Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

Syntese af Masarimycin, en lille molekylehæmmer af grampositiv bakterievækst

Published: January 7, 2022 doi: 10.3791/63191
Automatic Translation
1, 1, 1,2
1Department of Science and Technology, Bryant University, 2Center for Health and Behavioral Sciences, Bryant University

Summary

En detaljeret protokol præsenteres til fremstilling af det bakteriostatiske diamid masarimycin, en lille molekylesonde, der hæmmer væksten af Bacillus subtilis og Streptococcus pneumoniae ved at målrette cellevægnedbrydning. Dens anvendelse som en kemisk sonde er påvist i synergi / antagonisme assays og morfologiske undersøgelser med B. subtilis og S. pneumoniae.

Abstract

Peptidoglycan (PG) i bakteriernes cellevæg er en unik makromolekylær struktur, der giver form og beskyttelse mod det omgivende miljø. Centralt for at forstå cellevækst og -deling er viden om, hvordan PG-nedbrydning påvirker biosyntese og cellevægssamling. For nylig er den metaboliske mærkning af PG gennem introduktion af modificerede sukkerarter eller aminosyrer blevet rapporteret. Mens kemisk forhør af biosyntetiske trin med små molekylehæmmere er mulig, er kemiske biologiske værktøjer til at studere PG-nedbrydning af autolysiner underudviklede. Bakterielle autolysiner er en bred klasse af enzymer, der er involveret i den tæt koordinerede nedbrydning af PG. Her præsenteres en detaljeret protokol til fremstilling af en lille molekylesonde, masarimycin, som er en hæmmer af N-acetylglucosaminidase LytG i Bacillus subtilis og cellevægsmetabolisme i Streptococcus pneumoniae. Fremstilling af inhibitoren via mikrobølgeassisteret og klassisk organisk syntese tilvejebringes. Dens anvendelighed som et redskab til at studere gram-positiv fysiologi i biologiske assays præsenteres.

Introduction

Peptidoglycan (PG) er en mesh-lignende polymer, der afgrænser celleform og struktur i både Gram-positive og Gram-negative bakterier 1,2. Denne heteropolymer er en matrix af aminosukker, der er tværbundet af korte peptider 3,4,5,6 med en rygrad sammensat af β(1,4)-bundne vekslende N-acetylglucosamin (GlcNAc) og N-acetylmuraminsyre (MurNAc) rester (figur 1)1. Vedhæftet til C-3 lactyl moiety af MurNAc er stammepeptidet. Metabolismen af PG involverer et tæt koordineret system af biosyntetiske og nedbrydende enzymer til at inkorporere nyt materiale i cellevæggen 7,8. Nedbrydning af PG udføres af enzymer, der kollektivt betegnes som autolysiner9 og yderligere klassificeres baseret på specificiteten af den spaltede binding. Autolysiner deltager i mange cellulære processer, herunder cellevækst, celledeling, bevægelighed, PG-modning, kemotaxis, proteinsekretion, genetisk kompetence, differentiering og patogenicitet10,11. Unraveling de specifikke biologiske funktioner af individuelle autolysiner kan være skræmmende, delvis på grund af funktionel redundans. Nylige biofysiske 8,12,13 og beregningsmæssige undersøgelser12 har imidlertid givet ny indsigt i deres roller i PG-metabolisme. Derudover har nylige rapporter givet yderligere indsigt i syntesen14 og membranmedieret 15,16,17 trin i PG-metabolisme. En grundig forståelse af forholdet mellem nedbrydende og syntetiske veje for PG-metabolisme kan give anledning til tidligere uudnyttede antibiotikamål.

Mens der har været betydelige fremskridt i metodologi til undersøgelse af glykobiologi i eukaryoter, har bakteriel glykobiologi og især PG-metabolisme ikke udviklet sig med en lignende hastighed. Nuværende kemiske tilgange til undersøgelse af PG-metabolisme omfatter fluorescerende mærkede antibiotika18, fluorescerende sonder19,20 og metabolisk mærkning 21,22,23,24. Disse nye tilgange giver nye måder at forhøre bakteriel cellevægmetabolisme på. Mens nogle af disse strategier er i stand til at mærke PG in vivo, kan de være artsspecifikke19 eller kun arbejde i stammer, der mangler en bestemt autolysin25. Mange PG-mærkningsstrategier er beregnet til brug med isolerede cellevægge26 eller med in vitro-rekonstituerede PG-biosynteseveje 20,27,28. Anvendelsen af fluorescerende mærkede antibiotika er i øjeblikket begrænset til biosyntetiske trin og transpeptidering18.

Den nuværende viden om bakterielle autolysiner og deres rolle i cellevægsmetabolisme kommer fra genetisk og in vitro biokemisk analyse 11,29,30,31,32. Mens disse tilgange har givet et væld af oplysninger om denne vigtige klasse af enzymer, kan det være udfordrende at dechiffrere deres biologiske rolle. På grund af funktionel redundans33 resulterer sletning af en autolysin f.eks. i de fleste tilfælde ikke i at standse bakterievæksten. Dette er på trods af deres underforståede rolle i cellevækst og deling 7,12. En anden komplikation er, at genetisk deletion af bakterielle autolysiner kan give anledning til metafænotyper34. Metafænotyper opstår fra det komplekse samspil mellem den vej, der påvirkes af den genetiske deletion og andre indbyrdes forbundne veje. For eksempel kan en metafænotype opstå via en direkte effekt som manglen på et enzym eller en indirekte effekt såsom en forstyrrelse af regulatorer.

I øjeblikket er der kun få hæmmere af glycosidase autolysiner, såsom N-acetylglucosaminidaser (GlcNAcase) og N-acetylmuramidaser, som kan bruges som kemiske sonder til at studere nedbrydningen af PG. For at imødegå dette er diamidmasarimycin (tidligere betegnet som fgkc) blevet identificeret og karakteriseret35 som en bakteriostatisk hæmmer af Bacillus subtilis vækst, der er rettet mod GlcNAcase LytG32 (figur 1). LytG er en exo-virkende GlcNAcase36, et medlem af klynge 2 inden for glycosylhydrolasefamilie 73 (GH73). Det er den største aktive GlcNAcase under vegetativ vækst32. Så vidt vi ved, er masarimycin den første hæmmer af en PG-virkende GlcNAcase, der hæmmer cellulær vækst. Yderligere undersøgelser af masarimycin med Streptococcus pneumoniae viste, at masarimycin sandsynligvis hæmmer cellevægsmetabolismen i denne organisme37. Her rapporteres fremstillingen af masarimycin til brug som kemisk biologisk sonde til undersøgelse af fysiologi i de grampositive organismer B. subtilis og S. pneumoniae. Eksempler på morfologisk analyse af sub-minimum hæmmende koncentrationsbehandling med masarimycin samt et synergi/antagonisme-assay præsenteres. Synergi og antagonisme assays ved hjælp af antibiotika med veldefinerede virkningsmåder kan være en nyttig måde at udforske forbindelser mellem cellulære processer 38,39,40.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Generelle metoder

BEMÆRK: Alle forbindelser blev købt hos standardleverandører og brugt uden yderligere rensning.

  1. Udfør tyndtlagskromatografi (TLC) på en aluminiumsplade forbelagt med silicagel XG F254. Registrer pletter under en UV-lampe, ved nedsænkning i p-anisaldehydplet eller ved at udsætte for I2-damp.
  2. Optag alle NMR-spektre (nuclear magnetic resonance) på et 400 MHz spektrometer.
    BEMÆRK: 1H-NMR og 13C-NMR-spektre blev refereret til resterende opløsningsmiddeltoppe. Koblingskonstanter er angivet i [Hz] og kemiske skift i [ppm].
  3. Optag atmosfærisk tryk kemisk ionisering (APCI) massespektrometrispektre af masarimycin på et kompakt massespektrometer udstyret med en atmosfærisk faststofanalysesonde.

2. Generel procedure for fremstilling af masarimycin

BEMÆRK: Udfør nedenstående trin i en stinkhætte.

  1. Der fremstilles en 0,1 M opløsning i methanol af hver reaktant: cyclohexylamin, cyclohexylcarboxaldehyd, o-iodobenzoesyre og cyclohexylisocyanid35.
    FORSIGTIG: Cyclohexylamin, cyclohexylisocyanid og cyclohexylcarboxaldehyd er brandfarlige. De kan forårsage hudætsning og fremkalde oral, dermal, respiratorisk eller reproduktiv toksicitet. Hold forbindelser væk fra åben ild, varme overflader og antændelseskilder. Brug passende hud- og øjenbeskyttelse, arbejd i et godt ventileret område og undgå indånding af dampe eller tåge. Til opbevaring skal du holde flaskerne tæt lukket og opbevare dem på et køligt, tørt sted. Opbevar cyclohexylcarboxaldehyd i en ekssikkator under enN2-atmosfære .
  2. 5 ml cyclohexylamin (0,1 M opløsning i methanol) og 5 ml cyclohexylcarboxaldehyd (0,1 m i methanol) blandes i en rundbundet kolbe med lås, og opløsningen omrøres ved hjælp af en magnetisk omrøringsstang på en omrøring/kogeplade i 30 minutter ved 40 °C i et sandbad. Overvåg temperaturen ved hjælp af et termometer placeret ca. 1 cm under sandoverfladen.
  3. Efter 30 minutter tilsættes 5 ml cyclohexylisocyanid (0,1 M opløsning i methanol) til opløsningen fra trin 2.2 og omrøres i yderligere 20 minutter ved 50 °C. Til sidst tilsættes 5 ml o-iodobenzoesyre (0,1 M opløsning i methanol) til reaktionsblandingen og omrøres ved 55 °C i 3-5 timer.
  4. Reaktionens forløb overvåges med jævne mellemrum med TLC ca. hver time, efter at ovennævnte reaktionsblanding var blevet omrørt i 3 timer.
  5. Skær en 3 cm x 6 cm strimmel af aluminiumsstøttet TLC-plade. Brug en blyant nr. 2 til at tegne en linje ca. 1 cm fra bunden. Ved hjælp af en glasmikrokapillær anspottes ca. 5 μL af reaktionsblandingen på TLC-pladen og lades tørre.
  6. Til et bægerglas på 150 ml tilsættes nok mobil fase (90:10 hexan: isopropanol) til at dække bunden af bægerglasset. Brug et par pincet til forsigtigt at placere ovennævnte TLC-plade i bægerglasset, så det sikres, at TLC-pladen kommer jævnt ind i den mobile fase. Dæk toppen af bægerglasset med et stykke sølvpapir.
    BEMÆRK: Sørg for, at den mobile fase ikke dækker linjen og plettet prøve.
  7. Lad den mobile fase bevæge sig op ad TLC-pladen, indtil den er ca. 1 cm under toppen af pladen. Fjern TLC-pladen, og tegn en linje med en blyant, der angiver den tilbagelagte afstand af den mobile fase. Lad TLC-pladen tørre i en stinkhætte.
  8. Når den er tørret, anbringes TLC-pladen i et bægerglas, der indeholder en lille mængde fast I2 , og bægerglasset dækkes med et stykke stannifoli. Overvåg TLC for udvikling af gule/brune pletter. Når den er udviklet, skal du fjerne TLC-pladen og markere placeringen af pletterne ved hjælp af en blyant (supplerende figur 1).
    BEMÆRK: Hvis I2 pletter ikke er markeret, vil pletten forsvinde over tid. Pletter kan også visualiseres på TLC-pladen ved UV-lys, p-anisaldehydfarvning eller kaliumpermanganatfarvning (se Supplerende oplysninger).
  9. Beregn Rf-værdier for alle visualiserede pletter ved hjælp af følgende formel:
    Rf = Equation 1
  10. Betragt reaktionen som fuldført, når kun ét sted med Rf = 0,3 er synligt på TLC-pladen. Fjern opløsningsmidlet i en roterende fordamper under reduceret tryk, og tør råproduktet (opnået som en gulbrun olie) under et højt vakuum, indtil al methanol er fordampet.
  11. Det tørrede råprodukt opløses i 30 ml ethylacetat og overføres til en separatistragt. Ethylacetat ekstraherest sekventielt med 1 M HCl (2 x 30 ml),H20(30 ml), mættet NaHCO3-opløsning (2 x 30 ml),H20(30 ml) og mættet NaCl-opløsning (2 x 30 ml). Kassér de vandige lag.
    BEMÆRK: Ethylacetatlaget er det øverste lag i hver af ekstraktionerne. For hver ekstraktion rystes kraftigt den separationstragt, der indeholder ethylacetat og vandig opløsning (HCI,H20,NaHCO3 eller NaCl), og lad lagene adskilles fuldstændigt.
  12. Ethylacetatlaget fjernes fra separationstragten, og det opsamles i en Erlenmeyer-kolbe. Der tilsættes en spatel fuld af Na2SO4 (vandfri) for at fjerne resterende vand fra ethylacetat.
    BEMÆRK: Ethylacetatopløsningen betragtes som tør, når Na2SO4 i kolben løber frit og ikke klumper sig sammen. Hvis Na2SO4 klumper sammen, kan der tilføjes en ekstra spatel med Na2SO4.
  13. Den tørrede ethylacetatopløsning filtreres gennem filterpapir nr. 1 for at fjerne Na2SO4. Vask filterpapiret med en lille mængde ethylacetat. Den filtrerede ethylacetatopløsning anbringes i en rund bundkolbe, og opløsningsmidlet fjernes på en roterende fordamper under reduceret tryk for at opnå masarimycin som olie, når alt ethylacetat er fjernet.
  14. Masarimycinolien, der er opnået ovenfor, opløses i en minimal mængde (1-2 ml) på 9:1 hexan: isopropanol og omrøres på en magnetisk omrøringsplade, indtil hele forbindelsen er opløst.
  15. Rens den opløste masarimycin ved flashkromatografi ved hjælp af en 12 g normalfase silica flash søjle.
    1. Flashkolonnen udlignes med 10 kolonnevolumener af mobil fase (99:1 hexan: isopropanol) med instrumentet indstillet til en strømningshastighed på 15 ml/min.
      BEMÆRK: Når ligevægten er afsluttet, skal du stoppe flowet og frakoble toppen af søjlen fra systemet.
    2. Træk opløst masarimycin op ved hjælp af en 5 ml sprøjte. Tilslut sprøjten direkte til toppen af den ligevægtede flashsøjle og injicer opløsningen i søjlen. Tilslut den indlæste kolonne til flashkromatografisystemet igen, og start gradientelueringen.
    3. Elute masarimycin fra kolonnen ved hjælp af gradienteluering til en endelig mobil fasekoncentration på 10:90 hexan: isopropanol over 12 kolonnevolumener. Overvåg elueringen af masarimycin via absorption ved 230 og 254 nm.
    4. Saml de forbindelser, der elueres fra søjlen af en fraktionsopsamler, der samler 20 ml opløsningsmiddel pr. Fraktion.
      BEMÆRK: Hvis et flashkromatografisystem ikke er tilgængeligt, kan oprensning af masarimycin udføres via en tyngdekraftsilicasøjle med en 3:1 (hexan: ethylacetat) mobil fase. Fraktioner, der indeholder masarimycin, kan identificeres ved TLC ved hjælp af den samme mobile fase. Visualisering af TLC-pletter blev udført med enten UV-lys, I2 damp eller kaliumpermanganatfarvning.
    5. Identificer fraktioner, der indeholder masarimycin ved TLC (trin 2.5-2.9) eller massespektrometri på et kompakt massespektrometer udstyret med en atmosfærisk faststofanalysesonde. Tør slutproduktet under vakuum (~ 0,3 mbar).
      BEMÆRK: Masarimycin opnås rutinemæssigt som en farveløs olie eller et fast stof med et udbytte på 55% -70% med hensyn til mmol cyclohexylcarboxaldehyd tilsat reaktionen. Beregn det endelige udbytte af masarimycin ved at opnå massen af den rensede masarimycin og beregne det teoretiske udbytte af reaktionen ved hjælp af følgende formel:
      % udbytte = Equation 2 x 100%
  16. Bekræft strukturen af masarimycin af NMR.
    1. Opløs ~10 mg masarimycinprøve i 0,5 mlCDCl3. Brug en Pasteur-pipet til at overføre opløsningen til et 5 mm NMR-rør og dække røret. Anbring NMR-røret i spektrometeret.
    2. Anskaf 1H og 13C NMR-spektre ved hjælp af producentens forudindstillede eksperimenter. Kemiske skiftopgaver og repræsentative spektre findes i supplerende figur 3-4.
  17. Masarimycin opbevares tørt eller opløst i DMSO (25 mM endelig koncentration) ved -20 °C indtil brug.

3. Mikrobølgeprocedure til fremstilling af masarimycin

  1. Der fremstilles 0,6 M opløsninger af cyclohexylamin, cyclohexylcarboxaldehyd, cyclohexylisocyanid og o-iodobenzoesyre i acetonitril.
  2. Tilsæt en omrøringsstang og 10 ml acetonitril til et hætteglas med mikrobølgereaktion i glas.
  3. Der tilsættes 2 ml cyclohexylamin (0,6 M i acetonitril), 2 ml cyclohexylcarboxaldehyd (0,6 m i acetonitril) og 7 ml acetonitril til hætteglasset.
  4. Anbring mikrobølgereaktionshætteglasset i mikrobølgekarrusellen. Rør blandingen, opvarm den i 30 minutter ved 50 ° C ved en effektindstilling på 400 W, og lad den køle af til stuetemperatur.
  5. Der tilsættes 2 ml o-iodobenzoesyre (0,6 m i methanol) og 2 ml cyclohexylisocyanid (0,6 m i acetonitril) til hætteglasset. Rør blandingen, opvarm den til 100 °C i mikrobølgeovnen i 40 minutter ved en effektindstilling på 400 W, og lad den køle af til stuetemperatur.
  6. Overvåg reaktionens fremskridt med TLC (90:10 hexan: isopropanol) ved anvendelse afI2-damp efter afslutningen af trin 3.5.
    BEMÆRK: Hvis TLC viser, at reaktionen er ufuldstændig (dvs. flere pletter på TLC), skal du placere reaktionshætteglasset tilbage i mikrobølgeovnen og indstille mikrobølgebetingelserne beskrevet i trin 3.5.
  7. Når reaktionen er afsluttet, hældes opløsningen i en 100 ml rundbundet kolbe og fordampes til tørhed ved hjælp af en roterende fordamper.
  8. Følg trin 2.6-2.16 ovenfor for at fuldføre den vandige rensning, oprensning og karakterisering af masarimycin.

4. Synergi og antagonisme assay

  1. Dyrk Streptococcus pneumoniae R6 på Mueller-Hinton (MH) agarplader indeholdende 5 % (v/v) fåreblod ved 37 °C under anaerobe forhold. I alle forsøg skal du bruge anden passageceller dyrket i 5 ml MH-bouillon ved 37 ° C under anaerobe forhold, indtil OD600 er ~ 0,4.
  2. Hæmmerne masarimycin og optochin underkastes serielle 1:2-fortyndinger i de respektive opløsningsmidler, hvor de resulterende koncentrationer flankerer minimumsværdierne for hæmmende koncentration (MIC) for hver hæmmer.
    1. Foretag den indledende fortynding af masarimycin i dimethylsulfoxid (DMSO), indtil en koncentration på 100 μM er nået. Fra dette tidspunkt laves masarimycinfortyndinger i MH bouillon. Optochin-stamopløsning (3,5 mM) fremstilles ved at opløse kommercielt tilgængelig optochin (se materialetabel) i steril MH-bouillon.
      BEMÆRK: Masarimycin stamopløsninger blev fremstillet ved 25 mM i DMSO.
  3. Til en steril mikrotitreplade med 96 brønde tilsættes 2 μL alikvoter af hver optochinfortynding til hver række af pladen. Til den samme plade tilsættes 2 μL alikvoter af hver masarimycinfortynding til hver kolonne for at skabe en række optochin- og masarimycinkoncentrationer på pladen (figur 2).
  4. Tilsæt steril MH bouillon (93 μL) til hver brønd indeholdende ovennævnte hæmmere. Inokuler mikroterepladerne med 5 μL kultur (OD600 ~ 0,4) fra trin 4.1.
    BEMÆRK: Podning af pladen med 96 brønde udføres typisk under anaerobe forhold på en anaerob arbejdsstation. Det endelige volumen i brønden er 100 μL.
  5. Dyrkningskulturer i 18 timer ved 37 °C under anaerobe forhold efterfulgt af tilsætning af 30 μL 0,01 % (m/v) opløsning af resazurinnatriumsalt. Inkuber pladen ved stuetemperatur i 15 minutter for at muliggøre dannelse og stabilisering af farve.
    BEMÆRK: Resazurinopløsning fremstilles ved opløsning af forbindelsen i destilleret vand og kan opbevares ved 4 °C i op til to uger.
  6. Direkte aflæs koncentrationsværdierne fra pladen og tildel den laveste inhibitorkoncentration, for hvilken der ikke observeres nogen bakterievækst (blå farve) som [X] (se trin 4.7.1), dvs. den laveste hæmmende koncentration af lægemidlet i nærvær af co-lægemidlet.
    BEMÆRK: Positiv bakterievækst identificeres i brøndene ved, at resazurinfarvestoffet bliver lyserødt. MIC-værdier for hvert lægemiddel alene (dvs. i mangel af co-drug) bestemmes på samme måde ved anvendelse af resazurin MIC-assay35 med hvert lægemiddel separat (supplerende figur 5). IC'er i S. pneumoniae er 7,8 μM og 15,85 μM for henholdsvis masarimycin og optochin.
  7. Bestem den fraktionerede hæmmende koncentration (FIC) og FIC-indekset (FICI) ved hjælp af følgende ligninger.
    1. FIC= [X]/MICx, hvor [X] (fra trin 4.6) er den laveste hæmmende koncentration af lægemidlet i nærvær af co-lægemidlet, og MICx er den laveste hæmmende koncentration af lægemidlet i fravær af co-lægemidlet.
    2. FICI = FICmasarimycin + FICantibiotikum
      BEMÆRK: FICI < 0,5 = synergistisk, 0,5 < FICI < 1 = additiv, 1 < FICI < 4 = ligeglad, FICI > 4 = antagonistisk.

5. Morfologisk undersøgelse

  1. Grow Bacillus subtilis 11774 på Luria-Bertani (LB) agarplader (10 g/l tryptone, 5 g/l gærekstrakt og 5 g/l NaCl) indeholdende 1,5 % Bacto agar ved 37 °C. I alle forsøg skal du bruge anden passageceller dyrket i 5 ml LB bouillon ved 37 ° C indtil OD600 = 1. Voks S.pneumoniae på samme måde som i trin 4.1.
  2. Efter opnåelse af en cellekulturtæthed med OD600nm = 1 for B. subtilis eller OD600nm = 0,4 for S. pneumoniae, tilsættes masarimycin ved hjælp af en pipette til kulturrøret mærket "behandlet" til en endelig koncentration på 3,8 μM (0,75x MIC for B.subtilis) eller 5,85 μM (0,75x MIC for S.pneumoniae). Til det andet kulturrør mærket "kontrol" tilsættes et tilsvarende volumen DMSO.
  3. For B.subtilis anbringes prøverne i en inkubator ved 37 °C i 90 minutter med rystelser ved 150 o/min. For S. pneumoniae inkuberes cellerne uden at ryste under anaerobe forhold.
  4. Efter 90 minutter fastgøres kulturerne kemisk i en 1:10 blanding (v/v) af kulturmedier og fikseringsbuffer (20 mM HEPES, 1% formaldehyd (pH 6,8)) ved 4 °C natten over. Når fastgørelsen er afsluttet, påføres 10-20 μL prøver på glasmikroskopdias ved hjælp af en pipette og lad dem lufttørre. Fastgør de lufttørrede prøver ved at opvarme glasglider ved hjælp af en Bunsen-brænder.
  5. Efter varmefiksering, pletprøver med tilsætning af 100 μL 0,1% (m/v) methylenblåt (opløsning i 20% (v/v) ethanol). Inkuber de farvede dias i 10 minutter og vask det overskydende farvestof væk med dH2O. Opvarm derefter forsigtigt de farvede dias til 60 ° C i en ovn i 15-20 minutter for at bringe cellerne til et fælles brændplan.
  6. Forsegl de farvede prøver ved at placere et mikroskopdæksler over de farvede celler. Forsegl derefter kanterne ved hjælp af mikroskop glidecement. Placer det forseglede mikroskopdias på mikroskopscenen, og bring billedet i fokus ved 100x forstørrelse ved hjælp af lysfeltmikroskopi.
  7. Placer en dråbe nedsænkningsolie på mikroskopets dias, og bring synsfeltet i fokus ved hjælp af 1000x forstørrelse. Erhverv mikrografer ved hjælp af et kamera, der er fastgjort til mikroskopet og dets tilhørende software. Hent billeder ved hjælp af indstillingerne for automatisk hvidbalance og blænde på softwaren.
    BEMÆRK: Alternativt kan billeder behandles ved hjælp af open source ImageJ-softwaren.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Masarimycin er et lille molekyle bakteriostatisk hæmmer af B. subtilis og S. pneumoniae og har vist sig at hæmme den exo-virkende GlcNAcase LytG i B. subtilis35,37 og målrette cellevæggen i S. pneumoniae37. Masarimycin kan fremstilles effektivt enten ved den klassiske eller mikrobølgeassisterede organiske syntese med udbytter i intervallet 55%-70%. Mikrobølgeassisteret syntese har fordelen ved en signifikant reduktion i tid til at syntetisere forbindelsen. Mikrobølgeassisteret syntese forkorter syntesen fra 5-6 timer (traditionel syntese) til 2-3 timer, samtidig med at sammenlignelige udbytter opretholdes. Flashkromatografi giver en hurtig oprensning af masarimycin i høj renhed (supplerende figur 1-2). Strukturelle opgaver fra 1H og 13C NMR spektre sammen med repræsentative spektre findes i supplerende figur 3-4.

Synergi- og antagonismeskærme kan være et nyttigt redskab til at afsløre funktionelle forbindelser mellem cellulære komponenter (synergi) og til at undersøge genetiske netværk og mekanismer for lægemiddelvirkning (antagonisme)40. Evaluering af synergi/antagonisme med ATPasehæmmeren optochin i S. pneumoniae fremgår af figur 2. Resazurin microtitre pladeassay41 giver en let aflæsning af organismens vækst/ ikke-vækst. Den laveste koncentration af forbindelse til at hæmme bakterievækst (blå farve) tages som MIC-værdien i nærvær af et co-lægemiddel. Brønde med bakterievækst vil være lyserøde i farven. Forholdet mellem masarimycin og optochin blev bestemt ved beregning af det fraktionerede inhibitorkoncentrationsindeks (FICI) ved hjælp af ligninger i protokoltrin 4.7. FICI-værdien for masarimycin-optochin-interaktionen beregnes til at være 1,5, hvilket indikerer et ligegyldigt forhold baseret på offentliggjorte standarder42. Fænotypiske assays ved anvendelse af masarimycin i B. subtilis ved sub-MIC-koncentrationer præsenterede en pølselignende fænotype (figur 3B), som adskiller sig fra rapporterede fænotyper af ΔlytG-mutanten i litteraturen32 og mere ligner flere autolysin knockouts29. Fænotypisk analyse af S. pneumoniae med masarimycin ved sub-MIC-koncentrationer præsenterede en klumpende fænotype (figur 3D). Denne klumpende fænotype adskiller sig fra dem, der er rapporteret for S. pneumoniae cellevægsvirkende GlcNAcases 43,44,45.

Figure 1
Figur 1: Struktur af peptidoglycan, der viser spaltningsstedet for den exo-virkende N-acetylglucosaminidase LytG fra Bacillus subtilis. Inset viser strukturen af LytG-hæmmeren masarimycin. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 2
Figur 2: Synergi/Antagonisme-assay for at undersøge antagonistiske/synergistiske forhold til masarimycin og optochin i S. pneumoniae. Blå eller lilla farve indikerer ingen bakterievækst, mens lyserød farve indikerer bakterievækst. MIC i nærvær af co-drug tages som den laveste koncentration, der ikke viser nogen bakterievækst (blå farve). Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 3
Figur 3: Morfologisk analyse. Morfologiske ændringer af B. subtilis (A,B) og S. pneumoniae (C,D) ved behandling med 0,75x MIC (MICB.subtilis = 3,8 μM og MICS.pneumoniae = 7,8 μM) masarimycin. Celler blev fikseret og farvet med 0,1% (m / v) methylenblåt og visualiseret ved lysfeltmikroskopi under olienedsænkning ved 1000x forstørrelse. Dette tal er ændret fra 35. Klik her for at se en større version af denne figur.

Supplerende figur 1: Repræsentativ tyndtlagskromatografi af masarimycin efter vandig oparbejdelse. Den mobile fase er 90:10 hexan: isopropanol og joddamp anvendes til farvning af pletter. Rf = 0,3 for masarimycin. Klik her for at downloade denne fil.

Supplerende figur 2: Repræsentativt flashkromatogram til rensning af masarimycin. Toppen på ca. 1,2 kolonnevolumener indeholder masarimycin. Klik her for at downloade denne fil.

Supplerende figur 3: Repræsentativ 1H NMR for masarimycin opløst i CDCl3 og registreret på et 400 MHz NMR-spektrometer. Spektrum refereres til resterende CHCl3-opløsningsmiddeltop ved δ = 7,26. Tal i grønt over kemiske forskydninger angiver protontildelinger på de tilsvarende positioner i masarimycins struktur (se inset). Klik her for at downloade denne fil.

Supplerende figur 4: Repræsentativt 13C NMR-spektrum af masarimycin opløst i CDCl3 ved 100 MHz. Spektrum refereret til resterende CHCl 3-opløsningsmiddeltop ved δ = 77,36. Tal i grønt over kemiske forskydninger angiver carbonatomtildelinger på positionerne i masarimycins struktur (se inset). Klik her for at downloade denne fil.

Supplerende figur 5: Repræsentativt resazurin MIC-assay af masarimycin mod B. subtilis. Klik her for at downloade denne fil.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Masarimycin er en enkelt mikromolær bakteriostatisk hæmmer af B. subtilis35 og S. pneumoniae37 vækst. I B. subtilis har masarimycin vist sig at hæmme GlcNAcase LytG35, mens det præcise molekylære mål i cellevæggen hos S. pneumoniae ikke er blevet identificeret37. Syntese af masarimycin ved hjælp af enten den klassiske organiske syntese eller mikrobølgeprocedure giver hæmmeren i godt udbytte og høj renhed. Lave udbytter af masarimycin kan typisk tilskrives oxidationen af cyclohexylcarboxaldehydet. For at overvinde dette anbefales det at opbevare cyclohexylcarboxaldehyd under en inert atmosfære i en ekssikkator. Oxidation af aldehydet til den tilsvarende carboxylsyre kan ses som et hvidt fast stof i flasken. Køb af små mængder cyclohexylcarboxaldehyd uden at opbevare det i længere perioder reducerer dette problem kraftigt.

NMR-tildeling af masarimycinstruktur kompliceres af tilstedeværelsen af en blanding af cis- og transformer af amidbindingen samt atropisomere omkring o-iodophenylringen, der resulterer i flere toppe. Dette kan resultere i et protonkemisk skift spredt over 1 ppm og derved komplicere opgaver35. Som følge heraf er delvis tildeling af NMR-kemiske forskydninger for både 1H og 13C NMR-spektre sammen med repræsentative spektre angivet i supplerende figur 3-4. Hvis der er vanskeligheder med at tildele 1H og 13C kemiske skift til masarimycin på grund af blandingen af isomerer, kan 2-dimensionelle NMR-eksperimenter anvendes. Korreleret spektroskopi (COSY) kan bruges til at identificere protonspinsystemer, mens heteronukleære enkeltkvantekohærensspektroskopi (HSQC) NMR-eksperimenter kan bruges til at identificere proton-carbon enkeltbindingskorrelationer. Når masarimycin er renset, kan det opbevares ved -20 °C som olie eller opløses i DMSO i en koncentration på 25 mM, indtil det er nødvendigt. Det anbefales at opbevare i små alikvoter for at reducere antallet af fryse-optøningscyklusser. Efter gentagne fryse-optøningscyklusser af forbindelsen bør masarimycin-stamopløsningen kontrolleres af TLC for at overvåge for enhver nedbrydning.

Synergi- og antagonismeskærme kan være en effektiv strategi til at identificere vejinteraktioner og kan bruges til at forstå små molekylers virkemåde. Figur 2 viser et eksempel på et synergi/antagonisme-assay med S. pneumonia R6 ved anvendelse af masarimycin og ATPase-hæmmeren optochin (bemærk, at synergi/antagonisme-screeningen i B. subtilis stadig er en igangværende undersøgelse). Til reproducerbarhed blev anden passage celler anvendt og dyrket til en OD600nm på højst 0,4. En FICI på 1,5 blev observeret for interaktionen mellem masarimycin og optochin, hvilket indikerer et ligegyldigt forhold mellem antibiotikaparret. Det ligeglade forhold mellem masarimycin og optochin indikerer ingen tilsyneladende interaktion mellem de veje, disse antibiotika er rettet mod. Mens disse assays kan give nyttige oplysninger om lægemiddelinteraktioner, er det vigtigt at bemærke, at synergi / antagonisme assays bør køres med biologiske replikater og brug af de mere konservative cutoffs som beskrevet af Odds42. Dette hjælper med at forhindre overfortolkning af observerede mindre synergistiske eller antagonistiske forhold.

Fænotypisk analyse af B. subtilisceller behandlet med sub-MIC masarimycin (figur 3B) indikerer en fænotype, der adskiller sig fra fænotyper rapporteret for genetisk deletion af lytG32 og mere ligner fænotyper af B. subtilis stammer med flere autolysin deletioner29. Denne uoverensstemmelse i fænotype er spændende, fordi mens in vitro-hæmning af LytG er blevet demontreret35, har en ΔlytG-mutant ingen observerbar fænotype32. Denne uoverensstemmelse kan til dels forklares med forskelle i genetisk og kemisk inaktivering 46,47. De observerede forskelle i den kemiske eller genetiske inaktivering af LytG er et spændende spørgsmål, der i øjeblikket undersøges. S. pneumoniae-celler behandlet med masarimycin præsenterede en fænotype (figur 3D), der adskiller sig fra den genetiske deletion af det tilsvarende GlcNAcase (GH73, cluster 2) LytB 37,43,44,48. Denne morfologiske uoverensstemmelse fremhæver udfordringerne ved at tildele virkningsmåde eller tildele det biologiske mål for små molekylehæmmere. Morfologiske fænotyper kan opstå fra et mere komplekst sæt interaktioner end en enkelt genetisk deletion eller kemisk inaktivering af et cellevægsvirkende enzym. Disse metafænotyper34 kan opstå ved komplekse interaktioner via direkte (mangel på et enzym (er)) eller indirekte (tab af regulatorer) mekanismer.

Efter vores bedste overbevisning er masarimycin den første hæmmer af en bakteriel autolysin, der demonstrerer hæmning af bakterievækst (supplerende figur 5). Det er en smalspektret bakteriostatisk hæmmer af vækst i B. subtilis og S.pneumoniae. Dette snævre spektrum er en begrænsning for komparative undersøgelser af celle-vægmetabolisme mellem gram-positive og gram-negative organismer. Dette snævre spektrum skyldes til dels forskelle i nogle af de glycosylhydrolaseautolysiner, der anvendes under vegetativ vækst mellem grampositive (GlcNAcase) og gramnegative (lytiske transglycosylase) organismer. Ved hjælp af småmolekylehæmmere såsom masarimycin til hæmning af PG-autolysiner kan GlcNAcases især tilvejebringe en ortogonal tilgang til traditionel genetik til belysning af autolysinfunktion. Masarimycin har en klar fordel i forhold til nogle kemiske biologiske metoder, idet det kan anvendes i mere end en art (B. subtilis og S. pneumoniae). Det kan give mulighed for sammenlignende undersøgelser af cellevægsmetabolisme mellem stangformede (B. subtilis) og coccoid (S. pneumoniae) arter. Den mindre coregulerede cellevægsmetabolisme og opdeling i S. pneumoniae giver et kontrapunkt i det mere stramt regulerede system af stangformede arter49,50. Fremtidige anvendelser af denne teknik vil være at identificere det molekylære mål i S.pneumoniae og undersøge forskellene mellem genetisk og kemisk inaktivering af autolysiner i S.pneumoniae og B. subtilis.

Kritiske trin i protokollen
Det er vigtigt at være opmærksom på den effektive koncentration af masarimycin i biologiske og biokemiske assays. På grund af sin hydrofobe natur kan koncentrationer over 250 μM (65x MIC i B. subtilis) resultere i opløseligheds- og aggregeringsproblemer, der kan påvirke fortolkningen af biologiske data. Korrekt kontrol af køretøjets effekt (dvs. DMSO) i alle eksperimenter er afgørende.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Reid, C. W. har intellektuel ejendomsret, der involverer specifikke anvendelser af masarimycin.

Acknowledgments

Forskningen blev støttet af National Science Foundation under bevillingsnummer 2009522. NMR-analyse af masarimycin blev støttet af National Science Foundation store forskningsinstrumenteringsprogramtildeling under bevillingsnummer 1919644. Eventuelle meninger, resultater og konklusioner eller anbefalinger, der udtrykkes i dette materiale, er forfatternes og afspejler ikke nødvendigvis National Science Foundations synspunkter.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
2-Iodobenzoic acid SIGMA-ALDRICH I7675-25G corrosive, irritant, light yellow to orange-brown powder
2-Propanol SIGMA-ALDRICH 109827-4L flammable, irritant, colorless liquid
Acetonitrile SIGMA-ALDRICH 34851-4L flammable, irritant, colorless liquid
Aluminum backed silica plates Sorbtech 4434126 silica gel XG F254 on aluminum backed plates
chloroform-d SIGMA-ALDRICH 151823-50G solvent for NMR
Compact Mass Spectrometer Advion-Interchim Advion CMS compact mass spectrometer equiped with APCI source and atmospheric solids analysis probe
Corning Costar 96 well flat bottom plates-sterile fisher chemical 07-200-90 for synergy/antagonism assays
cover slips fisher chemical 12-547 for microscopy
Cyclohexanecarboxaldehyde CHEM-IMPEX INT'L INC. 24451 flammable, irritant, colorless to pink liquid
Cyclohexyl isocyanide SIGMA-ALDRICH 133302-5G irritant, colorless liquid, extremly unpleasant odor
Cyclohexylamine SIGMA-ALDRICH 240648-100ML corrosive, flammable, irritant, colorless liquid unless contaminated
Ethyl acetate SIGMA-ALDRICH 537446-4L flammable, irritant, colorless liquid
flash silica cartridge (12g) Advion-Interchim PF-50SIHP-F0012 pack of flash silica columns (12g) for purification of masarimycin
formaldehyde SIGMA-ALDRICH F8775-25ML fixing agent for microscopy
HEPES SIGMA-ALDRICH H8651-25G buffer for microscopy fixing solution
Hexane, mixture of isomers SIGMA-ALDRICH 178918-4L environmentally damaging, flammable, irritant, health hazard, colorless liquid
High performance compact mass spectrometer Advion expression Atmospheric Solids Analysis Probe (ASAP), low resolution
High Vac eppendorf Vacufuge plus vacuum aided by centrifugal force and temperature
Hydrochloric acid SIGMA-ALDRICH 258148-2.5L corrosive, irritant, colorless liquid
hydrochloric acid SIGMA-ALDRICH 320331-2.5L strong acid
immersion oil fisher chemical 12-365-19 for microscopy
Iodine, resublimed crystals Alfa Aesar 41955 environmentally damaging, irritant, health hazard, dark grey/purple crystals
Mestre Mnova MestreLab Research software for processing NMR spectra
Methanol SIGMA-ALDRICH 439193-4L flammable, toxic, health hazard, colorless liquid
methylene blue SIGMA-ALDRICH M9140-25G microscopy stain for staining cell walls
meuller-hinton agar plates + 5% sheep blood fisher chemical B21176X growth media for Streptococcus pneumoniae
meuller-hinton broth fisher chemical DF0757-17-6 growth media for Streptococcus pneumoniae
microscope slides fisher chemical 22-310397 for microscopy
Microwave Synthesis Labstation MILESTONE START SYNTH device that requires the ventilation of a fume hood, equipped with synthesis carousel
NMR tubes SIGMA-ALDRICH Z562769-5EA 5mm NMR tubes 600 MHz
Nuclear Magnetic Resonance (NMR) Bruker Ascend 400 large superconducting magnet (400MHz)
optochin fisher chemical AAB21627MC ethylhydrocupreine hydrochloride
petrie plates Celltreat 229695 for preparing agar plates for bacterial growth
Primo Star Bright field/Phase contrast Microscope with ERc5s camera Zeiss for morphology studies
puriFlash interchim XS520plus flash chromatography purification system
resazurin SIGMA-ALDRICH R7017-1G for synergy/antagonism assays
Rotary Evaporator Heidolph Hei-VAP Value "The Collegiate" solvent evaporator
Sodium bicarbonate SIGMA-ALDRICH S6014-500G irritant, white powder
Sodium chloride fisher chemical S271-1 crystalline, colorless
Sodium chloride SIGMA-ALDRICH S5886-500G for growth of B.subtilis and preparation of LB media
Sodium sulfate SIGMA-ALDRICH 7985592-500G anhydrous, granular, white
tryptone fisher chemical BP1421-500 for growth of B.subtilis and preparation of LB media
Whitney DG250 Workstation Microbiology International DG250 anaerobic workstation. Anaerobic gas mixture used: 5% hydrogen, 10% carbon dioxide, balance nitrogen
yeast extract fisher chemical BP1422-500 for growth of B.subtilis and preparation of LB media
Zen Lite (blue) software Zeiss for acquiring micrographs

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Vollmer, W., Blanot, D., de Pedro, M. A. Peptidoglycan structure and architecture. FEMS Microbiology Review. 32 (2), 149-167 (2008).
  2. Munita, J. M., Bayer, A. S., Arias, C. A. Evolving resistance among Gram-positive pathogens. Clinical Infectious Diseases. 61, suppl-2 48-57 (2015).
  3. Vollmer, W., Bertsche, U. Murein (peptidoglycan) structure, architecture and biosynthesis in Escherichia coli. Biochimica Biophysica Acta. 1778 (9), 1714-1734 (2008).
  4. Vollmer, W., Höltje, J. -V. The architecture of the murein (peptidoglycan) in Gram-negative bacteria: vertical scaffold or horizontal layer(s). Journal of Bacteriology. 186 (18), 5978-5987 (2004).
  5. Clarke, A. J. Compositional analysis of peptidoglycan by high-performance anion-exchange chromatography. Analytical Biochemistry. 212 (2), 344-350 (1993).
  6. Kim, S. J., Chang, J., Singh, M. Peptidoglycan architecture of Gram-positive bacteria by solid-state NMR. Biochimica Biophysica Acta. 1848, 350-362 (2014).
  7. Koch, A. L., Doyle, R. J. Inside-to-outside growth and turnover of the wall of gram-positive rods. Journal of Theoretical Biology. 117 (1), 137-157 (1985).
  8. Beeby, M., Gumbart, J. C., Roux, B., Jensen, G. J. Architecture and assembly of the Gram-positive cell wall. Molecular Microbiology. 88 (4), 664-672 (2013).
  9. Shockman, G. D., Daneo-Moore, L., Kariyama, R., Massidda, O. Bacterial walls, peptidoglycan hydrolases, autolysins, and autolysis. Microbial Drug Resistance. 2 (1), 95-98 (1996).
  10. Dijkstra, A. J., Keck, W. Peptidoglycan as a barrier to transenvelope transport. Journal of Bacteriology. 178 (19), 5555-5562 (1996).
  11. Blackman, S. A., Smith, T. J., Foster, S. J. The role of autolysins during vegetative growth of Bacillus subtilis 168. Microbiology. 144, 73-82 (1998).
  12. Misra, G., Rojas, E. R., Gopinathan, A., Huang, K. C. Mechanical consequences of cell-wall turnover in the elongation of a Gram-positive bacterium. Biophysical Journal. 104 (11), 2342-2352 (2013).
  13. Wheeler, R., et al. Bacterial cell enlargement requires control of cell wall stiffness mediated by peptidoglycan hydrolases. mBio. 6 (4), 00660 (2015).
  14. Taguchi, A., Kahne, D., Walker, S. Chemical tools to characterize peptidoglycan synthases. Current Opinion in Chemical Biology. 53, 44-50 (2019).
  15. Welsh, M. A., Schaefer, K., Taguchi, A., Kahne, D., Walker, S. Direction of chain growth and substrate preferences of shape, elongation, division, and sporulation-family peptidoglycan glycosyltransferases. Journal of the American Chemial Society. 141 (33), 12994-12997 (2019).
  16. Rubino, F. A., et al. Detection of transport intermediates in the peptidoglycan flippase MurJ identifies residues essential for conformational cycling. Journal of the American Chemical Society. 142 (12), 5482-5486 (2020).
  17. Sjodt, M., et al. Structure of the peptidoglycan polymerase RodA resolved by evolutionary coupling analysis. Nature. 556 (7699), 118-121 (2018).
  18. Tiyanont, K., et al. Imaging peptidoglycan biosynthesis in Bacillus subtilis with fluorescent antibiotics. Proceedings of the National Academy of Science U S A. 103 (29), 11033-11038 (2006).
  19. Lebar, M. D., et al. Reconstitution of peptidoglycan cross-linking leads to improved fluorescent probes of cell wall synthesis. Journal of the American Chemical Society. 136 (31), 10874-10877 (2014).
  20. Do, T., Page, J. E., Walker, S. Uncovering the activities, biological roles, and regulation of bacterial cell wall hydrolases and tailoring enzymes. Journal of Biological Chemistry. 295 (10), 3347-3361 (2020).
  21. Liang, H., et al. Metabolic labelling of the carbohydrate core in bacterial peptidoglycan and its applications. Nature Communications. 8, 15015 (2017).
  22. DeMeester, K. E., et al. Metabolic incorporation of N-acetyl muramic acid probes into bacterial peptidoglycan. Current Protocol in Chemical Biology. 11 (4), 74 (2019).
  23. Lazor, K. M., et al. Use of Bioorthogonal N-acetylcysteamine (SNAc) analogues and peptidoglycan O-acetyltransferase B (PatB) to label peptidoglycan. The FASEB Journal. 32, 630 (2018).
  24. Wang, Y., Leimkuhler-Grimes, C. Fluorescent labeling of the carbohydrate backbone of peptidoglycan to track degradation in vivo. The FASEB Journal. 29, (2015).
  25. Kuru, E., et al. In probing of newly synthesized peptidoglycan in live bacteria with fluorescent D-amino acids. Angewandte Chemie International Edition. 51 (50), 12519-12523 (2012).
  26. Zhou, R., Chen, S., Recsei, P. A dye release assay for determination of lysostaphin activity. Analytical Biochemistry. 171 (1), 141-144 (1988).
  27. Qiao, Y., et al. Lipid II overproduction allows direct assay of transpeptidase inhibition by β-lactams. Nature Chemical Biology. 13 (7), 793-798 (2017).
  28. Lebar, M. D., et al. Forming cross-linked peptidoglycan from synthetic Gram-negative lipid II. Journal of the American Chemical Society. 135 (12), 4632-4635 (2013).
  29. Chen, R., Guttenplan, S. B., Blair, K. M., Kearns, D. B. Role of the D-dependent autolysins in Bacillus subtilis population heterogeneity. Journal of Bacteriology. 191 (18), 5775-5784 (2009).
  30. Yukie, S., Miki, K., Yoshio, N., Kuniaki, T., Yoshihisa, Y. Identification and characterization of an autolysin-encoding gene of Streptococcus mutans. Infection and Immunity. 73 (6), 3512-3520 (2005).
  31. Domenech, M., García, E., Moscoso, M. In vitro destruction of Streptococcus pneumoniae biofilms with bacterial and phage peptidoglycan hydrolases. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 55 (9), 4144-4148 (2011).
  32. Horsburgh, G. J., Atrih, A., Williamson, M. P., Foster, S. J. LytG of Bacillus subtilis is a novel peptidoglycan hydrolase: the major active glucosaminidase. Biochemistry. 42 (2), 257-264 (2003).
  33. Vermassen, A., et al. Cell wall hydrolases in bacteria: insight on the diversity of cell wall amidases, glycosidases and peptidases toward peptidoglycan. Frontiers in Microbiology. 10, 331 (2019).
  34. Martin-Galiano, A. J., Yuste, J., Cercenado, M. I., de la Campa, A. G. Inspecting the potential physiological and biomedical value of 44 conserved uncharacterised proteins of Streptococcus pneumoniae. BMC Genomics. 15, 652 (2014).
  35. Nayyab, S., et al. Diamide inhibitors of the Bacillus subtilis N-acetylglucosaminidase LytG that exhibit antibacterial activity. ACS Infectioius Diseases. 3 (6), 421-427 (2017).
  36. Lipski, A., et al. Structural and biochemical characterization of the β-N-acetylglucosaminidase from Thermotoga maritima: Toward rationalization of mechanistic knowledge in the GH73 family. Glycobiology. 25 (3), 319-330 (2014).
  37. Haubrich, B. A., et al. Inhibition of Streptococcus pneumoniae autolysins highlight distinct differences between chemical and genetic inactivation. bioRxiv. , 300541 (2020).
  38. Farha, M. A., et al. Inhibition of WTA synthesis blocks the cooperative action of PBPs and sensitizes MRSA to β-lactams. ACS Chemical Biology. 8 (1), 226-233 (2013).
  39. Lehár, J., et al. Chemical combination effects predict connectivity in biological systems. Molecular Systems Biology. 3 (1), 80 (2007).
  40. Farha, M. A., et al. Antagonism screen for inhibitors of bacterial cell wall biogenesis uncovers an inhibitor of undecaprenyl diphosphate synthase. Proceedings of the National Academy of Science U S A. 112 (35), 11048-11053 (2015).
  41. Palomino, J. C., et al. Resazurin microtiter assay plate: simple and inexpensive method for detection of drug resistance in Mycobacterium tuberculosis. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 46 (8), 2720-2722 (2002).
  42. Odds, F. C. Synergy, antagonism, and what the chequerboard puts between them. Journal of Antimicrobial Chemotherapy. 52 (1), 1 (2003).
  43. Arrigucci, R., Pozzi, G. Identification of the chain-dispersing peptidoglycan hydrolase LytB of Streptococcus gordonii. PLoS One. 12 (4), 0176117 (2017).
  44. Bai, X. -H., et al. Structure of pneumococcal peptidoglycan hydrolase LytB reveals insights into the bacterial cell wall remodeling and pathogenesis. of Biological Chemistry. 289 (34), 23403-23416 (2014).
  45. Garcia, P., Gonzalez, M. P., Garcia, E., Lopez, R., Garcia, J. L. LytB, a novel pneumococcal murein hydrolase essential for cell separation. Molecular Microbiology. 31 (4), 1275-1281 (1999).
  46. Giladi, M., Altman-Price, N., Levin, I., Levy, L., Mevarech, M. FolM, a new chromosomally encoded dihydrofolate reductase in Escherichia coli. Journal of Bacteriology. 185 (23), 7015-7018 (2003).
  47. Chua, P. R., et al. Effective killing of the human pathogen Candida albicans by a specific inhibitor of non-essential mitotic kinesin Kip1p. Molecular Microbiology. 65 (2), 347-362 (2007).
  48. Rico-Lastres, P., et al. Substrate recognition and catalysis by LytB, a pneumococcal peptidoglycan hydrolase involved in virulence. Scientific Reports. 5, 16198 (2015).
  49. Vollmer, W., et al. The cell wall of Streptococcus pneumoniae. Microbiology Spectrum. 7 (3), (2019).
  50. Massidda, O., Nováková, L., Vollmer, W. From models to pathogens: how much have we learned about Streptococcus pneumoniae cell division. Environmental Microbiology. 15 (12), 3133-3157 (2013).

Tags

Biokemi udgave 179 Peptidoglycan metabolisme autolysin kemisk biologi hæmmer cellevæg
Syntese af Masarimycin, en lille molekylehæmmer af grampositiv bakterievækst
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Gallati, M., Point, B., Reid, C. W.… More

Gallati, M., Point, B., Reid, C. W. Synthesis of Masarimycin, a Small Molecule Inhibitor of Gram-Positive Bacterial Growth. J. Vis. Exp. (179), e63191, doi:10.3791/63191 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter