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JoVE Journal Biochemistry
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Biochemistry

Síntese de Masarimicina, um inibidor de pequenas moléculas do crescimento bacteriano gram-positivo

Published: January 7, 2022 doi: 10.3791/63191
Automatic Translation
1, 1, 1,2
1Department of Science and Technology, Bryant University, 2Center for Health and Behavioral Sciences, Bryant University

Summary

Um protocolo detalhado é apresentado para preparar a diamida bacteriostática masarimycina, uma pequena sonda de moléculas que inibe o crescimento de Bacillus subtilis e Streptococcus pneumoniae mirando a degradação da parede celular. Sua aplicação como sonda química é demonstrada em ensaios de sinergia/antagonismo e estudos morfológicos com B. subtilis e S. pneumoniae.

Abstract

Peptidoglycan (PG) na parede celular das bactérias é uma estrutura macromolecular única que confere forma e proteção do ambiente circundante. Central para entender o crescimento e a divisão celular é o conhecimento de como a degradação do PG influencia a biossíntese e a montagem da parede celular. Recentemente, foi relatada a rotulagem metabólica de PG através da introdução de açúcares modificados ou aminoácidos. Embora o interrogatório químico de passos biossintéticos com inibidores de pequenas moléculas seja possível, ferramentas de biologia química para estudar a degradação de PG por autolysinas são subdesenvolvidas. As autolysinas bacterianas são uma ampla classe de enzimas que estão envolvidas na degradação fortemente coordenada de PG. Aqui, um protocolo detalhado é apresentado para o preparo de uma pequena sonda de moléculas, a masarimicina, que é um inibidor de N-acetilglucosaminidase LytG em bacillus subtilis, e metabolismo de parede celular em Streptococcus pneumoniae. A preparação do inibidor por meio de síntese orgânica assistida por micro-ondas e clássica é fornecida. Sua aplicabilidade como ferramenta para estudar fisiologia gram-positiva em ensaios biológicos é apresentada.

Introduction

Peptidoglycan (PG) é um polímero em forma de malha que delineia a forma e a estrutura das células em ambas as bactérias Gram-positivas eGram-negativas 1,2. Este heteropolímero é uma matriz de açúcares aminosatrados intercides por peptídeos curtos 3,4,5,6 com uma espinha dorsal composta de resíduos de β N-acetilglucosamina alternada (GlcNAc) e ácido n-acetilmuramic (MurNAc) (Figura 1)1. Anexado ao c-3 lactyl moiety de MurNAc é o peptídeo de haste. O metabolismo de PG envolve um sistema bem coordenado de enzimas biossintéticas e degradativas para incorporar novo material na paredecelular 7,8. A degradação de PG é realizada por enzimas coletivamente referidas como autolysinas9 e ainda classificadas com base na especificidade do vínculo rachado. As autolysinas participam de muitos processos celulares, incluindo crescimento celular, divisão celular, motilidade, maturação de PG, quimiotáxi, secreção de proteínas, competência genética, diferenciação e patogenicidade10,11. Desvendar as funções biológicas específicas das autolysinas individuais pode ser assustador, devido, em parte, à redundância funcional. No entanto, os recentes estudos biofísicos 8,12,13 e computacionais12 forneceram novas informações sobre seus papéis no metabolismo PG. Além disso, relatórios recentes forneceram mais informações sobre a síntese14 e 15,16,17 passos mediados por membrana no metabolismo pg. Uma compreensão completa da relação entre vias degradativas e sintéticas do metabolismo PG poderia dar origem a alvos antibióticos inexplorados anteriormente.

Embora tenha havido avanços significativos na metodologia para estudar a glicobiologia em eucariotes, a glicobiologia bacteriana e, em particular, o metabolismo PG não avançou a uma taxa semelhante. As abordagens químicas atuais para estudar o metabolismo PG incluem antibióticos fluorescentesrotulados 18, sondas fluorescentes19,20 e rotulagem metabólica 21,22,23,24. Essas novas abordagens estão fornecendo novas maneiras de interrogar o metabolismo da parede celular bacteriana. Embora algumas dessas estratégias sejam capazes de rotular PG in vivo, elas podem ser específicas de espécies19, ou apenas trabalhar em cepas sem uma autolysinaparticular 25. Muitas estratégias de rotulagem PG destinam-se ao uso com paredes celulares isoladas26 ou com vias de biossíntese PG in vitro reconstituídas 20,27,28. Atualmente, o uso de antibióticos fluorescentes é limitado a etapas biossintéticas e transpeptidação18.

O conhecimento atual das autolysinas bacterianas e seu papel no metabolismo da parede celular vem da análise bioquímica genética e in vitro 11,29,30,31,32. Embora essas abordagens tenham fornecido uma riqueza de informações sobre esta importante classe de enzimas, decifrar seu papel biológico pode ser desafiador. Por exemplo, devido à redundância funcional33, a exclusão de uma autolise na maioria dos casos não resulta em interrupção do crescimento bacteriano. Isso apesar de seu papel implícito no crescimento celular e na divisão 7,12. Outra complicação é que a exclusão genética de autolysinas bacterianas pode dar origem a meta-fenótipos34. Os meta-fenótipos surgem da complexa interação entre a via afetada pela exclusão genética e outras vias interconectadas. Por exemplo, um meta-fenótipo pode surgir através de um efeito direto, como a falta de uma enzima, ou um efeito indireto, como uma interrupção dos reguladores.

