is expressed in the primordial germ cells. Development. 124 (16), Cambridge, England. 3157-3165 (1997).
- Gagnon, J. A., et al. Efficient mutagenesis by Cas9 protein-mediated oligonucleotide insertion and large-scale assessment of single-guide RNAs. PLoS ONE. 9 (5), 98186 (2014).
- Labun, K., Montague, T. G., Gagnon, J. A., Thyme, S. B., Valen, E. CHOPCHOP v2: a web tool for the next generation of CRISPR genome engineering. Nucleic Acids Research. 44, 272-276 (2016).
- Labun, K., Montague, T. G., Krause, M., Torres Cleuren, Y. N., Tjeldnes, H., Valen, E. CHOPCHOP v3: expanding the CRISPR web toolbox beyond genome editing. Nucleic Acids Research. 47, 171-174 (2019).
- Montague, T. G., Cruz, J. M., Gagnon, J. A., Church, G. M., Valen, E. CHOPCHOP: a CRISPR/Cas9 and TALEN web tool for genome editing. Nucleic Acids Research. 42, 401-407 (2014).
- Moravec, C. E., Pelegri, F. J. An accessible protocol for the generation of CRISPR-Cas9 knockouts using INDELs in zebrafish. Methods in Molecular Biology. 1920, Clifton, N.J. 377-392 (2019).
- White, R. J., et al. A high-resolution mRNA expression time course of embryonic development in zebrafish. eLife. 6, 30860 (2017).
- Aanes, H., et al. Zebrafish mRNA sequencing deciphers novelties in transcriptome dynamics during maternal to zygotic transition. Genome Research. 21 (8), 1328-1338 (2011).
- Aken, B. L., et al. The Ensembl gene annotation system. Database: The Journal of Biological Databases and Curation. 2016, (2016).
- Sorlien, E. L., Witucki, M. A., Ogas, J. Efficient production and identification of CRISPR/Cas9-generated gene knockouts in the model system Danio rerio. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (138), e56969 (2018).
- Kotani, H., Taimatsu, K., Ohga, R., Ota, S., Kawahara, A. efficient multiple genome modifications induced by the crRNAs, tracrRNA and Cas9 protein complex in zebrafish. PloS One. 10 (5), 0128319 (2015).
- Rosen, J. N., Sweeney, M. F., Mably, J. D. Microinjection of zebrafish embryos to analyze gene function. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (25), e1115 (2009).
- Xu, Q.
- Biology Mouse,, Zebrafish,, Chick, JoVE. Biology: Mouse, Zebrafish, and Chick. Zebrafish Microinjection Techniques. JoVE Science Education Database. , Cambridge, MA. (2021).
- Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F.
- D'Agostino, Y., et al. A rapid and cheap methodology for CRISPR/Cas9 zebrafish mutant screening. Molecular Biotechnology. 58 (1), 73-78 (2016).
- Baars, D. L., Takle, K. A., Heier, J., Pelegri, F. Ploidy manipulation of zebrafish embryos with Heat Shock 2 treatment. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (118), e54492 (2016).
- Nair, S., Lindeman, R. E., Pelegri, F. In vitro oocyte culture-based manipulation of zebrafish maternal genes. Developmental Dynamics: An Official Publication of the American Association of Anatomists. 242 (1), 44-52 (2013).
- Kushawah, G., et al. CRISPR-Cas13d induces efficient mRNA knockdown in animal embryos. Developmental Cell. 54 (6), 805-817 (2020).
- Kroeger, P. T., Poureetezadi, S. J., McKee, R., Jou, J., Miceli, R., Wingert, R. A. Production of haploid zebrafish embryos by in vitro fertilization. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (89), e51708 (2014).
- Xiao, T., Roeser, T., Staub, W., Baier, H. A GFP-based genetic screen reveals mutations that disrupt the architecture of the zebrafish retinotectal projection. Development. 132 (13), Cambridge, England. 2955-2967 (2005).
- Riemer, S., Bontems, F., Krishnakumar, P., Gömann, J., Dosch, R. A functional Bucky ball-GFP transgene visualizes germ plasm in living zebrafish. Gene Expression Patterns: GEP. 18 (1-2), 44-52 (2015).
- Moreno-Mateos, M. A., et al. CRISPRscan: designing highly efficient sgRNAs for CRISPR-Cas9 targeting in vivo. Nature Methods. 12 (10), 982-988 (2015).
