Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

Synthese van masarimycine, een kleine molecuulremmer van grampositieve bacteriegroei

Published: January 7, 2022 doi: 10.3791/63191
Automatic Translation
1, 1, 1,2
1Department of Science and Technology, Bryant University, 2Center for Health and Behavioral Sciences, Bryant University

Summary

Een gedetailleerd protocol wordt gepresenteerd voor het bereiden van de bacteriostatische diamide masarimycine, een kleine molecuul sonde die de groei van Bacillus subtilis en Streptococcus pneumoniae remt door zich te richten op de afbraak van de celwand. De toepassing ervan als chemische sonde wordt aangetoond in synergie/antagonisme assays en morfologische studies met B. subtilis en S. pneumoniae.

Abstract

Peptidoglycan (PG) in de celwand van bacteriën is een unieke macromoleculaire structuur die vorm en bescherming tegen de omgeving verleent. Centraal in het begrijpen van celgroei en -deling staat de kennis van hoe PG-degradatie de biosynthese en celwandassemblage beïnvloedt. Onlangs is de metabole etikettering van PG door de introductie van gemodificeerde suikers of aminozuren gemeld. Hoewel chemische ondervraging van biosynthetische stappen met kleine molecuulremmers mogelijk is, zijn chemische biologie-instrumenten om PG-afbraak door autolysinen te bestuderen onderontwikkeld. Bacteriële autolysines zijn een brede klasse van enzymen die betrokken zijn bij de strak gecoördineerde afbraak van PG. Hier wordt een gedetailleerd protocol gepresenteerd voor het voorbereiden van een sonde met kleine moleculen, masarimycine, een remmer van N-acetylglucosaminidase LytG in Bacillus subtilis, en celwandmetabolisme in Streptococcus pneumoniae. Bereiding van de remmer via microgolf-geassisteerde en klassieke organische synthese wordt verstrekt. De toepasbaarheid ervan als een hulpmiddel om Gram-positieve fysiologie in biologische assays te bestuderen, wordt gepresenteerd.

Introduction

Peptidoglycaan (PG) is een mesh-achtig polymeer dat celvorm en -structuur afbakent in zowel Gram-positieve als Gram-negatieve bacteriën 1,2. Dit heteropolymeer is een matrix van aminosuikers die door korte peptiden 3,4,5,6 worden verknoopt met een ruggengraat die bestaat uit β-(1,4)-gebonden afwisselende N-acetylglucosamine (GlcNAc) en N-acetylmuramic acid (MurNAc) residuen (Figuur 1)1. Aan het C-3 lactylgedeelte van MurNAc is het stengelpeptide bevestigd. Het metabolisme van PG omvat een strak gecoördineerd systeem van biosynthetische en degradatieve enzymen om nieuw materiaal in de celwand op te nemen 7,8. Afbraak van PG wordt uitgevoerd door enzymen die gezamenlijk autolysines9 worden genoemd en verder worden geclassificeerd op basis van de specificiteit van de gesplitste binding. Autolysinen nemen deel aan vele cellulaire processen, waaronder celgroei, celdeling, beweeglijkheid, PG-rijping, chemotaxis, eiwitsecretie, genetische competentie, differentiatie en pathogeniciteit10,11. Het ontrafelen van de specifieke biologische functies van individuele autolysines kan ontmoedigend zijn, deels als gevolg van functionele redundantie. Recente biofysische 8,12,13 en computationele studies12 hebben echter nieuw inzicht gegeven in hun rol in het PG-metabolisme. Daarnaast hebben recente rapporten meer inzicht gegeven in de synthese14 en membraangemedieerde 15,16,17 stappen in PG-metabolisme. Een grondig begrip van de relatie tussen degradatieve en synthetische routes van PG-metabolisme zou aanleiding kunnen geven tot eerder onaangeboorde antibioticadoelen.

Hoewel er aanzienlijke vooruitgang is geboekt in de methodologie om glycobiologie in eukaryoten te bestuderen, is bacteriële glycobiologie en in het bijzonder PG-metabolisme niet in een vergelijkbaar tempo gevorderd. Huidige chemische benaderingen om pg-metabolisme te bestuderen omvatten fluorescerend gelabelde antibiotica18, fluorescerende sondes19,20 en metabole etikettering 21,22,23,24. Deze nieuwe benaderingen bieden nieuwe manieren om het bacteriële celwandmetabolisme te ondervragen. Hoewel sommige van deze strategieën in staat zijn om PG in vivo te labelen, kunnen ze soortspecifiek19 zijn, of alleen werken bij stammen zonder een bepaalde autolysine25. Veel PG-etiketteringsstrategieën zijn bedoeld voor gebruik met geïsoleerde celwanden26 of met in vitro gereconstitueerde PG-biosyntheseroutes 20,27,28. Het gebruik van fluorescerend gelabelde antibiotica is momenteel beperkt tot biosynthetische stappen en transpeptidatie18.

De huidige kennis van bacteriële autolysines en hun rol in het celwandmetabolisme komt uit genetische en in vitro biochemische analyse 11,29,30,31,32. Hoewel deze benaderingen een schat aan informatie hebben opgeleverd over deze belangrijke klasse van enzymen, kan het ontcijferen van hun biologische rol een uitdaging zijn. Bijvoorbeeld, als gevolg van functionele redundantie33, deletie van een autolysine resulteert in de meeste gevallen niet in het stoppen van de bacteriegroei. Dit ondanks hun impliciete rol in celgroei en deling 7,12. Een andere complicatie is dat genetische deletie van bacteriële autolysines aanleiding kan geven tot metafenotypen34. Metafenotypen komen voort uit het complexe samenspel tussen de route die wordt beïnvloed door de genetische deletie en andere onderling verbonden paden. Zo kan een metafenotype ontstaan via een direct effect zoals het ontbreken van een enzym, of een indirect effect zoals een verstoring van regulatoren.

Momenteel zijn er slechts een paar remmers van glycosidase autolysinen zoals N-acetylglucosaminidasen (GlcNAcase) en N-acetylmuramidases, die kunnen worden gebruikt als chemische sondes om de afbraak van PG te bestuderen. Om dit aan te pakken, is de diamide masarimycine (voorheen aangeduid als fgkc) geïdentificeerd en gekarakteriseerd35 als een bacteriostatische remmer van Bacillus subtilis groei die zich richt op de GlcNAcase LytG32 (figuur 1). LytG is een exo-werkende GlcNAcase36, een lid van cluster 2 binnen glycosylhydrolasefamilie 73 (GH73). Het is de belangrijkste actieve GlcNA-zaak tijdens vegetatieve groei32. Voor zover wij weten, masarimycine is de eerste remmer van een PG-werkende GlcNAcase die de cellulaire groei remt. Aanvullende studies van masarimycine met Streptococcus pneumoniae vonden dat masarimycine waarschijnlijk het celwandmetabolisme in dit organisme remt37. Hier wordt de bereiding van masarimycine gerapporteerd voor gebruik als een chemische biologiesonde om de fysiologie te bestuderen in de Gram-positieve organismen B. subtilis en S. pneumoniae. Voorbeelden van morfologische analyse van subminimale remmende concentratiebehandeling met masarimycine, evenals een synergie / antagonisme-assay worden gepresenteerd. Synergie- en antagonismetests met behulp van antibiotica met goed gedefinieerde werkingsmechanismen kunnen een nuttige manier zijn om verbanden tussen cellulaire processen te onderzoeken 38,39,40.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Algemene methoden

OPMERKING: Alle verbindingen werden gekocht bij standaardleveranciers en gebruikt zonder verdere zuivering.

