Summary
세포벽 분해를 표적화함으로써 바실러스 서브틸 리스 및 스트렙토코커스 폐렴 의 성장을 억제하는 소분자 프로브인 정균성 디아미드 마사리마이신을 제조하기 위한 상세한 프로토콜이 제시된다. 화학 프로브로서의 그것의 적용은 B. subtilis 및 S. pneumoniae를 사용한 시너지 효과 / 길항작용 분석 및 형태 학적 연구에서 입증됩니다.
Abstract
박테리아의 세포벽에있는 펩티도글리칸 (PG)은 모양과 주변 환경으로부터의 보호를 부여하는 독특한 거대 분자 구조입니다. 세포 성장과 분열을 이해하는 핵심은 PG 분해가 생합성 및 세포벽 조립에 어떻게 영향을 미치는지에 대한 지식입니다. 최근에, 변형된 당 또는 아미노산의 도입을 통한 PG의 대사 표지가 보고되고 있다. 소분자 억제제를 사용한 생합성 단계의 화학적 심문이 가능하지만, autolysins에 의한 PG 분해를 연구하기위한 화학 생물학 도구는 저개발되어 있습니다. 박테리아 autolysins는 PG의 긴밀하게 배위된 분해에 관여하는 효소의 광범위한 부류이다. 여기에서, 바실러스 서브틸리스 에서 N-아세틸글루코사미니다제 LytG의 억제제인 소분자 프로브인 마사리마이신, 및 폐렴구균에서 세포벽 대사를 제조하기 위한 상세한 프로토콜이 제시된다. 마이크로파 보조 및 고전적 유기 합성을 통한 억제제의 제조가 제공된다. 생물학적 분석에서 그람 양성 생리학을 연구하는 도구로서의 적용 가능성이 제시됩니다.
Introduction
펩티도글리칸(PG)은 그람 양성균과 그람 음성 박테리아 1,2 모두에서 세포 모양과 구조를 묘사하는 메쉬형 폴리머이다. 이러한 헤테로폴리머는 짧은 펩티드3,4,5,6에 의해 가교결합된 아미노 당류의 매트릭스이며, β-(1,4)-연결된 교대 N-아세틸글루코사민(GlcNAc) 및 N-아세틸무람산(MurNAc) 잔기로 구성된 백본을 갖는다(도 1)1. MurNAc의 C-3 락틸 모이어티에 부착된 것은 줄기 펩티드이다. PG의 신진 대사는 세포벽 7,8에 새로운 물질을 통합하기 위해 생합성 및 분해 효소의 밀접하게 조정 된 시스템을 포함한다. PG의 분해는 자율분해신9로 총칭되는 효소에 의해 수행되고, 절단된 결합의 특이성에 기초하여 추가로 분류된다. 오토리신은 세포 성장, 세포 분열, 운동성, PG 성숙, 화학주성, 단백질 분비, 유전 능력, 분화 및 병원성10,11을 포함한 많은 세포 과정에 참여한다. 개별 autolysins의 특정 생물학적 기능을 푸는 것은 부분적으로 기능적 중복성으로 인해 어려울 수 있습니다. 그러나, 최근의 생물물리학적 8,12,13 및 전산 연구(12)는 PG 대사에서의 그들의 역할에 대한 새로운 통찰력을 제공하였다. 또한, 최근의 보고들은 PG 대사에서 합성14 및 막 매개 15,16,17 단계에 대한 추가적인 통찰을 제공하였다. PG 신진 대사의 분해 경로와 합성 경로 사이의 관계에 대한 철저한 이해는 이전에 미개척 된 항생제 표적을 야기 할 수 있습니다.
진핵생물에서 당생물학을 연구하기 위한 방법론의 상당한 발전이 있었지만, 박테리아 당생물학 및 특히 PG 대사는 유사한 속도로 진행되지 않았다. PG 대사를 연구하기 위한 현재의 화학적 접근법에는 형광 표지된 항생제18, 형광 프로브19,20 및 대사 표지21,22,23,24가 포함된다. 이러한 새로운 접근법은 박테리아 세포벽 신진 대사를 조사하는 새로운 방법을 제공하고 있습니다. 이들 전략 중 일부는 생체내에서 PG를 표지할 수 있지만, 이들은 종-특이적19일 수 있거나, 또는 특정 자가분해신(25)이 결여된 균주에서만 작용할 수 있다. 많은 PG 표지 전략은 단리된 세포벽(26) 또는 시험관내 재구성된 PG 생합성 경로(20,27,28)와 함께 사용하기 위한 것이다. 형광 표지된 항생제의 사용은 현재 생합성 단계 및 형질소화(transpeptidation)18로 제한된다.
박테리아 autolysins에 대한 현재의 지식과 세포벽 대사에서의 그들의 역할은 유전 및 시험관 내 생화학 분석 11,29,30,31,32에서 비롯됩니다. 이러한 접근법은이 중요한 종류의 효소에 대한 풍부한 정보를 제공했지만 생물학적 역할을 해독하는 것은 어려울 수 있습니다. 예를 들어, 기능적 중복성(33)으로 인해, 대부분의 경우 자가분해신의 결실은 박테리아 성장을 정지시키는 결과를 초래하지 않는다. 이것은 세포 성장 및 분열에서 그들의 묵시적 역할에도 불구하고 7,12. 또 다른 합병증은 박테리아 autolysin의 유전 적 결실이 메타 표현형34를 일으킬 수 있다는 것입니다. 메타 표현형은 유전 적 결실에 의해 영향을받는 경로와 다른 상호 연결된 경로 사이의 복잡한 상호 작용에서 발생합니다. 예를 들어, 메타 표현형은 효소의 부족과 같은 직접적인 효과 또는 조절자의 파괴와 같은 간접적 인 효과를 통해 발생할 수 있습니다.
