Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

Syntese av Masarimycin, en liten molekylhemmer av Gram-positiv bakterievekst

Published: January 7, 2022 doi: 10.3791/63191
Automatic Translation
1, 1, 1,2
1Department of Science and Technology, Bryant University, 2Center for Health and Behavioral Sciences, Bryant University

Summary

En detaljert protokoll presenteres for å forberede bakteriostatisk diamid masarimycin, en liten molekylsonde som hemmer veksten av Bacillus subtilis og Streptococcus pneumoniae ved å målrette celleveggforringelse. Dens anvendelse som en kjemisk sonde er demonstrert i synergi / antagonismeanalyser og morfologiske studier med B. subtilis og S. lungebetennelse.

Abstract

Peptidoglykan (PG) i bakterieveggen er en unik makromolekylær struktur som gir form og beskyttelse mot omgivelsene. Sentralt i forståelsen av cellevekst og -deling er kunnskapen om hvordan PG-nedbrytning påvirker biosyntese og celleveggmontering. Nylig har metabolsk merking av PG gjennom innføring av modifiserte sukkerarter eller aminosyrer blitt rapportert. Mens kjemisk avhør av biosyntetiske trinn med små molekylhemmere er mulig, er kjemiske biologiverktøy for å studere PG-nedbrytning av autolysiner underutviklet. Bakterielle autolysiner er en bred klasse enzymer som er involvert i tett koordinert nedbrytning av PG. Her presenteres en detaljert protokoll for å forberede en liten molekylsonde, masarimycin, som er en hemmer av N-acetylglucosaminidase LytG i Bacillus subtilis, og celleveggmetabolisme i Streptococcus pneumoniae. Tilberedning av inhibitoren via mikrobølgeassistert og klassisk organisk syntese er gitt. Dens anvendbarhet som et verktøy for å studere Gram-positiv fysiologi i biologiske analyser presenteres.

Introduction

Peptidoglykan (PG) er en maskelignende polymer som avgrenser celleform og struktur i både Gram-positive og Gram-negative bakterier 1,2. Denne heteropolymeren er en matrise av aminosukker kryssbundet av korte peptider 3,4,5,6 med en ryggrad som består av β-(1,4)-koblet vekslende N-acetylglukosamin (GlcNAc) og N-acetymuramsyre (MurNAc) rester (figur 1)1. Festet til C-3 laktylmoiety av MurNAc er stammen peptid. Metabolismen av PG innebærer et tett koordinert system av biosyntetiske og nedbrytende enzymer for å innlemme nytt materiale i celleveggen 7,8. Nedbrytning av PG utføres av enzymer samlet referert til som autolysiner9 og videre klassifisert basert på spesifisiteten av bindingen cleaved. Autolysiner deltar i mange cellulære prosesser, inkludert cellevekst, celledeling, motilitet, PG-modning, chemotaxis, proteinsekresjon, genetisk kompetanse, differensiering og patogenisitet10,11. Å avdekke de spesifikke biologiske funksjonene til individuelle autolysiner kan være skremmende, delvis på grunn av funksjonell redundans. Imidlertid har nyere biofysiske 8,12,13 og beregningsstudier12 gitt ny innsikt i deres roller i PG-metabolisme. I tillegg har nyere rapporter gitt ytterligere innsikt i syntesen14 og membranmediert 15,16,17 trinn i PG metabolisme. En grundig forståelse av sammenhengen mellom nedbrytende og syntetiske veier for PG-metabolisme kan føre til tidligere uutnyttede antibiotikamål.

Mens det har vært betydelige fremskritt i metodikk for å studere glykobiologi i eukaryoter, bakteriell glykobiologi og spesielt PG metabolisme har ikke avansert i en lignende hastighet. Nåværende kjemiske tilnærminger for å studere PG-metabolisme inkluderer fluorescerende merket antibiotika18, fluorescerende sonder19,20 og metabolsk merking 21,22,23,24. Disse nye tilnærmingene gir nye måter å forhøre bakteriell celleveggmetabolisme på. Mens noen av disse strategiene er i stand til å merke PG in vivo, kan de være artsspesifikke19, eller bare fungere i stammer som mangler en bestemt autolysin25. Mange PG-merkingsstrategier er beregnet for bruk med isolerte cellevegger26 eller med in vitro rekonstituerte PG biosynteseveier 20,27,28. Bruken av fluorescerende merkede antibiotika er for tiden begrenset til biosyntetiske trinn og transpeptidasjon18.

Den nåværende kunnskapen om bakterielle autolysiner og deres rolle i celleveggmetabolismen kommer fra genetisk og in vitro biokjemisk analyse 11,29,30,31,32. Selv om disse tilnærmingene har gitt et vell av informasjon om denne viktige klassen av enzymer, kan det være utfordrende å dechiffrere deres biologiske rolle. For eksempel, på grunn av funksjonell redundans33, fører sletting av en autolysin i de fleste tilfeller ikke til å stoppe bakterievekst. Dette til tross for deres underforståtte rolle i cellevekst og divisjon 7,12. En annen komplikasjon er at genetisk sletting av bakterielle autolysiner kan gi opphav til meta-fenotyper34. Meta-fenotyper oppstår fra det komplekse samspillet mellom banen som påvirkes av genetisk sletting og andre sammenkoblede veier. For eksempel kan en meta-fenotype oppstå via en direkte effekt som mangel på et enzym, eller en indirekte effekt som forstyrrelse av regulatorer.

For tiden er det bare noen få hemmere av glykosidase autolysiner som N-acetylglucosaminidases (GlcNAcase) og N-acetylmuramidaser, som kan brukes som kjemiske sonder for å studere nedbrytning av PG. For å løse dette har diamid masarimycin (tidligere kalt fgkc) blitt identifisert og karakterisert35 som en bakteriostatisk hemmer av Bacillus subtilis vekst som retter seg mot GlcNAcase LytG32 (figur 1). LytG er en ekso-fungerende GlcNAcase36, medlem av klynge 2 innen glykosylhydroksylfamilie 73 (GH73). Det er den store aktive GlcNAcase under vegetativ vekst32. Så vidt vi vet er masarimycin den første hemmeren av en PG-fungerende GlcNAcase som hemmer cellulær vekst. Ytterligere studier av masarimycin med Streptococcus pneumoniae fant at masarimycin sannsynligvis hemmer celleveggmetabolismen i denne organismen37. Her rapporteres utarbeidelsen av masarimycin for bruk som en kjemisk biologisonde for å studere fysiologi i Gram-positive organismer B. subtilis og S. lungebetennelse. Eksempler på morfologisk analyse av sub-minimum hemmende konsentrasjonsbehandling med masarimycin, samt en synergi/ antagonismeanalyse presenteres. Synergi- og antagonismeanalyser som bruker antibiotika med veldefinerte virkningsformer, kan være en nyttig måte å utforske sammenhenger mellom cellulære prosesser 38,39,40.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Generelle metoder

MERK: Alle forbindelser ble kjøpt fra standardleverandører og brukt uten ytterligere rensing.

  1. Utfør tynnlags kromatografi (TLC) på en aluminiumsplate forhåndsbelagt med silikagel XG F254. Oppdag flekker under en UV-lampe, ved nedsenking i p-anisaldehydflekk, eller ved å utsette for I2 damp.
  2. Registrer alle NMR-spektra (nuclear magnetic resonance) på et spektrometer på 400 MHz.
    MERK: 1H- NMR og 13C-NMR spektra ble referert til gjenværende løsemiddeltopper. Koblingskonstanter er gitt i [Hz] og kjemiske skift i [ppm].
  3. Registrer atmosfærisk trykk kjemisk ionisering (APCI) massespektrometrispektra av masarimycin på et kompakt massespektrometer utstyrt med en atmosfærisk solidsanalysesonde.

2. Generell prosedyre for fremstilling av masarimycin

MERK: Utfør trinnene nedenfor i en avtrekkshette.

  1. Forbered en 0,1 M løsning i metanol av hvert reaktant: cyclohexylamin, cyclohexylkarboksaldehyd, o-iodobenzosyre og cyclohexyl isocyanid35.
    FORSIKTIG: Cyclohexylamin, cyclohexyl isocyanid og cyclohexylkarboksaldehyd er brannfarlige. De kan forårsake hudkorrosjon og indusere oral, dermal, respiratorisk eller reproduktiv toksisitet. Hold forbindelser unna åpne flammer, varme overflater og tennkilder. Bruk passende hud- og øyebeskyttelse, arbeid i et godt ventilert område og unngå innånding av damper eller tåke. For lagring, hold flaskene tett lukket og oppbevar dem på et kjølig, tørt sted. Oppbevar cyclohexylkarboksaldehyd i en tørkeapparat under en N2-atmosfære .
  2. Bland 5 ml cyclohexylamin (0,1 M oppløsning i metanol) og 5 ml cyclohexylkarboksaldehyd (0,1 M i metanol) i en avkortet rund bunnflaske og rør løsningen ved hjelp av en magnetisk rørestang på en røre / varm plate i 30 min ved 40 ° C i et sandbad. Overvåk temperaturen ved hjelp av et termometer plassert ca. 1 cm under sandoverflaten.
  3. Etter 30 min, tilsett 5 ml cyklohexyl isocyanid (0,1 M oppløsning i metanol) til løsningen fra trinn 2.2 og rør i ytterligere 20 minutter ved 50 °C. Til slutt, tilsett 5 ml o-iodobenzoinsyre (0,1 M oppløsning i metanol) til reaksjonsblandingen og fortsett å røre ved 55 °C i 3-5 timer.
  4. Overvåk fremdriften av reaksjonen periodisk av TLC omtrent hver time etter at reaksjonsblandingen ovenfor hadde blitt omrørt i 3 timer.
  5. Klipp en 3 cm x 6 cm stripe med aluminiumsstøttet TLC-plate. Bruk en blyant nr. Bruk en mikrokapsel i glass, se ca. 5 μL av reaksjonsblandingen på TLC-platen og la den tørke.
  6. Til et 150 ml beger, legg til nok mobil fase (90:10 heksan: isopropanol) for å dekke bunnen av begeret. Bruk et par pinsett og plasser den ovennevnte TLC-platen forsiktig i begeret, slik at TLC-platen kommer jevnt inn i den mobile fasen. Dekk toppen av begeret med et stykke tinfoil.
    MERK: Pass på at mobilfasen ikke dekker linjen og den flekkete prøven.
  7. La den mobile fasen bevege seg opp TLC-platen til den er ca. 1 cm under toppen av platen. Fjern TLC-platen og bruk en blyant, tegn en linje som indikerer avstanden som er tilbakelagt av den mobile fasen. La TLC-platen tørke i en avtrekkshette.
  8. Når den er tørket, legg TLC-platen i et beger som inneholder en liten mengde solid I2 og dekk begeret med et stykke tinnfolie. Overvåk TLC for utvikling av gule/brune flekker. Når den er utviklet, fjern TLC-platen og merk plasseringen av flekkene med en blyant (tilleggsfigur 1).
    MERK: Hvis jeg ikke harmerket 2 flekker, vil flekken spre seg over tid. Flekker kan også visualiseres på TLC-platen ved UV-lys, p-anisaldehydfarging eller kaliumpermanganatfarging (se Tilleggsinformasjon).
  9. Beregn Rf-verdier for alle visualiserte flekker ved hjelp av følgende formel:
    Rf = Equation 1
  10. Vurder reaksjonen komplett når bare ett sted med Rf = 0,3 er synlig på TLC-platen. Fjern oppløsningsvæsken i en roterende fordamper under redusert trykk og tørk råproduktet (oppnådd som en gulbrun olje) under et høyt vakuum til all metanol fordampes.
  11. Løs opp det tørkede råproduktet i 30 ml etylacetat og overfør det til en separatortrakt. Trekk ut etylacetat sekvensielt med 1 M HCl (2 x 30 ml), H2O (30 ml), mettet NaHCO3-oppløsning (2 x 30 ml), H2O (30 ml) og mettet NaCl-oppløsning (2 x 30 ml). Kast de vandige lagene.
    MERK: Etylacetatlaget er det øverste laget i hver av ekstraksjonene. For hver ekstraksjon rister du separatortrakten som inneholder etylacetatet og vandig oppløsning (HCl, H2O, NaHCO3 eller NaCl) kraftig og lar lagene skille seg helt ut.
  12. Fjern etylacetatlaget fra separatortrakten og samle det i en Erlenmeyer-kolbe. Tilsett en slikkepott full av Na2SO4 (vannfri) for å fjerne restvann fra etylacetat.
    MERK: Etylacetatoppløsningen anses som tørr når Na2SO4 i kolben går fritt og ikke klumper seg. Hvis Na2SO4 klumper seg, kan en ekstra spatel av Na2SO4 legges til.
  13. Filtrer den tørkede etylacetatoppløsningen gjennom filterpapiret #1 for å fjerne Na2SO4. Vask filterpapiret med en liten mengde etylacetat. Plasser den filtrerte etylacetatoppløsningen i en rund bunnflaske og fjern løsningsmidlet på en roterende fordamper under redusert trykk for å oppnå masarimycin som olje når alt etylacetatet er fjernet.
  14. Løs opp masarimycinoljen oppnådd ovenfor i en minimal mengde (1-2 ml) på 9:1 heksan: isopropanol og rør på en magnetisk røreplate til all forbindelsen er oppløst.
  15. Rens oppløst masarimycin ved flashkromatografi ved hjelp av en 12 g normal fase silika flash kolonne.
    1. Likevekt blitskolonnen med 10 kolonnevolumer av mobilfase (99:1 heksan: isopropanol) med instrumentet satt til en strømningshastighet på 15 ml/min.
      MERK: Når likevekten er fullført, stopper du gjennomstrømningen og kobler toppen av kolonnen fra systemet.
    2. Trekk opp oppløst masarimycin ved hjelp av en 5 ml sprøyte. Koble sprøyten direkte til toppen av den likevektede blitskolonnen og injiser løsningen i kolonnen. Koble den innlastede kolonnen til blitskromatografisystemet på nytt, og start graderingsutvelgelsen.
    3. Elute masarimycin fra kolonnen ved hjelp av gradient elution til en endelig mobil fasekonsentrasjon på 10:90 heksan: isopropanol over 12 kolonnevolumer. Overvåk elution av masarimycin via absorpsjon ved 230 og 254 nm.
    4. Samle forbindelsene som er eluted fra kolonnen av en brøkdel samler som samler 20 ml løsningsmiddel per brøkdel.
      MERK: Hvis et blitskromatografisystem ikke er tilgjengelig, kan rensing av masarimycin utføres via en gravitasjonssiliikakolonne med en mobil fase på 3:1 (heksan: etylacetat). Brøker som inneholder masarimycin kan identifiseres ved hjelp av TLC ved hjelp av samme mobile fase. Visualisering av TLC flekker ble gjort med enten UV-lys, I2 damp, eller kaliumpermanganat farging.
    5. Identifiser brøker som inneholder masarimycin ved TLC (trinn 2,5-2,9) eller massespektrometri på et kompakt massespektrometer utstyrt med en atmosfærisk analysesonde for faste stoffer. Tørk sluttproduktet under vakuum (~0,3 mbar).
      MERK: Masarimycin oppnås rutinemessig som en fargeløs olje eller solid med et utbytte på 55%-70% med hensyn til mmol av cyclohexylkarboksaldehyd lagt til reaksjonen. Beregn det endelige utbyttet av masarimycin ved å oppnå massen av renset masarimycin og beregne det teoretiske utbyttet av reaksjonen ved hjelp av følgende formel:
      % avkastning = Equation 2 x 100 %
  16. Bekreft strukturen av masarimycin av NMR.
    1. Løs opp ~10 mg masarimycinprøve i 0,5 ml CDCl3. Bruk en Pasteur pipet, overfør løsningen til et 5 mm NMR-rør og hette røret. Plasser NMR-røret i spektrometeret.
    2. Skaff deg 1H og 13C NMR spektra ved hjelp av produsentens forhåndsinnstilte eksperimenter. Kjemiske skiftoppdrag og representativ spektra er gitt i supplerende figur 3-4.
  17. Oppbevar masarimycin tørr eller oppløst i DMSO (25 mM endelig konsentrasjon) ved -20 °C til bruk.