  1. Voer dunnelaagchromatografie (TLC) uit op een aluminiumplaat die is voorgecoat met silicagel XG F254. Detecteer vlekken onder een UV-lamp, door onderdompeling in p-anisaldehydevlek of door blootstelling aan I2-damp.
  2. Registreer alle nucleaire magnetische resonantie (NMR) spectra op een 400 MHz spectrometer.
    OPMERKING: 1H-NMR en 13C-NMR spectra werden verwezen naar resterende oplosmiddelpieken. Koppelingsconstanten worden gegeven in [Hz] en chemische verschuivingen in [ppm].
  3. Record atmosferische druk chemische ionisatie (APCI) massaspectrometrie spectra van masarimycine op een compacte massaspectrometer uitgerust met een atmosferische vaste stof analyse sonde.

2. Algemene procedure voor de bereiding van masarimycine

OPMERKING: Voer de onderstaande stappen uit in een zuurkast.

  1. Bereid een 0,1 M-oplossing in methanol van elke reactant: cyclohexylamine, cyclohexylcarboxaldehyde, o-joodbenzoëzuur en cyclohexylisocytanide35.
    LET OP: Cyclohexylamine, cyclohexyl isocyanide en cyclohexylcarboxaldehyde zijn ontvlambaar. Ze kunnen huidcorrosie veroorzaken en orale, dermale, respiratoire of reproductieve toxiciteit veroorzaken. Houd verbindingen uit de buurt van open vuur, hete oppervlakken en ontstekingsbronnen. Draag de juiste huid- en oogbescherming, werk in een goed geventileerde ruimte en vermijd inademing van dampen of nevel. Houd flessen voor opslag goed gesloten en bewaar ze op een koele, droge plaats. Bewaar cyclohexylcarboxaldehyde in een exsiccator onder een N2-atmosfeer .
  2. Meng 5 ml cyclohexylamine (0,1 M oplossing in methanol) en 5 ml cyclohexylcarboxaldehyde (0,1 M in methanol) in een afgedekte ronde bodemkolf en roer de oplossing met behulp van een magnetische roerstaaf gedurende 30 minuten op een roerplaat bij 40 °C in een zandbad. Controleer de temperatuur met behulp van een thermometer die ongeveer 1 cm onder het zandoppervlak is geplaatst.
  3. Voeg na 30 minuten 5 ml cyclohexylisocyanide (0,1 M oplossing in methanol) toe aan de oplossing uit stap 2.2 en roer nog eens 20 minuten bij 50 °C. Voeg ten slotte 5 ml o-joodbenzoëzuur (0,1 M oplossing in methanol) toe aan het reactiemengsel en blijf gedurende 3-5 uur roeren bij 55 °C.
  4. Controleer de voortgang van de reactie periodiek door TLC ongeveer elk uur nadat het bovenstaande reactiemengsel gedurende 3 uur was geroerd.
  5. Knip een strook van 3 cm x 6 cm TLC-plaat met aluminium achterkant. Teken met een #2 potlood een lijn op ongeveer 1 cm van de onderkant. Plaats met behulp van een glazen microcapillair ongeveer 5 μL van het reactiemengsel op de TLC-plaat en laat het drogen.
  6. Voeg aan een bekerglas van 150 ml voldoende mobiele fase (90:10 hexaan: isopropanol) toe om de bodem van het bekerglas te bedekken. Plaats met een pincet de bovenstaande TLC-plaat voorzichtig in het bekerglas en zorg ervoor dat de TLC-plaat gelijkmatig in de mobiele fase komt. Bedek de bovenkant van het bekerglas met een stukje tinfoil.
    OPMERKING: Zorg ervoor dat de mobiele fase de lijn en het gevlekte monster niet bedekt.
  7. Laat de mobiele fase de TLC-plaat opgaan totdat deze ongeveer 1 cm onder de bovenkant van de plaat ligt. Verwijder de TLC-plaat en teken met een potlood een lijn die de afgelegde afstand van de mobiele fase aangeeft. Laat de TLC-plaat drogen in een zuurkast.
  8. Eenmaal gedroogd, plaats de TLC-plaat in een bekerglas met een kleine hoeveelheid vaste I2 en dek het bekerglas af met een stuk tinfolie. Monitor de TLC op de ontwikkeling van geel/bruine vlekken. Eenmaal ontwikkeld, verwijdert u de TLC-plaat en markeert u de locatie van de vlekken met een potlood (aanvullende figuur 1).
    OPMERKING: Als ik2 vlekken niet markeer, zal de vlek na verloop van tijd verdwijnen. Vlekken kunnen ook op de TLC-plaat worden gevisualiseerd door UV-licht, p-anisaldehydekleuring of kaliumpermanganaatkleuring (zie Aanvullende informatie).
  9. Bereken Rf-waarden voor alle gevisualiseerde vlekken met behulp van de volgende formule:
    Rf = Equation 1
  10. Beschouw de reactie als voltooid wanneer slechts één plek met Rf = 0,3 zichtbaar is op de TLC-plaat. Verwijder het oplosmiddel in een roterende verdamper onder verlaagde druk en droog het ruwe product (verkregen als een geelbruine olie) onder een hoog vacuüm totdat alle methanol is verdampt.
  11. Los het gedroogde ruwe product op in 30 ml ethylacetaat en breng het over in een trechter van het separatoreum. Ethylacetaat achtereenvolgens extraheren met 1 M HCl (2 x 30 ml), H2O (30 ml), verzadigde NaHCO3-oplossing (2 x 30 ml), H2O (30 ml) en verzadigde NaCl-oplossing (2 x 30 ml). Gooi de waterige lagen weg.
    OPMERKING: De ethylacetaatlaag is de bovenste laag in elk van de extracties. Schud voor elke extractie krachtig de separatortrechter met het ethylacetaat en de waterige oplossing (HCl, H2O, NaHCO3 of NaCl) en laat de lagen volledig scheiden.
  12. Verwijder de ethylacetaatlaag uit de trechter en vang deze op in een Erlenmeyer. Voeg een spatel vol Na2SO4 (watervrij) toe om restwater uit ethylacetaat te verwijderen.
    OPMERKING: De ethylacetaatoplossing wordt als droog beschouwd wanneer Na2SO4 in de kolf vrij rondloopt en niet klontert. Als Na2SO4 samenklontert, kan een extra spatel van Na2SO4 worden toegevoegd.
  13. Filtreer de gedroogde ethylacetaatoplossing door #1 filterpapier om Na2SO4 te verwijderen. Was het filtreerpapier met een kleine hoeveelheid ethylacetaat. Plaats de gefilterde ethylacetaatoplossing in een kolf met ronde bodem en verwijder het oplosmiddel op een roterende verdamper onder verlaagde druk om masarimycine als olie te verkrijgen zodra al het ethylacetaat is verwijderd.
  14. Los de hierboven verkregen masarimycine-olie op in een minimale hoeveelheid (1-2 ml) van 9:1 hexaan: isopropanol en roer op een magnetische roerplaat totdat alle verbinding is opgelost.
  15. Zuiver de opgeloste masarimycine door flitschromatografie met behulp van een 12 g normale fase silica flitskolom.
    1. Breng de flitskolom in evenwicht met 10 kolomvolumes van de mobiele fase (99:1 hexaan: isopropanol) met het instrument dat is ingesteld op een debiet van 15 ml/min.
      OPMERKING: Nadat de evenwichtsbalans is voltooid, stopt u de stroom en koppelt u de bovenkant van de kolom los van het systeem.
    2. Zuig opgeloste masarimycine op met een spuit van 5 ml. Sluit de spuit rechtstreeks aan op de bovenkant van de gebalanceerde flitskolom en injecteer de oplossing in de kolom. Sluit de geladen kolom opnieuw aan op het flitschromatografiesysteem en start de gradiëntelutie.
    3. Eluteer masarimycine uit de kolom met behulp van gradiëntelutie tot een uiteindelijke mobiele faseconcentratie van 10:90 hexaan: isopropanol over 12 kolomvolumes. Controleer de elutie van masarimycine via absorptie bij 230 en 254 nm.
    4. Verzamel de verbindingen die uit de kolom worden geëlueerd door een fractiecollector die 20 ml oplosmiddel per fractie verzamelt.
      OPMERKING: Als een flashchromatografiesysteem niet beschikbaar is, kan de zuivering van masarimycine worden uitgevoerd via een zwaartekrachtsiliciumkolom met een 3:1 (hexaan: ethylacetaat) mobiele fase. Fracties die masarimycine bevatten, kunnen worden geïdentificeerd door TLC met behulp van dezelfde mobiele fase. Visualisatie van TLC-vlekken werd gedaan met UV-licht, I2-damp of kaliumpermanganaatkleuring.
    5. Identificeer fracties die masarimycine bevatten door TLC (stappen 2.5-2.9) of massaspectrometrie op een compacte massaspectrometer uitgerust met een atmosferische analysesonde voor vaste stoffen. Droog het eindproduct onder vacuüm (~ 0,3 mbar).
      OPMERKING: Masarimycine wordt routinematig verkregen als een kleurloze olie of vaste stof met een opbrengst van 55% -70% met betrekking tot mmol van cyclohexylcarboxaldehyde toegevoegd aan de reactie. Bereken de uiteindelijke opbrengst van masarimycine door de massa van de gezuiverde masarimycine te verkrijgen en de theoretische opbrengst van de reactie te berekenen met behulp van de volgende formule:
      % opbrengst = Equation 2 x 100%
  16. Bevestig de structuur van masarimycine door NMR.
    1. Los ~10 mg masarimycinemonster op in 0,5 ml CDCl3. Breng met behulp van een Pasteur-pipet de oplossing over in een NMR-buis van 5 mm en sluit de buis af. Plaats de NMR-buis in de spectrometer.
    2. Verkrijg 1H- en 13C NMR-spectra met behulp van vooraf ingestelde experimenten van de fabrikant. Chemische verschuivingstoewijzingen en representatieve spectra zijn opgenomen in aanvullende figuren 3-4.
  17. Bewaar masarimycine droog of opgelost in DMSO (eindconcentratie van 25 mM) bij -20 °C tot gebruik.