현재, PG의 분해를 연구하기 위한 화학 프로브로 사용될 수 있는 N-아세틸글루코사미니다제(GlcNAcase) 및 N-아세틸무라미다제와 같은 글리코시다제 autolysins의 억제제는 단지 몇 가지 밖에 없다. 이를 해결하기 위해, 디아미드 마사리마이신 (이전에 fgkc로 불림)은 GlcNAcase LytG32를 표적으로 하는 바실러스 서브틸리스 성장의 정균 억제제로서 확인되고 특성화되었다 (도 1). LytG는 엑소-작용 GlcNAcase36이며, 글리코실 가수분해효소 패밀리 73 (GH73) 내의 클러스터 2의 구성원이다. 그것은 식물 성장 동안 주요 활성 GlcNAcase입니다32. 우리의 지식에 따르면, 마사리 마이신은 세포 성장을 억제하는 PG 작용 GlcNAcase의 첫 번째 억제제입니다. 스트렙토코커스 폐렴을 이용한 마사리마이신에 대한 추가 연구에 따르면 마사리마이신은 이 유기체에서 세포벽 대사를 억제할 가능성이 높다는 것을 발견했다37. 여기서, 마사리마이신의 제제는 그람 양성 유기체 B. subtilis 및 S. pneumoniae에서 생리학을 연구하기 위한 화학 생물학 프로브로서 사용하기 위한 것으로 보고되어 있다. 마사리마이신을 사용한 서브 최소 억제 농도 처리의 형태학적 분석의 예, 뿐만 아니라 상승작용/길항작용 분석이 제시된다. 잘 정의된 작용 모드를 갖는 항생제를 사용하는 시너지 및 길항작용 분석은 세포 과정38,39,40 사이의 연관성을 탐구하는 유용한 방법이 될 수 있다.
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Protocol
1. 일반적인 방법
참고: 모든 화합물은 표준 공급업체로부터 구입하여 추가 정제 없이 사용했습니다.
- 실리카 겔 XG F254로 예비코팅된 알루미늄 플레이트에 박층 크로마토그래피(TLC)를 수행하십시오. UV 램프 아래, p-anisaldehyde 얼룩에 침지하거나 I2 증기에 노출시켜 반점을 감지합니다.
- 모든 핵 자기 공명(NMR) 스펙트럼을 400MHz 분광계에 기록합니다.
참고: 1H-NMR 및 13C-NMR스펙트럼은 잔류 용매 피크를 참조하였다. 커플링 상수는 [Hz]로 주어지고 화학적 이동은 [ppm]으로 주어집니다. - 대기압 화학 이온화 (APCI) 마사리 마이신의 질량 분광법 스펙트럼을 대기 고체 분석 프로브가 장착 된 소형 질량 분광계에 기록하십시오.
2. 마사리마이신의 제조를 위한 일반적인 절차
참고: 흄 후드에서 아래 단계를 수행하십시오.
- 각 반응물의 메탄올 중 0.1 M 용액을 제조하였다: 시클로헥실아민, 시클로헥실카르복스알데히드, o-요오도벤조산, 및 시클로헥실이소시아나이드35.
주의: 사이클로헥실아민, 사이클로헥실이소시아나이드 및 사이클로헥실카르복스알데히드는 가연성입니다. 그들은 피부 부식을 일으키고 구강, 진피, 호흡기 또는 생식 독성을 유발할 수 있습니다. 화합물을 화염, 뜨거운 표면 및 점화원으로부터 멀리하십시오. 적절한 피부와 눈 보호 장치를 착용하고 환기가 잘되는 곳에서 일하며 증기 나 안개의 흡입을 피하십시오. 보관을 위해 병을 단단히 닫아 서늘하고 건조한 곳에 보관하십시오. 사이클로헥실카르복스알데히드를N2 분위기 하에서 데시케이터에 저장한다. - 캡핑된 둥근바닥 플라스크에 사이클로헥실아민 5 mL(메탄올 중 0.1 M 용액)와 사이클로헥실카르복스알데히드 5 mL(메탄올 중 0.1 M)를 혼합하고, 자석 교반 막대를 사용하여 용액을 모래 욕조에서 40°C에서 30분 동안 교반/핫플레이트 상에서 교반한다. 모래 표면 아래 약 1cm 아래에 놓인 온도계를 사용하여 온도를 모니터링합니다.
- 30분 후, 단계 2.2로부터의 용액에 5 mL의 시클로헥실 이소시아나이드 (메탄올 중 0.1 M 용액)를 첨가하고, 50°C에서 추가로 20분 동안 교반한다. 마지막으로, 5 mL의 o-iodobenzoic acid (메탄올 중 0.1 M 용액)를 반응 혼합물에 첨가하고, 55°C에서 3-5 h 동안 교반을 계속한다.
- 상기 반응 혼합물을 3 h 동안 교반한 후 대략 매 시간마다 TLC에 의해 주기적으로 반응의 진행을 모니터링하였다.
- 알루미늄 지지형 TLC 플레이트의 3cm x 6cm 스트립을 자릅니다. # 2 연필을 사용하여 바닥에서 약 1cm 떨어진 곳에 선을 그립니다. 유리 미세모세관을 사용하여, 대략 5 μL의 반응 혼합물을 TLC 플레이트 상에 스팟팅하고 건조시킨다.
- 150 mL 비이커에 비이커의 바닥을 덮기에 충분한 이동상 (90:10 헥산: 이소프로판올)을 첨가한다. 한 쌍의 핀셋을 사용하여 위의 TLC 플레이트를 비이커에 조심스럽게 배치하여 TLC 플레이트가 이동상으로 고르게 들어가도록하십시오. 비커의 꼭대기를 틴포일 조각으로 덮으십시오.
참고: 이동 단계가 라인 및 스팟팅된 샘플을 커버하지 않는지 확인하십시오. - 이동상이 플레이트 상단에서 약 1cm 아래에 있을 때까지 TLC 플레이트 위로 이동하도록 허용하십시오. TLC 플레이트를 제거하고 연필을 사용하여, 이동상으로 이동한 거리를 나타내는 선을 그린다. TLC 플레이트를 흄 후드에서 건조시키십시오.
