Summary
細胞壁分解を標的とすることによって枯草菌および肺炎球菌の増殖を阻害する小分子プローブである静菌ジアミドマサリマイシンを調製するための詳細なプロトコールが提示される。化学プローブとしてのその応用は、枯草菌および肺炎菌との相乗効果/拮抗アッセイおよび形態学的研究において実証されている。
Abstract
細菌の細胞壁にあるペプチドグリカン(PG)は、形状、および周囲の環境からの保護を付与するユニークな高分子構造である。細胞の成長と分裂を理解する上で中心的なのは、PG分解が生合成と細胞壁アセンブリにどのように影響するかについての知識です。近年、修飾糖やアミノ酸の導入によるPGの代謝標識が報告されている。小分子阻害剤による生合成ステップの化学的尋問は可能であるが、オートライシンによるPG分解を研究するためのケミカルバイオロジーツールは未開発である。細菌性オートライシンは、PGの緊密に協調した分解に関与する幅広いクラスの酵素である。ここでは、枯 草菌 におけるN-アセチルグルコサミニダーゼLytGの阻害剤である小分子プローブ、マサリマイシン、および 肺炎球菌における細胞壁代謝を調製するための詳細なプロトコールが提示される。マイクロ波支援および古典的有機合成 を介 した阻害剤の調製が提供される。生物学的アッセイにおけるグラム陽性生理学を研究するためのツールとしてのその適用性が提示される。
Introduction
ペプチドグリカン(PG)は、グラム陽性およびグラム陰性細菌1,2の両方における細胞の形状および構造を描写する網目状のポリマーである。このヘテロポリマーは、β-(1,4)結合した交互のN-アセチルグルコサミン(GlcNAc)残基とN-アセチルムラミン酸(MurNAc)残基からなる骨格を有する短いペプチド3,4,5,6によって架橋されたアミノ糖のマトリックスである(図1)1。MurNAcのC-3ラクチル部分に結合しているのはステムペプチドである。PGの代謝は、細胞壁7、8に新しい物質を組み込むために、生合成および分解酵素の緊密に調整されたシステムを含む。PGの分解は、オートライシン9と総称する酵素によって行われ、さらに切断された結合の特異性に基づいて分類される。オートライシンは、細胞増殖、細胞分裂、運動性、PG成熟、走化性、タンパク質分泌、遺伝的能力、分化、および病原性を含む多くの細胞プロセスに関与する10,11。個々のオートライシンの特定の生物学的機能を解明することは、部分的には機能的な冗長性のために、困難な場合があります。しかし、最近の生物物理学的研究8,12,13および計算研究12は、PG代謝におけるそれらの役割についての新しい洞察を提供している。加えて、最近の報告は、PG代謝における合成14および膜媒介性15、16、17ステップについてのさらなる洞察を提供している。PG代謝の分解経路と合成経路の関係を徹底的に理解することは、これまで未開発の抗生物質標的を生じさせる可能性がある。
真核生物の糖生物学を研究するための方法論には著しい進歩があったが、細菌の糖生物学、特にPG代謝は同様の速度で進歩していない。PG代謝を研究するための現在の化学的アプローチには、蛍光標識抗生物質18、蛍光プローブ19、20、および代謝標識21、22、23、24が含まれる。これらの新しいアプローチは、細菌の細胞壁代謝を調査する新しい方法を提供している。これらの戦略のいくつかはインビボでPGを標識することができるが、それらは種特異的であり得る19、または特定のオートライシン25を欠く株においてのみ働く。多くのPG標識戦略は、単離された細胞壁26またはインビトロで再構成されたPG生合成経路20、27、28と共に使用するためのものである。蛍光標識された抗生物質の使用は、現在、生合成ステップおよびトランスペプテーション18に限定されている。
細菌のオートライシンと細胞壁代謝におけるそれらの役割に関する現在の知識は、遺伝的およびインビトロ生化学的分析11、29、30、31、32から来ている。これらのアプローチは、この重要なクラスの酵素に関する豊富な情報を提供してきましたが、それらの生物学的役割を解読することは困難な場合があります。例えば、機能的冗長性33のために、ほとんどの場合、オートライシンの欠失は細菌増殖の停止をもたらさない。これは、細胞増殖および分裂におけるそれらの暗黙の役割にもかかわらず、7,12である。もう一つの合併症は、細菌性自己分解体の遺伝的欠失がメタ表現型を生じさせる可能性があることである34。メタ表現型は、遺伝的欠失の影響を受ける経路と他の相互接続された経路との間の複雑な相互作用から生じる。例えば、メタ表現型は、酵素の欠如などの直接的な効果、または調節因子の破壊などの間接的な効果を介して生じ得る。
現在、PGの分解を研究するための化学プローブとして使用できるN-アセチルグルコサミニダーゼ(GlcNAcase)およびN-アセチルムラミダーゼなどのグリコシダーゼ自己分解の阻害剤はごくわずかである。これに対処するために、ジアミドマサリマイシン(以前はfgkcと呼ばれていた)が同定され、GlcNAcase LytG32を標的とする枯草菌増殖の静菌阻害剤として35を特徴付けた(図1)。LytGは、外効性GlcNAcase36であり、グリコシル加水分解酵素ファミリー73(GH73)内のクラスター2のメンバーである。これは、栄養成長中の主要な活性GlcNAcaseである32。我々の知る限り、マサリマイシンは、細胞増殖を阻害するPG作用型GlcNAcaseの最初の阻害剤である。肺炎連鎖球菌を用いたマサリマイシンのさらなる研究は、マサリマイシンがこの生物における細胞壁代謝を阻害する可能性が高いことを見出した37。ここで、マサリマイシンの調製は、グラム陽性生物B.枯草菌、および肺炎菌における生理学を研究するためのケミカルバイオロジープローブとしての使用について報告されている。マサリマイシンによる最小阻害濃度以下の処理の形態学的解析、ならびに相乗効果/拮抗作用アッセイの例を提示する。明確に定義された作用機序を有する抗生物質を用いた相乗効果および拮抗作用アッセイは、細胞プロセス間の関連を探求する有用な方法であり得る38、39、40。
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Protocol
1. 一般的な方法
注:すべての化合物は標準的な供給業者から購入され、それ以上の精製なしで使用されました。
- シリカゲルXG F254でプレコートしたアルミニウム板上で薄層クロマトグラフィー(TLC)を行う。UVランプの下、 p-アニスアルデヒド染色剤に浸漬するか、I2 蒸気にさらすことによってスポットを検出します。
- すべての核磁気共鳴(NMR)スペクトルを400MHz分光器に記録します。
注:1H−NMRおよび13C−NMRスペクトルは、残留溶媒ピークを参照した。 結合定数は [Hz] で、化学シフトは [ppm] で表されます。 - マサリマイシンの大気圧化学イオン化(APCI)質量分析スペクトルを、大気固体分析プローブを備えたコンパクトな質量分析計に記録します。
2. マサリマイシンの調製のための一般的な手順
メモ:ヒュームフードで以下の手順を実行します。
- 各反応物のメタノール中の0.1 M溶液を調製する:シクロヘキシルアミン、シクロヘキシルカルボキシアルデヒド、 o-ヨード安息香酸、およびシクロヘキシルイソシアニド35。
警告: シクロヘキシルアミン、シクロヘキシルイソシアニド、シクロヘキシルカルボキシアルデヒドは可燃性です。それらは皮膚腐食を引き起こし、経口、皮膚、呼吸器、または生殖毒性を誘発する可能性がある。コンパウンドは、裸火、高温の表面、および発火源から遠ざけてください。適切な皮膚と目の保護具を着用し、換気の良い場所で作業し、蒸気や霧の吸入を避けてください。保管のために、ボトルをしっかりと閉じたままにし、涼しく乾燥した場所に保管してください。シクロヘキシルカルボキシアルデヒドをN2 雰囲気下のデシケーターに保存する。 - キャップ付き丸底フラスコに5 mLのシクロヘキシルアミン(メタノール中0.1 M溶液)と5 mLのシクロヘキシルカルボキシアルデヒド(メタノール中0.1 M溶液)を混合し、マグネチックスターラーバーを用いて溶液を撹拌/ホットプレート上で砂浴中で40°Cで30分間撹拌する。砂面から約1cm下に設置した温度計で温度を監視します。
- 30分後、ステップ2.2の溶液に5 mLのシクロヘキシルイソシアン化物(メタノール中の0.1 M溶液)を加え、50°Cでさらに20分間撹拌する。 最後に、反応混合物に5 mLの ヨード安息香酸(メタノール中の0.1 M溶液)を加え、55°Cで3〜5時間撹拌し続ける。
- 上記の反応混合物が3時間撹拌された後の約1時間ごとにTLCにより反応の進行を定期的にモニターする。
- アルミニウムで裏打ちされたTLCプレートの3 cm x 6 cmのストリップを切り取ります。#2の鉛筆を使って、下から約1cmの線を描きます。ガラスマイクロキャピラリーを使用して、約5μLの反応混合物をTLCプレート上にスポットし、乾燥させる。
- 150 mLビーカーに、ビーカーの底を覆うのに十分な移動相(90:10ヘキサン:イソプロパノール)を加えます。一対のピンセットを使用して、上記のTLCプレートをビーカーに慎重に置き、TLCプレートが移動相に均等に入るようにします。ビーカーの上部をブリキの破片で覆います。
メモ:移動相がラインと斑点のあるサンプルを覆っていないことを確認します。 - 移動相がTLCプレートの上方を上り、プレートの上部から約1cm下になるまで移動させます。TLCプレートを取り出し、鉛筆を用いて、移動相が移動した距離を示す線を引く。TLCプレートをヒュームフードで乾かします。
- 乾燥したら、TLCプレートを少量の固体I2 を入れたビーカーに入れ、ビーカーを錫箔で覆う。TLCの黄色/茶色の斑点の発生を監視します。開発したら、TLCプレートを取り外し、鉛筆を使用してスポットの位置に印を付けます(補足図1)。
注:I2 つのスポットがマークされていない場合、汚れは時間の経過とともに消えます。スポットは、UV光、 p-アニスアルデヒド染色、または過マンガン酸カリウム染色によってTLCプレート上に視覚化することもできます( 補足情報を参照)。 - 次の式を使用して、視覚化されたすべてのスポットの Rf 値を計算します。
Rf =
- TLCプレート上にRf =0.3のスポットが1つだけ見えるときに反応が完了したと考えてください。減圧下で回転式蒸発器で溶媒を除去し、粗生成物(黄褐色の油状物として得られる)を、すべてのメタノールが蒸発するまで高真空下で乾燥させた。
- 乾燥粗生成物を30mLの酢酸エチルに溶解し、それを分液ロートに移す。酢酸エチルを1 M HCl(2 x 30 mL)、H2O(30 mL)、飽和NaHCO3溶液(2 x 30 mL)、H2O(30 mL)および飽和NaCl溶液(2 x30 mL)で順次抽出する。水層を捨てる。
注:酢酸エチル層は、各抽出の最上層です。各抽出について、酢酸エチルと水溶液(HCl、H2O、NaHCO3、またはNaCl)を含む分液ロートを激しく振って、層を完全に分離できるようにします。 - 分液漏斗から酢酸エチル層を取り出し、三角フラスコに集める。Na2SO4(無水)をいっぱいにしたヘラを加え、酢酸エチルから残留水を除去した。
注:酢酸エチル溶液は、フラスコ内のNa2SO4が自由に動作し、凝集しない場合、乾燥しているとみなされる。Na2SO4が凝集している場合は、Na2SO4のヘラを追加添加することができる。 - 乾燥した酢酸エチル溶液を#1ろ紙でろ過し、Na2SO4を除去した。ろ紙を少量の酢酸エチルで洗ってください。濾過した酢酸エチル溶液を丸底フラスコに入れ、減圧下で回転式エバポレーターで溶媒を除去し、酢酸エチルを全て除去したら油状物としてのマサリマイシンを得た。
- 上記で得られたマサリマイシン油を最小量(1〜2mL)の9:1ヘキサン:イソプロパノールに溶解し、すべての化合物が溶解するまで磁気攪拌板上で攪拌する。
- 溶解したマサリマイシンを12g順相シリカフラッシュカラムを用いたフラッシュクロマトグラフィーにより精製する。
- フラッシュカラムを 10 カラム容量の移動相 (99:1 ヘキサン:イソプロパノール) で平衡化し、15 mL/minの流速に設定した装置を使用します。
メモ: 平衡化が完了したら、フローを停止し、カラムの上部をシステムから取り外します。 - 溶解したマサリマイシンを5mLシリンジを用いて引き出す。シリンジを平衡化フラッシュカラムの上部に直接接続し、溶液をカラムに注入する。装填したカラムをフラッシュクロマトグラフィーシステムに再接続し、グラジエント溶出を開始します。
- 10:90の最終移動相濃度へのグラジエント溶出を用いてカラムからマサリマイシンを溶出するヘキサン:イソプロパノールを12カラム容量にわたって溶出する。230および254nmでの吸収 を介して マサリマイシンの溶出をモニターする。
- カラムから溶出した化合物を、フラクションあたり20mLの溶媒を収集するフラクションコレクターによって収集します。
注:フラッシュクロマトグラフィーシステムが利用できない場合、マサリマイシンの精製は、3:1(ヘキサン:酢酸エチル)移動相を有する重力シリカカラム を介して 行うことができる。マサリマイシンを含む画分は、同じ移動相を用いたTLCにより同定することができる。TLCスポットの可視化は、UV光、I2 蒸気、または過マンガン酸カリウム染色のいずれかを用いて行った。 - TLC(ステップ2.5-2.9)または大気固体分析プローブを備えたコンパクトな質量分析計上の質量分析によってマサリマイシンを含む画分を同定する。最終製品を真空下(約0.3mbar)で乾燥させます。
注:マサリマイシンは、反応に添加されるシクロヘキシルカルボキシアルデヒドのmmolに対して55%〜70%の収率で無色の油状または固体として日常的に得られる。精製マサリマイシンの質量を求め、下記式を用いて反応の理論収率を計算することにより、マサリマイシンの最終収率を計算する:
% 収率 =
x 100%
- フラッシュカラムを 10 カラム容量の移動相 (99:1 ヘキサン:イソプロパノール) で平衡化し、15 mL/minの流速に設定した装置を使用します。
- NMRによりマサリマイシンの構造を確認する。
- 約10mgのマサリマイシンサンプルを0.5mLのCDCl3に溶解する。パスツールピペットを使用して、溶液を5mmNMRチューブに移し、チューブをキャップする。NMRチューブを分光器に入れます。
- メーカーの事前設定された実験を使用して、1 H および 13C NMR スペクトルを取得します。ケミカルシフト割り当ておよび代表的なスペクトルは、 補足図3〜4に示されている。
- マサリマイシンを乾燥またはDMSO(最終濃度25mM)に溶解して使用時まで-20°Cで保存する。
x 100%3. マサリマイシンの調製のためのマイクロ波手順
- シクロヘキシルアミン、シクロヘキシルカルボキシアルデヒド、シクロヘキシルイソシアン化物、およびo-ヨード安息香酸の0.6 M溶液をアセトニトリル中に調製する。
- 攪拌子および10mLのアセトニトリルをガラスマイクロ波反応バイアルに加える。
- 2 mL のシクロヘキシルアミン (アセトニトリル中 0.6 M)、2 mL のシクロヘキシルカルボキシアルデヒド (アセトニトリル中 0.6 M)、および 7 mL のアセトニトリルをバイアルに加える。
- マイクロ波反応バイアルをマイクロ波カルーセルに入れる。混合物を攪拌し、400Wの電力設定で50°Cで30分間加熱し、室温まで冷却する。
- 2 mLのo-ヨード安息香酸(メタノール中0.6 M)および2 mLのシクロヘキシルイソシアン化物(アセトニトリル中0.6 M)をバイアルに加える。混合物を攪拌し、マイクロ波で100°Cに40分間400Wの電力設定で加熱し、室温まで冷却する。
- 工程3.5終了後にI2 蒸気を用いてTLC(90:10ヘキサン:イソプロパノール)により反応の進行をモニターする。
注:TLCが反応が不完全であることを示している場合(すなわち、TLC上の複数のスポット)、反応バイアルをマイクロ波に戻し、ステップ3.5で説明したマイクロ波条件を設定する。 - 反応が完了したら、溶液を100mLの丸底フラスコに注ぎ、ロータリーエバポレーターを使用して蒸発乾固させる。
- 上記のステップ2.6-2.16に従って、水性後処理、精製、およびマサリマイシンの特性評価を完了します。
4. 相乗効果と拮抗作用アッセイ
- 肺 炎連鎖球菌R6 を、嫌気的条件下で37°Cで5%(v/v)ヒツジの血液を含むミューラーヒントン(MH)寒天プレート上で増殖させる。全ての実験において、OD600 が〜0.4になるまで嫌気的条件下で37°Cで5mLのMHブロス中で増殖させた第2継代細胞を使用する。
- 被験者は、阻害剤マサリマイシンおよびオプトチンをそれぞれの溶媒中で連続1:2希釈し、得られた濃度を各阻害剤の最小阻害濃度(MIC)値に隣接させた。
- 100μMの濃度に達するまで、ジメチルスルホキシド(DMSO)中のマサリマイシンの初期希釈を行う。この時点から、MHブロスでマサリマイシン希釈液を作る。市販のオプトチン( 材料表を参照)を滅菌MHブロスに溶解してオプトチンストック溶液(3.5mM)を調製する。
注:マサリマイシンストック溶液は、DMSO中で25mMで作製した。
- 100μMの濃度に達するまで、ジメチルスルホキシド(DMSO)中のマサリマイシンの初期希釈を行う。この時点から、MHブロスでマサリマイシン希釈液を作る。市販のオプトチン( 材料表を参照)を滅菌MHブロスに溶解してオプトチンストック溶液(3.5mM)を調製する。
- 滅菌96ウェルマイクロタイタープレートに、各オプトチン希釈液の2μLアリコートをプレートの各列に加える。同じプレートに、各マサリマイシン希釈液の2 μLアリコートを各カラムに加え、プレート上にオプトチンおよびマサリマイシン濃度の配列を作成した(図2)。
- 上記の阻害剤を含む各ウェルに滅菌MHブロス(93μL)を加える。マイクロタイタープレートに、ステップ4.1から5μLの培養液(OD600〜0.4 )を接種する。
注:96ウェルプレートの接種は、通常、嫌気性ワークステーション内の嫌気的条件下で行われる。ウェル内の最終容量は100μLです。 - 嫌気的条件下で37°Cで18時間培養物を増殖させ、続いて0.01%(m/v)溶液のレサズリンナトリウム塩30 μLを添加した。プレートを室温で15分間インキュベートして、色の形成と安定化を可能にします。
注:レサズリン溶液は、化合物を蒸留水に溶解して調製され、4°Cで最大2週間保存することができる。 - プレートから濃度値を直接読み取り、細菌の増殖が観察されない最低の阻害剤濃度(青色)を[X](ステップ4.7.1参照)、すなわち、共薬剤の存在下での薬剤の最低阻害濃度として割り当てる。
注:正の細菌増殖は、ピンク色に変わるレサズリン色素によって井戸内で同定される。各薬物単独のMIC値は、(すなわち、共薬の非存在下で)各薬物を別々に有するレサズリンMICアッセイ35 を用いて同様の方法で決定される(補足図5)。 肺炎菌 のMICは、マサリマイシンおよびオプトチンについてそれぞれ7.8μMおよび15.85μMである。 - 分画阻害濃度(FIC)およびFIC指数(FICI)は、以下の式を用いて求める。
- FIC= [X]/MIC x、ここで、[X](ステップ4.6から)は、共薬の存在下での薬物の最低阻害濃度であり、MICxは、補薬物の非存在下における薬物の最低阻害濃度である。
- FICI = FICマサリマイシン + FIC抗生物質
注:FIC I<0.5=相乗的、0.5<FICI<1=相加的、1、FICI>4=拮抗的である。
5. 形態学的研究
- 枯 草菌 11774 を 1.5 % バクト寒天を含むルリア・ベルタニ (LB) 寒天プレート (10 g/L トリプトン、5 g/L 酵母エキス、および 5 g/L NaCl) で 37 °C で栽培します。 全ての実験において、OD600 =1になるまで37°Cで5mLのLBブロス中で増殖させた第2継代細胞を使用する。 S.pneumoniaeをステップ4.1 と同じ方法で成長させる。
- 枯草菌についてはOD600nm = 1、肺炎菌についてはOD600nm = 0.4で細胞培養密度を得た後、ピペットを用いてマサリマイシンを「処理」とラベル付けした培養チューブに添加し、終濃度3.8μM(枯草菌については0.75x MIC)、または5.85μM(肺炎菌については0.75x MIC)とする。「コントロール」とラベル付けした第2の培養チューブに、等量のDMSOを加える。
- B.subtilisの場合、サンプルを37°Cのインキュベーターに入れ、150rpmで振とうしながら90分間置く。肺炎菌の場合、嫌気性条件下で振盪することなく細胞をインキュベートする。
- 90分後、培養液の1:10混合物(v/v)および固定緩衝液(20mM HEPES、1%ホルムアルデヒド(pH6.8))で培養物を4°Cで一晩化学的に固定する。固定が完了したら、ピペットを使用して10〜20μLのサンプルをガラス顕微鏡スライドに塗布し、風乾させます。ブンゼンバーナーを用いてスライドガラスを加熱して風乾試料を固定する。
- 熱固定後、0.1%(m/v)メチレンブルー(20%(v/v)エタノール中の溶液)を100μL添加してサンプルを染色する。染色されたスライドを10分間インキュベートし、余分な色素をdH2Oで洗い流す。次いで、染色されたスライドをオーブン中で60°Cに15〜20分間穏やかに加熱し、細胞を共通の焦点面に連れて行く。
- 染色された細胞の上に顕微鏡カバースリップを置くことによって染色されたサンプルを密封する。次いで、顕微鏡スライドセメントを用いて縁部を密封する。密封した顕微鏡スライドを顕微鏡ステージに置き、明視野顕微鏡を用いて100倍の倍率で画像に焦点を合わせます。
- 顕微鏡スライドに液浸油を一滴置き、1000倍の倍率で視野を合わせます。顕微鏡に取り付けられたカメラとそれに関連するソフトウェアを使用して顕微鏡写真を取得します。ソフトウェアの自動ホワイトバランスと絞り設定を使用して画像を取得します。
メモ: または、オープンソースの ImageJ ソフトウェアを使用して画像を処理することもできます。
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Representative Results
マサリマイシンは、枯草菌および肺炎菌の小分子静菌阻害剤であり、枯草菌35、37における外効性GlcNAcase LytGを阻害し、肺炎菌37における細胞壁を標的とすることが示されている。マサリマイシンは、55%〜70%の範囲の収率を有する古典的またはマイクロ波支援有機合成のいずれかによって効率的に調製することができる。マイクロ波支援合成は、化合物を合成する時間を大幅に短縮するという利点を有する。マイクロ波支援合成は、同等の収率を維持しながら、合成を5〜6時間(従来の合成)から2〜3時間に短縮する。フラッシュクロマトグラフィーは、高純度のマサリマイシンの迅速な精製を提供する(補足図1〜2)。1Hおよび13CNMRスペクトルからの構造割り当てと代表的なスペクトルを補足図3〜4に示します。
相乗作用および拮抗作用スクリーニングは、細胞成分間の機能的結合(相乗効果)を明らかにし、薬物作用の遺伝的ネットワークおよびメカニズム(拮抗作用)を調査するための有用なツールとなり得る40。肺炎菌におけるATPase阻害剤オプトチンとの相乗効果/拮抗作用の評価を図2に示す。レサズリンマイクロタイタープレートアッセイ41は、生物の成長/非成長の容易な読み出しを提供する。細菌増殖を阻害する化合物の最低濃度(青色)は、共薬の存在下でMIC値として取られる。細菌が増殖する井戸の色はピンク色になります。マサリマイシンとオプトチンの関係は、プロトコールステップ4.7の式を用いて分画阻害剤濃度指数(FICI)を計算することによって決定した。マサリマイシン-オプトチン相互作用のFICI値は1.5と計算され、公表された標準42に基づく無関心な関係を示している。サブMIC濃度で枯草菌中のマサリマイシンを用いた表現型アッセイは、文献32で報告されたΔlytG変異体の表現型と異なり、複数のオートライシンノックアウト29によく似たソーセージ様表現型(図3B)を提示した。サブMIC濃度でのマサリマイシンを用いた肺炎菌の表現型解析は、凝集表現型を提示した(図3D)。この凝集表現型は、肺炎菌細胞壁作用型GlcNA症例43、44、45について報告されたものとは異なっている。
図1:枯草菌由来の外働きNアセチルグルコサミニダーゼLytGの切断部位を示すペプチドグリカンの構造。挿入図は、LytG阻害剤マサリマイシンの構造を示す。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図2: 肺炎菌におけるマサリマイシンおよびオプトチンとの拮抗的/相乗的関係を探るための相乗/拮抗作用アッセイ。 青色または紫色は細菌の増殖を示し、ピンク色は細菌の増殖を示す。併用薬物の存在下でのMICは、細菌増殖を示さない最低濃度(青色)として採取される。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図3:形態素解析0.75x MIC(MICB.subtilis = 3.8μMおよびMIC S.pneumoniae = 7.8μM)マサリマイシンで治療した場合の枯草菌(A,B)および肺炎菌(C,D)の形態学的変化。細胞を固定し、0.1%(m/v)メチレンブルーで染色し、1000倍の倍率で油浸下で明視野顕微鏡によって可視化した。この数値は 35 から修正されています。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
補足図1:水性後処理のマサリマイシンの代表的な薄層クロマトグラフィー。 移動相は90:10ヘキサン:イソプロパノールおよびヨウ素蒸気がスポットの染色に使用される。Rf =マサリマイシンについては0.3である。 このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。
補足図2:マサリマイシンの精製のための代表的なフラッシュクロマトグラム。 約1.2カラム容量のピークにはマサリマイシンが含まれています。 このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。
補足図3:CDCl3に溶解したマサリマイシンの代表的な1H NMR を、400MHz NMR分光計に記録した。スペクトルは、δ=7.26における残留CHCl3溶媒ピークを基準とする。化学シフトの上の緑色の数字は、マサリマイシンの構造中の対応する位置におけるプロトン割り当てを示す(挿入図を参照)。このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。
補足図4: 100MHzでCDCl3に溶解したマサリマイシンの代表的な13C NMRスペクトル。スペクトルはδ=77.36における残留CHCl3溶媒ピークを基準とした。上記の緑色の数字は、化学シフトの上で、マサリマイシンの構造中の位置における炭素原子の割り当てを示す(挿入図を参照)。このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。
補足図5:枯草菌に対するマサリマイシンの代表的なレサズリンMICアッセイ。このファイルをダウンロードするにはここをクリックしてください。
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Discussion
マサリマイシンは、枯草菌35および肺炎菌37増殖の単一微小モル静菌阻害剤である。枯草菌では、マサリマイシンがGlcNAcase LytG35を阻害することが示されているが、肺炎菌の細胞壁における正確な分子標的は同定されていない37。古典的な有機合成またはマイクロ波手順のいずれかを用いたマサリマイシンの合成は、阻害剤を良好な収率および高純度で提供する。マサリマイシンの収率が低いことは、典型的にはシクロヘキシルカルボキシアルデヒドの酸化に起因し得る。これを克服するには、シクロヘキシルカルボキシアルデヒドをデシケーター内の不活性雰囲気下で保存することが推奨される。アルデヒドから対応するカルボン酸への酸化は、ボトル内の白色固体として見ることができる。シクロヘキシルカルボキシアルデヒドを長期間保存せずに少量購入すると、この問題が大幅に軽減されます。
マサリマイシン構造のNMR割り当ては、アミド結合のシス型およびトランス型の混合物の存在、ならびに複数のピークをもたらすo−ヨードフェニル環の周りのアトロプ異性体の存在によって複雑になる。これにより、プロトン化学シフトが1ppmに広がり、割り当てが複雑になる可能性があります35。その結果、1Hおよび13CNMRスペクトルの両方に対するNMR化学シフトの部分的な割り当てが、代表スペクトルとともに補足図3〜4に提供される。異性体の混合物のためにマサリマイシンに1Hおよび13Cの化学シフトを割り当てることが困難な場合は、2次元NMR実験を使用することができる。相関分光法(COSY)はプロトンスピン系を同定するために使用でき、ヘテロ核単量子コヒーレンス分光法(HSQC)NMR実験はプロトン-炭素単結合相関を同定するために使用することができる。一旦精製されると、マサリマイシンは、油として-20°Cで保存するか、または必要になるまで25mMの濃度までDMSOに溶解させることができる。凍結融解サイクルの数を減らすために、小さなアリコートで保存することをお勧めします。化合物の凍結融解サイクルを繰り返した後、マサリマイシンストック溶液をTLCによってチェックして、分解を監視する必要があります。
相乗効果および拮抗作用スクリーンは、経路相互作用を同定するための効果的な戦略であり得、小分子の作用機序を理解するために使用することができる。 図2 は、マサリマイシンとATPase阻害剤オプトチンを用いた 肺炎菌 R6によるシナジー/アンタゴニズムアッセイの例を示しています( 枯草菌 におけるシナジー/アンタゴニズムスクリーニングはまだ進行中の研究であることに注意してください)。再現性のために、第2継代細胞を使用し、0.4以下のOD600nm まで増殖させた。1.5のFICI がマサリマイシンとオプトキンの間の相互作用について観察され、抗生物質対間の無関心な関係を示した。マサリマイシンとオプトチンとの間の無関心な関係は、これらの抗生物質が標的とする経路間の明らかな相互作用を示さないことを示している。これらのアッセイは薬物相互作用に関する有用な情報を提供することができますが、相乗効果/拮抗作用アッセイは、オッズ42で説明されているように、生物学的反復とより保守的なカットオフの使用で実行する必要があることに注意することが重要です。これは、観察されたマイナーな相乗的または拮抗的な関係の過剰解釈を防ぐのに役立ちます。
サブMICマサリマイシンで処理した枯草菌細胞の表現型解析(図3B)は、lytG32の遺伝的欠失について報告された表現型とは異なる表現型を示し、複数のオートライシン欠失を有する枯草菌株の表現型によりよく似ている29。表現型におけるこの不一致は、LytGのインビトロ阻害が35で実証されているのに対し、ΔlytG変異体は観察可能な表現型32を持たないため、興味深いものである。この不一致は、遺伝的および化学的不活性化の違いによって部分的に説明することができる46,47。LytGの化学的または遺伝的不活性化に観察された違いは、現在調査中の興味深い質問です。マサリマイシンで処理した肺炎菌細胞は、対応するGlcNAcase(GH73、クラスター2)LytB 37、43、44、48の遺伝的欠失とは異なる表現型(図3D)を提示した。この形態学的不一致は、作用機序を割り当てたり、小分子阻害剤の生物学的標的を帰属させたりする際の課題を強調している。形態学的表現型は、単一の遺伝的欠失または細胞壁作用酵素の化学的不活性化以外の相互作用のより複雑なセットから生じ得る。これらのメタ表現型34は、直接的(酵素の欠如)または間接的(調節因子の喪失)メカニズムを介した複雑な相互作用から生じ得る。
我々の知る限りでは、マサリマイシンは細菌増殖の阻害を示す細菌性自己分解の最初の阻害剤である(補足図5)。これは、枯草菌および肺炎菌における増殖の狭スペクトル静菌阻害剤である。この狭いスペクトルは、グラム陽性生物とグラム陰性生物の間の細胞壁代謝の多種比較研究の限界である。この狭いスペクトルは、グラム陽性(GlcNAcase)生物とグラム陰性(溶解性トランスグリコシラーゼ)生物との間の栄養成長中に使用されるグリコシル加水分解酵素オートリジンのいくつかの違いに部分的に起因している。PGオートリシンを阻害するためにマサリマイシンなどの小分子阻害剤を使用すること、特に、GlcNAcasesは、オートライシン機能を解明するための伝統的な遺伝学への直交的アプローチを提供することができる。マサリマイシンは、いくつかのケミカルバイオロジー法よりも明確な利点を持っています, それは、複数の種で使用することができるという点で (B. 枯草菌とS. 肺炎).これは、棒状(B. 枯草)およびコッカイド(S. pneumoniae)種。肺炎球菌における細胞壁代謝および分裂の共調節が少ないことは、棒状種49,50のより厳密に調節された系における対位法を提供する。この技術の将来の応用は、肺炎菌における分子標的を同定し、肺炎菌および枯草菌におけるオートライシンの遺伝的および化学的不活性化の違いを探求することである。
プロトコルの重要なステップ
生物学的および生化学的アッセイにおけるマサリマイシンの有効濃度に注意を払うことが重要です。その疎水性の性質上、250μMを超える濃度( 枯草菌の65倍のMIC)は、生物学的データの解釈に影響を与える可能性のある溶解度および凝集の問題をもたらす可能性がある。すべての実験においてビヒクル(すなわち DMSO)の効果について適切に制御することが不可欠である。
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Disclosures
リード、C.W.は、マサリマイシンの特定の用途を含む知的財産を有する。
Acknowledgments
研究は、助成金番号2009522の下で国立科学財団によって支援されました。マサリマイシンのNMR分析は、米国国立科学財団の助成金番号1919644の下で主要な研究機器プログラム賞によって支援されました。この資料で表明された意見、所見、結論、または勧告は著者のものであり、必ずしも国立科学財団の見解を反映するものではありません。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2-Iodobenzoic acid | SIGMA-ALDRICH | I7675-25G | corrosive, irritant, light yellow to orange-brown powder |
| 2-Propanol | SIGMA-ALDRICH | 109827-4L | flammable, irritant, colorless liquid |
| Acetonitrile | SIGMA-ALDRICH | 34851-4L | flammable, irritant, colorless liquid |
| Aluminum backed silica plates | Sorbtech | 4434126 | silica gel XG F254 on aluminum backed plates |
| chloroform-d | SIGMA-ALDRICH | 151823-50G | solvent for NMR |
| Compact Mass Spectrometer | Advion-Interchim | Advion CMS | compact mass spectrometer equiped with APCI source and atmospheric solids analysis probe |
| Corning Costar 96 well flat bottom plates-sterile | fisher chemical | 07-200-90 | for synergy/antagonism assays |
| cover slips | fisher chemical | 12-547 | for microscopy |
| Cyclohexanecarboxaldehyde | CHEM-IMPEX INT'L INC. | 24451 | flammable, irritant, colorless to pink liquid |
| Cyclohexyl isocyanide | SIGMA-ALDRICH | 133302-5G | irritant, colorless liquid, extremly unpleasant odor |
| Cyclohexylamine | SIGMA-ALDRICH | 240648-100ML | corrosive, flammable, irritant, colorless liquid unless contaminated |
| Ethyl acetate | SIGMA-ALDRICH | 537446-4L | flammable, irritant, colorless liquid |
| flash silica cartridge (12g) | Advion-Interchim | PF-50SIHP-F0012 | pack of flash silica columns (12g) for purification of masarimycin |
| formaldehyde | SIGMA-ALDRICH | F8775-25ML | fixing agent for microscopy |
| HEPES | SIGMA-ALDRICH | H8651-25G | buffer for microscopy fixing solution |
| Hexane, mixture of isomers | SIGMA-ALDRICH | 178918-4L | environmentally damaging, flammable, irritant, health hazard, colorless liquid |
| High performance compact mass spectrometer | Advion | expression | Atmospheric Solids Analysis Probe (ASAP), low resolution |
| High Vac | eppendorf | Vacufuge plus | vacuum aided by centrifugal force and temperature |
| Hydrochloric acid | SIGMA-ALDRICH | 258148-2.5L | corrosive, irritant, colorless liquid |
| hydrochloric acid | SIGMA-ALDRICH | 320331-2.5L | strong acid |
| immersion oil | fisher chemical | 12-365-19 | for microscopy |
| Iodine, resublimed crystals | Alfa Aesar | 41955 | environmentally damaging, irritant, health hazard, dark grey/purple crystals |
| Mestre Mnova | MestreLab Research | software for processing NMR spectra | |
| Methanol | SIGMA-ALDRICH | 439193-4L | flammable, toxic, health hazard, colorless liquid |
| methylene blue | SIGMA-ALDRICH | M9140-25G | microscopy stain for staining cell walls |
| meuller-hinton agar plates + 5% sheep blood | fisher chemical | B21176X | growth media for Streptococcus pneumoniae |
| meuller-hinton broth | fisher chemical | DF0757-17-6 | growth media for Streptococcus pneumoniae |
| microscope slides | fisher chemical | 22-310397 | for microscopy |
| Microwave Synthesis Labstation | MILESTONE | START SYNTH | device that requires the ventilation of a fume hood, equipped with synthesis carousel |
| NMR tubes | SIGMA-ALDRICH | Z562769-5EA | 5mm NMR tubes 600 MHz |
| Nuclear Magnetic Resonance (NMR) | Bruker | Ascend 400 | large superconducting magnet (400MHz) |
| optochin | fisher chemical | AAB21627MC | ethylhydrocupreine hydrochloride |
| petrie plates | Celltreat | 229695 | for preparing agar plates for bacterial growth |
| Primo Star Bright field/Phase contrast Microscope with ERc5s camera | Zeiss | for morphology studies | |
| puriFlash | interchim | XS520plus | flash chromatography purification system |
| resazurin | SIGMA-ALDRICH | R7017-1G | for synergy/antagonism assays |
| Rotary Evaporator | Heidolph | Hei-VAP Value "The Collegiate" | solvent evaporator |
| Sodium bicarbonate | SIGMA-ALDRICH | S6014-500G | irritant, white powder |
| Sodium chloride | fisher chemical | S271-1 | crystalline, colorless |
| Sodium chloride | SIGMA-ALDRICH | S5886-500G | for growth of B.subtilis and preparation of LB media |
| Sodium sulfate | SIGMA-ALDRICH | 7985592-500G | anhydrous, granular, white |
| tryptone | fisher chemical | BP1421-500 | for growth of B.subtilis and preparation of LB media |
| Whitney DG250 Workstation | Microbiology International | DG250 | anaerobic workstation. Anaerobic gas mixture used: 5% hydrogen, 10% carbon dioxide, balance nitrogen |
| yeast extract | fisher chemical | BP1422-500 | for growth of B.subtilis and preparation of LB media |
| Zen Lite (blue) software | Zeiss | for acquiring micrographs |
References
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