3. Microgolfprocedure voor de bereiding van masarimycine

  1. Bereid 0,6 M oplossingen van cyclohexylamine, cyclohexylcarboxaldehyde, cyclohexylisocyanide en o-joodbenzoëzuur in acetonitril.
  2. Voeg een roerstaaf en 10 ml acetonitril toe aan een glazen injectieflacon met microgolfreactie.
  3. Voeg 2 ml cyclohexylamine (0,6 M in acetonitril), 2 ml cyclohexylcarboxaldehyde (0,6 M in acetonitril) en 7 ml acetonitril toe aan de injectieflacon.
  4. Plaats de injectieflacon met microgolfreactie in de microgolfcarrousel. Roer het mengsel, verwarm het gedurende 30 minuten bij 50°C bij een vermogensinstelling van 400 W en laat het afkoelen tot kamertemperatuur.
  5. Voeg 2 ml o-joodbenzoëzuur (0,6 M methanol) en 2 ml cyclohexylisoocyanide (0,6 M in acetonitril) toe aan de injectieflacon. Roer het mengsel, verwarm het tot 100 °C in de magnetron gedurende 40 minuten bij een vermogensinstelling van 400 W en laat het afkoelen tot kamertemperatuur.
  6. Controleer de voortgang van de reactie door TLC (90:10 hexaan: isopropanol) met behulp van I2 damp na het voltooien van stap 3.5.
    OPMERKING: Als TLC aantoont dat de reactie onvolledig is (d.w.z. meerdere plekken op TLC), plaatst u de reactieflacon terug in de magnetron en stelt u de microgolfomstandigheden in die worden beschreven in stap 3.5.
  7. Zodra de reactie is voltooid, giet u de oplossing in een kolf met ronde bodem van 100 ml en verdampt u deze tot droogheid met behulp van een roterende verdamper.
  8. Volg stappen 2.6-2.16 hierboven om de waterige work-up, zuivering en karakterisering van masarimycine te voltooien.