- 일단 건조되면, TLC 플레이트를 소량의 고체I2 를 함유하는 비이커에 넣고 비커를 주석 호일 조각으로 덮는다. TLC에서 노란색/갈색 반점이 발생하는지 모니터링합니다. 일단 개발되면 TLC 플레이트를 제거하고 연필을 사용하여 반점의 위치를 표시하십시오 (보충 그림 1).
참고 :2 개의 반점이 표시되지 않으면 시간이 지남에 따라 얼룩이 사라집니다. 스팟은 또한 UV-광, p-아니살알데히드 염색, 또는 과망간산칼륨 염색에 의해 TLC 플레이트 상에서 가시화될 수 있다( 보충 정보 참조). - 다음 공식을 사용하여 시각화된 모든 스팟에 대한Rf 값을 계산합니다.
Rf=
- Rf=0.3인 한 스폿만이 TLC 플레이트 상에 보일 때 반응 완료를 고려한다. 감압 하에서 회전 증발기에서 용매를 제거하고, 모든 메탄올이 증발될 때까지 고진공 하에서 조 생성물(황갈색 오일로서 수득됨)을 건조시킨다.
- 건조된 조생성물을 에틸 아세테이트 30 mL에 용해시키고 이를 분리 깔때기로 옮긴다. 에틸 아세테이트를 1 M HCl (2 x 30 mL), H2O (30 mL), 포화 NaHCO3 용액 (2 x 30 mL),H2O(30 mL) 및 포화 NaCl 용액 (2 x30 mL)으로 순차적으로 추출한다. 수층을 버리십시오.
참고: 에틸 아세테이트 층은 각각의 추출에서 최상층이다. 각 추출에 대해, 에틸 아세테이트 및 수용액 (HCl,H2O, NaHCO3, 또는 NaCl)을 함유하는 분리 깔때기를 격렬하게 흔들어 층이 완전히 분리되도록 한다. - 분리 깔때기에서 에틸 아세테이트 층을 제거하고 삼각 플라스크에 수집하십시오. Na2SO4 (무수)로가득 찬 주걱을 첨가하여 에틸 아세테이트로부터 잔류 물을 제거한다.
참고 : 에틸 아세테이트 용액은 플라스크의Na2SO4가 자유롭게 달리고 덩어리지지 않을 때 건조한 것으로 간주됩니다. Na2SO4가 뭉치면,Na2SO4의 주걱이 추가로 첨가될 수 있다. - 건조된 에틸아세테이트 용액을 #1 여과지를 통해 여과하여Na2SO4를 제거하였다. 여과지를 소량의 에틸 아세테이트로 씻으십시오. 여과된 에틸아세테이트 용액을 둥근바닥 플라스크에 넣고 감압 회전증발기에 용매를 제거하여 에틸아세테이트가 모두 제거되면 오일로서 마사리마이신을 얻었다.
- 상기에서 얻어진 마사리마이신 오일을 9:1의 최량(1-2 mL)에 녹이고 헥산:이소프로판올을 모든 화합물이 용해될 때까지 자석 교반 플레이트 상에서 교반한다.
- 용해된 마사리마이신을 12 g 정상상 실리카 플래쉬 컬럼을 사용하여 플래쉬 크로마토그래피로 정제한다.
- 플래시 컬럼을 10 컬럼 부피의 이동상 (99:1 헥산: 이소프로판올)과 15 mL/min의 유속으로 설정된 계측기로 평형을 이룬다.
주: 평형화가 완료된 후 흐름을 중지하고 시스템에서 컬럼 상단을 분리하십시오. - 용해된 마사리마이신을 5 mL 주사기를 사용하여 드립한다. 주사기를 평형 플래시 컬럼의 상단에 직접 연결하고 용액을 컬럼에 주입하십시오. 로드된 컬럼을 플래시 크로마토그래피 시스템에 다시 연결하고 구배 용출을 시작합니다.
- 컬럼으로부터 마사리마이신을 10:90의 최종 이동상 농도로 구배 용출을 사용하여 헥산:이소프로판올을 12 컬럼 부피에 걸쳐 용출시킨다. 230 및 254 nm에서의 흡수 를 통해 마사리마이신의 용출을 모니터링한다.
- 분획 당 용매 20 mL를 수집하는 분획 수집기에 의해 컬럼으로부터 용출된 화합물을 수집한다.
참고: 플래시 크로마토그래피 시스템을 사용할 수 없는 경우, 마사리마이신의 정제는 3:1(헥산:에틸 아세테이트) 이동상을 갖는 중력 실리카 컬럼을 통해 수행될 수 있다. 마사리마이신을 함유하는 분획은 동일한 이동상을 사용하는 TLC에 의해 확인될 수 있다. TLC 스팟의 시각화는 UV 광,I2 증기, 또는 과망간산칼륨 염색으로 이루어졌다. - TLC (단계 2.5-2.9) 또는 대기 고체 분석 프로브가 장착 된 소형 질량 분광계에서 질량 분광법에 의해 마사리 마이신을 함유 한 분획을 확인합니다. 최종 제품을 진공 (~ 0.3mbar)에서 건조시킵니다.
참고: 마사리마이신은 반응에 첨가된 사이클로헥실카르복스알데히드의 mmol에 대하여 55%-70%의 수율로 무색 오일 또는 고체로서 일상적으로 수득된다. 정제된 마사리마이신의 질량을 구하여 마사리마이신의 최종 수율을 계산하고, 다음 공식을 사용하여 반응의 이론적 수율을 계산한다:
% 수율 =
x 100%
- 플래시 컬럼을 10 컬럼 부피의 이동상 (99:1 헥산: 이소프로판올)과 15 mL/min의 유속으로 설정된 계측기로 평형을 이룬다.