3. Mikrobølgeprosedyre for fremstilling av masarimycin

  1. Forbered 0,6 M løsninger av cyclohexylamin, cyclohexylkarboksaldehyd, cyclohexyl isocyanid og o-iodobenzoinsyre i acetonitril.
  2. Tilsett en rørestang og 10 ml acetonitril til et hetteglass med glassbølgereaksjon.
  3. Tilsett 2 ml cyclohexylamin (0,6 M i acetonitril), 2 ml cyklohexylkarboksaldehyd (0,6 M i acetonitril) og 7 ml acetonitril til hetteglasset.
  4. Plasser hetteglasset med mikrobølgereaksjon i mikrobølgekarusellen. Rør blandingen, varm den i 30 min ved 50 °C ved en effektinnstilling på 400 W, og la den avkjøles til romtemperatur.
  5. Tilsett 2 ml o-iodobenzoinsyre (0,6 M i metanol) og 2 ml cyklohexyl isocyanid (0,6 M i acetonitril) til hetteglasset. Rør blandingen, varm den til 100 °C i mikrobølgeovnen i 40 minutter ved en effektinnstilling på 400 W og la den avkjøles til romtemperatur.
  6. Overvåk fremdriften av reaksjonen av TLC (90:10 heksan: isopropanol) ved hjelp av I2 damp etter ferdigstillelse av trinn 3.5.
    MERK: Hvis TLC viser at reaksjonen er ufullstendig (dvs. flere flekker på TLC), plasserer du reaksjonsviften tilbake i mikrobølgeovnen og stiller inn mikrobølgeforholdene som er beskrevet i trinn 3.5.
  7. Når reaksjonen er fullført, hell løsningen i en 100 ml rundbunnsflaske og fordampe den til tørrhet ved hjelp av en roterende fordamper.
  8. Følg trinn 2.6-2.16 ovenfor for å fullføre den vandige opparbeidelsen, rensingen og karakteriseringen av masarimycin.