4. Synergie en antagonisme assay

  1. Kweek Streptococcus pneumoniae R6 op Mueller-Hinton (MH) agarplaten met 5% (v/v) schapenbloed bij 37 °C onder anaerobe omstandigheden. Gebruik in alle experimenten tweede passagecellen gekweekt in 5 ml MH-bouillon bij 37 °C onder anaërobe omstandigheden tot OD600 ~ 0,4 is.
  2. Onderwerp de remmers masarimycine en optochin aan seriële 1:2 verdunningen in respectievelijke oplosmiddelen, waarbij de resulterende concentraties de minimale remmende concentratie (MIC) waarden van elke remmer flankeren.
    1. Maak de eerste verdunning van masarimycine in dimethylsulfoxide (DMSO) tot een concentratie van 100 μM is bereikt. Maak vanaf dit punt masarimycine verdunningen in MH-bouillon. Bereid optochinenvoorraadoplossing (3,5 mM) door in de handel verkrijgbare optochine (zie materiaaltabel) op te lossen in steriele MH-bouillon.
      OPMERKING: Masarimycine stock oplossingen werden gemaakt op 25 mM in DMSO.
  3. Voeg aan een steriele 96-well microtiterplaat 2 μL aliquots van elke optochin verdunning toe aan elke rij van de plaat. Voeg aan dezelfde plaat 2 μL aliquots van elke masarimycineverdunning toe aan elke kolom om een reeks optochin- en masarimycineconcentraties op de plaat te creëren (figuur 2).
  4. Voeg steriele MH-bouillon (93 μL) toe aan elke put die de bovenstaande remmers bevat. Ent de microtiterplaten met 5 μL cultuur (OD600 ~0,4) vanaf stap 4.1.
    OPMERKING: Het inenten van de 96-putplaat gebeurt meestal onder anaerobe omstandigheden in een anaeroob werkstation. Het uiteindelijke volume in de put is 100 μL.
  5. Kweek culturen gedurende 18 uur bij 37 °C onder anaërobe omstandigheden, gevolgd door de toevoeging van 30 μL van 0,01% (m/v) oplossing van resazurin natriumzout. Incubeer de plaat bij kamertemperatuur gedurende 15 minuten om de vorming en stabilisatie van kleur mogelijk te maken.
    OPMERKING: Resazurin-oplossing wordt bereid door de verbinding op te lossen in gedestilleerd water en kan maximaal twee weken bij 4 °C worden bewaard.
  6. Lees direct de concentratiewaarden van de plaat af en wijs de laagste inhibitorconcentratie toe waarvoor geen bacteriegroei wordt waargenomen (blauwe kleur) als [X] (zie stap 4.7.1), d.w.z. de laagste remmende concentratie van het geneesmiddel in aanwezigheid van het co-geneesmiddel.
    OPMERKING: Positieve bacteriegroei wordt in de putten geïdentificeerd door de resazurinekleurstof die roze wordt. MIC-waarden voor elk geneesmiddel alleen (d.w.z. bij afwezigheid van co-drug) worden op een vergelijkbare manier bepaald met behulp van de resazurin MIC-test35 met elk geneesmiddel afzonderlijk (aanvullende figuur 5). MIC's in S. pneumoniae zijn respectievelijk 7,8 μM en 15,85 μM voor masarimycine en optochin.
  7. Bepaal de fractionele remmende concentratie (FIC) en FIC-index (FICI) met behulp van de volgende vergelijkingen.
    1. FIC= [X]/MICx, waarbij [X] (uit stap 4.6) de laagste remmende concentratie van het geneesmiddel is in aanwezigheid van het co-geneesmiddel, en MICx de laagste remmende concentratie van het geneesmiddel in afwezigheid van het co-geneesmiddel.
    2. FICI = FICmasarimycine + FICantibioticum
      OPMERKING: FICI < 0,5 = synergetisch, 0,5 < FICI < 1 = additief, 1 < FICI < 4 = onverschillig, FICI > 4 = antagonistisch.

5. Morfologisch onderzoek

  1. Kweek Bacillus subtilis 11774 op Luria-Bertani (LB) agarplaten (10 g/L trypton, 5 g/L gistextract en 5 g/L NaCl) met 1,5% Bacto agar bij 37 °C. Gebruik in alle experimenten tweede passagecellen gekweekt in 5 ml LB-bouillon bij 37 °C tot OD600 = 1. Kweek S.pneumoniae op dezelfde manier als in stap 4.1.
  2. Na het verkrijgen van een celkweekdichtheid met OD600nm = 1 voor B. subtilis, of OD600nm = 0,4 voor S. pneumoniae, voeg masarimycine met behulp van een pipet toe aan de kweekbuis met het label "behandeld" tot een eindconcentratie van 3,8 μM (0,75x MIC voor B.subtilis), of 5,85 μM (0,75x MIC voor S.pneumoniae). Voeg aan de tweede kweekbuis met het label "controle" een equivalent volume DMSO toe.
  3. Voor B.subtilis plaatst u de monsters gedurende 90 minuten in een incubator bij 37 °C met schudden bij 150 tpm. Voor S. pneumoniae, incubateer de cellen zonder te schudden onder anaerobe omstandigheden.
  4. Na 90 min, de culturen chemisch fixeren in een 1:10 mengsel (v/v) van kweekmedia en fixing buffer (20 mM HEPES, 1% formaldehyde (pH 6,8)) bij 4 °C gedurende de nacht. Nadat het bevestigen is voltooid, brengt u 10-20 μL monsters aan op glazen microscoopglaasjes met behulp van een pipet en laat u ze aan de lucht drogen. Bevestig de luchtgedroogde monsters door de glasglaasjes te verwarmen met een Bunsen-brander.
  5. Na warmtefixatie, vlekmonsters met toevoeging van 100 μL 0,1% (m/v) methyleenblauw (oplossing in 20% (v/v) ethanol). Incubeer de bevlekte glaasjes gedurende 10 minuten en spoel de overtollige kleurstof weg met dH2O. Verwarm vervolgens de gekleurde dia's voorzichtig tot 60 °C in een oven gedurende 15-20 minuten om cellen naar een gemeenschappelijk brandpuntsvlak te brengen.
  6. Verzegel de gekleurde monsters door een microscoopdeksel over de gekleurde cellen te plaatsen. Sluit vervolgens de randen af met microscoopglaascement. Plaats het verzegelde microscoopglaasje op het microscooppodium en breng het beeld scherp met een vergroting van 100x met behulp van bright-field microscopie.
  7. Plaats een druppel dompelolie op de microscoopglaasjes en breng het gezichtsveld scherp met een vergroting van 1000x. Verkrijg microfoto's met behulp van een camera die aan de microscoop en de bijbehorende software is bevestigd. Verkrijg afbeeldingen met behulp van de automatische witbalans- en diafragma-instellingen in de software.
    OPMERKING: Als alternatief kunnen afbeeldingen worden verwerkt met behulp van de open-source ImageJ-software.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Masarimycine is een bacteriostatische remmer met klein molecuul van B. subtilis en S. pneumoniae en er is aangetoond dat het de exo-werkende GlcNAcase LytG in B. subtilis35,37 remt en zich richt op de celwand in S. pneumoniae37. Masarimycine kan efficiënt worden bereid door de klassieke of microgolfondersteunde organische synthese met opbrengsten in het bereik van 55% -70%. Microgolf-geassisteerde synthese heeft het voordeel van een aanzienlijke vermindering van de tijd om de verbinding te synthetiseren. Microgolf-geassisteerde synthese verkort de synthese van 5-6 uur (traditionele synthese) tot 2-3 uur met behoud van vergelijkbare opbrengsten. Flashchromatografie zorgt voor een snelle zuivering van masarimycine in hoge zuiverheid (aanvullende figuren 1-2). Structurele toewijzingen van 1H- en 13C NMR-spectra samen met representatieve spectra zijn opgenomen in aanvullende figuren 3-4.