- NMR로 마사리마이신의 구조를 확인한다.
- ~10mg의 마사리마이신 시료를 0.5mL의 CDCl3에 녹인다. 파스퇴르 피펫을 사용하여 용액을 5mm NMR 튜브로 옮기고 튜브를 캡핑합니다. NMR 튜브를 분광계에 놓습니다.
- 제조업체 사전 설정 실험을 사용하여 1H 및 13CNMR 스펙트럼을 획득합니다. 화학적 이동 할당 및 대표 스펙트럼은 보충 그림 3-4에 제공된다.
- 마사리마이신을 사용 전까지 -20°C에서 DMSO(25 mM 최종 농도)에 용해 건조 또는 보관한다.
x 100%3. 마사리마이신의 제조를 위한 마이크로파 절차
- 아세토니트릴 중의 시클로헥실아민, 시클로헥실카르복스알데히드, 시클로헥실이소시아나이드 및 o-요오도벤조산의 0.6 M 용액을 제조한다.
- 교반 막대 및 아세토니트릴 10 mL를 유리 마이크로파 반응 바이알에 첨가한다.
- 사이클로헥실아민 2 mL (아세토니트릴 중 0.6 M), 사이클로헥실카르복스알데히드 2 mL (아세토니트릴 중 0.6 M), 및 아세토니트릴 7 mL를 바이알에 첨가한다.
- 마이크로파 반응 바이알을 마이크로파 회전 목마에 넣는다. 혼합물을 교반하고 400W의 전력 설정에서 50 ° C에서 30 분 동안 가열하고 실온으로 냉각하십시오.
- 2 mL의 o-iodobenzoic acid (메탄올 중 0.6 M) 및 2 mL의 시클로헥실 이소시아나이드 (아세토니트릴 중 0.6 M)를 바이알에 첨가한다. 혼합물을 교반하고, 400 W의 전력 설정에서 40분 동안 마이크로파에서 100°C로 가열하고, 실온으로 냉각시킨다.
- 단계 3.5의 완료 후I2 증기를 사용하여 TLC (90:10 헥산:이소프로판올)에 의한 반응의 진행을 모니터링한다.
참고: TLC가 반응이 불완전한 경우(즉, TLC 상의 여러 스팟), 반응 바이알을 다시 마이크로파에 넣고 단계 3.5에 설명된 마이크로파 조건을 설정한다. - 반응이 완료되면 용액을 100 mL 둥근바닥 플라스크에 붓고 회전식 증발기를 사용하여 증발시켜 건조시킨다.
- 위의 2.6-2.16 단계에 따라 마사리 마이신의 수성 워크업, 정제 및 특성화를 완료하십시오.
4. 시너지 효과와 적대감 분석
- 혐기성 조건 하에서 37°C에서 5%(v/v) 양 혈액을 함유하는 뮬러-힌튼(MH) 한천 플레이트 상에서 스트렙토코커스 폐렴 R6 을 성장시킨다. 모든 실험에서,OD600 이 ∼0.4가 될 때까지 혐기성 조건 하에서 37°C에서 5 mL의 MH 브로스에서 성장한 초계대 세포를 사용한다.
- 마사리마이신 및 옵토신 억제제를 각각의 용매 중에서 연속 1:2 희석으로 피험하고, 생성된 농도는 각 억제제의 최소 억제 농도(MIC) 값을 플랭킹한다.
- 100 μM의 농도에 도달할 때까지 디메틸설폭사이드(DMSO)에서 마사리마이신의 초기 희석액을 확인한다. 이 시점부터, MH 국물에 마사리 마이신 희석액을 만드십시오. 시판되는 옵토친(표 표 참조)을 멸균 MH 국물에 용해시켜 옵토친 원액(3.5 mM) 을 준비한다.
참고: 마사리마이신 스톡 용액은 DMSO 중 25 mM에서 제조되었다.
- 100 μM의 농도에 도달할 때까지 디메틸설폭사이드(DMSO)에서 마사리마이신의 초기 희석액을 확인한다. 이 시점부터, MH 국물에 마사리 마이신 희석액을 만드십시오. 시판되는 옵토친(표 표 참조)을 멸균 MH 국물에 용해시켜 옵토친 원액(3.5 mM) 을 준비한다.
- 멸균된 96-웰 마이크로타이터 플레이트에, 플레이트의 각 행에 각 옵토킨 희석액의 2 μL 분취량을 첨가한다. 동일한 플레이트에, 각 컬럼에 희석된 각 마사리마이신 분취량 2μL를 첨가하여 플레이트 상에 옵토친 및 마사리마이신 농도의 어레이를 생성한다(도 2).
- 상기 억제제를 함유하는 멸균 MH 브로스 (93 μL)를 각 웰에 첨가한다. 마이크로타이터 플레이트를 단계 4.1로부터 5 μL의 배양물 (OD600∼0.4 )로 접종한다.
참고: 96-웰 플레이트의 접종은 일반적으로 혐기성 워크스테이션에서 혐기성 조건 하에서 수행됩니다. 웰 내의 최종 부피는 100 μL이다. - 혐기성 조건 하에서 37°C에서 18시간 동안 배양물을 성장시키고, 이어서 레사주린 나트륨 염의 0.01% (m/v) 용액 중 30 μL를 첨가하였다. 플레이트를 실온에서 15분 동안 인큐베이션하여 색의 형성 및 안정화를 허용한다.
참고: 레사주린 용액은 화합물을 증류수에 용해시켜 제조되며 4°C에서 최대 2주 동안 보관할 수 있습니다. - 플레이트로부터 농도 값을 직접 판독하고, 박테리아 성장이 관찰되지 않는 최저 억제제 농도(청색)를 [X]로 지정하고(단계 4.7.1 참조), 즉 공동 약물의 존재 하에 약물의 최저 억제 농도를 지정한다.
참고 : 긍정적 인 박테리아 성장은 분홍색으로 변하는 resazurin 염료에 의해 우물에서 확인됩니다. 각 약물 단독에 대한 MIC 값(즉, 공동 약물의 부재 하에서)은 각각의 약물과 별개로 레사주린 MIC 분석법(35 )을 사용하여 유사한 방식으로 결정된다(보충 도 5). S. pneumoniae 의 MICs는 마사리마이신 및 옵토친에 대해 각각 7.8 μM 및 15.85 μM이다. - 다음 방정식을 이용하여 분획억제농도(FIC) 및 FIC 지수(FICI)를 결정한다.
- FIC= [X]/MICx, 여기서 [X](단계 4.6부터)는 공동약물의 존재 하에 약물의 최저 억제 농도이고,MICx는 공동약물의 부재 하에 약물의 최저 억제 농도이다.
- FICI = FIC마사리 마이신 + FIC항생제
참고: FIC I < 0.5 = 상승작용, 0.5 < FIC I < 1 = 첨가제, 1 < FIC I < 4 = 무관심, FIC I > 4 = 길항성.
5. 형태학적 연구
- 37°C에서 1.5% 박토 한천을 함유하는 루리아-베르타니(LB) 한천 플레이트(10g/L 트립톤, 5g/L 효모 추출물 및 5g/L NaCl)에서 바실 러스 서브틸리스 11774를 성장시킨다. 모든 실험에서,OD600 =1이 될 때까지 37°C에서 LB 배양액 5 mL에서 성장한 초계대 세포를 사용한다. 단계 4.1에서와 동일한 방법으로 S.pneumoniae 를 성장시킨다.
- B. subtilis에 대해 OD600nm = 1, 또는 S. pneumoniae에 대해OD600nm = 0.4로 세포 배양 밀도를 얻은 후, 피펫을 사용하여 "처리된" 표지된 배양 튜브에 마사리마이신을 최종 농도 3.8 μM (B.subtilis의 경우 0.75x MIC), 또는 5.85 μM (S.pneumoniae의 경우 0.75x MIC)으로 첨가하였다. "대조군"으로 표지된 두 번째 배양 튜브에 등가 부피의 DMSO를 첨가한다.
- B.subtilis의 경우, 샘플을 150 rpm에서 진탕하면서 90분 동안 37°C의 인큐베이터에 놓는다. S. pneumoniae의 경우, 혐기성 조건 하에서 흔들리지 않고 세포를 배양하십시오.
- 90분 후, 배양물을 4°C에서 밤새 1:10 혼합물(v/v)의 배양 배지 및 고정 완충액(20 mM HEPES, 1% 포름알데히드(pH 6.8))에 화학적으로 고정시켰다. 고정이 완료된 후 피펫을 사용하여 10-20 μL의 샘플을 유리 현미경 슬라이드에 적용하고 공기 건조시킵니다. Bunsen 버너를 사용하여 유리 슬라이드를 가열하여 공기 건조 샘플을 고정하십시오.
- 열 고정 후, 0.1% (m/v) 메틸렌 블루 (20% (v/v) 에탄올 중의 용액) 100 μL를 첨가하여 샘플을 염색한다. 염색된 슬라이드를 10분 동안 인큐베이션하고, 과량의 염료를dH2O로 세척한다. 이어서, 염색된 슬라이드를 오븐에서 60°C로 15-20분 동안 부드럽게 가열하여 세포를 공통 초점면으로 가져온다.
- 염색된 샘플을 현미경 커버슬립을 염색된 세포 위에 놓음으로써 밀봉한다. 그런 다음 현미경 슬라이드 시멘트를 사용하여 가장자리를 밀봉하십시오. 밀봉 된 현미경 슬라이드를 현미경 스테이지에 놓고 밝은 필드 현미경을 사용하여 이미지를 100x 배율로 초점으로 맞 춥니 다.
- 현미경 슬라이드에 침지 오일 한 방울을 놓고 1000x 배율을 사용하여 시야에 초점을 맞 춥니 다. 현미경 및 관련 소프트웨어에 부착 된 카메라를 사용하여 현미경 사진을 획득하십시오. 소프트웨어의 자동 화이트 밸런스 및 조리개 설정을 사용하여 이미지를 가져옵니다.
참고: 또는 오픈 소스 ImageJ 소프트웨어를 사용하여 이미지를 처리할 수 있습니다.
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Representative Results
마사리마이신은 B. subtilis 및 S. pneumoniae의 소분자 정균 억제제이며, B. subtilis35,37에서 엑소액 작용 GlcNAcase LytG를 억제하고 S. pneumoniae 37에서 세포벽을 표적으로 하는 것으로 나타났다. Masarimycin은 55 % -70 % 범위의 수율로 고전적 또는 전자 레인지 보조 유기 합성에 의해 효율적으로 제조 될 수 있습니다. 마이크로파 보조 합성은 화합물을 합성하는 데 걸리는 시간이 크게 단축되는 장점이 있다. 마이크로파 보조 합성은 비교 가능한 수율을 유지하면서 합성을 5-6 h (전통적인 합성)에서 2-3 h로 단축시킵니다. 플래시 크로마토그래피는 고순도의 마사리마이신의 신속한 정제를 제공한다(보충 그림 1-2). 대표적인 스펙트럼과 함께 1H및 13CNMR 스펙트럼으로부터의 구조적 할당이 보충 도면 3-4에 제공된다.
시너지 및 길항작용 스크린은 세포 성분들 사이의 기능적 연결(synergy)을 밝히고 약물 작용(antagonism)의 유전 네트워크 및 메카니즘을 조사하는 데 유용한 도구가 될 수 있다(antagonism)40. S. pneumoniae에서 ATPase 억제제 옵토신과의 상승작용/길항작용의 평가는 도 2에 제시되어 있다. 레사주린 마이크로타이터 플레이트 분석법(41)은 유기체의 성장/비성장의 쉬운 판독을 제공한다. 박테리아 성장을 억제하는 화합물의 최저 농도(청색)는 공동약의 존재 하에 MIC 값으로서 취해진다. 박테리아가 성장한 우물은 분홍색이 될 것입니다. 마사리마이신과 옵토친 사이의 관계는 프로토콜 단계 4.7의 방정식을 사용하여 분획 억제제 농도 지수 (FICI)를 계산함으로써 결정되었다. 마사리마이신-옵토신 상호작용에 대한 FICI 값은 1.5로 계산되며, 이는 공개된 표준(42)에 기초한 무관심한 관계를 나타낸다. 서브-MIC 농도에서 B. 서브틸리스에서 마사리마이신을 사용한 표현형 검정은 문헌32에서 보고된 ΔlytG 돌연변이체의 표현형과 상이하고, 다중 자가분해신 녹아웃(29)과 더욱 유사하게 유사한 소시지 유사 표현형(도 3B)을 제시하였다. 서브-MIC 농도에서 마사리마이신을 사용한 S. pneumoniae의 표현형 분석은 응집 표현형을 제시하였다(도 3D). 이러한 응집 표현형은 S. 폐렴 세포벽-작용 GlcNAcases43,44,45에 대해 보고된 것들과 구별된다.
도 1: 바실러스 서브틸리스로부터의 엑소작용 N-아세틸글루코사미니다제 LytG의 절단 부위를 나타내는 펩티도글리칸의 구조. 인셋은 LytG 억제제 마사리마이신의 구조를 나타낸다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: S. pneumoniae에서 masarimycin 및 optochin과의 길항적/상승적 관계를 탐구하기 위한 시너지 효과/Antagonism 분석. 파란색 또는 자주색은 박테리아 성장을 나타내지 않으며 분홍색은 박테리아 성장을 나타냅니다. 공동 약물의 존재하에있는 MIC는 박테리아 성장 (파란색)을 나타내지 않는 가장 낮은 농도로 취해집니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3: 형태학적 분석. 0.75x MIC (MIC B.subtilis = 3.8 μM 및 MICS.pneumoniae = 7.8 μM) 마사리마이신으로 처리하였을 때 B. subtilis (A,B) 및 S. pneumoniae (C,D)에 대한 형태학적 변화. 세포를 고정하고 0.1% (m/v) 메틸렌 블루로 염색하고, 1000x 배율로 오일 침지 하에서 밝은 필드 현미경으로 시각화하였다. 이 수치는 35에서 수정되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
보충 그림 1 : 수성 워크업 후 마사리 마이신의 대표적인 박층 크로마토그래피. 이동상은 90:10 헥산이다: 이소프로판올 및 요오드 증기는 반점 염색에 사용된다. Rf= 마사리마이신에 대해 0.3. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
보충 도 2: 마사리마이신의 정제를 위한 대표적인 플래쉬 크로마토그램. 대략 1.2 컬럼 부피에서의 피크는 마사리마이신을 함유한다. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
보충 도 3: CDCl3에 용해된 마사리마이신의 대표적인 1H NMR 은 400 MHz NMR 분광기에 기록되었다. 스펙트럼은 δ=7.26에서의 잔류 CHCl3 용매 피크를 참조한다. 화학적 이동 위의 녹색의 숫자는 마사리마이신 구조의 해당 위치에서의 양성자 할당을 나타냅니다 (삽입 참조). 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
보충 도 4: 100 MHz에서 CDCl3에 용해된 마사리마이신의 대표적인 13C NMR 스펙트럼. δ=77.36에서의 잔류 CHCl3 용매 피크를 참조하는 스펙트럼. 화학적 이동 위의 녹색의 숫자는 masarimycin 구조의 위치에서의 탄소 원자 할당을 나타냅니다 (삽입 참조). 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
보충 그림 5: B. subtilis에 대한 masarimycin의 대표적인 resazurin MIC 분석. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
마사리마이신은 B. subtilis35 및 S. pneumoniae37 성장의 단일 마이크로몰 정균 억제제이다. B. subtilis에서, 마사리마이신은 GlcNAcase LytG 35를 억제하는 것으로 나타났지만, S. pneumoniae의 세포벽에서 정확한 분자 표적은 확인되지 않았다37. 고전적인 유기 합성 또는 마이크로파 절차를 사용하여 마사리 마이신의 합성은 억제제를 좋은 수율과 높은 순도로 제공합니다. 마사리마이신의 낮은 수율은 전형적으로 사이클로헥실카르복스알데히드의 산화에 기인할 수 있다. 이를 극복하기 위해, 사이클로헥실 카르복스알데히드를 데시케이터의 불활성 분위기 하에 저장하는 것이 좋습니다. 상응하는 카르복실산에 대한 알데히드의 산화는 병에서 백색 고체로서 볼 수 있다. 사이클로헥실카르복스알데히드를 장기간 보관하지 않고 소량 구매하면 이 문제가 크게 줄어든다.
마사리마이신 구조의 NMR 할당은 다중 피크를 초래하는 o-iodophenyl 고리 주위의 아트로피소머뿐만 아니라 아미드 결합의 시스 및 트랜스 형태의 혼합물의 존재에 의해 복잡해진다. 이것은 양성자 화학적 이동이 1ppm 이상으로 확산되어 할당(35)을 복잡하게 만들 수 있다. 그 결과, 대표적인 스펙트럼과 함께 1H및 13CNMR 스펙트럼 둘 다에 대한 NMR 화학적 이동의 부분적 할당이 보충 도 3-4에 제공된다. 이성체의 혼합물로 인해 마사리마이신에 대해 1H 및 13C화학적 이동을 할당하는 데 어려움이 있는 경우, 2차원 NMR 실험을 사용할 수 있다. 상관 분광법 (COSY)은 양성자 스핀 시스템을 식별하는 데 사용할 수 있으며, 이종 핵 단일 양자 일관성 분광법 (HSQC) NMR 실험을 사용하여 양성자 - 탄소 단일 결합 상관 관계를 식별 할 수 있습니다. 일단 정제되면, 마사리마이신은 -20°C에서 오일로서 저장되거나 필요할 때까지 25 mM의 농도로 DMSO에 용해될 수 있다. 동결 - 해동 사이클의 수를 줄이기 위해 작은 분취량에 보관하는 것이 좋습니다. 화합물의 반복적 인 동결 - 해동 사이클 후에, 마사리마이신 원액은 TLC에 의해 검사되어 어떤 분해를 모니터링해야합니다.
시너지 및 길항작용 스크린은 경로 상호 작용을 식별하는 효과적인 전략이 될 수 있으며 소분자의 작용 방식을 이해하는 데 사용할 수 있습니다. 도 2 는 마사리마이신 및 ATPase 억제제 옵토친을 사용하는 S. pneumonia R6과의 상승작용/길항작용 분석의 예를 보여준다( B. subtilis 에서의 상승작용/길항작용 스크리닝은 여전히 진행중인 조사임에 유의하라). 재현성을 위해, 제2 계대 세포를 사용하였고,0.4 이하의 OD600nm 로 성장시켰다. 1.5의 FICI 가 마사리마이신과 옵토친 사이의 상호작용에 대해 관찰되었으며, 이는 항생제 쌍 사이의 무관심한 관계를 나타낸다. 마사리마이신과 옵토친 사이의 무관심한 관계는 이들 항생제가 표적으로 하는 경로 사이의 명백한 상호작용을 나타내지 않는다. 이러한 분석은 약물 상호작용에 대한 유용한 정보를 제공할 수 있지만, 시너지 효과/길항작용 분석은 생물학적 반복실험 및 배당률42에 의해 설명된 바와 같이 보다 보존적인 컷오프의 사용으로 실행되어야 한다는 점에 유의하는 것이 중요하다. 이것은 관찰 된 사소한 상승 작용 또는 적대적인 관계의 과도한 해석을 방지하는 데 도움이됩니다.
sub-MIC 마사리마이신으로 처리된 B. subtilis 세포의 표현형 분석(도 3B)은 lytG32의 유전적 결실에 대해 보고된 표현형과 상이한 표현형을 나타내며, 다중 자가분해신 결실을 갖는 B. 서브틸리스 균주의 표현형과 더욱 밀접하게 유사하다(29). 표현형에서의 이러한 불일치는 LytG의 시험관내 억제가35로 demontrated 된 반면, ΔlytG 돌연변이체는 관찰 가능한 표현형32를 갖지 않기 때문에 흥미 롭습니다. 이러한 불일치는 부분적으로 유전 및 화학적 불활성화의 차이에 의해 설명될 수 있다(46,47). LytG의 화학적 또는 유전 적 불활성화의 관찰 된 차이는 현재 조사중인 흥미로운 질문입니다. S. 폐렴균 마사리마이신으로 처리된 세포는 상응하는 GlcNAcase (GH73, 클러스터 2) LytB 37,43,44,48의 유전적 결실과 구별되는 표현형(도 3D)을 제시하였다. 이러한 형태학적 불일치는 작용 방식을 할당하거나 소분자 억제제의 생물학적 표적을 귀속시키는 데 있어 도전을 강조한다. 형태학적 표현형은 세포벽 작용 효소의 단일 유전적 결실 또는 화학적 불활성화 이외의 보다 복잡한 상호작용 세트로부터 발생할 수 있다. 이러한 메타표현형(34)은 직접적(효소(들)의 부족) 또는 간접적(조절제의 손실) 메카니즘을 통한 복잡한 상호작용으로부터 발생할 수 있다.
우리가 아는 한, 마사리마이신은 박테리아 성장의 억제를 보여주는 박테리아 자동 분해의 첫 번째 억제제입니다 (보충 그림 5). 그것은 B. subtilis 및 S.pneumoniae에서 성장의 좁은 스펙트럼 정균 억제제입니다. 이 좁은 스펙트럼은 그람 양성과 그람 음성 유기체 사이의 세포벽 대사에 대한 다중 종 비교 연구의 한계입니다. 이러한 좁은 스펙트럼은 부분적으로 그람 양성(GlcNAcase)과 그람 음성(용균성 트랜스글리코실라제) 유기체 사이의 식물 성장 동안 사용되는 일부 글리코실 가수분해효소 자가분해효소의 차이에 기인한다. PG 자가분해신을 억제하기 위해 마사리마이신과 같은 소분자 억제제를 사용하여, 특히 GlcNAcase는 자가분해신 기능을 해명하기 위한 전통적인 유전학에 대한 직교 접근법을 제공할 수 있다. Masarimycin은 하나 이상의 종 (B. subtilis 및 S. pneumoniae)에서 사용될 수 있다는 점에서 일부 화학 생물학 방법에 비해 뚜렷한 이점을 가지고 있습니다. 그것은 막대 모양 (B. subtilis) 및 coccoid (S. pneumoniae) 종. S. pneumoniae에서 덜 공동 조절된 세포벽 대사 및 분열은 막대 모양의 종49,50의 더 엄격하게 조절된 시스템에서 카운터 포인트를 제공한다. 이 기술의 향후 적용은 S.pneumoniae에서 분자 표적을 확인하고 S.pneumoniae와 B. subtilis에서 autolysins의 유전 적 및 화학적 불활성화 사이의 차이점을 탐구하는 것입니다.
프로토콜의 중요한 단계
생물학적 및 생화학 적 분석에서 마사리 마이신의 효과적인 농도에주의를 기울이는 것이 중요합니다. 소수성 특성으로 인해 250μM 이상의 농도( B. subtilis의 65x MIC)는 생물학적 데이터의 해석에 영향을 줄 수 있는 용해도 및 응집 문제를 초래할 수 있습니다. 모든 실험에서 비히클(즉, DMSO)의 효과에 대해 적절하게 제어하는 것이 필수적이다.
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Disclosures
Reid, C. W.는 masarimycin의 특정 응용 프로그램과 관련된 지적 재산권을 보유하고 있습니다.
Acknowledgments
연구는 국립 과학 재단 (National Science Foundation)의 보조금 번호 2009522에 의해 지원되었습니다. 마사리마이신에 대한 NMR 분석은 국립 과학 재단의 주요 연구 계측 프로그램 어워드에 의해 보조금 번호 1919644에 의해 지원되었다. 이 자료에 표현 된 의견, 결과 및 결론 또는 권장 사항은 저자의 의견이며 반드시 국립 과학 재단의 견해를 반영하지는 않습니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2-Iodobenzoic acid | SIGMA-ALDRICH | I7675-25G | corrosive, irritant, light yellow to orange-brown powder |
| 2-Propanol | SIGMA-ALDRICH | 109827-4L | flammable, irritant, colorless liquid |
| Acetonitrile | SIGMA-ALDRICH | 34851-4L | flammable, irritant, colorless liquid |
| Aluminum backed silica plates | Sorbtech | 4434126 | silica gel XG F254 on aluminum backed plates |
| chloroform-d | SIGMA-ALDRICH | 151823-50G | solvent for NMR |
| Compact Mass Spectrometer | Advion-Interchim | Advion CMS | compact mass spectrometer equiped with APCI source and atmospheric solids analysis probe |
| Corning Costar 96 well flat bottom plates-sterile | fisher chemical | 07-200-90 | for synergy/antagonism assays |
| cover slips | fisher chemical | 12-547 | for microscopy |
| Cyclohexanecarboxaldehyde | CHEM-IMPEX INT'L INC. | 24451 | flammable, irritant, colorless to pink liquid |
| Cyclohexyl isocyanide | SIGMA-ALDRICH | 133302-5G | irritant, colorless liquid, extremly unpleasant odor |
| Cyclohexylamine | SIGMA-ALDRICH | 240648-100ML | corrosive, flammable, irritant, colorless liquid unless contaminated |
| Ethyl acetate | SIGMA-ALDRICH | 537446-4L | flammable, irritant, colorless liquid |
| flash silica cartridge (12g) | Advion-Interchim | PF-50SIHP-F0012 | pack of flash silica columns (12g) for purification of masarimycin |
| formaldehyde | SIGMA-ALDRICH | F8775-25ML | fixing agent for microscopy |
| HEPES | SIGMA-ALDRICH | H8651-25G | buffer for microscopy fixing solution |
| Hexane, mixture of isomers | SIGMA-ALDRICH | 178918-4L | environmentally damaging, flammable, irritant, health hazard, colorless liquid |
| High performance compact mass spectrometer | Advion | expression | Atmospheric Solids Analysis Probe (ASAP), low resolution |
| High Vac | eppendorf | Vacufuge plus | vacuum aided by centrifugal force and temperature |
| Hydrochloric acid | SIGMA-ALDRICH | 258148-2.5L | corrosive, irritant, colorless liquid |
| hydrochloric acid | SIGMA-ALDRICH | 320331-2.5L | strong acid |
| immersion oil | fisher chemical | 12-365-19 | for microscopy |
| Iodine, resublimed crystals | Alfa Aesar | 41955 | environmentally damaging, irritant, health hazard, dark grey/purple crystals |
| Mestre Mnova | MestreLab Research | software for processing NMR spectra | |
| Methanol | SIGMA-ALDRICH | 439193-4L | flammable, toxic, health hazard, colorless liquid |
| methylene blue | SIGMA-ALDRICH | M9140-25G | microscopy stain for staining cell walls |
| meuller-hinton agar plates + 5% sheep blood | fisher chemical | B21176X | growth media for Streptococcus pneumoniae |
| meuller-hinton broth | fisher chemical | DF0757-17-6 | growth media for Streptococcus pneumoniae |
| microscope slides | fisher chemical | 22-310397 | for microscopy |
| Microwave Synthesis Labstation | MILESTONE | START SYNTH | device that requires the ventilation of a fume hood, equipped with synthesis carousel |
| NMR tubes | SIGMA-ALDRICH | Z562769-5EA | 5mm NMR tubes 600 MHz |
| Nuclear Magnetic Resonance (NMR) | Bruker | Ascend 400 | large superconducting magnet (400MHz) |
| optochin | fisher chemical | AAB21627MC | ethylhydrocupreine hydrochloride |
| petrie plates | Celltreat | 229695 | for preparing agar plates for bacterial growth |
| Primo Star Bright field/Phase contrast Microscope with ERc5s camera | Zeiss | for morphology studies | |
| puriFlash | interchim | XS520plus | flash chromatography purification system |
| resazurin | SIGMA-ALDRICH | R7017-1G | for synergy/antagonism assays |
| Rotary Evaporator | Heidolph | Hei-VAP Value "The Collegiate" | solvent evaporator |
| Sodium bicarbonate | SIGMA-ALDRICH | S6014-500G | irritant, white powder |
| Sodium chloride | fisher chemical | S271-1 | crystalline, colorless |
| Sodium chloride | SIGMA-ALDRICH | S5886-500G | for growth of B.subtilis and preparation of LB media |
| Sodium sulfate | SIGMA-ALDRICH | 7985592-500G | anhydrous, granular, white |
| tryptone | fisher chemical | BP1421-500 | for growth of B.subtilis and preparation of LB media |
| Whitney DG250 Workstation | Microbiology International | DG250 | anaerobic workstation. Anaerobic gas mixture used: 5% hydrogen, 10% carbon dioxide, balance nitrogen |
| yeast extract | fisher chemical | BP1422-500 | for growth of B.subtilis and preparation of LB media |
| Zen Lite (blue) software | Zeiss | for acquiring micrographs |
References
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