4. Synergi og antagonismeanalyse

  1. Vokse Streptococcus pneumoniae R6 på Mueller-Hinton (MH) agarplater som inneholder 5% (v / v) saueblod ved 37 ° C under anaerobe forhold. I alle eksperimenter, bruk andre passasjeceller vokst i 5 ml MH kjøttkraft ved 37 °C under anaerobe forhold til OD600 er ~0,4.
  2. Subjekt hemmerne masarimycin og optochin til serielle 1:2 fortynninger i respektive løsningsmidler, med de resulterende konsentrasjonene som flankerer minimumshemmerkonsentrasjonsverdiene (MIC) til hver inhibitor.
    1. Gjør den første fortynning av masarimycin i dimetylsulfoksid (DMSO) til en konsentrasjon på 100 μM er nådd. Fra dette punktet, gjør masarimycin fortynning i MH kjøttkraft. Forbered optochin lagerløsning (3,5 mM) ved å oppløse kommersielt tilgjengelig optochin (se Materialbord) i steril MH-buljong.
      MERK: Masarimycin lagerløsninger ble laget på 25 mM i DMSO.
  3. Til en steril 96-brønns mikrotitreplate, tilsett 2 μL aliquots av hver optochin fortynning til hver rad av platen. Til samme plate legger du til 2 μL aliquots av hver masarimycinfortynning til hver kolonne for å skape en rekke optochin- og masarimycinkonsentrasjoner på platen (figur 2).
  4. Tilsett steril MH-kjøttkraft (93 μL) i hver brønn som inneholder de ovennevnte inhibitorene. Inokuler mikrotitreplatene med 5 μL kultur (OD600 ~0,4) fra trinn 4.1.
    MERK: Inokulering av 96-brønnsplaten gjøres vanligvis under anaerobe forhold i en anaerob arbeidsstasjon. Det endelige volumet i brønnen er 100 μL.
  5. Voks kulturer i 18 timer ved 37 °C under anaerobe forhold, etterfulgt av tilsetning av 30 μL 0,01% (m/v) oppløsning av resazurin natriumsalt. Inkuber platen ved romtemperatur i 15 min for å tillate dannelse og stabilisering av farge.
    MERK: Resazurin-oppløsningen fremstilles ved å oppløse forbindelsen i destillert vann og kan lagres ved 4 °C i opptil to uker.
  6. Les konsentrasjonsverdiene direkte fra platen og tildel den laveste hemmerkonsentrasjonen som det ikke observeres bakterievekst for (blå farge) som [X] (se trinn 4.7.1), det vil si den laveste hemmende konsentrasjonen av legemidlet i nærvær av co-stoffet.
    MERK: Positiv bakterievekst identifiseres i brønnene ved at resazurinfargen blir rosa. MIC-verdier for hvert legemiddel alene (dvs. i fravær av co-drug) bestemmes på samme måte ved hjelp av resazurin MIC-analysen35 med hvert legemiddel separat (Supplerende figur 5). MICer i S. lungebetennelse er henholdsvis 7,8 μM og 15,85 μM for masarimycin og optochin.
  7. Bestem fraksjonell hemmende konsentrasjon (FIC) og FIC-indeks (FICI) ved hjelp av følgende ligninger.
    1. FIC = [X]/MICx, hvor [X] (fra trinn 4.6) er den laveste hemmende konsentrasjonen av stoffet i nærvær av co-drug, og MICx er den laveste hemmende konsentrasjonen av stoffet i fravær av co-drug.
    2. FICI = FICmasarimycin + FICantibiotika
      MERK: FICI < 0,5 = synergistisk, 0,5 < FICI < 1 = additiv, 1 < FICI < 4 = likegyldig, FICI > 4 = antagonistisk.

5. Morfologisk studie

  1. Vokse Bacillus subtilis 11774 på Luria-Bertani (LB) agar plater (10 g / L tryptone, 5 g / L gjær ekstrakt, og 5 g / L NaCl) som inneholder 1,5% Bacto agar ved 37 °C. I alle eksperimenter, bruk andre passasjeceller vokst i 5 ml LB kjøttkraft ved 37 °C til OD600 = 1. Vokse S.pneumoniae på samme måte som i trinn 4.1.
  2. Etter å ha fått en cellekulturtetthet med OD600nm = 1 for B. subtilis, eller OD600nm = 0,4 for S. lungebetennelse, tilsett masarimycin ved hjelp av en pipette til kulturrøret merket "behandlet" til en endelig konsentrasjon på 3,8 μM (0,75x MIC for B.subtilis), eller 5,85 μM (0,75x MIC for S.pneumoniae). Til det andre kulturrøret merket "kontroll", legg til et tilsvarende volum DMSO.
  3. For B.subtilis, plasser prøvene i en inkubator ved 37 °C i 90 minutter med risting ved 150 o/min. For S. lungebetennelse, inkuber cellene uten å riste under anaerobe forhold.
  4. Etter 90 min, kjemisk fikse kulturer i en 1:10 blanding (v / v) av kulturmedier og fikseringsbuffer (20 mM HEPES, 1% formaldehyd (pH 6.8)) ved 4 °C over natten. Etter at festen er fullført, bruk 10-20 μL prøver på glassmikroskopsklier ved hjelp av en pipette og la dem lufttørke. Fest de lufttørkede prøvene ved å varme opp glasssklier ved hjelp av en Bunsen-brenner.
  5. Etter varmefiksing, flekkprøver med tilsetning av 100 μL 0,1% (m / v) metylenblå (løsning i 20% (v / v) etanol). Inkuber de fargede lysbildene i 10 min og vask bort overflødig fargestoff med dH2O. Varm deretter forsiktig de fargede lysbildene til 60 °C i en ovn i 15-20 minutter for å bringe celler til et felles fokusplan.
  6. Forsegle de fargede prøvene ved å plassere et mikroskopdeksler over de fargede cellene. Deretter forsegler du kantene ved hjelp av mikroskopskliesement. Plasser det forseglede mikroskopet på mikroskopstadiet og sett bildet i fokus ved 100x forstørrelse ved hjelp av lysfeltmikroskopi.
  7. Plasser en dråpe nedsenkningsolje på mikroskopet og ta synsfeltet i fokus ved hjelp av 1000x forstørrelse. Anskaffe mikrografer ved hjelp av et kamera festet til mikroskopet og tilhørende programvare. Hent bilder ved hjelp av innstillingene for automatisk hvitbalanse og blenderåpning på programvaren.
    MERK: Alternativt kan bilder behandles ved hjelp av open source ImageJ-programvaren.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Masarimycin er en liten molekylbakteriostatisk hemmer av B. subtilis og S. pneumoniae og har vist seg å hemme den ekso-fungerende GlcNAcase LytG i B. subtilis35,37 og målrette celleveggen i S. pneumoniae37. Masarimycin kan effektivt tilberedes enten av den klassiske eller mikrobølgeassisterte organiske syntesen med utbytter i området 55%-70%. Mikrobølgeassistert syntese har fordelen av en betydelig reduksjon i tid for å syntetisere forbindelsen. Mikrobølgeassistert syntese forkorter syntesen fra 5-6 t (tradisjonell syntese) til 2-3 timer samtidig som sammenlignbare utbytter opprettholdes. Flashkromatografi gir en rask rensing av masarimycin i høy renhet (Supplerende figur 1-2). Strukturelle oppgaver fra 1H og 13C NMR spektra sammen med representativ spektra er gitt i supplerende figur 3-4.

Synergi- og antagonismeskjermer kan være et nyttig verktøy for å avdekke funksjonelle forbindelser mellom cellulære komponenter (synergi) og for å undersøke genetiske nettverk og mekanismer for narkotikavirkning (antagonisme)40. Evaluering av synergi/antagonisme med ATPase-hemmeren optochin i S. pneumoniae er presentert i figur 2. Resazurin mikrotitre plateanalyse41 gir en enkel avlesning av organismens vekst / ikke-vekst. Den laveste konsentrasjonen av forbindelse for å hemme bakterievekst (blå farge) er tatt som MIC-verdien i nærvær av et ko-stoff. Brønner med bakterievekst vil være rosa i fargen. Forholdet mellom masarimycin og optochin ble bestemt ved å beregne konsentrasjonsindeksen for fraksjonshemmer (FICI) ved hjelp av ligninger i protokolltrinn 4.7. FICI-verdien for masarimycin-optochin-interaksjonen er beregnet til å være 1,5, noe som indikerer et likegyldig forhold basert på publiserte standarder42. Fenotypiske analyser ved bruk av masarimycin i B. subtilis ved sub-MIC-konsentrasjoner presenterte en pølselignende fenotype (figur 3B) som skiller seg fra rapporterte fenotyper av ΔlytG-mutanten i litteraturen32 og ligner nærmere på flere autolysin knockouts29. Fenotypisk analyse av S. pneumoniae med masarimycin ved sub-MIC-konsentrasjoner presenterte en klumpende fenotype (figur 3D). Denne klumpende fenotypen skiller seg fra de som er rapportert for S. pneumoniae celle-vegg-fungerende GlcNAcases 43,44,45.

Figure 1
Figur 1: Struktur av peptidoglykan som viser spaltningsstedet til ekso-fungerende N-acetylglukoseaminidase LytG fra Bacillus subtilis. Inset viser strukturen til LytG-hemmeren masarimycin. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 2
Figur 2: Synergi/antagonismeanalyse for å utforske antagonistiske/synergistiske forhold til masarimycin og optochin i S. lungebetennelse. Blå eller lilla farge indikerer ingen bakterievekst, mens rosa farge indikerer bakteriell vekst. MIC i nærvær av co-drug er tatt som den laveste konsentrasjonen som ikke viser bakterievekst (blå farge). Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 3
Figur 3: Morfologisk analyse. Morfologiske endringer i B. subtilis (A, B) og S. pneumoniae (C,D) når de behandles med 0,75x MIC (MICB.subtilis = 3,8 μM og MICS.pneumoniae = 7,8 μM) masarimycin. Celler ble festet og farget med 0,1% (m / v) metylenblå og visualisert av lysfeltmikroskopi under olje nedsenking ved 1000x forstørrelse. Dette tallet er endret fra 35. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Supplerende figur 1: Representativ tynn lagkromatografi av masarimycin post vandig workup. Den mobile fasen er 90:10 heksan: isopropanol og joddamp brukes til farging av flekker. Rf = 0,3 for masarimycin. Klikk her for å laste ned denne filen.

Supplerende figur 2: Representativt blitskromatogram for rensing av masarimycin. Toppen på ca. 1,2 kolonnevolum inneholder masarimycin. Klikk her for å laste ned denne filen.

Supplerende figur 3: Representativ 1H NMR av masarimycin oppløst i CDCl3 og innspilt på et 400 MHz NMR spektrometer. Det refereres til spektrum til gjenværende CHCl 3-løsningsmiddeltopp ved δ = 7,26. Tall i grønt over kjemiske skift indikerer protonoppdrag ved tilsvarende posisjoner i masarimycinstrukturen (se innsett). Klikk her for å laste ned denne filen.

Supplerende figur 4: Representativt 13C NMR-spekter av masarimycin oppløst i CDCl3 ved 100 MHz. Spektrum referert til gjenværende CHCl 3-løsningsmiddeltopp ved δ = 77,36. Tall i grønt over kjemiske skift indikerer karbonatomoppgaver i posisjonene i masarimycinstrukturen (se innsett). Klikk her for å laste ned denne filen.

Supplerende figur 5: Representativ resazurin MIC-analyse av masarimycin mot B. subtilis. Klikk her for å laste ned denne filen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Masarimycin er en enkelt mikromolar bakteriostatisk hemmer av B. subtilis35 og S. lungebetennelse37 vekst. I B. subtilis har masarimycin vist seg å hemme GlcNAcase LytG35, mens det nøyaktige molekylære målet i celleveggen til S. lungebetennelse ikke er identifisert37. Syntese av masarimycin ved hjelp av enten den klassiske organiske syntesen eller mikrobølgeprosedyren gir inhibitoren i godt utbytte og høy renhet. Lave utbytter av masarimycin kan vanligvis tilskrives oksidasjon av cyclohexylkarboksaldehyd. For å overvinne dette anbefales det å lagre cyclohexylkarboksaldehyd under en inert atmosfære i en desiccator. Oksidasjon av aldehyden til den tilsvarende karboksylsyren kan ses på som et hvitt fast stoff i flasken. Å kjøpe små mengder cyclohexylkarboksaldehyd uten å lagre den i lengre perioder reduserer dette problemet sterkt.

NMR-tildeling av masarimycinstruktur er komplisert av tilstedeværelsen av en blanding av cis og transformer av amidbindingen, samt atropisomerer rundt o-iodofenylringen som resulterer i flere topper. Dette kan resultere i et proton kjemisk skifte spredt over 1 ppm og dermed komplisere oppdrag35. Som et resultat er delvis tildeling av NMR kjemiske skift for både 1H og 13C NMR spektra sammen med representativ spektra gitt i supplerende tall 3-4. Hvis det er vanskeligheter med å tildele 1H og 13C kjemiske skift for masarimycin på grunn av blandingen av isomerer, kan 2-dimensjonale NMR-eksperimenter brukes. Korrelert spektroskopi (COSY) kan brukes til å identifisere protonspinnsystemer, mens heteronukleære enkeltantekoherensspektroskopi (HSQC) NMR-eksperimenter kan brukes til å identifisere protonkarbon enkeltbindingskorrelasjoner. Når den er renset, kan masarimycin lagres ved -20 °C som olje eller oppløses i DMSO til en konsentrasjon på 25 mM til det er nødvendig. Det anbefales å lagre i små aliquots for å redusere antall fryse-tine sykluser. Etter gjentatte fryse-tine sykluser av forbindelsen, masarimycin lager løsning bør kontrolleres av TLC for å overvåke for noen nedbrytning.

Synergi- og antagonismeskjermer kan være en effektiv strategi for å identifisere baneinteraksjoner og kan brukes til å forstå virkningsmåten til små molekyler. Figur 2 viser et eksempel på en synergi/antagonismeanalyse med S. lungebetennelse R6 ved bruk av masarimycin og ATPase-hemmeren optochin (merk at synergi/antagonismescreening i B. subtilis fortsatt er en pågående undersøkelse). For reproduserbarhet ble andre passasjeceller brukt og vokst til en OD600nm på ikke mer enn 0,4. En FICI på 1,5 ble observert for samspillet mellom masarimycin og optochin, noe som indikerer et likegyldig forhold mellom antibiotikaparet. Det likegyldige forholdet mellom masarimycin og optochin indikerer ingen tilsynelatende interaksjon mellom veiene disse antibiotikamålet. Selv om disse analysene kan gi nyttig informasjon om legemiddelinteraksjoner, er det viktig å merke seg at synergi/antagonismeanalyser bør kjøres med biologiske replikeringer og bruk av de mer konservative avskjæringene som beskrevet av Odds42. Dette bidrar til å forhindre overtolkning av observerte mindre synergistiske eller antagonistiske forhold.

Fenotypisk analyse av B. subtilis-celler behandlet med sub-MIC masarimycin (figur 3B) indikerer en fenotype som skiller seg fra fenotyper rapportert for genetisk sletting av lytG32 og ligner nærmere fenotyper av B. subtilis stammer med flere autolysinslettinger29. Dette avviket i fenotype er spennende fordi mens in vitro-hemming av LytG har blitt demontert35, har en ΔlytG mutant ingen observerbar fenotype32. Denne uoverensstemmelsen kan delvis forklares med forskjeller i genetisk og kjemisk inaktivering46,47. De observerte forskjellene i kjemisk eller genetisk inaktivering av LytG er et spennende spørsmål som for tiden er under undersøkelse. S. lungebetennelse celler behandlet med masarimycin presenterte en fenotype (figur 3D) forskjellig fra genetisk sletting av tilsvarende GlcNAcase (GH73, klynge 2) LytB 37,43,44,48. Denne morfologiske uoverensstemmelsen fremhever utfordringene ved å tildele virkningsmåten eller tilskrive det biologiske målet til små molekylhemmere. Morfologiske fenotyper kan oppstå fra et mer komplekst sett med andre interaksjoner enn en enkelt genetisk sletting eller kjemisk inaktivering av et celleveggvirkende enzym. Disse meta-fenotypene34 kan oppstå fra komplekse interaksjoner via direkte (mangel på et enzym(er)) eller indirekte (tap av regulatorer) mekanismer.

Så vidt vi vet er masarimycin den første hemmeren av en bakteriell autolysin som viser hemming av bakterievekst (supplerende figur 5). Det er en smalspektret bakteriostatisk hemmer av vekst i B. subtilis og S.pneumoniae. Dette smale spekteret er en begrensning for multi-arter komparative studier av celleveggmetabolisme mellom Gram-positive og Gram-negative organismer. Dette smale spekteret skyldes delvis forskjeller i noen av glykosylhydrolysinene som brukes under vegetativ vekst mellom Gram-positive (GlcNAcase) og Gram-negative (lytiske transglykosylase) organismer. Ved hjelp av småmolekylhemmere som masarimycin for å hemme PG autolysiner, spesielt, kan GlcNAcases gi en ortogonal tilnærming til tradisjonell genetikk for å belyse autolysinfunksjon. Masarimycin har en klar fordel i forhold til noen kjemiske biologimetoder, ved at den kan brukes i mer enn en art (B. subtilis og S. pneumoniae). Det kan tillate komparative studier av celleveggmetabolisme mellom stangformet (B. subtilis) og coccoid (S. pneumoniae) arter. Den mindre kjernegulerte celleveggmetabolismen og delingen i S. lungebetennelse gir et motpunkt i det tettere regulerte systemet med stangformede arter49,50. Fremtidige anvendelser av denne teknikken vil være å identifisere molekylært mål i S.pneumoniae og utforske forskjellene mellom genetisk og kjemisk inaktivering av autolysiner i S.pneumoniae og B. subtilis.

Kritiske trinn i protokollen
Det er viktig å være oppmerksom på den effektive konsentrasjonen av masarimycin i biologiske og biokjemiske analyser. På grunn av sin hydrofobe natur kan konsentrasjoner over 250 μM (65x MIC i B. subtilis) føre til løselighet og aggregasjonsproblemer som kan påvirke tolkningen av biologiske data. Riktig styring for effekten av kjøretøy (dvs. DMSO) i alle eksperimenter er viktig.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Reid, C. W. har intellektuell eiendom som involverer spesifikke anvendelser av masarimycin.

Acknowledgments

Forskningen ble støttet av National Science Foundation under tilskuddsnummer 2009522. NMR-analyse av masarimycin ble støttet av National Science Foundations store forskningsinstrumenteringsprogrampris under tilskuddsnummer 1919644. Eventuelle meninger, funn og konklusjoner, eller anbefalinger uttrykt i dette materialet, er forfatternes og gjenspeiler ikke nødvendigvis synspunktene til National Science Foundation.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
2-Iodobenzoic acid SIGMA-ALDRICH I7675-25G corrosive, irritant, light yellow to orange-brown powder
2-Propanol SIGMA-ALDRICH 109827-4L flammable, irritant, colorless liquid
Acetonitrile SIGMA-ALDRICH 34851-4L flammable, irritant, colorless liquid
Aluminum backed silica plates Sorbtech 4434126 silica gel XG F254 on aluminum backed plates
chloroform-d SIGMA-ALDRICH 151823-50G solvent for NMR
Compact Mass Spectrometer Advion-Interchim Advion CMS compact mass spectrometer equiped with APCI source and atmospheric solids analysis probe
Corning Costar 96 well flat bottom plates-sterile fisher chemical 07-200-90 for synergy/antagonism assays
cover slips fisher chemical 12-547 for microscopy
Cyclohexanecarboxaldehyde CHEM-IMPEX INT'L INC. 24451 flammable, irritant, colorless to pink liquid
Cyclohexyl isocyanide SIGMA-ALDRICH 133302-5G irritant, colorless liquid, extremly unpleasant odor
Cyclohexylamine SIGMA-ALDRICH 240648-100ML corrosive, flammable, irritant, colorless liquid unless contaminated
Ethyl acetate SIGMA-ALDRICH 537446-4L flammable, irritant, colorless liquid
flash silica cartridge (12g) Advion-Interchim PF-50SIHP-F0012 pack of flash silica columns (12g) for purification of masarimycin
formaldehyde SIGMA-ALDRICH F8775-25ML fixing agent for microscopy
HEPES SIGMA-ALDRICH H8651-25G buffer for microscopy fixing solution
Hexane, mixture of isomers SIGMA-ALDRICH 178918-4L environmentally damaging, flammable, irritant, health hazard, colorless liquid
High performance compact mass spectrometer Advion expression Atmospheric Solids Analysis Probe (ASAP), low resolution
High Vac eppendorf Vacufuge plus vacuum aided by centrifugal force and temperature
Hydrochloric acid SIGMA-ALDRICH 258148-2.5L corrosive, irritant, colorless liquid
hydrochloric acid SIGMA-ALDRICH 320331-2.5L strong acid
immersion oil fisher chemical 12-365-19 for microscopy
Iodine, resublimed crystals Alfa Aesar 41955 environmentally damaging, irritant, health hazard, dark grey/purple crystals
Mestre Mnova MestreLab Research software for processing NMR spectra
Methanol SIGMA-ALDRICH 439193-4L flammable, toxic, health hazard, colorless liquid
methylene blue SIGMA-ALDRICH M9140-25G microscopy stain for staining cell walls
meuller-hinton agar plates + 5% sheep blood fisher chemical B21176X growth media for Streptococcus pneumoniae
meuller-hinton broth fisher chemical DF0757-17-6 growth media for Streptococcus pneumoniae
microscope slides fisher chemical 22-310397 for microscopy
Microwave Synthesis Labstation MILESTONE START SYNTH device that requires the ventilation of a fume hood, equipped with synthesis carousel
NMR tubes SIGMA-ALDRICH Z562769-5EA 5mm NMR tubes 600 MHz
Nuclear Magnetic Resonance (NMR) Bruker Ascend 400 large superconducting magnet (400MHz)
optochin fisher chemical AAB21627MC ethylhydrocupreine hydrochloride
petrie plates Celltreat 229695 for preparing agar plates for bacterial growth
Primo Star Bright field/Phase contrast Microscope with ERc5s camera Zeiss for morphology studies
puriFlash interchim XS520plus flash chromatography purification system
resazurin SIGMA-ALDRICH R7017-1G for synergy/antagonism assays
Rotary Evaporator Heidolph Hei-VAP Value "The Collegiate" solvent evaporator
Sodium bicarbonate SIGMA-ALDRICH S6014-500G irritant, white powder
Sodium chloride fisher chemical S271-1 crystalline, colorless
Sodium chloride SIGMA-ALDRICH S5886-500G for growth of B.subtilis and preparation of LB media
Sodium sulfate SIGMA-ALDRICH 7985592-500G anhydrous, granular, white
tryptone fisher chemical BP1421-500 for growth of B.subtilis and preparation of LB media
Whitney DG250 Workstation Microbiology International DG250 anaerobic workstation. Anaerobic gas mixture used: 5% hydrogen, 10% carbon dioxide, balance nitrogen
yeast extract fisher chemical BP1422-500 for growth of B.subtilis and preparation of LB media
Zen Lite (blue) software Zeiss for acquiring micrographs

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Vollmer, W., Blanot, D., de Pedro, M. A. Peptidoglycan structure and architecture. FEMS Microbiology Review. 32 (2), 149-167 (2008).
  2. Munita, J. M., Bayer, A. S., Arias, C. A. Evolving resistance among Gram-positive pathogens. Clinical Infectious Diseases. 61, suppl-2 48-57 (2015).
  3. Vollmer, W., Bertsche, U. Murein (peptidoglycan) structure, architecture and biosynthesis in Escherichia coli. Biochimica Biophysica Acta. 1778 (9), 1714-1734 (2008).
  4. Vollmer, W., Höltje, J. -V. The architecture of the murein (peptidoglycan) in Gram-negative bacteria: vertical scaffold or horizontal layer(s). Journal of Bacteriology. 186 (18), 5978-5987 (2004).
  5. Clarke, A. J. Compositional analysis of peptidoglycan by high-performance anion-exchange chromatography. Analytical Biochemistry. 212 (2), 344-350 (1993).
  6. Kim, S. J., Chang, J., Singh, M. Peptidoglycan architecture of Gram-positive bacteria by solid-state NMR. Biochimica Biophysica Acta. 1848, 350-362 (2014).
  7. Koch, A. L., Doyle, R. J. Inside-to-outside growth and turnover of the wall of gram-positive rods. Journal of Theoretical Biology. 117 (1), 137-157 (1985).
  8. Beeby, M., Gumbart, J. C., Roux, B., Jensen, G. J. Architecture and assembly of the Gram-positive cell wall. Molecular Microbiology. 88 (4), 664-672 (2013).
  9. Shockman, G. D., Daneo-Moore, L., Kariyama, R., Massidda, O. Bacterial walls, peptidoglycan hydrolases, autolysins, and autolysis. Microbial Drug Resistance. 2 (1), 95-98 (1996).
  10. Dijkstra, A. J., Keck, W. Peptidoglycan as a barrier to transenvelope transport. Journal of Bacteriology. 178 (19), 5555-5562 (1996).
  11. Blackman, S. A., Smith, T. J., Foster, S. J. The role of autolysins during vegetative growth of Bacillus subtilis 168. Microbiology. 144, 73-82 (1998).
  12. Misra, G., Rojas, E. R., Gopinathan, A., Huang, K. C. Mechanical consequences of cell-wall turnover in the elongation of a Gram-positive bacterium. Biophysical Journal. 104 (11), 2342-2352 (2013).
  13. Wheeler, R., et al. Bacterial cell enlargement requires control of cell wall stiffness mediated by peptidoglycan hydrolases. mBio. 6 (4), 00660 (2015).
  14. Taguchi, A., Kahne, D., Walker, S. Chemical tools to characterize peptidoglycan synthases. Current Opinion in Chemical Biology. 53, 44-50 (2019).
  15. Welsh, M. A., Schaefer, K., Taguchi, A., Kahne, D., Walker, S. Direction of chain growth and substrate preferences of shape, elongation, division, and sporulation-family peptidoglycan glycosyltransferases. Journal of the American Chemial Society. 141 (33), 12994-12997 (2019).
  16. Rubino, F. A., et al. Detection of transport intermediates in the peptidoglycan flippase MurJ identifies residues essential for conformational cycling. Journal of the American Chemical Society. 142 (12), 5482-5486 (2020).
  17. Sjodt, M., et al. Structure of the peptidoglycan polymerase RodA resolved by evolutionary coupling analysis. Nature. 556 (7699), 118-121 (2018).
  18. Tiyanont, K., et al. Imaging peptidoglycan biosynthesis in Bacillus subtilis with fluorescent antibiotics. Proceedings of the National Academy of Science U S A. 103 (29), 11033-11038 (2006).
  19. Lebar, M. D., et al. Reconstitution of peptidoglycan cross-linking leads to improved fluorescent probes of cell wall synthesis. Journal of the American Chemical Society. 136 (31), 10874-10877 (2014).
  20. Do, T., Page, J. E., Walker, S. Uncovering the activities, biological roles, and regulation of bacterial cell wall hydrolases and tailoring enzymes. Journal of Biological Chemistry. 295 (10), 3347-3361 (2020).
  21. Liang, H., et al. Metabolic labelling of the carbohydrate core in bacterial peptidoglycan and its applications. Nature Communications. 8, 15015 (2017).
  22. DeMeester, K. E., et al. Metabolic incorporation of N-acetyl muramic acid probes into bacterial peptidoglycan. Current Protocol in Chemical Biology. 11 (4), 74 (2019).
  23. Lazor, K. M., et al. Use of Bioorthogonal N-acetylcysteamine (SNAc) analogues and peptidoglycan O-acetyltransferase B (PatB) to label peptidoglycan. The FASEB Journal. 32, 630 (2018).
  24. Wang, Y., Leimkuhler-Grimes, C. Fluorescent labeling of the carbohydrate backbone of peptidoglycan to track degradation in vivo. The FASEB Journal. 29, (2015).
  25. Kuru, E., et al. In probing of newly synthesized peptidoglycan in live bacteria with fluorescent D-amino acids. Angewandte Chemie International Edition. 51 (50), 12519-12523 (2012).
  26. Zhou, R., Chen, S., Recsei, P. A dye release assay for determination of lysostaphin activity. Analytical Biochemistry. 171 (1), 141-144 (1988).
  27. Qiao, Y., et al. Lipid II overproduction allows direct assay of transpeptidase inhibition by β-lactams. Nature Chemical Biology. 13 (7), 793-798 (2017).