Synergie- en antagonismeschermen kunnen een nuttig hulpmiddel zijn om functionele verbindingen tussen cellulaire componenten (synergie) te onthullen en om genetische netwerken en mechanismen van geneesmiddelwerking (antagonisme) te onderzoeken40. Evaluatie van synergie/antagonisme met de ATPase-remmer optochin in S. pneumoniae is weergegeven in figuur 2. Resazurin microtiter plate assay41 biedt een gemakkelijke aflezing van de groei / niet-groei van het organisme. De laagste concentratie van verbinding om bacteriële groei te remmen (blauwe kleur) wordt genomen als de MIC-waarde in de aanwezigheid van een co-drug. Putten met bacteriegroei zullen roze van kleur zijn. De relatie tussen masarimycine en optochin werd bepaald door de fractionele inhibitorconcentratie-index (FICI) te berekenen met behulp van vergelijkingen in protocolstap 4.7. De FICI-waarde voor de interactie masarimycine-optochin wordt berekend op 1,5, wat wijst op een onverschillige relatie op basis van gepubliceerde normen42. Fenotypische assays met masarimycine in B. subtilis bij sub-MIC-concentraties presenteerden een worstachtig fenotype (figuur 3B) dat verschilt van gerapporteerde fenotypen van de ΔlytG-mutant in de literatuur32 en meer lijkt op meerdere autolysine knock-outs29. Fenotypische analyse van S. pneumoniae met masarimycine bij sub-MIC-concentraties presenteerde een klonterend fenotype (figuur 3D). Dit klonterende fenotype verschilt van die gerapporteerd voor S. pneumoniae celwand-werkende GlcNAcases 43,44,45.

Figure 1
Figuur 1: Structuur van peptidoglycan met de splitsingsplaats van de exo-acetyl glucosaminidase LytG van Bacillus subtilis. Inzet toont de structuur van de LytG-remmer masarimycine. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figure 2
Figuur 2: Synergy/Antagonism assay om antagonistische/synergetische relaties met masarimycine en optochin in S. pneumoniae te onderzoeken. Blauwe of paarse kleur duidt op geen bacteriegroei, terwijl roze kleur bacteriegroei aangeeft. De MIC in aanwezigheid van co-drug wordt genomen als de laagste concentratie die geen bacteriële groei vertoont (blauwe kleur). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figure 3
Figuur 3: Morfologische analyse. Morfologische veranderingen in B. subtilis (A,B) en S. pneumoniae (C,D) bij behandeling met 0,75x MIC (MICB.subtilis = 3,8 μM en MICS.pneumoniae = 7,8 μM) masarimycine. Cellen werden gefixeerd en gekleurd met 0,1% (m / v) methyleenblauw en gevisualiseerd door heldere veldmicroscopie onder olie-onderdompeling bij 1000x vergroting. Dit cijfer is gewijzigd van 35. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Aanvullende figuur 1: Representatieve dunnelaagchromatografie van masarimycine na waterige work-up. De mobiele fase is 90:10 hexaan: isopropanol en jodiumdamp worden gebruikt voor het kleuren van vlekken. Rf = 0,3 voor masarimycine. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullende figuur 2: Representatief flashchromatogram voor de zuivering van masarimycine. De piek op ongeveer 1,2 kolomvolumes bevat masarimycine. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullende figuur 3: Vertegenwoordiger 1H NMR van masarimycine opgelost in CDCl3 en geregistreerd op een 400 MHz NMR-spectrometer. Spectrum wordt verwezen naar de resterende CHCl 3-oplosmiddelpiek bij δ = 7,26. Getallen in het groen boven chemische verschuivingen geven protontoewijzingen aan op de overeenkomstige posities in de structuur van masarimycine (zie inzet). Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullende figuur 4: Representatief 13C NMR-spectrum van masarimycine opgelost in CDCl3 bij 100 MHz. Spectrum verwezen naar residuele CHCl3 oplosmiddelpiek bij δ = 77,36. Getallen in het groen boven chemische verschuivingen geven koolstofatoomtoewijzingen aan op de posities in de structuur van masarimycine (zie inzet). Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullende figuur 5: Representatieve resazurin MIC-test van masarimycine tegen B. subtilis. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Masarimycine is een enkele micromolaire bacteriostatische remmer van B. subtilis35 en S. pneumoniae37 groei. Bij B. subtilis is aangetoond dat masarimycine de GlcNAcase LytG35 remt, terwijl het precieze moleculaire doelwit in de celwand van S. pneumoniae niet is geïdentificeerd37. Synthese van masarimycine met behulp van de klassieke organische synthese of microgolfprocedure biedt de remmer een goede opbrengst en een hoge zuiverheid. Lage opbrengsten van masarimycine kunnen meestal worden toegeschreven aan de oxidatie van de cyclohexylcarboxaldehyde. Om dit te ondervangen, wordt aanbevolen om cyclohexylcarboxaldehyde onder een inerte atmosfeer in een exsiccator op te slaan. Oxidatie van het aldehyde tot het overeenkomstige carbonzuur kan worden gezien als een witte vaste stof in de fles. Het kopen van kleine hoeveelheden cyclohexylcarboxaldehyde zonder het voor langere perioden op te slaan, vermindert dit probleem aanzienlijk.

NMR-toewijzing van masarimycinestructuur wordt gecompliceerd door de aanwezigheid van een mengsel van cis- en transvormen van de amidebinding en atropisomeren rond de o-jodofenylring die resulteert in meerdere pieken. Dit kan resulteren in een proton chemische verschuiving verspreid over 1 ppm waardoor opdrachten35 worden bemoeilijkt. Als gevolg hiervan worden gedeeltelijke toewijzing van NMR-chemische verschuivingen voor zowel 1H- als 13C NMR-spectra samen met representatieve spectra verstrekt in aanvullende figuren 3-4. Als het moeilijk is om chemische verschuivingen van 1H en 13C toe te wijzen voor masarimycine als gevolg van het mengsel van isomeren, kunnen 2-dimensionale NMR-experimenten worden gebruikt. Gecorreleerde spectroscopie (COSY) kan worden gebruikt om protonspinsystemen te identificeren, terwijl heteronucleaire enkelvoudige kwantumcoherentiespectroscopie (HSQC) NMR-experimenten kunnen worden gebruikt om proton-koolstof single bond correlaties te identificeren. Eenmaal gezuiverd, kan masarimycine worden bewaard bij -20 °C als olie of opgelost in DMSO tot een concentratie van 25 mM totdat het nodig is. Het wordt aanbevolen om in kleine aliquots te bewaren om het aantal vries-dooicycli te verminderen. Na herhaalde vries-dooicycli van de verbinding moet de masarimycine-stamoplossing door TLC worden gecontroleerd om te controleren op eventuele afbraak.

Synergie- en antagonismeschermen kunnen een effectieve strategie zijn om route-interacties te identificeren en kunnen worden gebruikt om het werkingsmechanisme van kleine moleculen te begrijpen. Figuur 2 toont een voorbeeld van een synergie/antagonisme-assay met S. pneumonie R6 met masarimycine en de ATPase-remmer optochin (merk op dat de synergie/antagonismescreening in B. subtilis nog steeds een lopend onderzoek is). Voor de reproduceerbaarheid werden tweede passagecellen gebruikt en gekweekt tot een OD600nm van niet meer dan 0,4. Een FICI van 1,5 werd waargenomen voor de interactie tussen masarimycine en optochin, wat wijst op een onverschillige relatie tussen het antibioticapaar. De onverschillige relatie tussen masarimycine en optochin duidt op geen duidelijke interactie tussen de routes waarop deze antibiotica zich richten. Hoewel deze assays nuttige informatie kunnen bieden over geneesmiddelinteracties, is het belangrijk op te merken dat synergie / antagonisme-assays moeten worden uitgevoerd met biologische replicaties en het gebruik van de meer conservatieve cutoffs zoals beschreven door Odds42. Dit helpt om de overinterpretatie van waargenomen kleine synergetische of antagonistische relaties te voorkomen.

Fenotypische analyse van B. subtilis-cellen behandeld met sub-MIC masarimycine (figuur 3B) duidt op een fenotype dat verschilt van fenotypen die zijn gerapporteerd voor genetische deletie van lytG32 en meer lijkt op fenotypen van B. subtilis-stammen met meerdere autolysinedeleties29. Deze discrepantie in fenotype is intrigerend omdat terwijl in vitro remming van LytG is gedemonteerd35, een ΔlytG-mutant geen waarneembaar fenotype32 heeft. Deze discrepantie kan gedeeltelijk worden verklaard door verschillen in genetische en chemische inactivatie46,47. De waargenomen verschillen in de chemische of genetische inactivatie van LytG is een intrigerende vraag die momenteel wordt onderzocht. S. pneumoniaecellen behandeld met masarimycine vertoonden een fenotype (figuur 3D) dat verschilt van de genetische deletie van de overeenkomstige GlcNAcase (GH73, cluster 2) LytB 37,43,44,48. Deze morfologische discrepantie benadrukt de uitdagingen bij het toewijzen van het werkingsmechanisme of het toewijzen van het biologische doelwit van kleine molecuulremmers. Morfologische fenotypen kunnen voortkomen uit een complexere reeks interacties anders dan een enkele genetische deletie of chemische inactivatie van een celwandwerkend enzym. Deze metafenotypen34 kunnen ontstaan uit complexe interacties via directe (gebrek aan een ofzym(en)) of indirecte (verlies van regulatoren) mechanismen.

Voor zover bekend is masarimycine de eerste remmer van een bacteriële autolysine die remming van bacteriegroei aantoont (aanvullende figuur 5). Het is een smalspectrum bacteriostatische remmer van groei in B. subtilis en S.pneumoniae. Dit smalle spectrum is een beperking voor multi-species vergelijkende studies van celwandmetabolisme tussen Gram-positieve en Gram-negatieve organismen. Dit smalle spectrum is deels te wijten aan verschillen in sommige van de glycosylhydrolase autolysinen die worden gebruikt tijdens vegetatieve groei tussen Gram-positieve (GlcNAcase) en Gram-negatieve (lytische transglycosylase) organismen. Met behulp van kleine-molecuulremmers zoals masarimycine voor het remmen van PG-autolysines, in het bijzonder, kunnen GlcNAcases een orthogonale benadering van traditionele genetica bieden voor het ophelderen van de autolysinefunctie. Masarimycine heeft een duidelijk voordeel ten opzichte van sommige chemische biologiemethoden, omdat het in meer dan één soort kan worden gebruikt (B. subtilis en S. pneumoniae). Het kan vergelijkende studies van het celwandmetabolisme tussen staafvormig (B. subtilis) en coccoid (S. pneumoniae) soorten. Het minder gekernelde celwandmetabolisme en -deling in S. pneumoniae biedt een contrapunt in het meer strak gereguleerde systeem van staafvormige soorten49,50. Toekomstige toepassingen van deze techniek zullen zijn om het moleculaire doelwit in S.pneumoniae te identificeren en de verschillen tussen genetische en chemische inactivatie van autolysinen in S.pneumoniae en B. subtilis te onderzoeken.

Kritieke stappen in het protocol
Het is belangrijk om aandacht te besteden aan de effectieve concentratie van masarimycine in biologische en biochemische testen. Vanwege de hydrofobe aard kunnen concentraties boven 250 μM (65x MIC in B. subtilis) leiden tot oplosbaarheids- en aggregatieproblemen die van invloed kunnen zijn op de interpretatie van biologische gegevens. Het is essentieel om het effect van het voertuig (d.w.z. DMSO) in alle experimenten goed te controleren.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Reid, C. W. heeft intellectueel eigendom met betrekking tot specifieke toepassingen van masarimycine.

Acknowledgments

Onderzoek werd ondersteund door de National Science Foundation onder subsidienummer 2009522. NMR-analyse van masarimycine werd ondersteund door de National Science Foundation major research instrumentation program award onder subsidienummer 1919644. Alle meningen, bevindingen en conclusies of aanbevelingen die in dit materiaal worden geuit, zijn die van de auteurs en weerspiegelen niet noodzakelijkerwijs de opvattingen van de National Science Foundation.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
2-Iodobenzoic acid SIGMA-ALDRICH I7675-25G corrosive, irritant, light yellow to orange-brown powder
2-Propanol SIGMA-ALDRICH 109827-4L flammable, irritant, colorless liquid
Acetonitrile SIGMA-ALDRICH 34851-4L flammable, irritant, colorless liquid
Aluminum backed silica plates Sorbtech 4434126 silica gel XG F254 on aluminum backed plates
chloroform-d SIGMA-ALDRICH 151823-50G solvent for NMR
Compact Mass Spectrometer Advion-Interchim Advion CMS compact mass spectrometer equiped with APCI source and atmospheric solids analysis probe
Corning Costar 96 well flat bottom plates-sterile fisher chemical 07-200-90 for synergy/antagonism assays
cover slips fisher chemical 12-547 for microscopy
Cyclohexanecarboxaldehyde CHEM-IMPEX INT'L INC. 24451 flammable, irritant, colorless to pink liquid
Cyclohexyl isocyanide SIGMA-ALDRICH 133302-5G irritant, colorless liquid, extremly unpleasant odor
Cyclohexylamine SIGMA-ALDRICH 240648-100ML corrosive, flammable, irritant, colorless liquid unless contaminated
Ethyl acetate SIGMA-ALDRICH 537446-4L flammable, irritant, colorless liquid
flash silica cartridge (12g) Advion-Interchim PF-50SIHP-F0012 pack of flash silica columns (12g) for purification of masarimycin
formaldehyde SIGMA-ALDRICH F8775-25ML fixing agent for microscopy
HEPES SIGMA-ALDRICH H8651-25G buffer for microscopy fixing solution
Hexane, mixture of isomers SIGMA-ALDRICH 178918-4L environmentally damaging, flammable, irritant, health hazard, colorless liquid
High performance compact mass spectrometer Advion expression Atmospheric Solids Analysis Probe (ASAP), low resolution
High Vac eppendorf Vacufuge plus vacuum aided by centrifugal force and temperature
Hydrochloric acid SIGMA-ALDRICH 258148-2.5L corrosive, irritant, colorless liquid
hydrochloric acid SIGMA-ALDRICH 320331-2.5L strong acid
immersion oil fisher chemical 12-365-19 for microscopy
Iodine, resublimed crystals Alfa Aesar 41955 environmentally damaging, irritant, health hazard, dark grey/purple crystals
Mestre Mnova MestreLab Research software for processing NMR spectra
Methanol SIGMA-ALDRICH 439193-4L flammable, toxic, health hazard, colorless liquid
methylene blue SIGMA-ALDRICH M9140-25G microscopy stain for staining cell walls
meuller-hinton agar plates + 5% sheep blood fisher chemical B21176X growth media for Streptococcus pneumoniae
meuller-hinton broth fisher chemical DF0757-17-6 growth media for Streptococcus pneumoniae
microscope slides fisher chemical 22-310397 for microscopy
Microwave Synthesis Labstation MILESTONE START SYNTH device that requires the ventilation of a fume hood, equipped with synthesis carousel
NMR tubes SIGMA-ALDRICH Z562769-5EA 5mm NMR tubes 600 MHz
Nuclear Magnetic Resonance (NMR) Bruker Ascend 400 large superconducting magnet (400MHz)
optochin fisher chemical AAB21627MC ethylhydrocupreine hydrochloride
petrie plates Celltreat 229695 for preparing agar plates for bacterial growth
Primo Star Bright field/Phase contrast Microscope with ERc5s camera Zeiss for morphology studies
puriFlash interchim XS520plus flash chromatography purification system
resazurin SIGMA-ALDRICH R7017-1G for synergy/antagonism assays
Rotary Evaporator Heidolph Hei-VAP Value "The Collegiate" solvent evaporator
Sodium bicarbonate SIGMA-ALDRICH S6014-500G irritant, white powder
Sodium chloride fisher chemical S271-1 crystalline, colorless
Sodium chloride SIGMA-ALDRICH S5886-500G for growth of B.subtilis and preparation of LB media
Sodium sulfate SIGMA-ALDRICH 7985592-500G anhydrous, granular, white
tryptone fisher chemical BP1421-500 for growth of B.subtilis and preparation of LB media
Whitney DG250 Workstation Microbiology International DG250 anaerobic workstation. Anaerobic gas mixture used: 5% hydrogen, 10% carbon dioxide, balance nitrogen
yeast extract fisher chemical BP1422-500 for growth of B.subtilis and preparation of LB media
Zen Lite (blue) software Zeiss for acquiring micrographs

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Vollmer, W., Blanot, D., de Pedro, M. A. Peptidoglycan structure and architecture. FEMS Microbiology Review. 32 (2), 149-167 (2008).
  2. Munita, J. M., Bayer, A. S., Arias, C. A. Evolving resistance among Gram-positive pathogens. Clinical Infectious Diseases. 61, suppl-2 48-57 (2015).
  3. Vollmer, W., Bertsche, U. Murein (peptidoglycan) structure, architecture and biosynthesis in Escherichia coli. Biochimica Biophysica Acta. 1778 (9), 1714-1734 (2008).
  4. Vollmer, W., Höltje, J. -V. The architecture of the murein (peptidoglycan) in Gram-negative bacteria: vertical scaffold or horizontal layer(s). Journal of Bacteriology. 186 (18), 5978-5987 (2004).
  5. Clarke, A. J. Compositional analysis of peptidoglycan by high-performance anion-exchange chromatography. Analytical Biochemistry. 212 (2), 344-350 (1993).
  6. Kim, S. J., Chang, J., Singh, M. Peptidoglycan architecture of Gram-positive bacteria by solid-state NMR. Biochimica Biophysica Acta. 1848, 350-362 (2014).
  7. Koch, A. L., Doyle, R. J. Inside-to-outside growth and turnover of the wall of gram-positive rods. Journal of Theoretical Biology. 117 (1), 137-157 (1985).
  8. Beeby, M., Gumbart, J. C., Roux, B., Jensen, G. J. Architecture and assembly of the Gram-positive cell wall. Molecular Microbiology. 88 (4), 664-672 (2013).
  9. Shockman, G. D., Daneo-Moore, L., Kariyama, R., Massidda, O. Bacterial walls, peptidoglycan hydrolases, autolysins, and autolysis. Microbial Drug Resistance. 2 (1), 95-98 (1996).
  10. Dijkstra, A. J., Keck, W. Peptidoglycan as a barrier to transenvelope transport. Journal of Bacteriology. 178 (19), 5555-5562 (1996).
  11. Blackman, S. A., Smith, T. J., Foster, S. J. The role of autolysins during vegetative growth of Bacillus subtilis 168. Microbiology. 144, 73-82 (1998).
  12. Misra, G., Rojas, E. R., Gopinathan, A., Huang, K. C. Mechanical consequences of cell-wall turnover in the elongation of a Gram-positive bacterium. Biophysical Journal. 104 (11), 2342-2352 (2013).
  13. Wheeler, R., et al. Bacterial cell enlargement requires control of cell wall stiffness mediated by peptidoglycan hydrolases. mBio. 6 (4), 00660 (2015).
  14. Taguchi, A., Kahne, D., Walker, S. Chemical tools to characterize peptidoglycan synthases. Current Opinion in Chemical Biology. 53, 44-50 (2019).
  15. Welsh, M. A., Schaefer, K., Taguchi, A., Kahne, D., Walker, S. Direction of chain growth and substrate preferences of shape, elongation, division, and sporulation-family peptidoglycan glycosyltransferases. Journal of the American Chemial Society. 141 (33), 12994-12997 (2019).
  16. Rubino, F. A., et al. Detection of transport intermediates in the peptidoglycan flippase MurJ identifies residues essential for conformational cycling. Journal of the American Chemical Society. 142 (12), 5482-5486 (2020).
  17. Sjodt, M., et al. Structure of the peptidoglycan polymerase RodA resolved by evolutionary coupling analysis. Nature. 556 (7699), 118-121 (2018).
  18. Tiyanont, K., et al. Imaging peptidoglycan biosynthesis in Bacillus subtilis with fluorescent antibiotics. Proceedings of the National Academy of Science U S A. 103 (29), 11033-11038 (2006).
  19. Lebar, M. D., et al. Reconstitution of peptidoglycan cross-linking leads to improved fluorescent probes of cell wall synthesis. Journal of the American Chemical Society. 136 (31), 10874-10877 (2014).
  20. Do, T., Page, J. E., Walker, S. Uncovering the activities, biological roles, and regulation of bacterial cell wall hydrolases and tailoring enzymes. Journal of Biological Chemistry. 295 (10), 3347-3361 (2020).
  21. Liang, H., et al. Metabolic labelling of the carbohydrate core in bacterial peptidoglycan and its applications. Nature Communications. 8, 15015 (2017).
  22. DeMeester, K. E., et al. Metabolic incorporation of N-acetyl muramic acid probes into bacterial peptidoglycan. Current Protocol in Chemical Biology. 11 (4), 74 (2019).
  23. Lazor, K. M., et al. Use of Bioorthogonal N-acetylcysteamine (SNAc) analogues and peptidoglycan O-acetyltransferase B (PatB) to label peptidoglycan. The FASEB Journal. 32, 630 (2018).
  24. Wang, Y., Leimkuhler-Grimes, C. Fluorescent labeling of the carbohydrate backbone of peptidoglycan to track degradation in vivo. The FASEB Journal. 29, (2015).
  25. Kuru, E., et al. In probing of newly synthesized peptidoglycan in live bacteria with fluorescent D-amino acids. Angewandte Chemie International Edition. 51 (50), 12519-12523 (2012).
  26. Zhou, R., Chen, S., Recsei, P. A dye release assay for determination of lysostaphin activity. Analytical Biochemistry. 171 (1), 141-144 (1988).
  27. Qiao, Y., et al. Lipid II overproduction allows direct assay of transpeptidase inhibition by β-lactams. Nature Chemical Biology. 13 (7), 793-798 (2017).
  28. Lebar, M. D., et al. Forming cross-linked peptidoglycan from synthetic Gram-negative lipid II. Journal of the American Chemical Society. 135 (12), 4632-4635 (2013).
  29. Chen, R., Guttenplan, S. B., Blair, K. M., Kearns, D. B. Role of the D-dependent autolysins in Bacillus subtilis population heterogeneity. Journal of Bacteriology. 191 (18), 5775-5784 (2009).
  30. Yukie, S., Miki, K., Yoshio, N., Kuniaki, T., Yoshihisa, Y. Identification and characterization of an autolysin-encoding gene of Streptococcus mutans. Infection and Immunity. 73 (6), 3512-3520 (2005).
  31. Domenech, M., García, E., Moscoso, M. In vitro destruction of Streptococcus pneumoniae biofilms with bacterial and phage peptidoglycan hydrolases. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 55 (9), 4144-4148 (2011).
  32. Horsburgh, G. J., Atrih, A., Williamson, M. P., Foster, S. J. LytG of Bacillus subtilis is a novel peptidoglycan hydrolase: the major active glucosaminidase. Biochemistry. 42 (2), 257-264 (2003).
  33. Vermassen, A., et al. Cell wall hydrolases in bacteria: insight on the diversity of cell wall amidases, glycosidases and peptidases toward peptidoglycan. Frontiers in Microbiology. 10, 331 (2019).
  34. Martin-Galiano, A. J., Yuste, J., Cercenado, M. I., de la Campa, A. G. Inspecting the potential physiological and biomedical value of 44 conserved uncharacterised proteins of Streptococcus pneumoniae. BMC Genomics. 15, 652 (2014).
  35. Nayyab, S., et al. Diamide inhibitors of the Bacillus subtilis N-acetylglucosaminidase LytG that exhibit antibacterial activity. ACS Infectioius Diseases. 3 (6), 421-427 (2017).
  36. Lipski, A., et al. Structural and biochemical characterization of the β-N-acetylglucosaminidase from Thermotoga maritima: Toward rationalization of mechanistic knowledge in the GH73 family. Glycobiology. 25 (3), 319-330 (2014).
  37. Haubrich, B. A., et al. Inhibition of Streptococcus pneumoniae autolysins highlight distinct differences between chemical and genetic inactivation. bioRxiv. , 300541 (2020).
  38. Farha, M. A., et al. Inhibition of WTA synthesis blocks the cooperative action of PBPs and sensitizes MRSA to β-lactams. ACS Chemical Biology. 8 (1), 226-233 (2013).
  39. Lehár, J., et al. Chemical combination effects predict connectivity in biological systems. Molecular Systems Biology. 3 (1), 80 (2007).
  40. Farha, M. A., et al. Antagonism screen for inhibitors of bacterial cell wall biogenesis uncovers an inhibitor of undecaprenyl diphosphate synthase. Proceedings of the National Academy of Science U S A. 112 (35), 11048-11053 (2015).
  41. Palomino, J. C., et al. Resazurin microtiter assay plate: simple and inexpensive method for detection of drug resistance in Mycobacterium tuberculosis. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 46 (8), 2720-2722 (2002).
  42. Odds, F. C. Synergy, antagonism, and what the chequerboard puts between them. Journal of Antimicrobial Chemotherapy. 52 (1), 1 (2003).
  43. Arrigucci, R., Pozzi, G. Identification of the chain-dispersing peptidoglycan hydrolase LytB of Streptococcus gordonii. PLoS One. 12 (4), 0176117 (2017).
  44. Bai, X. -H., et al. Structure of pneumococcal peptidoglycan hydrolase LytB reveals insights into the bacterial cell wall remodeling and pathogenesis. of Biological Chemistry. 289 (34), 23403-23416 (2014).
  45. Garcia, P., Gonzalez, M. P., Garcia, E., Lopez, R., Garcia, J. L. LytB, a novel pneumococcal murein hydrolase essential for cell separation. Molecular Microbiology. 31 (4), 1275-1281 (1999).
  46. Giladi, M., Altman-Price, N., Levin, I., Levy, L., Mevarech, M. FolM, a new chromosomally encoded dihydrofolate reductase in Escherichia coli. Journal of Bacteriology. 185 (23), 7015-7018 (2003).
  47. Chua, P. R., et al. Effective killing of the human pathogen Candida albicans by a specific inhibitor of non-essential mitotic kinesin Kip1p. Molecular Microbiology. 65 (2), 347-362 (2007).
  48. Rico-Lastres, P., et al. Substrate recognition and catalysis by LytB, a pneumococcal peptidoglycan hydrolase involved in virulence. Scientific Reports. 5, 16198 (2015).
  49. Vollmer, W., et al. The cell wall of Streptococcus pneumoniae. Microbiology Spectrum. 7 (3), (2019).
  50. Massidda, O., Nováková, L., Vollmer, W. From models to pathogens: how much have we learned about Streptococcus pneumoniae cell division. Environmental Microbiology. 15 (12), 3133-3157 (2013).

Tags

Biochemie Nummer 179 Peptidoglycan metabolisme autolysine chemische biologie remmer celwand
Synthese van masarimycine, een kleine molecuulremmer van grampositieve bacteriegroei
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Gallati, M., Point, B., Reid, C. W.… More

Gallati, M., Point, B., Reid, C. W. Synthesis of Masarimycin, a Small Molecule Inhibitor of Gram-Positive Bacterial Growth. J. Vis. Exp. (179), e63191, doi:10.3791/63191 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter