Summary
Представлен подробный протокол получения бактериостатического диамида масаримицина, маломолекулярного зонда, который ингибирует рост Bacillus subtilis и Streptococcus pneumoniae путем нацеливания на деградацию клеточной стенки. Его применение в качестве химического зонда продемонстрировано в анализах синергизма/антагонизма и морфологических исследованиях с B. subtilis и S. pneumoniae.
Abstract
Пептидогликан (ПГ) в клеточной стенке бактерий представляет собой уникальную макромолекулярную структуру, которая придает форму и защиту от окружающей среды. Центральное место в понимании роста и деления клеток занимает знание того, как деградация ПГ влияет на биосинтез и сборку клеточной стенки. Недавно сообщалось о метаболической маркировке ПГ путем введения модифицированных сахаров или аминокислот. В то время как химический опрос биосинтетических ступеней с ингибиторами малых молекул возможен, инструменты химической биологии для изучения деградации ПГ автолизинами недостаточно развиты. Бактериальные аутолизины представляют собой широкий класс ферментов, которые участвуют в жестко скоординированной деградации ПГ. Здесь представлен подробный протокол приготовления маломолекулярного зонда масаримицина, который является ингибитором N-ацетилглюкозаминидазы LytG в Bacillus subtilis, и метаболизма клеточной стенки у Streptococcus pneumoniae. Обеспечивается получение ингибитора путем микроволнового и классического органического синтеза. Представлена его применимость как инструмента изучения грамположительной физиологии в биологических анализах.
Introduction
Пептидогликан (PG) представляет собой сетчатый полимер, который очерчивает форму и структуру клеток как у грамположительных, так и у грамотрицательныхбактерий 1,2. Этот гетерополимер представляет собой матрицу аминосахаров, сшитыхкороткими пептидами 3,4,5,6 с основой, состоящей из β-(1,4)-связанных чередующихся N-ацетилглюкозамин (GlcNAc) и N-ацетилмураминовой кислоты (MurNAc) остатков (Рисунок 1)1. К лактиловому фрагменту C-3 MurNAc прикреплен стволовый пептид. Метаболизм ПГ включает в себя тесно скоординированную систему биосинтетических и деградирующих ферментов для включения нового материала в клеточную стенку 7,8. Деградация ПГ осуществляется ферментами, которые в совокупности называются аутолизинами9 и далее классифицируются на основе специфичности расщепленной связи. Аутолизины участвуют во многих клеточных процессах, включая рост клеток, деление клеток, подвижность, созревание ПГ, хемотаксис, секрецию белка, генетическую компетентность, дифференцировку и патогенность10,11. Разгадка специфических биологических функций отдельных аутолизинов может быть сложной задачей, отчасти из-за функциональной избыточности. Тем не менее, недавние биофизические 8,12,13 и вычислительные исследования12 дали новое представление об их роли в метаболизме PG. Кроме того, недавние отчеты дали дальнейшее представление о синтезе14 и мембранно-опосредованных 15,16,17 шагах метаболизма PG. Глубокое понимание взаимосвязи между деградирующими и синтетическими путями метаболизма ПГ может привести к появлению ранее неиспользованных мишеней антибиотиков.
Хотя были достигнуты значительные успехи в методологии изучения гликобиологии у эукариот, бактериальная гликобиология и, в частности, метаболизм ПГ не развивались с одинаковой скоростью. Современные химические подходы к изучению метаболизма ПГ включают флуоресцентно меченые антибиотики18, флуоресцентные зонды19,20 и метаболическую маркировку 21,22,23,24. Эти новые подходы предоставляют новые способы опроса метаболизма бактериальной клеточной стенки. Хотя некоторые из этих стратегий способны маркировать PG in vivo, они могут быть видоспецифичными19 или работать только в штаммах, не имеющих определенного автолизина25. Многие стратегии маркировки ПГ предназначены для использования с изолированными клеточными стенками26 или с восстановленными in vitro путями биосинтезаПГ 20,27,28. Использование флуоресцентно меченных антибиотиков в настоящее время ограничено биосинтетическими этапами и транспептидацией18.
Современные знания о бактериальных аутолизинах и их роли в метаболизме клеточных стенок получены из генетического и биохимического анализа in vitro 11,29,30,31,32. Хотя эти подходы предоставили богатую информацию об этом важном классе ферментов, расшифровка их биологической роли может быть сложной задачей. Например, из-за функциональной избыточности33 удаление аутолизина в большинстве случаев не приводит к остановке роста бактерий. И это несмотря на их подразумеваемую роль в росте и делении клеток 7,12. Другое осложнение заключается в том, что генетическая делеция бактериальных аутолизинов может привести к метафенотипам34. Метафенотипы возникают в результате сложного взаимодействия между путем, на который влияет генетическая делеция, и другими взаимосвязанными путями. Например, метафенотип может возникнуть через прямой эффект, такой как отсутствие фермента, или косвенный эффект, такой как нарушение работы регуляторов.
В настоящее время существует всего несколько ингибиторов аутолизинов гликозидазы, таких как N-ацетилглюкозаминидазы (GlcNAcase) и N-ацетилмурамидазы, которые могут быть использованы в качестве химических зондов для изучения деградации ПГ. Чтобы решить эту проблему, диамид масаримицин (ранее называемый fgkc) был идентифицирован и охарактеризован35 как бактериостатический ингибитор роста Bacillus subtilis, который нацелен на GlcNAcase LytG32 (рисунок 1). LytG представляет собой GlcNAcase36 экзоактивного действия, член кластера 2 в семействе гликозилгидролаз 73 (GH73). Это основной активный GlcNAcase во время вегетативного роста32. Насколько нам известно, масаримицин является первым ингибитором PG-действующего GlcNAcase, который ингибирует клеточный рост. Дополнительные исследования масаримицина со Streptococcus pneumoniae показали, что масаримицин, вероятно, ингибирует метаболизм клеточной стенки в этом организме37. Здесь сообщается о препарате масаримицина для использования в качестве химико-биологического зонда для изучения физиологии у грамположительных организмов B. subtilis и S. pneumoniae. Приведены примеры морфологического анализа лечения субминутной ингибирующей концентрацией масаримицином, а также анализ синергизма/антагонизма. Анализ синергии и антагонизма с использованием антибиотиков с четко определенными способами действия может быть полезным способом изучения связей между клеточными процессами 38,39,40.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Общие методы
ПРИМЕЧАНИЕ: Все соединения были закуплены у стандартных поставщиков и использовались без дальнейшей очистки.
- Проводят тонкослойную хроматографию (TLC) на алюминиевой пластине, предварительно покрытой силикагелем XG F254. Обнаружение пятен под ультрафиолетовой лампой, путем погружения в пятно p-анизальдегида или путем воздействия пара I2.
- Регистрируйте все спектры ядерного магнитного резонанса (ЯМР) на спектрометре 400 МГц.
ПРИМЕЧАНИЕ: 1Н-ЯМР и 13спектров С-ЯМР были отнесены к остаточным пикам растворителей. Константы связи задаются в [Гц], а химические сдвиги в [ppm]. - Запись масс-спектрометрии масс-спектрометрии масаримицина химической ионизации атмосферного давления (APCI) на компактном масс-спектрометре, оснащенном зондом анализа атмосферных твердых тел.
2. Общий порядок приготовления масаримицина
ПРИМЕЧАНИЕ: Выполните следующие шаги в вытяжном шкафу.
- Готовят раствор 0,1 М в метаноле каждого реагента: циклогексиламина, циклогексилкарбоксальдегида, о-йодобенсой кислоты и циклогексилизоцианида35.
ВНИМАНИЕ: Циклогексиламин, циклогексилизоцианид и циклогексилкарбоксальдегид являются легковоспламеняющимися. Они могут вызвать коррозию кожи и вызвать пероральную, кожную, респираторную или репродуктивную токсичность. Храните соединения вдали от открытого пламени, горячих поверхностей и источников воспламенения. Носите соответствующую защиту кожи и глаз, работайте в хорошо проветриваемом помещении и избегайте вдыхания паров или тумана. Для хранения держите бутылки плотно закрытыми и храните их в прохладном, сухом месте. Хранить циклогексилкарбоксальдегид в осушителе при атмосфереN2 . - Смешайте 5 мл циклогексиламина (0,1 М раствора в метаноле) и 5 мл циклогексилкарбоксальдегида (0,1 М в метаноле) в колбе с круглым дном и перемешайте раствор с помощью магнитного перемешивателя на мешалке/горячей плите в течение 30 мин при 40 °C в песчаной ванне. Контролируйте температуру с помощью термометра, расположенного примерно на 1 см ниже поверхности песка.
- Через 30 мин добавляют 5 мл циклогексилизоцианида (0,1 М раствора в метаноле) в раствор со стадии 2.2 и перемешивают в течение дополнительных 20 мин при 50°С. Наконец, добавляют 5 мл о-йодбензойной кислоты (0,1 М раствора в метаноле) в реакционную смесь и продолжают перемешивание при 55 °C в течение 3-5 ч.
- Периодически контролируют ход реакции с помощью TLC примерно каждый час после того, как вышеуказанная реакционная смесь перемешивается в течение 3 ч.
- Вырежьте полосу TLC размером 3 см х 6 см с алюминиевой подложкой. С помощью карандаша No2 нарисуйте линию примерно на расстоянии 1 см от дна. Используя стеклянный микрокапилляр, нанесите примерно 5 мкл реакционной смеси на пластину TLC и дайте ей высохнуть.
- К стакану объемом 150 мл добавьте достаточно подвижной фазы (гексан 90:10: изопропанол), чтобы покрыть нижнюю часть стакана. Используя пару пинцетов, аккуратно поместите вышеуказанную пластину TLC в стакан, гарантируя, что пластина TLC равномерно входит в подвижную фазу. Накройте верхнюю часть стакана куском фольги.
ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь, что подвижная фаза не покрывает линию и пятнистый образец. - Позвольте подвижной фазе перемещаться вверх по пластине TLC до тех пор, пока она не окажется примерно на 1 см ниже верхней части пластины. Снимите пластину TLC и карандашом нарисуйте линию, указывающую расстояние, пройденное подвижной фазой. Дайте пластине TLC высохнуть в вытяжке.
- После высыхания поместите пластину TLC в стакан, содержащий небольшое количество твердого вещества I2 , и накройте стакан кусочком оловянной фольги. Следите за TLC на предмет развития желтых/коричневых пятен. После разработки снимите пластину TLC и отметьте расположение пятен карандашом (дополнительный рисунок 1).
ПРИМЕЧАНИЕ: Если I2 пятна не отмечены, пятно будет рассеиваться с течением времени. Пятна также могут быть визуализированы на пластине TLC с помощью ультрафиолетового света, окрашивания p-анизальдегидом или окрашивания перманганатом калия (см. Дополнительную информацию). - Вычислите значения Rf для всех визуализированных пятен, используя следующую формулу:
Rf =
- Считать реакцию завершенной, когда на пластине TLC видно только одно пятно с Rf = 0,3. Удалите растворитель в ротационном испарителе под пониженным давлением и высушите сырой продукт (полученный в виде желтовато-коричневого масла) под высоким вакуумом до тех пор, пока весь метанол не испарится.
- Растворите высушенный сырой продукт в 30 мл этилацетата и переложите его в сепараторную воронку. Экстрагировать этилацетат последовательно с 1 M HCl (2 х 30 мл), H2O (30 мл), насыщенным раствором NaHCO3 (2 х 30 мл), H2O (30 мл) и насыщенным раствором NaCl (2 х 30 мл). Отбросьте водные слои.
ПРИМЕЧАНИЕ: Слой этилацетата является верхним слоем в каждой из экстракций. Для каждой экстракции энергично встряхните сепараторную воронку, содержащую этилацетат и водный раствор (HCl,H2O, NaHCO3 или NaCl) и дайте слоям полностью разделиться. - Удалите слой этилацетата из сепараторной воронки и соберите его в колбу Эрленмейера. Добавьте шпатель, полный Na2SO4 (безводный), чтобы удалить остаточную воду из этилацетата.
ПРИМЕЧАНИЕ: Раствор этилацетата считается сухим, когда Na2SO4 в колбе работает свободно и не слипается. Если Na2SO4 слипается, можно добавить дополнительный шпатель Na2SO4 . - Процедите высушенный раствор этилацетата через фильтровальную бумагу No1 для удаленияNa2SO4. Промыть фильтровальную бумагу небольшим количеством этилацетата. Поместите отфильтрованный раствор этилацетата в колбу с круглым дном и удалите растворитель на ротационном испарителе под пониженным давлением, чтобы получить масаримицин в виде масла после удаления всего этилацетата.
- Масаримициновое масло, полученное выше, растворяют в минимальном количестве (1-2 мл) гексана 9:1: изопропанола и перемешивают на магнитной пластине перемешивания до тех пор, пока все соединение не растворится.
- Очищают растворенный масаримицин методом флэш-хроматографии с использованием 12 г колонки вспышки кремнезема нормальной фазы.
- Уравновешивайте колонку вспышки 10 колоннами объемов подвижной фазы (гексан 99:1: изопропанол) прибором, установленным со скоростью потока 15 мл/мин.
ПРИМЕЧАНИЕ: После завершения уравновешивания остановите поток и отсоедините верхнюю часть колонны от системы. - Нанесите растворенный масаримицин с помощью шприца объемом 5 мл. Подключите шприц непосредственно к верхней части уравновешенной колонки вспышки и введите раствор в колонну. Повторно подключите загруженный столбец к системе флэш-хроматографии и инициируйте градиентное элюирование.
- Элют масаримицин из колонки с использованием градиентного элюирования до конечной концентрации подвижной фазы 10:90 гексана: изопропанола на 12 колонных объемах. Контролируют элюирование масаримицина путем абсорбции при 230 и 254 нм.
- Соберите соединения, элюированные из колонны, дробным коллектором, который собирает 20 мл растворителя на фракцию.
ПРИМЕЧАНИЕ: Если система флэш-хроматографии недоступна, очистка масаримицина может быть выполнена через гравитационную кремнеземную колонну с подвижной фазой 3:1 (гексан: этилацетат). Фракции, содержащие масаримицин, могут быть идентифицированы с помощью TLC с использованием той же подвижной фазы. Визуализация пятен TLC проводилась либо с помощью ультрафиолетового света, I2 пара, либо окрашивания перманганатом калия. - Идентификация фракций, содержащих масаримицин, с помощью TLC (этапы 2.5-2.9) или масс-спектрометрии на компактном масс-спектрометре, оснащенном зондом для анализа атмосферных твердых частиц. Высушите конечный продукт под вакуумом (~0,3 мбар).
ПРИМЕЧАНИЕ: Масаримицин обычно получают в виде бесцветного масла или твердого вещества с выходом 55%-70% по отношению к ммоль циклогексилкарбоксальдегида, добавленного в реакцию. Рассчитать конечный выход масаримицина можно путем получения массы очищенного масаримицина и расчета теоретического выхода реакции по следующей формуле:
% доходность =
x 100%
- Уравновешивайте колонку вспышки 10 колоннами объемов подвижной фазы (гексан 99:1: изопропанол) прибором, установленным со скоростью потока 15 мл/мин.
- Подтвердить структуру масаримицина методом ЯМР.
- Растворить ~10 мг образца масаримицина в 0,5 мл CDCl3. Используя пипетку Пастера, перенесите раствор в 5-миллиметровую ЯМР-трубку и закройте трубку. Поместите ЯМР-трубку в спектрометр.
- Приобретитеспектры ЯМР 1 H и 13C с помощью предустановленных производителем экспериментов. Назначения химических сдвигов и репрезентативные спектры приведены в дополнительных рисунках 3-4.
- Хранить масаримицин сухо или растворенным в ДМСО (конечная концентрация 25 мМ) при -20 °C до начала использования.
x 100%3. Микроволновая процедура приготовления масаримицина
- Готовят 0,6 М растворов циклогексиламина, циклогексилкарбоксальдегида, циклогексилизоцианида и о-йодбензойной кислоты в ацетонитриле.
- Добавьте перемешивание и 10 мл ацетонитрила в стеклянный флакон микроволновой реакции.
- Добавьте 2 мл циклогексиламина (0,6 М в ацетонитриле), 2 мл циклогексилкарбоксальдегида (0,6 М в ацетонитриле) и 7 мл ацетонитрила во флакон.
- Поместите флакон микроволновой реакции в микроволновую карусель. Перемешайте смесь, нагрейте ее в течение 30 мин при 50°C при мощности 400 Вт и дайте остыть до комнатной температуры.
- Добавьте во флакон 2 мл о-йодбензойной кислоты (0,6 М в метаноле) и 2 мл циклогексилизоцианида (0,6 М в ацетонитриле). Перемешайте смесь, нагрейте ее до 100 °C в микроволновой печи в течение 40 мин при мощности 400 Вт и дайте остыть до комнатной температуры.
- Контролируют ход реакции методом TLC (90:10 гексан: изопропанол) с использованием пара I2 после завершения этапа 3.5.
ПРИМЕЧАНИЕ: Если TLC показывает, что реакция является неполной (т.е. несколько пятен на TLC), поместите реакционный флакон обратно в микроволновую печь и установите микроволновые условия, описанные на этапе 3.5. - Как только реакция будет завершена, налейте раствор в колбу круглого дна объемом 100 мл и испарите его до сухости с помощью роторного испарителя.
- Выполните шаги 2.6-2.16 выше, чтобы завершить водную обработку, очистку и характеристику масаримицина.
4. Анализ синергии и антагонизма
- Выращивают Streptococcus pneumoniae R6 на агаровых пластинах Мюллера-Хинтона (MH), содержащих 5% (v/v) овечьей крови при 37 °C в анаэробных условиях. Во всех экспериментах используют клетки второго прохода, выращенные в 5 мл бульона MH при 37 °C в анаэробных условиях, пока OD600 не составит ~ 0,4.
- Подвергайте ингибиторы масаримицина и оптохина последовательным разведениям 1:2 в соответствующих растворителях, при этом полученные концентрации приближаются к значениям минимальной ингибирующей концентрации (МИК) каждого ингибитора.
- Производят начальное разведение масаримицина в диметилсульфоксиде (ДМСО) до достижения концентрации 100 мкМ. С этого момента делают разведения масаримицина в бульоне MH. Готовят раствор оптохина (3,5 мМ) путем растворения коммерчески доступного оптохина (см. Таблицу материалов) в стерильном отваре MH.
ПРИМЕЧАНИЕ: Растворы масаримицина были изготовлены на 25 мМ в ДМСО.
- Производят начальное разведение масаримицина в диметилсульфоксиде (ДМСО) до достижения концентрации 100 мкМ. С этого момента делают разведения масаримицина в бульоне MH. Готовят раствор оптохина (3,5 мМ) путем растворения коммерчески доступного оптохина (см. Таблицу материалов) в стерильном отваре MH.
- К стерильной 96-луночной микротитровой пластине добавляют 2 мкл аликвоты каждого оптохина в каждый ряд пластины. К той же пластине добавляют 2 мкл аликвот каждого разведения масаримицина в каждую колонку, чтобы создать массив концентраций оптохина и масаримицина на пластине (рисунок 2).
- Добавьте стерильный отвар MH (93 мкл) в каждую лунку, содержащую вышеуказанные ингибиторы. Инокулируют микротитрные пластины 5 мкл культуры (OD600 ~0,4) со стадии 4.1.
ПРИМЕЧАНИЕ: Инокуляция 96-луночной пластины обычно проводится в анаэробных условиях на анаэробной рабочей станции. Конечный объем в скважине составляет 100 мкл. - Выращивать культуры в течение 18 ч при 37 °С в анаэробных условиях с последующим добавлением 30 мкл 0,01% (м/об) раствора натриевой соли ресазурина. Инкубируйте пластину при комнатной температуре в течение 15 мин, чтобы обеспечить образование и стабилизацию цвета.
ПРИМЕЧАНИЕ: Раствор ресазурина получают путем растворения соединения в дистиллированной воде и могут храниться при 4 °C до двух недель. - Непосредственно считывайте значения концентрации с пластины и назначайте самую низкую концентрацию ингибитора, для которой не наблюдается роста бактерий (синий цвет), как [X] (см. этап 4.7.1), т.е. самую низкую ингибирующую концентрацию лекарственного средства в присутствии сопрепарата.
ПРИМЕЧАНИЕ: Положительный бактериальный рост выявляется в колодцах по розовому красителю ресазурина. Значения MIC для каждого лекарственного средства в отдельности (т.е. при отсутствии ко-препарата) определяют аналогичным образом с использованием анализа35 ресазурина MIC с каждым препаратом отдельно (дополнительная фиг.5). MICs в S. pneumoniae составляют 7,8 мкМ и 15,85 мкМ для масаримицина и оптохина соответственно. - Определите фракционную ингибирующую концентрацию (FIC) и индекс FIC (FICI) с помощью следующих уравнений.
- FIC= [X]/MICx, где [X] (из стадии 4.6) - самая низкая ингибирующая концентрация лекарственного средства в присутствии ко-лекарственного средства, а MICx - самая низкая ингибирующая концентрация лекарственного средства в отсутствие ко-препарата.
- FICI = FICмасаримицин +антибиотик FIC
ПРИМЕЧАНИЕ: FICI < 0,5 = синергетический, 0,5 < FICI < 1 = аддитивный, 1 < FICI < 4 = безразличный, FICI > 4 = антагонистический.
5. Морфологическое исследование
- Выращивайте Bacillus subtilis 11774 на агаровых пластинах Luria-Bertani (LB) (10 г / л триптона, 5 г / л дрожжевого экстракта и 5 г / л NaCl), содержащих 1,5% бакто-агара при 37 °C. Во всех экспериментах используют клетки второго прохода, выращенные в 5 мл бульона LB при 37 °C до OD600 = 1. Выращивайте S.pneumoniae таким же образом, как и на шаге 4.1.
- После получения плотности клеточной культуры с OD600 нм = 1 для B. subtilis или OD600 нм = 0,4 для S. pneumoniae, добавляют масаримицин с помощью пипетки в культуральную трубку, помеченную как «обработанная», до конечной концентрации 3,8 мкМ (0,75x MIC для B.subtilis) или 5,85 мкМ (0,75x MIC для S.pneumoniae). Ко второй культуральной трубке с надписью «контрольная» добавляют эквивалентный объем ДМСО.
- Для B.subtilis поместите образцы в инкубатор при 37 °C в течение 90 мин с встряхиванием при 150 об/мин. Для S. pneumoniae инкубируют клетки без встряхивания в анаэробных условиях.
- Через 90 мин химически фиксируют культуры в смеси 1:10 (v/v) питательных сред и фиксирующего буфера (20 мМ HEPES, 1% формальдегида (pH 6,8)) при 4 °C в течение ночи. После завершения фиксации нанесите 10-20 мкл образцов на предметные стекла стеклянного микроскопа с помощью пипетки и дайте им высохнуть на воздухе. Зафиксируйте высушенные на воздухе образцы, нагревая стеклянные слайды с помощью горелки Бунзена.
- После термофиксации окрашивают образцы с добавлением 100 мкл 0,1% (м/об) метиленового синего (раствор в 20% (v/v) этанола). Инкубировать окрашенные горки в течение 10 мин и смыть лишний краситель с dH2O. Затем аккуратно нагрейте окрашенные слайды до 60 °C в духовке в течение 15-20 мин, чтобы вывести клетки в общую фокальную плоскость.
- Запечатайте окрашенные образцы, поместив крышку микроскопа на окрашенные клетки. Затем запечатайте края с помощью цемента микроскопа. Поместите запечатанный слайд микроскопа на ступень микроскопа и сфокусируйте изображение с 100-кратным увеличением с помощью микроскопии яркого поля.
- Поместите каплю погружного масла на предметное стекло микроскопа и доведите поле зрения до фокусировки с помощью 1000-кратного увеличения. Получайте микроснимки с помощью камеры, прикрепленной к микроскопу, и связанного с ним программного обеспечения. Получайте изображения с помощью автоматического баланса белого и настроек диафрагмы в программном обеспечении.
ПРИМЕЧАНИЕ: Кроме того, изображения могут быть обработаны с использованием программного обеспечения ImageJ с открытым исходным кодом.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Масаримицин является низкомолекулярным бактериостатическим ингибитором B. subtilis и S. pneumoniae и, как было показано, ингибирует экзо-действующий GlcNAcase LytG в B. subtilis35,37 и нацелен на клеточную стенку в S. pneumoniae37. Масаримицин может быть эффективно получен либо классическим, либо микроволновым органическим синтезом с выходом в диапазоне 55-70%. Микроволновый синтез имеет преимущество значительного сокращения времени синтеза соединения. Микроволновый синтез сокращает синтез с 5-6 ч (традиционный синтез) до 2-3 ч при сохранении сопоставимых выходов. Флэш-хроматография обеспечивает быструю очистку масаримицина в высокой чистоте (Дополнительные рисунки 1-2). Структурные назначения из спектров ЯМР 1H и 13C вместе с репрезентативными спектрами приведены в дополнительных рисунках 3-4.
Экраны синергии и антагонизма могут быть полезным инструментом для выявления функциональных связей между клеточными компонентами (синергия) и для исследования генетических сетей и механизмов действия лекарств (антагонизм)40. Оценка синергизма/антагонизма с ингибитором АТФазы оптохином у S. pneumoniae представлена на рисунке 2. Анализ микротитровой пластины41 ресазурина обеспечивает легкое считывание роста/нерастания организма. Самая низкая концентрация соединения для ингибирования роста бактерий (синий цвет) принимается за значение MIC в присутствии совместного препарата. Лунки с бактериальным ростом будут розового цвета. Взаимосвязь между масаримицином и оптохином определяли путем расчета индекса концентрации фракционного ингибитора (FICI) с использованием уравнений на этапе протокола 4.7. Значение FICI для взаимодействия масаримицин-оптохин рассчитано как 1,5, что указывает на индифферентную связь на основе опубликованных стандартов42. Фенотипические анализы с использованием масаримицина в B. subtilis в суб-MIC концентрациях представляли колбасоподобный фенотип (рисунок 3B), который отличается от зарегистрированных фенотипов мутанта ΔlytG в литературе32 и более похож на множественные нокауты автолизина29. Фенотипический анализ S. pneumoniae с масаримицином в суб-MIC концентрациях показал слипающийся фенотип (рисунок 3D). Этот сгущающийся фенотип отличается от тех, которые зарегистрированы для S. pneumoniae cell-wall-acting GlcNAcases 43,44,45.
Рисунок 1: Структура пептидогликана, показывающая участок расщепления экзо-действующей N-ацетилглюкозаминидазы LytG из Bacillus subtilis. Вставка показывает структуру ингибитора LytG масаримицина. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 2: Анализ синергии/антагонизма для изучения антагонистических/синергетических отношений с масаримицином и оптохином у S. pneumoniae. Синий или фиолетовый цвет указывает на отсутствие роста бактерий, в то время как розовый цвет указывает на рост бактерий. МИК в присутствии ко-препарата принимают как самую низкую концентрацию, которая не показывает роста бактерий (синий цвет). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 3: Морфологический анализ. Морфологические изменения B. subtilis (A,B) и S. pneumoniae (C,D) при лечении 0,75x MIC (MICB.subtilis = 3,8 мкМ и MICS.pneumoniae = 7,8 мкМ) масаримицина. Клетки фиксировали и окрашивали 0,1% (м/об) метиленового синего и визуализировали с помощью яркой полевой микроскопии под масляным погружением при 1000-кратном увеличении. Эта цифра была изменена с 35. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Дополнительный рисунок 1: Репрезентативная тонкослойная хроматография масаримицина после водной обработки. Подвижной фазой является гексан 90:10: изопропанол и пары йода используются для окрашивания пятен. Rf = 0,3 для масаримицина. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.
Дополнительный рисунок 2: Репрезентативная флэш-хроматограмма для очистки масаримицина. Пик примерно в 1,2 колонки объемов содержит масаримицин. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.
Дополнительный рисунок 3: Репрезентативный ЯМР 1 H масаримицина, растворенного в CDCl3 и записанного на ЯМР-спектрометре с частотой 400 МГц. Спектр ссылается на остаточный пик растворителя CHCl3 при δ = 7,26. Цифры зеленым цветом над химическими сдвигами указывают на назначения протонов в соответствующих позициях в структуре масаримицина (см. вставку). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.
Дополнительный рисунок 4: Репрезентативный 13C ЯМР спектра масаримицина, растворенного в CDCl3 на частоте 100 МГц. Спектр, относящийся к остаточному пику растворителяCHCl3 при δ = 77,36. Цифры зеленым цветом над химическими сдвигами указывают на присвоение атомов углерода в положениях в структуре масаримицина (см. вставку). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.
Дополнительный рисунок 5: Репрезентативный анализ мазаримицина на B . subtilis. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Масаримицин является единственным микромолярным бактериостатическим ингибитором роста B. subtilis35 и S. pneumoniae37 . Было показано, что у B. subtilis масаримицин ингибирует GlcNAcase LytG35, в то время как точная молекулярная мишень в клеточной стенке S. pneumoniae не была идентифицирована37. Синтез масаримицина с использованием либо классического органического синтеза, либо микроволновой процедуры обеспечивает ингибитору хороший выход и высокую чистоту. Низкие выходы масаримицина обычно можно объяснить окислением циклогексилкарбоксальдегида. Чтобы преодолеть это, рекомендуется хранить циклогексилкарбоксальдегид под инертной атмосферой в осушителе. Окисление альдегида до соответствующей карбоновой кислоты можно рассматривать как белое твердое вещество в бутылке. Покупка небольших количеств циклогексилкарбоксальдегида без его хранения в течение длительных периодов времени значительно уменьшает эту проблему.
ЯМР-присвоение структуры масаримицина осложняется наличием смеси цис- и транс-форм амидной связи, а также атропизомеров вокруг о-йодофенилового кольца, что приводит к множественным пикам. Это может привести к протонному химическому сдвигу, распространяющемуся на 1 ppm, тем самым усложняя назначения35. В результате частичное присвоение химических сдвигов ЯМР как для 1H, так и для 13C ЯМР-спектров вместе с репрезентативными спектрами приведены в дополнительных рисунках 3-4. Если возникает трудность с назначением химических сдвигов 1H и 13C для масаримицина из-за смеси изомеров, могут быть использованы 2-мерные эксперименты ЯМР. Коррелированная спектроскопия (COSY) может быть использована для идентификации протонных спиновых систем, в то время как гетероядерные эксперименты с одинарной квантовой когерентной спектроскопией (HSQC) ЯМР могут быть использованы для идентификации корреляций протон-углерод с одной связью. После очистки масаримицин можно хранить при -20 °C в виде масла или растворять в ДМСО до концентрации 25 мМ до тех пор, пока это не понадобится. Рекомендуется хранить в небольших аликвотах, чтобы уменьшить количество циклов замораживания-оттаивания. После повторных циклов замораживания-оттаивания соединения раствор масаримицина должен быть проверен TLC для мониторинга любой деградации.
Экраны синергии и антагонизма могут быть эффективной стратегией для выявления взаимодействий путей и могут быть использованы для понимания способа действия малых молекул. На рисунке 2 показан пример анализа синергизма/антагонизма с S. pneumonia R6 с использованием масаримицина и ингибитора АТФазы оптохина (обратите внимание, что скрининг синергизма/антагонизма у B. subtilis все еще продолжается). Для воспроизводимости использовали клетки второго прохода и выращивали до OD600 нм не более 0,4. FICI 1,5 наблюдался для взаимодействия между масаримицином и оптохином, что указывает на индифферентную связь между парой антибиотиков. Индифферентная связь между масаримицином и оптохином указывает на отсутствие видимого взаимодействия между путями, на которые нацелены эти антибиотики. Хотя эти анализы могут предоставить полезную информацию о лекарственном взаимодействии, важно отметить, что анализы синергии / антагонизма должны проводиться с биологическими репликами и использованием более консервативных отсечек, как описано в Шансах42. Это помогает предотвратить чрезмерную интерпретацию наблюдаемых незначительных синергетических или антагонистических отношений.
Фенотипический анализ клеток B. subtilis, обработанных суб-MIC масаримицином (рисунок 3B), указывает на фенотип, который отличается от фенотипов, о которых сообщалось для генетической делеции lytG32, и более близко напоминает фенотипы штаммов B. subtilis с множественными аутолизиновыми делециями29. Это расхождение в фенотипе интригует, потому что, хотя ингибирование LytG in vitro было демонтировано35, мутант ΔlytG не имеет наблюдаемого фенотипа32. Это несоответствие может быть частично объяснено различиями в генетической и химической инактивации46,47. Наблюдаемые различия в химической или генетической инактивации LytG являются интригующим вопросом, который в настоящее время исследуется. Клетки S. pneumoniae, обработанные масаримицином, представляли фенотип (рисунок 3D), отличный от генетической делеции соответствующего GlcNAcase (GH73, кластер 2) LytB 37,43,44,48. Это морфологическое несоответствие подчеркивает проблемы при назначении способа действия или приписывании биологической мишени ингибиторов малых молекул. Морфологические фенотипы могут возникать в результате более сложного набора взаимодействий, отличных от одной генетической делеции или химической инактивации фермента, действующего на клеточную стенку. Эти метафенотипы34 могут возникать в результате сложных взаимодействий через прямые (отсутствие фермента (ферментов)) или косвенные (потеря регуляторов) механизмы.
Насколько нам известно, масаримицин является первым ингибитором бактериального аутолизина, который демонстрирует ингибирование роста бактерий (дополнительный рисунок 5). Является бактериостатическим ингибитором роста узкого спектра У B. subtilis и S.pneumoniae. Этот узкий спектр является ограничением для многовидовых сравнительных исследований метаболизма клеточной стенки между грамположительными и грамотрицательными организмами. Этот узкий спектр частично обусловлен различиями в некоторых гликозилгидролазных аутолизинах, используемых во время вегетативного роста между грамположительными (GlcNAcase) и грамотрицательными (литическая трансгликозилаза) организмами. Используя низкомолекулярные ингибиторы, такие как масаримицин, для ингибирования аутолизинов PG, в частности, GlcNAcases может обеспечить ортогональный подход к традиционной генетике для выяснения функции аутолизина. Масаримицин имеет явное преимущество перед некоторыми методами химической биологии, поскольку он может быть использован более чем у одного вида (B. subtilis и S. pneumoniae). Это может позволить провести сравнительные исследования метаболизма клеточной стенки между палочковидными (B. subtilis) и коккоидные (S. pneumoniae) виды. Менее корегулированный метаболизм и деление клеточной стенки у S. pneumoniae обеспечивает контрапункт в более жестко регулируемой системе палочковидных видов49,50. Будущие применения этого метода будут заключаться в идентификации молекулярной мишени в S.pneumoniae и изучении различий между генетической и химической инактивацией аутолизинов в S.pneumoniae и B. subtilis.
Важнейшие этапы протокола
Важно обратить внимание на эффективную концентрацию масаримицина в биологических и биохимических анализах. Из-за своей гидрофобной природы концентрации выше 250 мкМ (65x MIC в B. subtilis) могут привести к проблемам растворимости и агрегации, которые могут повлиять на интерпретацию биологических данных. Правильный контроль за воздействием транспортного средства (т.е. DMSO) во всех экспериментах имеет важное значение.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Reid, C.W. обладает интеллектуальной собственностью, связанной с конкретными применениями масаримицина.
Acknowledgments
Исследования были поддержаны Национальным научным фондом в рамках гранта No 2009522. ЯМР-анализ масаримицина был поддержан грантом Национального научного фонда в рамках гранта No 1919644. Любые мнения, выводы и выводы или рекомендации, выраженные в этом материале, принадлежат авторам и не обязательно отражают взгляды Национального научного фонда.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2-Iodobenzoic acid | SIGMA-ALDRICH | I7675-25G | corrosive, irritant, light yellow to orange-brown powder |
| 2-Propanol | SIGMA-ALDRICH | 109827-4L | flammable, irritant, colorless liquid |
| Acetonitrile | SIGMA-ALDRICH | 34851-4L | flammable, irritant, colorless liquid |
| Aluminum backed silica plates | Sorbtech | 4434126 | silica gel XG F254 on aluminum backed plates |
| chloroform-d | SIGMA-ALDRICH | 151823-50G | solvent for NMR |
| Compact Mass Spectrometer | Advion-Interchim | Advion CMS | compact mass spectrometer equiped with APCI source and atmospheric solids analysis probe |
| Corning Costar 96 well flat bottom plates-sterile | fisher chemical | 07-200-90 | for synergy/antagonism assays |
| cover slips | fisher chemical | 12-547 | for microscopy |
| Cyclohexanecarboxaldehyde | CHEM-IMPEX INT'L INC. | 24451 | flammable, irritant, colorless to pink liquid |
| Cyclohexyl isocyanide | SIGMA-ALDRICH | 133302-5G | irritant, colorless liquid, extremly unpleasant odor |
| Cyclohexylamine | SIGMA-ALDRICH | 240648-100ML | corrosive, flammable, irritant, colorless liquid unless contaminated |
| Ethyl acetate | SIGMA-ALDRICH | 537446-4L | flammable, irritant, colorless liquid |
| flash silica cartridge (12g) | Advion-Interchim | PF-50SIHP-F0012 | pack of flash silica columns (12g) for purification of masarimycin |
| formaldehyde | SIGMA-ALDRICH | F8775-25ML | fixing agent for microscopy |
| HEPES | SIGMA-ALDRICH | H8651-25G | buffer for microscopy fixing solution |
| Hexane, mixture of isomers | SIGMA-ALDRICH | 178918-4L | environmentally damaging, flammable, irritant, health hazard, colorless liquid |
| High performance compact mass spectrometer | Advion | expression | Atmospheric Solids Analysis Probe (ASAP), low resolution |
| High Vac | eppendorf | Vacufuge plus | vacuum aided by centrifugal force and temperature |
| Hydrochloric acid | SIGMA-ALDRICH | 258148-2.5L | corrosive, irritant, colorless liquid |
| hydrochloric acid | SIGMA-ALDRICH | 320331-2.5L | strong acid |
| immersion oil | fisher chemical | 12-365-19 | for microscopy |
| Iodine, resublimed crystals | Alfa Aesar | 41955 | environmentally damaging, irritant, health hazard, dark grey/purple crystals |
| Mestre Mnova | MestreLab Research | software for processing NMR spectra | |
| Methanol | SIGMA-ALDRICH | 439193-4L | flammable, toxic, health hazard, colorless liquid |
| methylene blue | SIGMA-ALDRICH | M9140-25G | microscopy stain for staining cell walls |
| meuller-hinton agar plates + 5% sheep blood | fisher chemical | B21176X | growth media for Streptococcus pneumoniae |
| meuller-hinton broth | fisher chemical | DF0757-17-6 | growth media for Streptococcus pneumoniae |
| microscope slides | fisher chemical | 22-310397 | for microscopy |
| Microwave Synthesis Labstation | MILESTONE | START SYNTH | device that requires the ventilation of a fume hood, equipped with synthesis carousel |
| NMR tubes | SIGMA-ALDRICH | Z562769-5EA | 5mm NMR tubes 600 MHz |
| Nuclear Magnetic Resonance (NMR) | Bruker | Ascend 400 | large superconducting magnet (400MHz) |
| optochin | fisher chemical | AAB21627MC | ethylhydrocupreine hydrochloride |
| petrie plates | Celltreat | 229695 | for preparing agar plates for bacterial growth |
| Primo Star Bright field/Phase contrast Microscope with ERc5s camera | Zeiss | for morphology studies | |
| puriFlash | interchim | XS520plus | flash chromatography purification system |
| resazurin | SIGMA-ALDRICH | R7017-1G | for synergy/antagonism assays |
| Rotary Evaporator | Heidolph | Hei-VAP Value "The Collegiate" | solvent evaporator |
| Sodium bicarbonate | SIGMA-ALDRICH | S6014-500G | irritant, white powder |
| Sodium chloride | fisher chemical | S271-1 | crystalline, colorless |
| Sodium chloride | SIGMA-ALDRICH | S5886-500G | for growth of B.subtilis and preparation of LB media |
| Sodium sulfate | SIGMA-ALDRICH | 7985592-500G | anhydrous, granular, white |
| tryptone | fisher chemical | BP1421-500 | for growth of B.subtilis and preparation of LB media |
| Whitney DG250 Workstation | Microbiology International | DG250 | anaerobic workstation. Anaerobic gas mixture used: 5% hydrogen, 10% carbon dioxide, balance nitrogen |
| yeast extract | fisher chemical | BP1422-500 | for growth of B.subtilis and preparation of LB media |
| Zen Lite (blue) software | Zeiss | for acquiring micrographs |
References
- Vollmer, W., Blanot, D., de Pedro, M. A.
- Munita, J. M., Bayer, A. S., Arias, C. A. Evolving resistance among Gram-positive pathogens. Clinical Infectious Diseases. 61, suppl-2 48-57 (2015).
- Vollmer, W., Bertsche, U. Murein (peptidoglycan) structure, architecture and biosynthesis in Escherichia coli. Biochimica Biophysica Acta. 1778 (9), 1714-1734 (2008).
- Vollmer, W., Höltje, J. -V. The architecture of the murein (peptidoglycan) in Gram-negative bacteria: vertical scaffold or horizontal layer(s). Journal of Bacteriology. 186 (18), 5978-5987 (2004).
- Clarke, A. J. Compositional analysis of peptidoglycan by high-performance anion-exchange chromatography. Analytical Biochemistry. 212 (2), 344-350 (1993).
- Kim, S. J., Chang, J., Singh, M. Peptidoglycan architecture of Gram-positive bacteria by solid-state NMR. Biochimica Biophysica Acta. 1848, 350-362 (2014).
- Koch, A. L., Doyle, R. J. Inside-to-outside growth and turnover of the wall of gram-positive rods. Journal of Theoretical Biology. 117 (1), 137-157 (1985).
- Beeby, M., Gumbart, J. C., Roux, B., Jensen, G. J. Architecture and assembly of the Gram-positive cell wall. Molecular Microbiology. 88 (4), 664-672 (2013).
- Shockman, G. D., Daneo-Moore, L., Kariyama, R., Massidda, O. Bacterial walls, peptidoglycan hydrolases, autolysins, and autolysis. Microbial Drug Resistance. 2 (1), 95-98 (1996).
- Dijkstra, A. J., Keck, W. Peptidoglycan as a barrier to transenvelope transport. Journal of Bacteriology. 178 (19), 5555-5562 (1996).
- Blackman, S. A., Smith, T. J., Foster, S. J. The role of autolysins during vegetative growth of Bacillus subtilis 168. Microbiology. 144, 73-82 (1998).
- Misra, G., Rojas, E. R., Gopinathan, A., Huang, K. C. Mechanical consequences of cell-wall turnover in the elongation of a Gram-positive bacterium. Biophysical Journal. 104 (11), 2342-2352 (2013).
- Wheeler, R., et al. Bacterial cell enlargement requires control of cell wall stiffness mediated by peptidoglycan hydrolases. mBio. 6 (4), 00660 (2015).
- Taguchi, A., Kahne, D., Walker, S. Chemical tools to characterize peptidoglycan synthases. Current Opinion in Chemical Biology. 53, 44-50 (2019).
- Welsh, M. A., Schaefer, K., Taguchi, A., Kahne, D., Walker, S. Direction of chain growth and substrate preferences of shape, elongation, division, and sporulation-family peptidoglycan glycosyltransferases. Journal of the American Chemial Society. 141 (33), 12994-12997 (2019).
- Rubino, F. A., et al. Detection of transport intermediates in the peptidoglycan flippase MurJ identifies residues essential for conformational cycling. Journal of the American Chemical Society. 142 (12), 5482-5486 (2020).
- Sjodt, M., et al. Structure of the peptidoglycan polymerase RodA resolved by evolutionary coupling analysis. Nature. 556 (7699), 118-121 (2018).
- Tiyanont, K., et al. Imaging peptidoglycan biosynthesis in Bacillus subtilis with fluorescent antibiotics. Proceedings of the National Academy of Science U S A. 103 (29), 11033-11038 (2006).
- Lebar, M. D., et al. Reconstitution of peptidoglycan cross-linking leads to improved fluorescent probes of cell wall synthesis. Journal of the American Chemical Society. 136 (31), 10874-10877 (2014).
- Do, T., Page, J. E., Walker, S. Uncovering the activities, biological roles, and regulation of bacterial cell wall hydrolases and tailoring enzymes. Journal of Biological Chemistry. 295 (10), 3347-3361 (2020).
- Liang, H., et al. Metabolic labelling of the carbohydrate core in bacterial peptidoglycan and its applications. Nature Communications. 8, 15015 (2017).
- DeMeester, K. E., et al. Metabolic incorporation of N-acetyl muramic acid probes into bacterial peptidoglycan. Current Protocol in Chemical Biology. 11 (4), 74 (2019).
- Lazor, K. M., et al. Use of Bioorthogonal N-acetylcysteamine (SNAc) analogues and peptidoglycan O-acetyltransferase B (PatB) to label peptidoglycan. The FASEB Journal. 32, 630 (2018).
- Wang, Y., Leimkuhler-Grimes, C. Fluorescent labeling of the carbohydrate backbone of peptidoglycan to track degradation in vivo. The FASEB Journal. 29, (2015).
- Kuru, E., et al. In probing of newly synthesized peptidoglycan in live bacteria with fluorescent D-amino acids. Angewandte Chemie International Edition. 51 (50), 12519-12523 (2012).
- Zhou, R., Chen, S., Recsei, P. A dye release assay for determination of lysostaphin activity. Analytical Biochemistry. 171 (1), 141-144 (1988).
- Qiao, Y., et al. Lipid II overproduction allows direct assay of transpeptidase inhibition by β-lactams. Nature Chemical Biology. 13 (7), 793-798 (2017).
- Lebar, M. D., et al. Forming cross-linked peptidoglycan from synthetic Gram-negative lipid II. Journal of the American Chemical Society. 135 (12), 4632-4635 (2013).
- Chen, R., Guttenplan, S. B., Blair, K. M., Kearns, D. B. Role of the D-dependent autolysins in Bacillus subtilis population heterogeneity. Journal of Bacteriology. 191 (18), 5775-5784 (2009).
- Yukie, S., Miki, K., Yoshio, N., Kuniaki, T., Yoshihisa, Y. Identification and characterization of an autolysin-encoding gene of Streptococcus mutans. Infection and Immunity. 73 (6), 3512-3520 (2005).
- Domenech, M., García, E., Moscoso, M. In vitro destruction of Streptococcus pneumoniae biofilms with bacterial and phage peptidoglycan hydrolases. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 55 (9), 4144-4148 (2011).
- Horsburgh, G. J., Atrih, A., Williamson, M. P., Foster, S. J. LytG of Bacillus subtilis is a novel peptidoglycan hydrolase: the major active glucosaminidase. Biochemistry. 42 (2), 257-264 (2003).
- Vermassen, A., et al. Cell wall hydrolases in bacteria: insight on the diversity of cell wall amidases, glycosidases and peptidases toward peptidoglycan. Frontiers in Microbiology. 10, 331 (2019).
- Martin-Galiano, A. J., Yuste, J., Cercenado, M. I., de la Campa, A. G. Inspecting the potential physiological and biomedical value of 44 conserved uncharacterised proteins of Streptococcus pneumoniae. BMC Genomics. 15, 652 (2014).
- Nayyab, S., et al. Diamide inhibitors of the Bacillus subtilis N-acetylglucosaminidase LytG that exhibit antibacterial activity. ACS Infectioius Diseases. 3 (6), 421-427 (2017).
- Lipski, A., et al. Structural and biochemical characterization of the β-N-acetylglucosaminidase from Thermotoga maritima: Toward rationalization of mechanistic knowledge in the GH73 family. Glycobiology. 25 (3), 319-330 (2014).
- Haubrich, B. A., et al. Inhibition of Streptococcus pneumoniae autolysins highlight distinct differences between chemical and genetic inactivation. bioRxiv. , 300541 (2020).
- Farha, M. A., et al. Inhibition of WTA synthesis blocks the cooperative action of PBPs and sensitizes MRSA to β-lactams. ACS Chemical Biology. 8 (1), 226-233 (2013).
- Lehár, J., et al. Chemical combination effects predict connectivity in biological systems. Molecular Systems Biology. 3 (1), 80 (2007).
- Farha, M. A., et al. Antagonism screen for inhibitors of bacterial cell wall biogenesis uncovers an inhibitor of undecaprenyl diphosphate synthase. Proceedings of the National Academy of Science U S A. 112 (35), 11048-11053 (2015).
- Palomino, J. C., et al. Resazurin microtiter assay plate: simple and inexpensive method for detection of drug resistance in Mycobacterium tuberculosis. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 46 (8), 2720-2722 (2002).
- Odds, F. C. Synergy, antagonism, and what the chequerboard puts between them. Journal of Antimicrobial Chemotherapy. 52 (1), 1 (2003).
- Arrigucci, R., Pozzi, G. Identification of the chain-dispersing peptidoglycan hydrolase LytB of Streptococcus gordonii. PLoS One. 12 (4), 0176117 (2017).
- Bai, X. -H., et al. Structure of pneumococcal peptidoglycan hydrolase LytB reveals insights into the bacterial cell wall remodeling and pathogenesis. of Biological Chemistry. 289 (34), 23403-23416 (2014).
- Garcia, P., Gonzalez, M. P., Garcia, E., Lopez, R., Garcia, J. L. LytB, a novel pneumococcal murein hydrolase essential for cell separation. Molecular Microbiology. 31 (4), 1275-1281 (1999).
- Giladi, M., Altman-Price, N., Levin, I., Levy, L., Mevarech, M. FolM, a new chromosomally encoded dihydrofolate reductase in Escherichia coli. Journal of Bacteriology. 185 (23), 7015-7018 (2003).
- Chua, P. R., et al. Effective killing of the human pathogen Candida albicans by a specific inhibitor of non-essential mitotic kinesin Kip1p. Molecular Microbiology. 65 (2), 347-362 (2007).
- Rico-Lastres, P., et al. Substrate recognition and catalysis by LytB, a pneumococcal peptidoglycan hydrolase involved in virulence. Scientific Reports. 5, 16198 (2015).
- Vollmer, W., et al. The cell wall of Streptococcus pneumoniae. Microbiology Spectrum. 7 (3), (2019).
- Massidda, O., Nováková, L., Vollmer, W. From models to pathogens: how much have we learned about Streptococcus pneumoniae cell division. Environmental Microbiology. 15 (12), 3133-3157 (2013).