Atualmente, existem apenas alguns inibidores de glicosidase autolysinas como N-acetylglucosaminidases (GlcNAcase) e N-acetylmuramidases, que podem ser usados como sondas químicas para estudar a degradação de PG. Para lidar com isso, a diamide masarimicina (anteriormente denominada fgkc) foi identificada e caracterizada35 como um inibidor bacteriostático do crescimento de subtilis bacilo que tem como alvo o GlcNAcase LytG32 (Figura 1). LytG é um exo-ator glcNAcase36, um membro do cluster 2 dentro da família de hidrolase glicosyl 73 (GH73). É o maior GlcNAcase ativo durante o crescimento vegetativo32. Pelo que sabemos, a masarimicina é o primeiro inibidor de um GLCNAcase de ação pg que inibe o crescimento celular. Estudos adicionais de masarimicina com Streptococcus pneumoniae descobriram que a masarimicina provavelmente inibe o metabolismo da parede celular neste organismo37. Aqui, a preparação da masarimicina é relatada para uso como uma sonda de biologia química para estudar fisiologia nos organismos Gram-positivos B. subtilis, e S. pneumoniae. Exemplos de análise morfológica do tratamento de concentração inibitória submínica com masarimicina, bem como um ensaio de sinergia/antagonismo são apresentados. Ensaios de sinergia e antagonismo usando antibióticos com modos de ação bem definidos podem ser uma maneira útil de explorar conexões entre processos celulares 38,39,40.

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Protocol

1. Métodos gerais

NOTA: Todos os compostos foram comprados de fornecedores padrão e utilizados sem maiores purificações.

  1. Realize cromatografia de camada fina (TLC) em uma placa de alumínio pré-revestida com gel de sílica XG F254. Detecte manchas sob uma lâmpada UV, por imersão na mancha de p-anisaldeído, ou expondo-se ao vapor I2 .
  2. Registo de ressonância magnética nuclear (NMR) em um espectrômetro de 400 MHz.
    NOTA: 1H-NMR e 13espectros C-NMR foram referenciados a picos de solventes residuais. Constantes de acoplamento são dadas em [Hz] e mudanças químicas em [ppm].
  3. Registro de espectrometria química de pressão atmosférica (APCI) espectrometria de massa de masarimicina em um espectrômetro de massa compacto equipado com uma sonda de análise de sólidos atmosféricos.

2. Procedimento geral para preparação de masarimicina

NOTA: Execute as etapas abaixo em um capô de fumaça.

  1. Prepare uma solução de 0,1 M em metanol de cada reagente: ciclohexylamina, carboxaldeído ciclohexyl, ácido o-iodobenzóico e isocianida de ciclohexyl35.
    ATENÇÃO: Ciclohexylamina, isocianida ciclohexilal e carboxaldeído ciclohexil são inflamáveis. Podem causar corrosão da pele e induzir toxicidade oral, dérmica, respiratória ou reprodutiva. Mantenha os compostos longe de chamas abertas, superfícies quentes e fontes de ignição. Use proteção adequada da pele e dos olhos, trabalhe em uma área bem ventilada e evite a inalação de vapores ou névoa. Para armazenamento, mantenha as garrafas bem fechadas e guarde-as em um lugar fresco e seco. Armazene carboxaldeído ciclohexyl em um desiccador sob uma atmosfera N2 .
  2. Misture 5 mL de ciclohexilamina (solução de 0,1 M em metanol) e 5 mL de carboxaldeído ciclohexyl (0,1 M em metanol) em um frasco de fundo redondo tampado e mexa a solução usando uma barra de agitação magnética em uma placa de agitação/quente por 30 min a 40 °C em um banho de areia. A temperatura do monitor usando um termômetro colocou aproximadamente 1 cm abaixo da superfície da areia.
  3. Depois de 30 min, adicione 5 mL de isocianida ciclohexyl (solução de 0,1 M em metanol) à solução a partir da etapa 2.2 e mexa por mais 20 min a 50 °C. Por fim, adicione 5 mL de ácido o-iodobenzóico (solução de 0,1 M em metanol) à mistura de reação e continue mexendo a 55 °C por 3-5 h.
  4. Monitore o progresso da reação periodicamente por TLC aproximadamente a cada hora após a mistura de reação acima ter sido agitada por 3 h.
  5. Corte uma tira TLC de 3 cm x 6 cm de placa TLC recorrida em alumínio. Usando um lápis #2, desenhe uma linha aproximadamente 1 cm da parte inferior. Usando um microcapilar de vidro, localizá-lo aproximadamente 5 μL da mistura de reação na placa TLC e deixá-lo secar.
  6. Para um béquer de 150 mL, adicione fase móvel suficiente (90:10 hexanol: isopropanol) para cobrir a parte inferior do béquer. Usando um par de pinças, coloque cuidadosamente a placa TLC acima no béquer, garantindo que a placa TLC entre uniformemente na fase móvel. Cubra a parte superior do béquer com um pedaço de papel alumínio.
    NOTA: Certifique-se de que a fase móvel não cobre a linha e a amostra manchada.
  7. Deixe que a fase móvel viaje até a placa TLC até que esteja aproximadamente 1 cm abaixo da parte superior da placa. Remova a placa TLC e usando um lápis, desenhe uma linha indicando a distância percorrida pela fase móvel. Deixe a placa TLC secar em um capô de fumaça.
  8. Uma vez seco, coloque a placa TLC em um béquer contendo uma pequena quantidade de I2 sólido e cubra o béquer com um pedaço de papel alumínio. Monitore o TLC para o desenvolvimento de manchas amarelas/marrons. Uma vez desenvolvida, remova a placa TLC e marque a localização das manchas usando um lápis (Figura Suplementar 1).
    NOTA: Se eu2 manchas não estiverem marcadas, a mancha se dissipará com o tempo. As manchas também podem ser visualizadas na placa TLC por luz UV, coloração p-anisaldeído ou coloração de permangênio de potássio (ver Informações Complementares).
  9. Calcular valores Rf para todos os pontos visualizados usando a seguinte fórmula:
    Rf = Equation 1
  10. Considere a reação completa quando apenas uma mancha com Rf = 0,3 estiver visível na placa TLC. Remova o solvente em um evaporador rotativo sob pressão reduzida e seque o produto bruto (obtido como óleo marrom-amarelado) sob um vácuo alto até que todo o metanol seja evaporado.
  11. Dissolva o produto bruto seco em 30 mL de acetato de etila e transfira-o para um funil separador. Extrair acetato de etila sequencialmente com 1 M HCl (2 x 30 mL), H2O (30 mL), solução NaHCO3 saturada (2 x 30 mL), H2O (30 mL) e solução naCl saturada (2 x 30 mL). Descarte as camadas aquosas.
    NOTA: A camada de acetato etílico é a camada superior em cada uma das extrações. Para cada extração, agite vigorosamente o funil separador contendo o acetato etílico e a solução aquosa (HCl, H2O, NaHCO3 ou NaCl) e permita que as camadas se separem completamente.
  12. Remova a camada de acetato etílico do funil separador e colete-a em um frasco de Erlenmeyer. Adicione uma espátula cheia de Na2SO4 (anidro) para remover água residual do acetato etílico.
    NOTA: A solução de acetato etílico é considerada seca quando o NA2SO4 no frasco funciona livremente e não se aglomera. Se o NA2SO4 estiver se agrupando, uma espátula adicional de Na2SO4 pode ser adicionada.
  13. Filtre a solução de acetato de etila seca através do papel do filtro #1 para remover o NA2SO4. Lave o papel do filtro com uma pequena quantidade de acetato etílico. Coloque a solução de acetato etílico filtrado em um frasco fundo redondo e remova o solvente em um evaporador rotativo sob pressão reduzida para obter masarimicina como óleo uma vez que todo o acetato de etila é removido.
  14. Dissolva o óleo de masarimicina obtido acima em uma quantidade mínima (1-2 mL) de hexano 9:1: isopropanol e mexa em uma placa de agitação magnética até que todo o composto seja dissolvido.
  15. Purifique a masarimicina dissolvida por cromatografia flash usando uma coluna flash de sílica de fase normal de 12 g.
    1. Equilibre a coluna flash com 10 volumes de colunas de fase móvel (99:1 hexano: isopropanol) com o conjunto de instrumentos a uma vazão de 15 mL/min.
      NOTA: Após a conclusão do equilíbrio, pare o fluxo e desconecte a parte superior da coluna do sistema.
    2. Elasente a masarimicina dissolvida usando uma seringa de 5 mL. Conecte a seringa diretamente à parte superior da coluna flash equilibrada e injete a solução na coluna. Reconecte a coluna carregada ao sistema de cromatografia flash e inicie a elução gradiente.
    3. Masarimicina elute da coluna usando elução gradiente para uma concentração final de fase móvel de hexano 10:90: isopropanol sobre 12 volumes de coluna. Monitore a eluição da masarimicina via absorção a 230 e 254 nm.
    4. Colete os compostos elucidos da coluna por um coletor de fração que coleta 20 mL de solvente por fração.
      NOTA: Se um sistema de cromatografia flash não estiver disponível, a purificação da masarimicina pode ser realizada através de uma coluna de sílica de gravidade com uma fase móvel de 3:1 (hexano: acetato de etila). Frações contendo masarimicina podem ser identificadas pela TLC usando a mesma fase móvel. A visualização das manchas de TLC foi feita com luz UV, vapor I2 ou coloração de permangã de potássio.
    5. Identifique frações contendo masarimicina por TLC (etapas 2.5-2.9) ou especttrometria de massa em um espectrômetro de massa compacto equipado com uma sonda de análise de sólidos atmosféricos. Seque o produto final sob vácuo (~0,3 mbar).
      NOTA: A masarimicina é obtida rotineiramente como um óleo incolor ou sólido com um rendimento de 55%-70% em relação ao mmol de carboxaldeído ciclohexyl adicionado à reação. Calcule o rendimento final da masarimicina obtendo a massa da masarimicina purificada e calculando o rendimento teórico da reação utilizando a seguinte fórmula:
      % rendimento = Equation 2 x 100%
  16. Confirme a estrutura da masarimicina por NMR.
    1. Dissolva ~10 mg de amostra de masarimicina em 0,5 mL de CDCl3. Usando uma tubulação Pasteur, transfira a solução para um tubo NMR de 5 mm e tampa o tubo. Coloque o tubo NMR no espectrômetro.
    2. Adquira espectros de 1H e 13C NMR usando experimentos de predefinição do fabricante. Atribuições de turnos químicos e espectros representativos são fornecidos em Figuras Suplementares 3-4.
  17. Armazene masarimicina seca ou dissolvida em DMSO (concentração final de 25 mM) a -20 °C até usar.

3. Procedimento de micro-ondas para preparação de masarimicina

  1. Prepare soluções de 0,6 M de ciclohexylamina, carboxaldeído ciclohexyl, isocianidato de ciclohexyl e ácido oodobenzóico em acetonitrila.
  2. Adicione uma barra de mexida e 10 mL de acetonitrilo a um frasco de reação de micro-ondas de vidro.
  3. Adicione 2 mL de ciclohexilamina (0,6 M em acetonitrilo), 2 mL de carboxaldeído cyclohexyl (0,6 M em acetonitrilo) e 7 mL de acetonitrilo ao frasco.
  4. Coloque o frasco de reação de micro-ondas no carrossel de micro-ondas. Mexa a mistura, aqueça-a por 30 min a 50°C em um ajuste de potência de 400 W e deixe esfriar até a temperatura ambiente.
  5. Adicione 2 mL de ácido oodobenzóico (0,6 M em metanol) e 2 mL de isocianidato de ciclohexyl (0,6 M em acetonitrila) ao frasco. Mexa a mistura, aqueça-a a 100 °C no micro-ondas por 40 min em um ajuste de potência de 400 W e deixe esfriar até a temperatura ambiente.
  6. Monitore o progresso da reação por TLC (90:10 hexano: isopropanol) usando i2 vapor após a conclusão da etapa 3.5.
    NOTA: Se o TLC mostrar que a reação está incompleta (ou seja, vários pontos no TLC), coloque o frasco de reação de volta no micro-ondas e defina as condições de micro-ondas descritas na etapa 3.5.
  7. Uma vez que a reação esteja completa, despeje a solução em um frasco de fundo redondo de 100 mL e evapora-a até o ressecamento usando um evaporador rotativo.
  8. Siga os passos 2.6-2.16 acima para completar o trabalho aquoso, purificação e caracterização da masarimicina.

4. Ensaio de sinergia e antagonismo

  1. Cultivar Streptococcus pneumoniae R6 em placas de ágar Mueller-Hinton (MH) contendo 5% (v/v) sangue de ovelha a 37 °C sob condições anaeróbicas. Em todos os experimentos, use células de segunda passagem cultivadas em 5 mL de caldo de MH a 37 °C sob condições anaeróbicas até OD600 é ~0,4.
  2. Sujeitos os inibidores masarimicina e optochin a diluições seriais 1:2 em seus respectivos solventes, com as concentrações resultantes flanqueando os valores mínimos de concentração inibitória (MIC) de cada inibidor.
    1. Faça a diluição inicial da masarimicina em sulfóxido de dimetila (DMSO) até que uma concentração de 100 μM seja atingida. A partir deste ponto, faça diluições de masarimicina no caldo DE MH. Prepare a solução de estoque optochin (3,5 mM) dissolvendo optochin comercialmente disponível (ver Tabela de Materiais) em caldo MH estéril.
      NOTA: As soluções de estoque de masarimicina foram feitas a 25 mM na DMSO.
  3. Para uma placa microtitre estéril de 96 poços, adicione 2 alíquotas de μL de cada diluição optochina a cada linha da placa. Na mesma placa, adicione 2 alíquotas de μL de cada diluição de masarimicina a cada coluna para criar uma matriz de concentrações de optochin e masarimicina na placa (Figura 2).
  4. Adicione caldo MH estéril (93 μL) a cada poço contendo os inibidores acima. Inocular as placas de microistras com 5 μL de cultura (OD600 ~0,4) da etapa 4.1.
    NOTA: A inoculação da placa de 96 poços é tipicamente feita sob condições anaeróbicas em uma estação de trabalho anaeróbica. O volume final no poço é de 100 μL.
  5. Cultivar culturas por 18h a 37 °C em condições anaeróbicas, seguido pela adição de 30 μL de solução de 0,01% (m/v) de sal de sódio resazurina. Incubar a placa em temperatura ambiente por 15 minutos para permitir a formação e estabilização da cor.
    NOTA: A solução de resazurina é preparada dissolvendo o composto em água destilada e pode ser armazenada a 4 °C por até duas semanas.
  6. Leia diretamente os valores de concentração da placa e atribua a menor concentração inibidora para a qual não se observa o crescimento bacteriano (cor azul) como [X] (ver passo 4.7.1), ou seja, a menor concentração inibitória da droga na presença da co-droga.
    NOTA: O crescimento bacteriano positivo é identificado nos poços pelo corante de resazurina que fica rosado. Os valores MIC para cada droga sozinho (ou seja, na ausência de co-droga) são determinados de forma semelhante usando o ensaio MIC de resazurina35 com cada droga separadamente (Figura Suplementar 5). Os MICs em S. pneumoniae são de 7,8 μM e 15,85 μM para masarimicina e optochin, respectivamente.
  7. Determinar a concentração inibitória fracionária (FIC) e índice FIC (FICI) utilizando as seguintes equações.
    1. FIC= [X]/MICx, onde [X] (a partir do passo 4.6) é a menor concentração inibitória da droga na presença da co-droga, e MICx é a menor concentração inibitória da droga na ausência da co-droga.
    2. FICI= FICmasarimicina +antibiótico FIC
      NOTA: FICI < 0,5 = sinérgico, 0,5 < FICI < 1 = aditivo, 1 < FICI < 4 = indiferente, FICI > 4 = antagônico.

5. Estudo morfológico

  1. Grow Bacillus subtilis 11774 em placas de ágar Luria-Bertani (LB) (10 g/L tryptone, extrato de levedura de 5 g/L e 5 g/L NaCl) contendo 1,5% de Bacto a 37 °C. Em todos os experimentos, use células de segunda passagem cultivadas em 5 mL de caldo LB a 37 °C até OD600 = 1. Cresça S.pneumoniae da mesma forma que no passo 4.1.
  2. Após a obtenção de uma densidade de cultura celular com OD600nm = 1 para B. subtilis, ou OD600nm = 0,4 para S. pneumoniae, adicione masarimicina usando uma pipeta ao tubo de cultura rotulado como "tratado" a uma concentração final de 3,8 μM (0,75x MIC para B.subtilis), ou 5,85 μM (0,75x MIC para S.pneumoniae). Ao segundo tubo de cultura rotulado como "controle", adicione um volume equivalente de DMSO.
  3. Para B.subtilis, coloque as amostras em uma incubadora a 37 °C por 90 min com agitação a 150 rpm. Para S. pneumoniae, incubar as células sem tremer em condições anaeróbicas.
  4. Após 90 min, fixe quimicamente as culturas em uma mistura de 1:10 (v/v) de mídia cultural e tampão de fixação (20 mM HEPES, 1% formaldeído (pH 6.8)) a 4 °C durante a noite. Após a fixação estiver concluída, aplique 10-20 μL de amostras em lâminas de microscópio de vidro usando uma pipeta e permita que elas sequem. Fixar as amostras secas a ar aquecendo as lâminas de vidro usando um queimador Bunsen.
  5. Após a fixação do calor, amostras de manchas com a adição de 100 μL de 0,1% (m/v) azul de metileno (solução em 20% (v/v) etanol). Incubar os slides manchados por 10 minutos e lavar o excesso de corante com dH2O. Em seguida, aqueça suavemente os slides manchados a 60 °C em um forno por 15-20 min para levar as células a um plano focal comum.
  6. Sele as amostras manchadas colocando uma tampa de microscópio sobre as células manchadas. Em seguida, sele as bordas usando cimento slide de microscópio. Coloque o slide do microscópio selado no estágio do microscópio e coloque a imagem em foco com ampliação de 100x usando microscopia de campo brilhante.
  7. Coloque uma gota de óleo de imersão no slide do microscópio e traga o campo de visão para se concentrar usando a ampliação de 1000x. Adquira micrografias usando uma câmera ligada ao microscópio e seu software associado. Adquira imagens usando as configurações de balanço de branco automático e abertura no software.
    NOTA: Alternativamente, as imagens podem ser processadas usando o software ImageJ de código aberto.

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Representative Results

Masarimicina é uma pequena molécula inibidora bacteriostática de B. subtilis e S. pneumoniae e tem sido mostrado para inibir o exo-ato glcNAcase LytG em B. subtilis35,37 e atingir a parede celular em S. pneumoniae37. A masarimicina pode ser preparada eficientemente pela síntese orgânica clássica ou assistida por micro-ondas com rendimentos na faixa de 55%-70%. A síntese assistida por micro-ondas tem a vantagem de uma redução significativa no tempo para sintetizar o composto. A síntese assistida por micro-ondas encurta a síntese de 5-6 h (síntese tradicional) para 2-3 h, mantendo rendimentos comparáveis. A cromatografia flash fornece uma rápida purificação da masarimicina em alta pureza (Figuras Suplementares 1-2). Atribuições estruturais de espectros de 1H e 13C NMR, juntamente com espectros representativos, são fornecidas em Figuras Suplementares 3-4.

Telas de sinergia e antagonismo podem ser uma ferramenta útil para revelar conexões funcionais entre componentes celulares (sinergia) e investigar redes genéticas e mecanismos de ação medicamentosa (antagonismo)40. A avaliação da sinergia/antagonismo com o inibidor atpase optochin em S. pneumoniae é apresentada na Figura 2. O ensaio da placa microtitre resazurina41 fornece uma leitura fácil do crescimento/não crescimento do organismo. A menor concentração de composto para inibir o crescimento bacteriano (cor azul) é tomada como o valor MIC na presença de uma co-droga. Poços com crescimento bacteriano serão cor-de-rosa. A relação entre masarimicina e optochin foi determinada pelo cálculo do índice de concentração do inibidor fracionado (FICI) utilizando equações na etapa 4.7 do protocolo. O valor FICI para a interação masarimicina-optochin é calculado em 1,5, indicando uma relação indiferente com base nas normaspublicadas 42. Ensaios fenotípicos usando masarimicina em B. subtilis em concentrações sub-MIC apresentaram um fenótipo semelhante a salsicha (Figura 3B) que difere dos fenótipos relatados do mutante ΔlytG na literatura32 e mais próximo se assemelha a múltiplos nocautes autolysina29. A análise fenotípica de S. pneumoniae com masarimicina em concentrações sub-MIC apresentou um fenótipo desajeitado (Figura 3D). Este fenótipo de aglomeração é distinto daqueles relatados para GlcNAcases de ação celular S. pneumoniae 43,44,45.

Figure 1
Figura 1: Estrutura de peptidoglycan mostrando o local do decote do exo-atuante N-acetyl glucosaminidase LytG de Bacillus subtilis. Inset mostra a estrutura do inibidor lytG masarimicina. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 2
Figura 2: Ensaio de sinergia/antagonismo para explorar relações antagônicas/sinérgicas com masarimicina e optochin em S. pneumoniae. A cor azul ou roxa não indica crescimento bacteriano, enquanto a cor rosa indica crescimento bacteriano. O MIC na presença de co-droga é tomado como a menor concentração que não mostra crescimento bacteriano (cor azul). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 3
Figura 3: Análise morfológica. Alterações morfológicas em B. subtilis (A,B) e S. pneumoniae (C,D) quando tratados com 0,75x MIC (MICB.subtilis = 3,8 μM e MICS.pneumoniae = 7,8 μM) masarimicina. As células foram fixadas e manchadas com 0,1% (m/v) azul de metileno e visualizadas por microscopia de campo brilhante sob imersão de óleo a 1000x de ampliação. Este número foi modificado de 35. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura suplementar 1: Cromatografia de camada fina representativa da masarimicina pós-aquoso. A fase móvel é 90:10 hexano: isopropanol e vapor de iodo é usado para manchas. Rf = 0,3 para masarimicina. Clique aqui para baixar este Arquivo.

Figura suplementar 2: Cromatograma flash representativo para a purificação da masarimicina. O pico em aproximadamente 1,2 colunas contém masarimicina. Clique aqui para baixar este Arquivo.

Figura suplementar 3: Representante 1H NMR de masarimicina dissolvida na CDCl3 e registrada em um espectrômetro NMR de 400 MHz. O espectro é referenciado ao pico residual de solventes CHCl3 em δ = 7,26. Números em verde acima de mudanças químicas indicam atribuições de prótons nas posições correspondentes na estrutura da masarimicina (ver inset). Clique aqui para baixar este Arquivo.

Figura suplementar 4: Espectro representativo 13C NMR de masarimicina dissolvido em CDCl3 a 100 MHz. Espectro referenciado ao pico residual de solvente CHCl3 em δ = 77,36. Números em verde acima de mudanças químicas indicam atribuições de átomos de carbono nas posições na estrutura da masarimicina (ver inset). Clique aqui para baixar este Arquivo.

Figura suplementar 5: Representante resazurin MIC ensaio de masarimicina contra B. subtilis. Por favor clique aqui para baixar este Arquivo.

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Discussion

Masarimicina é um único inibidor bacteriostático micromolar de B. subtilis35 e S. pneumoniae37 . Em B. subtilis, a masarimicina tem sido demonstrada para inibir o GlcNAcase LytG35, enquanto o alvo molecular preciso na parede celular de S. pneumoniae não foi identificado37. A síntese de masarimicina usando a síntese orgânica clássica ou o procedimento de micro-ondas fornece o inibidor em bom rendimento e alta pureza. Baixos rendimentos de masarimicina podem ser tipicamente atribuídos à oxidação do carboxaldeído ciclohexyl. Para superar isso, recomenda-se armazenar carboxaldeído ciclohexyl sob uma atmosfera inerte em um dessecador. A oxidação do aldeído ao ácido carboxílico correspondente pode ser vista como um sólido branco na garrafa. Comprar pequenas quantidades de carboxaldeído ciclohexyl sem armazená-lo por longos períodos reduz muito esse problema.

A atribuição de NMR da estrutura de masarimicina é complicada pela presença de uma mistura de cis e formas trans da ligação de amida, bem como atropisômeros ao redor do anel o-iodofenil que resulta em múltiplos picos. Isso pode resultar em uma mudança química de prótons espalhada por 1 ppm, complicando assim as atribuições35. Como resultado, a cessão parcial de mudanças químicas NMR para espectros de 1H e 13C NMR, juntamente com espectros representativos, são fornecidas em Figuras Suplementares 3-4. Se houver dificuldade em atribuir mudanças químicas de 1H e 13C para masarimicina devido à mistura de isômeros, experimentos de RMN bidimensionais podem ser usados. A espectroscopia correlacionada (COSY) pode ser usada para identificar sistemas de spin de prótons, enquanto os experimentos de NMR de coerência quântica única heteronuclear (HSQC) podem ser usados para identificar correlações de títulos unidótons de carbono único. Uma vez purificada, a masarmicina pode ser armazenada a -20 °C como óleo ou dissolvida em DMSO a uma concentração de 25 mM até que seja necessário. Recomenda-se armazenar em pequenas alíquotas para reduzir o número de ciclos de congelamento. Após repetidos ciclos de congelamento do composto, a solução de estoque de masarimicina deve ser verificada pela TLC para monitorar qualquer degradação.

Telas de sinergia e antagonismo podem ser uma estratégia eficaz para identificar interações de caminhos e podem ser usadas para entender o modo de ação de pequenas moléculas. A Figura 2 mostra um exemplo de um ensaio de sinergia/antagonismo com S. pneumonia R6 usando masarimicina e o optochin inibidor atpase (note que o rastreamento de sinergia/antagonismo em B. subtilis ainda é uma investigação em andamento). Para a reprodutibilidade, as células de segunda passagem foram utilizadas e cultivadas a um OD600nm de no máximo 0,4. Observou-se FIC I de 1,5 para a interação entre masarimicina e optochin, indicando uma relação indiferente entre o par de antibióticos. A relação indiferente entre masarimicina e optochin indica que não há interação aparente entre as vias que esses antibióticos visam. Embora esses ensaios possam fornecer informações úteis sobre interações medicamentosas, é importante notar que os ensaios de sinergia/antagonismo devem ser executados com réplicas biológicas e uso dos cortes mais conservadores, conforme descrito pelas Odds42. Isso ajuda a evitar a super-interpretação das relações sinérgicas ou antagônicas observadas.

A análise fenotípica das células B. subtilis tratadas com masarimicina sub-MIC (Figura 3B) indica um fenótipo que difere dos fenótipos relatados para exclusão genética do lytG32 e mais se assemelha aos fenótipos de cepas de B. subtilis com múltiplas exclusões de autolise29. Essa discrepância no fenótipo é intrigante porque, embora a inibição in vitro de LytG tenha sido demontada35, um mutante ΔlytG não tem fenótipoobservável 32. Essa discrepância pode, em parte, ser explicada por diferenças na inativação genética e química46,47. As diferenças observadas na inativação química ou genética do LytG é uma questão intrigante que está atualmente sob investigação. As células de pneumonia s. tratadas com masarimicina apresentaram um fenótipo (Figura 3D) distinto da exclusão genética da glcNAcase correspondente (GH73, cluster 2) LytB 37,43,44,48. Essa discrepância morfológica destaca os desafios em atribuir o modo de ação ou atribuir o alvo biológico de inibidores de pequenas moléculas. Fenótipos morfológicos podem surgir de um conjunto mais complexo de interações que não seja uma única exclusão genética ou inativação química de uma enzima de ação de parede celular. Esses meta-fenótipos34 podem surgir de interações complexas através de mecanismos diretos (falta de uma enzima)) ou indiretos (perda de reguladores).

Pelo que sabemos, a masarimicina é o primeiro inibidor de uma autolise bacteriana que demonstra inibição do crescimento bacteriano (Figura Suplementar 5). É um inibidor bacteriostático de espectro estreito do crescimento em B. subtilis e S.pneumoniae. Este espectro estreito é uma limitação para estudos comparativos de várias espécies do metabolismo da parede celular entre organismos Gram-positivos e Gram-negativos. Este espectro estreito é em parte devido a diferenças em algumas das autolysinas de hidrolasina glicosyl usadas durante o crescimento vegetativo entre os organismos Gram-positivo (GlcNAcase) e Gram-negativo (transglicosylase lítico). Usando inibidores de pequenas moléculas, como a masarimicina para inibir as autolysinas PG, em particular, as GlcNAcases podem fornecer uma abordagem ortogonal à genética tradicional para elucidar a função de autolise. A masarimicina tem uma vantagem distinta sobre alguns métodos de biologia química, na qual pode ser usada em mais de uma espécie (B. subtilis e S. pneumoniae). Pode permitir estudos comparativos do metabolismo da parede celular entre a forma de vara (B. subtilis) e espécies coccoid (S. pneumoniae). O metabolismo e divisão de parede celular menos coregulados em S. pneumoniae fornece um contraponto no sistema mais fortemente regulamentado de espécies em forma de vara49,50. Futuras aplicações desta técnica serão identificar o alvo molecular em S.pneumoniae e explorar as diferenças entre a inativação genética e química de autolysinas em S.pneumoniae e B. subtilis.

Passos críticos no protocolo
É importante prestar atenção à concentração efetiva de masarimicina em ensaios biológicos e bioquímicos. Devido à sua natureza hidrofóbica, concentrações acima de 250 μM (65x MIC em B. subtilis) podem resultar em problemas de solubilidade e agregação que podem impactar a interpretação de dados biológicos. Controlar adequadamente o efeito do veículo (ou seja, DMSO) em todos os experimentos é essencial.

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Disclosures

Reid, C. W. tem propriedade intelectual envolvendo aplicações específicas de masarimicina.

Acknowledgments

A pesquisa foi apoiada pela Fundação Nacional de Ciência sob o número de bolsas 2009522. A análise da RMN de masarimicina foi apoiada pelo prêmio do programa de instrumentação de pesquisa da National Science Foundation sob o número de bolsas 1919644. Quaisquer opiniões, achados e conclusões ou recomendações expressas neste material são dos autores e não refletem necessariamente as opiniões da Fundação Nacional de Ciência.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
2-Iodobenzoic acid SIGMA-ALDRICH I7675-25G corrosive, irritant, light yellow to orange-brown powder
2-Propanol SIGMA-ALDRICH 109827-4L flammable, irritant, colorless liquid
Acetonitrile SIGMA-ALDRICH 34851-4L flammable, irritant, colorless liquid
Aluminum backed silica plates Sorbtech 4434126 silica gel XG F254 on aluminum backed plates
chloroform-d SIGMA-ALDRICH 151823-50G solvent for NMR
Compact Mass Spectrometer Advion-Interchim Advion CMS compact mass spectrometer equiped with APCI source and atmospheric solids analysis probe
Corning Costar 96 well flat bottom plates-sterile fisher chemical 07-200-90 for synergy/antagonism assays
cover slips fisher chemical 12-547 for microscopy
Cyclohexanecarboxaldehyde CHEM-IMPEX INT'L INC. 24451 flammable, irritant, colorless to pink liquid
Cyclohexyl isocyanide SIGMA-ALDRICH 133302-5G irritant, colorless liquid, extremly unpleasant odor
Cyclohexylamine SIGMA-ALDRICH 240648-100ML corrosive, flammable, irritant, colorless liquid unless contaminated
Ethyl acetate SIGMA-ALDRICH 537446-4L flammable, irritant, colorless liquid
flash silica cartridge (12g) Advion-Interchim PF-50SIHP-F0012 pack of flash silica columns (12g) for purification of masarimycin
formaldehyde SIGMA-ALDRICH F8775-25ML fixing agent for microscopy
HEPES SIGMA-ALDRICH H8651-25G buffer for microscopy fixing solution
Hexane, mixture of isomers SIGMA-ALDRICH 178918-4L environmentally damaging, flammable, irritant, health hazard, colorless liquid
High performance compact mass spectrometer Advion expression Atmospheric Solids Analysis Probe (ASAP), low resolution
High Vac eppendorf Vacufuge plus vacuum aided by centrifugal force and temperature
Hydrochloric acid SIGMA-ALDRICH 258148-2.5L corrosive, irritant, colorless liquid
hydrochloric acid SIGMA-ALDRICH 320331-2.5L strong acid
immersion oil fisher chemical 12-365-19 for microscopy
Iodine, resublimed crystals Alfa Aesar 41955 environmentally damaging, irritant, health hazard, dark grey/purple crystals
Mestre Mnova MestreLab Research software for processing NMR spectra
Methanol SIGMA-ALDRICH 439193-4L flammable, toxic, health hazard, colorless liquid
methylene blue SIGMA-ALDRICH M9140-25G microscopy stain for staining cell walls
meuller-hinton agar plates + 5% sheep blood fisher chemical B21176X growth media for Streptococcus pneumoniae
meuller-hinton broth fisher chemical DF0757-17-6 growth media for Streptococcus pneumoniae
microscope slides fisher chemical 22-310397 for microscopy
Microwave Synthesis Labstation MILESTONE START SYNTH device that requires the ventilation of a fume hood, equipped with synthesis carousel
NMR tubes SIGMA-ALDRICH Z562769-5EA 5mm NMR tubes 600 MHz
Nuclear Magnetic Resonance (NMR) Bruker Ascend 400 large superconducting magnet (400MHz)
optochin fisher chemical AAB21627MC ethylhydrocupreine hydrochloride
petrie plates Celltreat 229695 for preparing agar plates for bacterial growth
Primo Star Bright field/Phase contrast Microscope with ERc5s camera Zeiss for morphology studies
puriFlash interchim XS520plus flash chromatography purification system
resazurin SIGMA-ALDRICH R7017-1G for synergy/antagonism assays
Rotary Evaporator Heidolph Hei-VAP Value "The Collegiate" solvent evaporator
Sodium bicarbonate SIGMA-ALDRICH S6014-500G irritant, white powder
Sodium chloride fisher chemical S271-1 crystalline, colorless
Sodium chloride SIGMA-ALDRICH S5886-500G for growth of B.subtilis and preparation of LB media
Sodium sulfate SIGMA-ALDRICH 7985592-500G anhydrous, granular, white
tryptone fisher chemical BP1421-500 for growth of B.subtilis and preparation of LB media
Whitney DG250 Workstation Microbiology International DG250 anaerobic workstation. Anaerobic gas mixture used: 5% hydrogen, 10% carbon dioxide, balance nitrogen
yeast extract fisher chemical BP1422-500 for growth of B.subtilis and preparation of LB media
Zen Lite (blue) software Zeiss for acquiring micrographs

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Bioquímica Edição 179 Peptidoglycan metabolismo autolysina biologia química inibidor parede celular
Síntese de Masarimicina, um inibidor de pequenas moléculas do crescimento bacteriano gram-positivo
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Gallati, M., Point, B., Reid, C. W.… More

Gallati, M., Point, B., Reid, C. W. Synthesis of Masarimycin, a Small Molecule Inhibitor of Gram-Positive Bacterial Growth. J. Vis. Exp. (179), e63191, doi:10.3791/63191 (2022).

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