  28. Lebar, M. D., et al. Forming cross-linked peptidoglycan from synthetic Gram-negative lipid II. Journal of the American Chemical Society. 135 (12), 4632-4635 (2013).
  29. Chen, R., Guttenplan, S. B., Blair, K. M., Kearns, D. B. Role of the D-dependent autolysins in Bacillus subtilis population heterogeneity. Journal of Bacteriology. 191 (18), 5775-5784 (2009).
  30. Yukie, S., Miki, K., Yoshio, N., Kuniaki, T., Yoshihisa, Y. Identification and characterization of an autolysin-encoding gene of Streptococcus mutans. Infection and Immunity. 73 (6), 3512-3520 (2005).
  31. Domenech, M., García, E., Moscoso, M. In vitro destruction of Streptococcus pneumoniae biofilms with bacterial and phage peptidoglycan hydrolases. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 55 (9), 4144-4148 (2011).
  32. Horsburgh, G. J., Atrih, A., Williamson, M. P., Foster, S. J. LytG of Bacillus subtilis is a novel peptidoglycan hydrolase: the major active glucosaminidase. Biochemistry. 42 (2), 257-264 (2003).
  33. Vermassen, A., et al. Cell wall hydrolases in bacteria: insight on the diversity of cell wall amidases, glycosidases and peptidases toward peptidoglycan. Frontiers in Microbiology. 10, 331 (2019).
  34. Martin-Galiano, A. J., Yuste, J., Cercenado, M. I., de la Campa, A. G. Inspecting the potential physiological and biomedical value of 44 conserved uncharacterised proteins of Streptococcus pneumoniae. BMC Genomics. 15, 652 (2014).
  35. Nayyab, S., et al. Diamide inhibitors of the Bacillus subtilis N-acetylglucosaminidase LytG that exhibit antibacterial activity. ACS Infectioius Diseases. 3 (6), 421-427 (2017).
  36. Lipski, A., et al. Structural and biochemical characterization of the β-N-acetylglucosaminidase from Thermotoga maritima: Toward rationalization of mechanistic knowledge in the GH73 family. Glycobiology. 25 (3), 319-330 (2014).
  37. Haubrich, B. A., et al. Inhibition of Streptococcus pneumoniae autolysins highlight distinct differences between chemical and genetic inactivation. bioRxiv. , 300541 (2020).
  38. Farha, M. A., et al. Inhibition of WTA synthesis blocks the cooperative action of PBPs and sensitizes MRSA to β-lactams. ACS Chemical Biology. 8 (1), 226-233 (2013).
  39. Lehár, J., et al. Chemical combination effects predict connectivity in biological systems. Molecular Systems Biology. 3 (1), 80 (2007).
  40. Farha, M. A., et al. Antagonism screen for inhibitors of bacterial cell wall biogenesis uncovers an inhibitor of undecaprenyl diphosphate synthase. Proceedings of the National Academy of Science U S A. 112 (35), 11048-11053 (2015).
  41. Palomino, J. C., et al. Resazurin microtiter assay plate: simple and inexpensive method for detection of drug resistance in Mycobacterium tuberculosis. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 46 (8), 2720-2722 (2002).
  42. Odds, F. C. Synergy, antagonism, and what the chequerboard puts between them. Journal of Antimicrobial Chemotherapy. 52 (1), 1 (2003).
  43. Arrigucci, R., Pozzi, G. Identification of the chain-dispersing peptidoglycan hydrolase LytB of Streptococcus gordonii. PLoS One. 12 (4), 0176117 (2017).
  44. Bai, X. -H., et al. Structure of pneumococcal peptidoglycan hydrolase LytB reveals insights into the bacterial cell wall remodeling and pathogenesis. of Biological Chemistry. 289 (34), 23403-23416 (2014).
  45. Garcia, P., Gonzalez, M. P., Garcia, E., Lopez, R., Garcia, J. L. LytB, a novel pneumococcal murein hydrolase essential for cell separation. Molecular Microbiology. 31 (4), 1275-1281 (1999).
  46. Giladi, M., Altman-Price, N., Levin, I., Levy, L., Mevarech, M. FolM, a new chromosomally encoded dihydrofolate reductase in Escherichia coli. Journal of Bacteriology. 185 (23), 7015-7018 (2003).
  47. Chua, P. R., et al. Effective killing of the human pathogen Candida albicans by a specific inhibitor of non-essential mitotic kinesin Kip1p. Molecular Microbiology. 65 (2), 347-362 (2007).
  48. Rico-Lastres, P., et al. Substrate recognition and catalysis by LytB, a pneumococcal peptidoglycan hydrolase involved in virulence. Scientific Reports. 5, 16198 (2015).
  49. Vollmer, W., et al. The cell wall of Streptococcus pneumoniae. Microbiology Spectrum. 7 (3), (2019).
  50. Massidda, O., Nováková, L., Vollmer, W. From models to pathogens: how much have we learned about Streptococcus pneumoniae cell division. Environmental Microbiology. 15 (12), 3133-3157 (2013).

Tags

Biokjemi Utgave 179 Peptidoglykan metabolisme autolysin kjemisk biologi inhibitor cellevegg
Syntese av Masarimycin, en liten molekylhemmer av Gram-positiv bakterievekst
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Gallati, M., Point, B., Reid, C. W.… More

Gallati, M., Point, B., Reid, C. W. Synthesis of Masarimycin, a Small Molecule Inhibitor of Gram-Positive Bacterial Growth. J. Vis. Exp. (179), e63191, doi:10.3791/63191 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter